FR2901133A1 - Utilisation de modulateurs de la glycolyse comme agents anti-age - Google Patents

Abstract

L'invention se rapporte à l'utilisation dans une composition contenant un milieu physiologiquement acceptable, d'au moins un composé inducteur de glycolyse épidermique, à l'exclusion de l'IGF-1 (Insulin Growth Factor de type 1) comme agent pour diminuer et/ou retarder les signes du vieillissement de la peau et/ou de ses annexes.

Description

Utilisation de modulateurs de la glycolyse comme agents anti-âge

L'invention se rapporte à l'utilisation dans une composition contenant un milieu physiologiquement acceptable, d'au moins un composé inducteur de glycolyse épidermique, à l'exclusion de l'IGF-1 (Insulin Growth Factor de type 1) comme agent pour diminuer et/ou retarder les signes du vieillissement de la peau et/ou de ses annexes.

Mis en forme 1 La présente invention se rapporte au domaine du vieillissement et des signes qui lui sont associés, sur la peau et ses annexes. Elle concerne en particulier la modulation de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation des cellules épidermiques et l'amélioration des signes liés au phénomène d'amincissement de l'épiderme dû à une diminution du nombre de kératinocytes en phase de prolifération. Les femmes, voire même les hommes, ont tendance actuellement à vouloir paraître jeunes le plus longtemps possible et cherchent par conséquent à estomper les marques du vieillissement de la peau, qui se traduisent notamment par des rides et des ridules, un amincissement de l'épiderme et/ou un aspect de peau molle et flétrie. A ce sujet, la publicité et la mode font état de produits destinés à garder le plus longtemps possible une peau éclatante et sans ride, marques d'une peau jeune, d'autant plus que l'aspect physique agit sur le psychisme et/ou sur le moral. La peau est constituée de deux compartiments, l'un superficiel, l'épiderme, et un plus profond, le derme, qui interagissent. L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau, notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures appelé "fonction barrière".

L'épiderme est conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes constituant la couche germinative de l'épiderme, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyédriques disposées sur les couches germinatives, une à trois couches dites granuleuses constituées de cellules aplaties contenant des inclusions cytoplasmiques distinctes, les grains de kératohyaline et enfin la couche cornée (ou stratum corneum), constituée d'un ensemble de couches de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes. Les cornéocytes sont des cellules anucléées principalement constituées d'une matière fibreuse contenant des cytokératines, entourée d'une enveloppe cornée. Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée majoritairement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale. Ces composants sont synthétisés par les fibroblastes. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. Enfin, le derme est traversé par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses.

La cohésion entre l'épiderme et le derme est assurée par la jonction dermo-épidermique. 2 Il y a en permanence dans l'épiderme une production de nouveaux kératinocytes pour compenser la perte en continu de cellules épidermiques au niveau de la couche cornée. Cependant, au cours du vieillissement, on peut observer de façon physiologique une diminution du nombre de cellules en phase de prolifération, et par conséquent une diminution des couches épidermiques vivantes. En limitant et/ou retardant le passage des cellules en phase de différenciation, on maintient le pool de cellules jeunes. Il est donc important de préserver ce pool de cellules prolifératives, en évitant ou retardant leur différenciation, afin de contribuer à retarder l'apparition de signes du vieillissement. Les rétinoïdes, et notamment le rétinol, sont ainsi classiquement utilisés pour lutter contre les signes du vieillissement et favoriser le renouvellement épidermique. Cependant, il existe toujours un besoin de trouver de nouveaux agents utiles en anti-âge.

C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation dans une composition contenant un milieu physiologiquement acceptable, d'au moins un composé inducteur de glycolyse épidermique, comme agent pour diminuer et/ou retarder les signes du vieillissement de la peau et/ou de ses annexes, notamment du cheveu. En effet, de manière inattendue, il a été trouvé dans le cadre de l'invention que ces composés peuvent être utilisés comme agent pour limiter la différenciation des cellules épidermiques. On maintient ainsi un pool basal de kératinocytes au stade de la prolifération.

De préférence, ledit composé n'est pas de l'IGF-1 (Insulin Growth Factor de type 1 : facteur de croissance de l'insuline), ou l'IGF-1 n'est pas utilisé comme seul inducteur de glycolyse épidermique. Avantageusement, le composé inducteur de glycolyse est un activateur des peptides transporteurs du glucose (GLUT).

Le transport du glucose dans la plupart des cellules de mammifères est régulé par une 30 famille de protéines membranaires appelé "glucose transporter", aussi désigné par GLUT. Au moins 13 protéines sont codées par une famille de gènes apparentés, ces protéines présentant différents domaines transmembranaires. L'expression des différentes isoformes de GLUT varie en fonction du tissu et des conditions hormonales et environnementales.

Les kératinocytes expriment au moins 4 types de transporteurs de glucose, GLUT-1, 2, 3 et 5.

Shen et al (J. Invest. Dermatol., 2000) ont décrit les variations de taux de transporteurs dans des kératinocytes murins lors de stimulation par l'insuline ou l'IGF-1. Lors de la différenciation, ils observent une augmentation de l'expression de GLUT-3 et une diminution de celle de GLUT-1, 2 et 5. Ils indiquent que, la stimulation des kératinocytes en cours de différenciation par l'insuline ou l'IGF-1, n'a pas d'effet sur l'expression des ces GLUTs. En revanche, l'insuline active la translocation (du cytoplasme à la fraction membranaire) des GLUT-1 et 5, et l'IGF-1 active la translocation des GLUT-2 et 3 pendant la phase de prolifération. Les auteurs concluent qu'il serait intéressant de comparer les variations entre une peau normale et la peau de sujets diabétiques. US 2003/0187036 propose l'utilisation de dérivés de biguanides pour favoriser la cicatrisation des lésions cutanées telles que les ulcères survenant chez les diabétiques, ou d'autres blessures. US 2005/0037440 se rapporte à l'identification de facteurs de longévité chez les mammifères, et au rôle du facteur cJUN et de la modulation du signal JNK. Il suggère ainsi d'utiliser des agents diminuant l'activité d'un indicateur comme DAF-14, la superoxyde-dismutase, GLUT-1 ou GLUT-4 pour lutter contre les signes du vieillissement causés principalement par le stress oxydatifs. DE 10259966 décrit des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant des acides aminés de type mycosporine et améliorant la capture de l'oxygène; ces composés induisent notamment une réduction de l'expression de GLUT-1. Les compositions peuvent notamment être appliquées pour le traitement du vieillissement de la peau.

Cependant, à la connaissance de la demanderesse, il n'a jamais été proposé d'utiliser des composés inducteurs de glycolyse, ni des composés capables de stimuler les systèmes transporteurs de glucose GLUT, en vue de lutter contre les signes du vieillissement de la peau ou de ses annexes et de favoriser les renouvellement des cellules épidermiques.

Par composé activateur des peptides transporteurs du glucose on entend à la fois des composés augmentant la quantité de GLUT et des agents augmentant leur activité intrinsèque. Les agents augmentant la quantité de GLUT sont notamment des composés stimulant sa synthèse, en particulier en stimulant l'expression ou la transcription du gène correspondant. Les agents augmentant l'activité intrinsèque de GLUT sont notamment 4 des agents favorisant la translocation de la protéine dans la membrane cellulaire ou la fixation du glucose.

Par composé inducteur de glycolyse, on entend des composés augmentant la réaction 5 par laquelle le glucose est métabolisé dans les cellules. La glycolyse comprend plusieurs étapes: une première chaîne de réaction aboutit à la formation de fructosel,6 di-phosphate, qui est ensuite dégradé en pyruvate, avec la production d'ATP. En conditions anaérobies, la LDH catalyse la transformation du pyruvate en lactate. 10 Les inventeurs ont en effet mis en évidence que la glycolyse anaérobie est maximale dans les kératinocytes au cours de la phase de prolifération. En revanche, la différenciation se caractérise par une diminution importante de la glycolyse, sans modification qualitative de celle-ci. De préférence, les activateurs de peptides transporteur GLUT sont des activateurs de GLUT-1, GLUT-2 et/ou GLUT-3. Il peut s'agir d'activateur spécifique d'un ou plusieurs de ces transporteurs, ou d'activateurs non spécifiques. Avantageusement les activateurs de peptides utiles selon l'invention sont activateurs de GLUT-1. 20 Il a été montré dans le cadre de l'invention que les transporteurs de glucose, en particulier GLUT-1 et GLUT-2, varient en fonction de l'état de prolifération / différenciation des kératinocytes et sont impliqués dans l'homéostasie épidermique. La modification de leur activité peut donc influer sur le contrôle de l'équilibre prolifération/ différenciation au cours 25 du vieillissement.

Les composés inducteurs de glycolyse et/ou activateur de GLUT utiles selon l'invention peuvent notamment être choisis parmi les biguanides hypoglycémiants tels que la metformine, la phenformine, la buformine ou le proguanil; l'insuline; les analogues de 30 thiazolidones, le troglitazone; les interleukines, en particulier l'IL-3; les inhibiteurs de protéines phosphatase comme le vanadate, l'acide okadaique; le dibutyryl AMPc et le TGF-13. De manière générale, on utilise des composés favorisant le fonctionnement de la glycolyse épidermique, qui se caractérisent par une production de lactate accrue.

D'autres composés utiles selon l'invention pourront être identifiés par le procédé comprenant les étapes suivantes: a) mise en culture de kératinocytes b) ajout du composé à tester dans le milieu de culture c) comparaison du taux de glycolyse dans les kératinocytes en présence du composé à tester, avec le taux de glycolyse dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester d) sélection du composé qui provoque une augmentation d'au moins 30% du taux de glycolyse.

L'étape a) peut être effectuée selon des modalités connues de l'homme du métier, par exemple en milieu autocrine ou en milieu complet en présence de facteurs de croissance tels que EGF, insuline, et extraits de glande hypophysaire. Lors de l'étape b), le composé à tester est ajouté à des concentrations compatibles avec la viabilité des cellules et généralement de 10-2 à 10-9 M. Il sera laissé en contact avec la culture cellulaire pendant un temps suffisant pour être métabolisé par les cellules. Ce temps est généralement supérieur ou égal à 12 heures. Le taux de glycolyse à l'étape c) sera mesuré dans des kératinocytes en phase de prolifération et/ou dans des kératinocytes en phase de différenciation; ce taux sera comparé à celui observé dans un échantillon témoin cultivé en l'absence de composé à tester, toutes les autres conditions de culture étant identiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, la variation du taux de glycolyse induite par le composé à tester est mesurée d'une part dans une population de kératinocytes majoritairement, voire de façon homogène, en phase de prolifération, d'autre part dans une population de kératinocytes majoritairement, voire de façon homogène, en phase de différenciation. Cette étape de mesure de la glycolyse épidermique, peut le cas échéant, être directement quantifiée soit par la mesure de l'activité PFK1 et/ou soit par la mesure de la consommation de glucose et/ou soit par la mesure du taux de GLUT exprimé par les cellules et/ou soit par le taux de lactate produit au cours de la réaction globale.

Le procédé selon l'invention peut ainsi comprendre les étapes suivantes: a)Mise en culture de kératinocytes et ajout du composé à tester dans le milieu de culture b)Comparaison du niveau de glycolyse dans les kératinocytes en prolifération et en différenciation en présence du composé à tester comparativement à un échantillon témoin cultivé sans composé à tester. c)Cette étape de mesure de la glycolyse épidermique, peut le cas échéant, être directement quantifiée soit par la mesure de l'activité PFK1 et/ou soit par la mesure de la consommation de glucose et/ou soit par la mesure du taux de GLUT exprimé par les cellules et/ou soit par le taux de lactate produit au cours de la réaction globale. d)Phase de sélection du composé qui provoque une activation significative des paramètres décrits en b) et/ou c).

Les effets des composés identifiés par le procédé décrit ci-dessus sur le niveau d'expression de GLUT-1 pourront être évalués dans une deuxième temps. Cette évaluation pourrait être réalisé selon les étapes suivantes : a) mise en culture de kératinocytes b) ajout du composé à tester dans le milieu de culture c) comparaison du niveau d'expression de GLUT-1 dans les kératinocytes en présence du composé à tester, avec le niveau d'expression dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester d) sélection du composé qui provoque une augmentation significative, notamment d'au moins 25% de l'expression de GLUT-1.

L'étape a) peut être effectuée selon des modalités connues de l'homme du métier, par exemple en milieu autocrine ou en milieu complet en présence de facteurs de croissance tels que EGF, insuline, et extraits de glande hypophysaire.

Lors de l'étape b), le composé à tester est ajouté à des concentrations compatibles avec la viabilité des cellules et généralement de 10-2 à 10-9 M. Il sera laissé en contact avec la culture cellulaire pendant un temps suffisant pour être métabolisé par les cellules. Ce temps est généralement supérieur ou égal à 12 heures. Le niveau d'expression à l'étape c) sera mesuré dans des kératinocytes en phase de prolifération et/ou dans des kératinocytes en phase de différenciation; cette expression sera comparée à celui observée dans un échantillon témoin cultivé en l'absence de composé à tester, toutes les autres conditions de culture étant identiques. Cette étape de mesure du niveau d'expression de GLUT-1, peut le cas échéant, être directement quantifiée soit par la quantification du signal suite aux immunomarquages des kératinocytes avec un anti-corps spécifique pour GLUT-1 soit par la quantification par RT- PCR des mRNA codant pour le GLUT-1 et/ou soit par la mesure de l'expression de la protéine par Western blot. Les composés utiles selon l'invention peuvent ainsi être sélectionnés par un procédé comprenant les étapes suivantes: a)Mise en culture de kératinocytes et ajout du composé à tester dans le milieu de culture b)Comparaison du niveau d'expression du GLUT-1 dans les kératinocytes en prolifération et en différenciation en présence du composé à tester comparativement à un échantillon témoin cultivé sans composé à tester. c)Cette étape de mesure de l'expression de GLUT-1, peut le cas échéant, être directement quantifiée soit par la quantification du signal suite aux immunomarquages des kératinocytes avec un anti-corps spécifique pour GLUT-1 et/ou soit par la quantification par RT-PCR des mRNA codant pour le GLUT-1 et/ou soit par la mesure de l'expression de la protéine par Western blot. d)Phase de sélection du composé qui provoque une augmentation significative des paramètres décrits en b) et/ou c).

Il est entendu que les procédés permettant de sélectionner des composés adaptés et leurs variantes sont également objet de l'invention.

Des composés régulant le métabolisme du glucose en activant ou augmentant le transport du glucose dans les cellules, plus particulièrement dans les kératinocytes, peuvent augmenter leur prolifération et/ou ralentir leur différenciation, les maintenant ainsi dans un état prolifératif correspondant à des cellules jeunes. Cette activation de la prolifération et/ou cette diminution de la différenciation est objectivée notamment, par l'augmentation de l'incorporation de thymidine tritiée ou par la diminution de l'expression de certains marqueurs de la différenciation parmi lesquels, la kératine 1 et/ou la kératine 10 et/ou la transglutaminase K et/ou la loricrine et/ou la fillagrine. K10 (kératine 10) est une protéine qui sert de marqueur de différenciation précoce. Elle est coexprimée avec K1 sous forme d'une protéine hétérodimérique. Elle est détectée dans tous les kératinocytes des couches suprabasales de l'épiderme c'est à dire dès le début du processus de différenciation. TGK (Transglutaminase K) est un marqueur de différenciation tardive. C'est une enzyme impliquée dans la réticulation de l'enveloppe cornée des kératinocytes des couches suprabasales supérieures.

Les composés inducteurs de glycolyse selon l'invention seront notamment utiles comme agent pour lutter contre les signes du vieillissement chronobiologique de la peau et de ses annexes.

Par peau, on entend désigner dans le présent texte, la peau, les muqueuses et/ou le cuir chevelu. Par annexes de la peau on entend en particulier les phanères, c'est-à-dire les poils, les cils, les cheveux et/ou les ongles. Les composés seront particulièrement adaptés à lutter contre les signes du vieillissement chronobiologique de l'épiderme. Au cours du vieillissement chronobiologique, l'épaisseur de l'épiderme se réduit, les divisions cellulaires diminuant en nombre. En facilitant la multiplication cellulaire, en particulier des cellules de l'épiderme, on facilitera sa régénération et la peau aura un aspect plus jeune.

Les compositions selon l'invention sont notamment destinées à prévenir ou diminuer les rides et les ridules, et/ou l'amincissement de la peau et/ou contre la peau molle et/ou flétrie.

Selon un autre aspect de l'invention, le composé inducteur de glycolyse et/ou activateur de GLUT ou les compositions le contenant sont utilisés pour lutter contre les signes du vieillissement des phanères. Le composé est ainsi utilisé comme agent pour diminuer et/ou prévenir la chute des cheveux, et /ou pour prévenir l'hétérogénéité du diamètre capillaire. En effet, en favorisant au niveau du follicule pileux, le maintien de kératinocytes en phase de prolifération, on contribue à la formation d'une tige pilaire et à son renouvellement. Lesdits composés ou compositions sont notamment destinés au traitement ou à la prévention de l'alopécie. Au cours de l'alopécie le vieillissement de toute la structure épithéliale du follicule pileux est constaté, avec notamment une diminution de la croissance et du diamètre de la tige pilaire qu'elle soit liée directement à une altération fonctionnelle du renouvellement des cellules épithéliales liée au vieillissement de la structure ou indirectement à un défaut d'oxygénation ou de nutrition ou encore, à une dégradation de la fonctionnalité des structures conjonctives de soutien de l'organe.

Selon un autre aspect de l'invention, le composé inducteur de glycolyse et/ou activateur de GLUT est utilisé comme agent pour lutter contre la déshydratation cutanée et/ou la sécheresse de l'épiderme. Il est utilisé comme agent hydratant, dans des compositions destinées à favoriser la synthèse de NMF (natural moisturizing factor) élément constitutif pour la fonction barrière et l'hydratation de l'épiderme. Cette synthèse est favorisée par le biais de la production de lactate, qui est un constituant majeur du NMF.

La sécheresse cutanée peut être liée au vieillissement de la peau, et en être l'un des signes. Mais les composés sont également utiles pour lutter contre les états de sécheresse constitutifs de la peau, pouvant exister physiologiquement chez un sujet indépendamment de son âge.

Selon un autre mode de réalisation, le composé inducteur de glycolyse tel que défini précédemment, est utilisé pour la préparation d'une composition destinée à traiter les troubles liés à une différenciation anormale de l'épiderme, tels que les hyperkératoses.

Les compositions selon l'invention peuvent être des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, en particulier des compositions dermatologiques.

Par milieu physiologiquement acceptable, on entend un milieu compatible avec la peau, les muqueuses ou les phanères. Il s'agit notamment d'un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.

La quantité de composé inducteur de glycolyse dans les compositions dépend de l'effet recherché et sera adapté par l'homme du métier pour obtenir une stimulation de la prolifération ou une diminution de la différenciation des kératinocytes. A titre d'exemple, la quantité d'agent inducteur de glycolyse ou du transport du glucose peut varier de 0,0001% à 10% et de préférence de 0,001 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition.

De préférence les compositions sont des compositions cosmétiques, c'est-à-dire destinée à améliorer l'aspect de l'individu.

Pour une administration par la voie orale, la composition de l'invention peut se présenter sous toutes les formes adaptées, particulièrement sous forme d'une solution buvable, d'un comprimé, d'une gélule , d'une capsule ou encore d'un aliment nutritionnel ou d'un complément nutritionnel.

Ladite composition comprend en outre au moins un excipient approprié adapté à l'administration orale.

Pour une administration par application topique sur la peau, les cheveux et/ou les muqueuses, la composition selon l'invention comprend bien évidemment un support cosmétiquement acceptable, c'est à dire un support compatible avec la peau, les muqueuses, les ongles, les cheveux et peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique, notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une suspension ou d'une dispersion; par exemple une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou mieux des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique.

Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide, et par exemple sous forme de stick. Elle peut être utilisée comme produit de soin, comme produit de nettoyage ou comme produit de maquillage.

De façon connue, la composition de l'invention peut contenir les adjuvants habituels dans les domaines cosmétiques et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les pigments, les agents chélateurs, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 % à 20 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules.35 Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en poids, et de préférence de 5 % à 50 % du poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 % à 20 % du poids total de la composition.

Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales, les huiles d'origine végétale (huile d'abricot, huile de tournesol), les huiles d'origine animale, les huiles de synthèse, les huiles siliconées et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matières grasses des alcools gras (alcool cétylique), des acides gras, des cires (cire d'abeilles).

Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple les esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG-40, le stéarate de PEG-100, les esters d'acide gras et de polyol tels que le stéarate de glycéryle et le tristéarate de sorbitane.

Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer en particulier les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, la silice hydrophobe et les polyéthylènes.

Selon un mode de réalisation avantageux, les compositions selon l'invention contiendront au moins un autre actif choisi parmi les filtres anti-UV, les agents hydratants, les dépigmentants, les agents anti-glycation, les inhibiteurs de NO synthase, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou épidermiques et/ou empêchant leur dégradation, les agents stimulant la prolifération des fibroblastes ou des kératinocytes, les agent myorelaxant ou dermo-décontractant, les agents tenseurs, les agents anti-pollution ou anti-radicalaire, les agents apaisants et les actifs sur le métabolisme énergétique des cellules. 12 La quantité de ces actifs additionnels pourra varier dans une large mesure et sera par exemple de 10-6 à 20% en poids, notamment de 0,001 à 10% en poids par rapport au poids total de la composition.

Les agents stimulant la prolifération des fibroblastes utilisables dans la composition selon l'invention peuvent par exemple être choisis parmi les protéines ou polypeptides végétaux, extraits notamment du soja (par exemple un extrait de soja commercialisé par la société LSN sous la dénomination Eleseryl SH-VEG 8 ou commercialisé par la société SILAB sous la dénomination commerciale Raffermine ); et les hormones végétales telles que les giberrellines et les cytokinines.

Les agents stimulant la prolifération des kératinocytes, utilisables dans la composition selon l'invention, comprennent notamment les rétinoïdes tels que le rétinol et ses esters, dont le palmitate de rétinyle ; l'adénosine, l'acide cinnamique et ses dérivés, le lycopène et ses dérivés; le phloroglucinol ; les extraits de tourteaux de noix commercialisés par la société GATTEFOSSE ; et les extraits de Solanum tuberosum commercialisés par la société SEDERMA.

L'invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique pour prévenir et/ou diminuer les signes associés au vieillissement de la peau ou de ses annexes, dans lequel on applique sur la peau, les muqueuses et/ou le cuir chevelu au moins un composé inducteur de glycolyse et/ou activateur de GLUT tel que défini précédemment. Le composé sera depréférence appliqué dans une composition cosmétique, l'application pouvant être quotidienne, pluri-quotidienne ou hebdomadaire. Elle pourra être poursuivie pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, par exemple pendant 1 à 2 mois puis reprise après une interruption, ou bien être continue.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes Figure 1: Immunomarquage des coupes histologiques de peau humaine montrant l'expression différentielle des transporteurs GLUT1 et GLUT-2 dans les kératinocytes épidermiques.

Figure 2: Courbe montrant l'effet de différentes concentrations de metformine sur le transport de glucose dans des kératinocytes en phase de prolifération. Figure 3 : Effet activateur de la metformine sur l'expression de GLUT-1 dans des kératinocytes en phase de différenciation.

Figure 4 : Effet inhibiteur de la metformine sur l'expression des marqueurs de différenciation épidermique. Résultats observés sur des monocouches des kératinocytes en cours de différenciation.

Exemple 1: Evolution de la glycolyse dans les kératinocytes . Les kératinocytes épidermiques humains sont isolés, selon la technique décrite par Wille et al. (1984), à partir d'échantillons de peau normale provenant d'abdominoplastie. Les kératinocytes sont tout d'abord cultivés en culture primaire dans un milieu complet sans sérum (milieu de base KBM, Cambrex, additionné d'EGF, d'insuline, d'hydrocortisone, d'extrait de glande hypophysaire bovine et de gentamycine). Les kératinocytes en prolifération provenant de cultures sous-confluentes sont trypsinisés (trypsine/EDTA 1X, Invitrogen) et ensemencées à raison de 10 X 103 cellules/cm2 dans le même milieu complet. Lorsque les cellules recouvrent environ 40% de la surface de culture, les kératinocytes synthétisent leurs propres facteurs de croissance en quantité suffisante. Le milieu complet est alors remplacé par un milieu autocrine contenant uniquement le milieu de base, l'hydrocortisone et la gentamycine. Les cultures sous-confluentes de kératinocytes en prolifération correspondent à 24h de culture autocrine. L'entrée en confluence des cellules (3 jours après la mise en culture autocrine) induit l'arrêt de la prolifération cellulaire et marque l'initiation du processus de différenciation (Poumay et Pittelkow, 1995 ; Poumay et al., 1999a). Les cultures post-confluentes de kératinocytes en différenciation correspondent à 6 jours de culture autocrine (ou 3 jours de culture confluente).

Le taux de glycolyse est mesuré par la méthode de la détritiation du [2-3H]Glucose (uptake de glucose) et du [3-3H]Glucose (flux glycolytique).

Mesure de la détritiation du f2-3HlGlucose (uptake de glucose) et du f3-3HlGlucose (flux glycolytique).

La capture de glucose (transport et phosphorylation du glucose) est évalué par la vitesse de détritiation du [2-3H]glucose tandis que le flux gycolytique au travers de la PFK1 est estimé par la vitesse de détritiation du [3-3H]glucose. Les kératinocytes cultivés en condition autocrine sont incubés en présence de milieu frais contenant 6 mM de glucose.

Après 2 heures, le tracer radioactif ([2-3H]glucose ou [3-3H]glucose) est ajouté au milieu de culture (0,25 Ci/ml). Après 30 à 60 minutes d'incubation, le milieu de culture est récupéré pour mesurer la formation de 3H2O. Ces échantillons sont tout d'abord déprotéinisé sur glace par de l'acide perchlorique (7% final). Après neutralisation par du KOH/KHCO3 3M/3M, les échantillons sont centrifugés (1000g, 10 min, 4 C). Le 3H2O est séparé du glucose radioactif par chromatographie sur colonne (résine échangeuse AGX8 sous forme borate). Les résultats sont exprimés en nmole de glucose détritié par heure et par pg de protéines.

Dosage du lactate.

Le dosage du lactate s'effectue par mesure de la formation de NADH (lecture à 340 nm) par la lactate dehydrogenase (LDH). La réaction s'effectue en présence de 25 à 100 pl de milieu de culture déprotéinisé et neutralisé (voir Mesure du [2-3H]Glucose et du [3-3H] Glucose ), de tampon hydrazine pH 9,3 (hydrazine sulfate 0,4 M, Glycine 1M, EDTA 5 mM), de 2 mM final de NAD. Après une première lecture à 340 nm (E0), la réaction est initié par 50 pg LDH. La deuxième lecture à 340 nm s'effectue au plateau de réaction (après environ 30 min) (El). Le résultat s'exprime en nmole en tenant compte du coefficient d'extinction molaire du NADH (6200).

On observe les résultats suivants : Le tableau 1 montre le métabolisme du glucose dans les kératinocytes en prolifération et en différenciation, en présence ou non de facteurs de croissance (respectivement culture autocrine et culture en milieu complet). Les valeurs sont exprimées en nmoles/ g protéines/h et représentent la moyenne SD d'au moins 3 expériences indépendantes.

Transport de Flux glycolytique Production de glucose lactate Autocr 0,65 0,07 0,99 0,19 1,62 0,20 prolif r en prolifération at Autocrine en 0,20 0,05 0,21 0,05 0,43 0,05 différenciation Complet en 1,17 0,11 1,52 0,21 3,04 0,33 prolifération (facteurs de croissance) Complet en 0,53 0,13 0,43 0,03 0,75 0,05 différenciation (facteurs de croissance) a) au cours des phases de prolifération la glycolyse est maximale dans des kératinocytes. Cette glycolyse est de type anaérobie avec une production de 2 lactates pour un glucose consommé. Quelques soient les conditions expérimentales la glycolyse épidermique est de type anaérobie et conduit à la production de deux lactates par molécule de glucose. Les valeurs obtenues sont comparables à celles observées dans des cellules à très haut degré énergétique comme les cellules musculaires en contraction : cellules des muscles striés ou du muscle cardiaque. b) La différenciation induit une diminution importante de la glycolyse.

En conclusion, les phases de prolifération puis de différenciation de l'épithélium cutané sont corrélées au métabolisme du glucose. Au cours du passage en différenciation cette glycolyse diminue.

Exemple 2: Contrôle de la glycolyse dans l'épiderme : Expression de GLUT-1 et GLUT-2

Le transport du glucose s'effectue par diffusion facilitée via des transporteurs transmembranaires, les GLUTs (GLUT-1-12 et HIMT), dont l'expression varie en fonction des tissus et des conditions hormonales et environnementales. Les kératinocytes expriment au moins 4 types de transporteurs de glucose (GLUT-1,2 3 et 5).

Détection en immunofluorescence de l'expression des GLUTs.

Les échantillons de peau congelés dans un milieu d'enrobage et conservés à -80 C sont coupés au cryostat. Les coupes sont fixées dans l'acétone à 4 C pendant 10 min puis séchées à l'air. Les sites non spécifiques sont saturés par incubation dans un tampon PBS sans Ca/Mg (ICN Biomedicals) additionné de 0,1% de triton-X-100 et 10% de BSA (Albumine Bovine fraction V, MP Biomedicals) pendant 1h à 37 C en chambre humide.

Les coupes sont ensuite incubées en présence de l'anticorps primaire spécifique (anti-GLUT-1, rabbit, Santa Cruz, 1/100 ; Ac anti-GLUT-2, rabbit, Santa Cruz, 1/100) dilué dans du PBS/BSA 1%/0,01% Triton-X-100) pendant 1h à 37 C en chambre humide. Après lavages dans le PBS, les coupes sont incubées en présence de l'anticorps secondaire anti-rabbit-Alexa Fluor 598 (Molecular Probe, 1/800, PBS/1% BSA/0,01% Triton-X-100) pendant 1h à 37 C en chambre humide. Les noyaux sont marqués par une incubation de 10 min avec du Hoescht (1/1000, PBS/BSA 1%/0,01% Triton-X-100). Les coupes sont à nouveau lavées dans le PBS, montées et observées au microscope à fluorescence.

Analyse, par Western blot, de l'expression des GLUTs dans des kératinocytes en culture. Les kératinocytes sont cultivés selon le protocole décrit en examplel. Les kératinocytes en prolifération sont prélevés à 1 jour de culture autocrine. Les kératinocytes en différenciation sont prélevés à 6 jours de culture autocrine. Pour la détection de GLUT-1, les kératinocytes sont lysés dans un tampon triton (Hepes 20 mM, pH 7.6, NaF 20 mM, KCI 30 mM, EDTA 1 mM, inhibiteurs de protéases et phosphatases, triton 1%). Pour la détection de GLUT-2, les kératinocytes sont lysés dans un tampon SDS (Tris 62,5 mM, pH 7.5, SDS 1%). Les protéines (15 g/piste) sont séparées par gel SDS-Page 10% et transférées sur membrane de PVDF. Saturation des sites pendant 1h dans du TBS/Tween 0,1%/lait 5%.

L'anticorps primaire est incubé pendant l h dans le tampon de saturation (Anti-Glucose Transporter-1, Human (rabbit) Calbiochem, réf 400060, 1/1000 ; Anti-Glucose Transporter-2, rat (rabbit) Calbiochem, réf 400061, 1/1000). L'anticorps secondaire est incubé pendant 1 h (anticorps anti-rabbit/peroxydase Sigma A-0545, 1/20000) dans du TBS/Tween 0,1%. Utilisation du kit ECL (Roche) pour la révélation.

L'expression des transporteurs GLUT-1 et GLUT-2, observée sur coupes d'épiderme varie en fonction de la localisation épidermique : GLUT-1 est exprimée surtout dans les cellules en prolifération û la couche basale -alors que GLUT-2 est exprimée préférentiellement dans les cellules en différenciation.

L'expression préférentielle du GLUT-1 en phase de prolifération et du GLUT-2 en phase de différenciation est également observée par technique des Western Blots ou l'on observe une bande à 51 kDa correspondant au marquage par l'Anticorps anti-GLUT-1 pour les cellules en phase de prolifération. Cette bande n'est pas visible pour les cellules en différenciation.35 Les résultats sont présentés sur la figure 1 en annexe. GLUT-1 est visualisé dans les couches basales de l'épiderme et GLUT-2 dans les couches différenciées jusqu'au stratum corneum.

Exemple 3 : Effet du metformine sur le transport de glucose, l'expression de GLUT-1 et le processus de différenciation dans des kératinocytes. Les kératinocytes, au jour 1 de culture autocrine, sont traités pendant 2h30 avec des doses croissantes de metformine (0-10 mM). Le traceur radioactif ([2-3H]Glucose, 0.25 Ci/ml) est ajouté pendant les 50 dernières minutes de l'incubation. Après incubation, les milieux de culture sont tout d'abord déprotéinisé sur glace par de l'acide perchlorique (10% final). Après neutralisation par du KOH/KHCO3 3M/3M, les échantillons sont centrifugés (1000g, 10 min, 4 C). Le 3H2O est séparé du glucose radioactif par chromatographie sur colonne (résine échangeuse AGX8 sous forme borate). Les résultats sont exprimés en nmole de glucose détritié par heure et par pg de protéines.

Les résultats sont présentés sur la figure 2 en annexe. La metformine augmente, d'une façon dose dépendante, le transport de glucose dans des kératinocytes. Cette augmentation est liée à une augmentation de l'expression de GLUT-1.

Effet activateur de la metformine sur l'expression de GLUT-1 dans des kératinocytes. Les kératinocytes sont traités avec soit le metformine (2 mM) soit l'EGF (10 ng/ml) soit l'insuline (5 g/ml) à partir du jour 3 de culture autocrine (95% de confluence) et pendant 72 h (renouvellement du traitement après 48 h de traitement). Les ARN sont extraits au moyen du kit High Pure RNA isolation kit (Roche) selon les indications du fournisseur. L'ARN (1 g/condition) est rétro-transcrit pendant 2 h à 37 C. L'ADNc correspondant aux ARN codant pour GLUT-1 est amplifié au moyen d'amorces spécifiques pendant 25 cycles. Les PCR quantitatives sont réalisées avec le Platinium SYBR Green (Invitrogen) sur un MyIQ thermal cycler (Bio-Rad) selon les indications du fournisseur. L'amplification de 36B4 est utilisés comme contrôle interne.

Une augmentation de l'expression de GLUT-1 dans des kératinocytes est observée pour le metformine. Les résultats sont présentés sur figure 3 en annexe.

Effet de la modification du flux glvcolvtique sur la différenciation des kératinocytes. 18

Les kératinocytes sont traités avec la metformine 2 mM à partir du jour 3 de culture autocrine (95% de confluence) et pendant 72 h (renouvellement du traitement après 48 h de traitement). Les ARN sont extraits au moyen du kit High Pure RNA isolation kit (Roche) selon les indications du fournisseur. L'ARN (1 g/condition) est rétro-transcrit pendant 2 h à 37 C. L'ADNc correspondant aux ARN codant pour la kératine 10, l'involucrine, la loricrine et la transglutaminase 1 sont amplifiés au moyen d'amorces spécifiques pendant 25 cycles. Les PCR quantitatives sont réalisées avec le Platinium SYBR Green (Invitrogen) sur un MyIQ thermal cycler (Bio-Rad) selon les indications du fournisseur. L'amplification de 36B4 est utilisés comme contrôle interne.

La metformine, qui augmente le transport du glucose, inhibe de façon importante, les processus de différenciation. Il existe donc une corrélation étroite entre glycolyse et prolifération/différenciation. Les résultats sont présentés sur la figure 4 en annexe.

Claims (12)

Revendications

1- Utilisation dans une composition contenant un milieu physiologiquement acceptable, d'au moins un composé inducteur de glycolyse épidermique, à l'exclusion de l'IGF-1 (Insulin Growth Factor de type 1) comme agent pour diminuer et/ou retarder les signes du vieillissement de la peau et/ou de ses annexes.

2- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon la revendication 1 10 comme agent pour limiter la différenciation des cellules épidermiques.

3- Utilisation selon l'une au moins des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le composé inducteur de glycolyse est un activateur des peptides transporteurs du glucose (GLUT)

4- Utilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'au moins un composé activateur de GLUT est choisi dans le groupe comprenant les agents stimulant la synthèse de GLUT et les agents augmentant son activité intrinsèque. 20

5- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un activateur de GLUT-1, GLUT-2 et/ou GLUT-3.

6- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une quelconque 25 des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'au moins un composé est choisi parmi la metformine, la phenformine, la buformine, le proguanil, l'insuline, les inhibiteurs de protéines phosphatase comme le vanadate, l'acide okadaique, le dibutyryl AMPc et le TGF-13. 30

7- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ce composé est identifié par le procédé comprenant les étapes suivantes: a) Mise en culture de kératinocytes 35 b) ajout du composé à tester dans le milieu de culture.20 c) Comparaison du niveau de glycolyse dans les kératinocytes en en présence du composé à tester avec le taux de glycolyse dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester d) Sélection du composé qui provoque une augmentation d'au moins 30% du taux de glycolyse

8- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ce composé est identifié par le procédé comprenant les étapes suivantes: i) mise en culture de kératinocytes ii) ajout du composé à tester dans le milieu de culture iii) comparaison du niveau d'expression du GLUT-1 dans les kératinocytes en présence du composé à tester avec le niveau d'expression dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester iv) sélection du composé qui augmente d'au moins 25 % l'expression de GLUT-1

9- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit composé est utilisé comme agent pour lutter contre les signes du vieillissement chronobiologique de l'épiderme.

10- Utilisation selon la revendication 9 caractérisée en ce que l'inducteur de glycolyse est destiné à prévenir ou diminuer les rides et les ridules, et/ou l'amincissement de la peau et/ou contre la peau molle et/ou flétrie.

11-Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit composé est utilisé comme agent pour diminuer et/ou prévenir la chute des cheveux, et /ou pour prévenir l'hétérogénéité du diamètre capillaire. 30

12- Utilisation d'au moins un composé inducteur de glycolyse tel que défini dans l'une des revendications 1 à 8, dans une composition contenant un milieu physiologiquement acceptable, caractérisée en ce que ledit composé est utilisé comme agent pour lutter contre la déshydratation cutanée et/ou la sécheresse de 35 l'épiderme.