FR2891924A1 - Dispositif et procede d'imagerie en luminescence - Google Patents

Abstract

Le dispositif d'imagerie en luminescence comprend : - une scène recevant un échantillon (2) émettant une information de luminescence,- une source de lumière (8) éclairant la scène,- une unité électronique de commande définissant des trames de temps,un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison de l'information de luminescence et de la réflexion de l'éclairage par l'échantillon.Au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9) acquiert à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE D'IMAGERIE EN LUMINESCENCE La présente invention est

relative aux dispositifs et aux procédés d'imagerie en luminescence.

Plus particulièrement, l'invention se rapporte principalement à un dispositif d'imagerie en luminescence comprenant : - une enceinte étanche à la lumière comprenant une scène adaptée pour recevoir un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon, - une source de lumière adaptée pour générer un éclairage incident en direction de la scène, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, - un dispositif de détection adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondants à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, - une unité électronique de commande adaptée pour définir une pluralité de trames de temps, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage de la deuxième image, ladite unité électronique de commande étant également adaptée pour commander à la source de lumière de générer l'éclairage incident au cours de chaque trame de temps, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant au dispositif de détection pendant chaque trame de temps. Le document WO 01/37,195 décrit un exemple d'un tel dispositif. Ce dispositif dispose d'un mode live pour prendre une pluralité de représentations photographiques de l'échantillon. Puis, lorsque l'échantillon émet une lumière suite à une réaction chimique prenant place à l'intérieur de l'échantillon (phénomène de luminescence), ce dispositif peut prendre des images en luminescence de l'échantillon, détectant ainsi la quantité de lumière émise par l'échantillon due aux réactions chimiques en question. Toutefois, ce dispositif ne permet pas de suivre l'évolution temporelle rapide de l'information relative à la luminescence. Si l'échantillon se déplace pendant la mesure, (en particulier s'il est nécessaire que l'échantillon se déplace pendant la mesure, parce que la mesure correspond à une activité musculaire qui ne peut être enregistrée pour un échantillon anesthésié), une telle installation ne sera pas adaptée. La présente invention a notamment pour but de fournir un dispositif permettant de pallier ces inconvénients. A cet effet, selon l'invention, un dispositif du genre en question est caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de séparation adaptés pour qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux. Grâce à ces dispositions, on acquière simultanément, à l'échelle de la trame de temps vidéo, une information correspondant à une représentation cinématographique de l'échantillon, et une information relative à la luminescence de l'échantillon.

Dans certains modes de réalisation de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou à l'autre des dispositions suivantes : - le dispositif de détection présente une pluralité de pixels adaptés chacun pour détecter des signaux lumineux en provenance d'une région donnée respective de l'enceinte ; - le dispositif de détection est adapté pour stocker la première image selon un premier échantillonnage de trames de temps et pour stocker la deuxième image selon un deuxième échantillonnage de trames de temps, le premier échantillonnage présentant une fréquence différente de celle du deuxième échantillonnage ; - la fréquence du premier échantillonnage est plus 15 basse que celle du deuxième échantillonnage ; - le deuxième signal lumineux comporte un signal lumineux relatif à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et un signal lumineux d'autofluorescence de l'échantillon 20 soumis audit éclairage incident, et le dispositif d'imagerie est adapté pour séparer les signaux lumineux présentant un spectre de luminescence des signaux lumineux d'autofluorescence et relatifs à la réflexion; - le dispositif de détection comporte : 25 - un premier détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux portant une information de luminescence, et - un deuxième détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière 30 incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon ; - les moyens de séparation comprennent un filtre disposé en entrée du premier détecteur, ledit filtre étant adapté pour empêcher des signaux lumineux correspondant à 35 la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon d'être acquis par le premier détecteur ; - les moyens de séparation comprennent en outre une lame séparatrice adaptée pour transmettre au premier détecteur le premier signal lumineux, et pour transmettre au deuxième détecteur le deuxième signal lumineux ; - les premier et deuxième détecteurs sont décalés angulairement l'un par rapport à l'autre, et reçoivent chacun directement le signal lumineux combiné, le dispositif d'imagerie comprenant de plus une unité de reconstruction adaptée pour associer les première et deuxième données à un référentiel lié à l'enceinte ; - la source lumineuse émet en continu, et le signal lumineux combiné est une combinaison spectrale des premier et deuxième signaux lumineux ; - le premier signal lumineux présente un spectre distribué entre une longueur d'onde minimale et une longueur d'onde maximale, et la source lumineuse émet un éclairage incident distribué sensiblement audelà de ladite longueur d'onde maximale ; - les moyens de séparation comprennent un séquenceur adapté pour que l'unité de commande commande à la source lumineuse de générer de manière pulsée ledit éclairage incident, chaque trame de temps présentant un instant clair, pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, le séquenceur étant adapté pour commander au premier détecteur d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, et d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair ; - une unité de traitement adaptée pour rapporter 35 l'information de luminescence dans un référentiel lié à l'échantillon. Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'imagerie en luminescence comprenant les étapes suivantes . disposant d'une enceinte étanche à la lumière comprenant une scène comportant un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon, (a)une unité électronique de commande définit une 10 pluralité de trames de temps, et commande à une source de lumière de générer un éclairage incident en direction de la scène au cours de chaque trame de temps, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, 15 un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant à un dispositif de détection pendant chaque trame de temps, (b)on sépare le signal lumineux combiné de sorte 20 qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection, qui est adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre 25 part pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident 30 provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au 35 stockage d'une deuxième image. 5 Dans certains modes de réalisation de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou l'autre des dispositions suivantes : - au cours de l'étape (a), chaque trame de temps est divisée en un temps clair pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, et, au cours de l'étape (b), on commande à un premier détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair, et à un deuxième détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident sur l'échantillon d'être dans un état de détection au moins pendant l'instant clair ; - au cours de l'étape (b), un premier détecteur détecte le premier signal lumineux portant l'information de luminescence, et un deuxième détecteur détecte le signal lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, en empêchant des signaux lumineux correspondants à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon de parvenir au premier détecteur ; le dispositif de détection comporte une pluralité de pixels, et au cours de chaque trame de temps, on associe les première et deuxième données à une coordonnée d'une région de l'enceinte ; - pour chaque trame de temps, on rapporte les premières données dans un référentiel lié à l'échantillon ; - avant l'étape (a), on déclenche une réaction chimique à l'intérieur de l'échantillon, ladite réaction chimique générant le premier signal lumineux, et après l'étape (b), on extrait une information relative à la réaction chimique à partir des première et deuxième données ; - avant l'étape (a) . - on illumine au moins une molécule adaptée pour émettre un signal de phosphorescence suite à son illumination, et - on introduit à l'intérieur de l'échantillon la 10 molécule illuminée, le premier signal lumineux correspondant à l'émission de lumière par la molécule depuis l'intérieur de l'échantillon. D'autres caractéristiques et avantages de 15 l'invention apparaîtront au cours de la description suivante d'une de ses formes de réalisation, donnée à titre d'exemple non limitatif, en regard des dessins joints. Sur les dessins : - la figure 1 est une vue schématique en 20 perspective d'un dispositif d'imagerie, - la figure 2 est une vue plane schématique de l'intérieur de l'enceinte du dispositif de la figure 1 selon un premier mode de réalisation, - la figure 3 est un schéma synoptique d'un 25 exemple de traitement des données, - la figure 4 est un schéma présentant un exemple de traitement effectué par l'unité de traitement de la figure 3, - les figures 5a, 5b et 5c sont des graphiques 30 montrant les états de la source de lumière, du deuxième et du premier détecteur, respectivement, selon une variante de réalisation de l'invention, et - la figure 6 est une vue correspondant à la figure 2 pour un deuxième mode de réalisation de 35 l'invention.

Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires. La figure 1 représente schématiquement un dispositif d'imagerie 1 destiné à prendre une image d'un échantillon 2 et un écran de visualisation 3 comprenant un affichage 4 présentant une image de l'échantillon 2. Le dispositif d'imagerie décrit ici est un dispositif d'imagerie en luminescence, par exemple en bioluminescence, c'est-à-dire destiné à prendre une image d'un échantillon 2, tel qu'en particulier un petit animal de laboratoire émettant une lumière depuis l'intérieur de son corps. Cette lumière est par exemple produite suite à une réaction chimique à l'intérieur du corps du petit animal.

Pour obtenir cette réaction chimique, on peut par exemple disposer préalablement d'un petit animal de laboratoire modifié génétiquement pour comprendre un gène codant pour une protéine qui présente la particularité d'émettre de la lumière lorsqu'elle réagit chimiquement avec une entité chimique complémentaire donnée, telle qu'une molécule, un atome ou un ion. Avant d'avoir placé le petit animal de laboratoire 2 dans le dispositif d'imagerie 1, on fournit à celui-ci, par exemple par inoculation, ladite molécule complémentaire et, éventuellement, on laisse le temps à celle-ci d'atteindre le possible site de réaction avec la protéine. La quantité de lumière dégagée localement par la réaction chimique est un facteur de la quantité de la protéine produite, et permet donc de mesurer localement le niveau d'expression du gène. En particulier, si on souhaite vérifier que le gène en question s'exprime particulièrement en réponse à un évènement donné, on pourra mettre en oeuvre la mesure explicitée ci-après d'une part pour un petit animal de laboratoire 2 pour lequel on a déclenché l'évènement, et d'autre part pour un petit animal de laboratoire 2 pour lequel on n'a pas déclenché l'évènement, afin de comparer les signaux émis par ces deux animaux. Alternativement, l'expérience en question peut par exemple consister en la mesure de l'activité musculaire générée par un évènement chez un animal de laboratoire, par la détection de la quantité de lumière émise par le couple substrat-photoprotéine coelentherazine-Aequorin qui réagit avec une entité chimique complémentaire donnée. L'entité en question est par exemple le calcium arrivant en la proximité de la photoprotéine au niveau des axones. De tels évènements ayant une signature temporelle très rapide, il est utile de pouvoir obtenir rapidement une information relative au taux de réaction.

Le dispositif ici décrit peut également être utilisé pour mettre en oeuvre un procédé d'imagerie par phosphorescence ou luminescence retardée. Lors d'un tel procédé, une molécule adaptée pour émettre de la lumière pendant un temps suffisamment long, de l'ordre de quelques minutes, par phosphorescence, est illuminée ex-vivo pour déclencher cette phosphorescence. La molécule est alors introduite à l'intérieur du petit animal de laboratoire et peut être utilisée comme traceur lumineux. La concentration de la molécule dans un emplacement de l'organisme, par exemple parce qu'une certaine réaction a lieu à cet emplacement, et que la molécule en question participe à cette réaction, est détectable par le dispositif décrit ci-après et permet de caractériser quantitativement ou qualitativement la réaction en question. Comme représenté sur les figures 1 et 2, le petit animal de laboratoire 2 est placé dans une enceinte 5 étanche à la lumière par exemple par la fermeture d'une porte 6 ou autre. L'enceinte comporte, comme représenté sur la figure 2, une scène 7, formant par exemple le plancher de l'enceinte, sur laquelle est disposé le petit animal de laboratoire 2, et une source de lumière 8 générant un éclairage incident en direction de la scène 7 (par exemple transmis par une fibre optique).

Du fait de la réaction décrite ci-dessus, le petit animal de laboratoire 2 émet naturellement un premier signal lumineux qui porte une information de luminescence du petit animal. De plus, du fait de l'éclairage généré par la source de lumière 8, un deuxième signal lumineux, correspondant sensiblement à la réflexion par le petit animal de laboratoire 2 de l'éclairage incident 8 est également émis dans l'enceinte 5. Ce deuxième signal lumineux peut également comporter une partie correspondant à l'auto-fluorescence de l'échantillon 2 du fait de l'éclairage par la source de lumière 8. Ces premier et deuxième signaux lumineux se combinent pour former un signal lumineux combiné arrivant à un dispositif de détection 9 représenté entouré en pointillé sur la figure 2.

Dans le premier mode de réalisation présenté en relation avec la figure 2, le dispositif de détection comporte un premier détecteur 10 adapté pour détecter des signaux lumineux provenant de l'échantillon 2 présentant un spectre de luminescence. Un tel premier détecteur 10 est par exemple une caméra CCD refroidie présentant une matrice de pixels disposés en rangées et en colonnes, un ICCD, un EMCCD (CCD à multiplication interne) ou autre. Le dispositif de détection 9 comporte également un deuxième détecteur 11, qui est par exemple une caméra CCD classique ou intensifiée présentant un grand nombre de pixels disposés en colonnes et en rangées. Dans l'exemple présenté sur la figure 2, les premier et deuxième détecteurs 10, 11 sont disposés chacun sur une face distincte de l'enceinte 5.

Dans l'exemple présenté, la source de lumière 8 émet en continu un éclairage incident en direction de la scène de sorte que le signal lumineux combiné correspond à une combinaison spectrale des premier (portant l'information de luminescence) et deuxième signaux lumineux. Le signal lumineux combiné est séparé par une lame séparatrice 12, qui sépare les signaux sur la base de leur longueur d'onde. Une telle lame séparatrice est par exemple un miroir dichroïque ou miroir de type hot mirror séparant le visible de l'infra-rouge. Le signal lumineux portant l'information de luminescence est sensiblement intégralement transmis en direction du premier détecteur 10, alors que le deuxième signal lumineux est quasiment intégralement transmis au deuxième détecteur 11. Pour être sûr que seul le signal portant l'information de luminescence parvient au premier détecteur 10, on peut également disposer un filtre 13 en entrée du premier détecteur 10, adapté pour empêcher aux longueurs d'onde ne correspondant pas à ce signal d'atteindre le premier détecteur 10.

En pratique, pour être certain que le signal parvenant au premier détecteur 10 ne corresponde qu'à la luminescence depuis l'intérieur de l'échantillon 2, on fait en sorte que le signal d'auto-fluorescence émis par l'échantillon 2 sous l'effet de la source de lumière 8 présente une longueur d'onde différente du signal en question. A cet effet, on pourra choisir de travailler avec une source de lumière 8 qui émet un éclairage incident présentant un spectre adapté, distribué au-delà de la gamme des longueurs d'onde émises par luminescence. Par exemple, on peut utiliser un éclairage infra rouge centré sur une longueur d'onde sensiblement égale à 800 nm quand le spectre de luminescence présente une longueur d'onde maximale de 700 nm ou moins. Comme représenté sur la figure 3, on dispose une 35 unité électronique de commande 14 qui définit une pluralité de trame de temps durant chacune quelques millisecondes, correspondant sensiblement au temps nécessaire pour acquérir et stocker une représentation cinématographique de la scène 7 à l'aide du deuxième détecteur 11. Cette représentation cinématographique comprend une pluralité de couples de données coordonnées, propriété lumineuse (intensité, ...) . On pourra régler ces trames de temps comme ayant une durée déterminée par l'utilisateur, si celui-ci souhaite un taux d'acquisition donné, tel que 24 images par seconde, par exemple ou autre. Au début de chaque trame de temps, le signal précédemment produit dans le deuxième détecteur 11 est lu et stocké dans une deuxième mémoire 21, ainsi qu'une information de coordonnée relative à chaque pixel et une nouvelle acquisition débute au niveau du deuxième détecteur 11. De manière similaire, au début de chaque trame de temps, le signal produit par le premier détecteur 10 est stocké dans une première mémoire 20 ainsi qu'une information de coordonnée relative à chaque pixel. Une unité de traitement 15 est adaptée pour lire les données stockées dans les première et deuxième mémoire 20, 21, pour les stocker et/ou pour afficher sur l'écran 4 les images correspondantes. Toutefois, il peut survenir qu'il soit préférable de ne pas lire les données mesurées au niveau du premier détecteur 10 pour chaque trame de temps, mais plutôt toutes les n trames de temps, n étant strictement supérieur à 1, afin de laisser s'accumuler au niveau du premier détecteur 10 un signal suffisamment intense pour pouvoir être détecté. Par exemple, on ne déclenchera la lecture du premier détecteur 10 que toutes les 0,3 secondes environ, ce qui reste un temps relativement faible au niveau de la dynamique des phénomènes observés. Dans ce cas, on peut par exemple prévoir que l'unité de traitement 15 soit adaptée pour recalculer pour chaque représentation photographique acquise par le deuxième détecteur 11 une valeur significative de l'information de luminescence pour chacune de ces représentations, par exemple de la manière représentée schématiquement sur la figure 4.

Sur la figure 4, on a représenté en haut quatre images de l'échantillon 2 acquises successivement par le deuxième détecteur 11, à des temps successifs Tl, T2, T3 et T4. Comme cela est représenté grossièrement sur la figure 4, l'échantillon 2 peut s'être déplacé vers l'avant de l'instant Tl à l'instant T4, d'un déplacement D donné, qui est volontairement exagéré sur la figure 4 à des fins explicatives. Sur chaque image de l'échantillon 2 obtenue par le deuxième détecteur 11, on superpose une image portant une information de luminescence obtenue par le premier détecteur 10, représentée par la référence 16. Du fait que, du temps Tl au temps T4, une seule acquisition a été faite au niveau du premier détecteur 10, on obtient pour ces quatre instants du haut de la figure 4, une même image 16, qui apparaît floue, car elle correspond à une zone émettrice de l'échantillon 2 qui s'est déplacée entre les instants Tl et T4, du fait du déplacement de l'échantillon lui-même. Une fois enregistrées les quatre images provenant du deuxième détecteur 11 pour les quatre instants Tl, T2, T3 et T4, et l'image provenant du premier détecteur 10 pour l'instant durant entre Tl et T4, l'unité de traitement 15 peut calculer, à partir des quatre représentations photographiques fournies par le deuxième détecteur 11 la localisation, représentée en 16' sur les représentations photographiques de la figure 4, de la zone de l'échantillon 2 émettant l'information de luminescence. Il s'agit par exemple d'extraire des quatre représentations photographiques fournies par le deuxième détecteur 11, le champ de déplacement auquel a été soumis l'échantillon 2, par exemple par reconnaissance de forme sur les représentations photographiques. Puis, on applique à l'image obtenue par le premier détecteur 10 un traitement permettant d'obtenir, à partir de cette image unique, quatre images probables identiques correspondant à chacun des instants Tl, T2, T3 et T4. Puis, les quatre images probables identiques de luminescence sont superposées aux quatre représentations photographiques du deuxième détecteur 11 pour fournir la succession d'images représentées sur le bas de la figure 4. Le mode de réalisation présenté en relation avec la figure 2 implique une certaine contrainte au niveau de la source de lumière 8, car il faut que celle-ci éclaire l'échantillon 2 dans une gamme de longueur d'ondes telle que l'auto-fluorescence de l'échantillon 2 du fait de cet éclairage présente un spectre éloigné du spectre d'émission en luminescence de l'échantillon 2. Dans une variante de réalisation, explicitée ci-après en relation avec les figures 5a et 5c, on peut également mettre en oeuvre un éclairage pulsé de l'ordre de la fréquence vidéo. Un tel éclairage est par exemple fourni depuis une diode laser, ou autre. Dans cette variante de réalisation, l'unité électronique de commande comporte un séquenceur 17 qui commande à la source de lumière 8 de générer l'éclairage incident pendant un temps clair tc de la trame de temps T. Cet éclairage incident est par exemple synchronisé avec l'acquisition du détecteur du signal de luminescence. On notera que dans le mode de réalisation présenté précédemment, l'unité électronique de commande commande à la source de lumière de générer l'éclairage incident en continu, et par conséquent au cours de chaque trame de temps. Dans la présente variante, au cours du temps clair tc, par exemple situé en début de trame T, un éclairage incident est émis en direction de la scène, de sorte qu'un signal lumineux comprenant principalement une réflexion de l'éclairage incident par l'échantillon 2 parvient au dispositif de détection 9. Comme représenté sur la figure 5c, le premier détecteur 10 est alors aveuglé, de sorte que celui-ci ne peut détecter aucun signal. Pour obturer le premier détecteur 10, on a par exemple recours à un obturateur mécanique situé en entrée du premier détecteur 10, ou on a recours à une obturation électrique obtenue par exemple par une inversion de tension exercée aux bornes du premier détecteur. Puis, au bout du temps to, l'unité électronique de commande commande de couper l'éclairage incident, de sorte que quelques instants après t,, seule la luminescence provenant de l'échantillon 2 est détectable dans l'enceinte 5. Au cours de cet instant obscur to, le premier détecteur 10 est à nouveau dans l'état de détection, et détecte le signal lumineux portant l'information de luminescence en provenance de l'échantillon 2. Au cours d'une trame de temps, dans cette variante de réalisation, le signal lumineux combiné correspond donc sensiblement à une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux, le premier signal lumineux (luminescent) étant majoritaire pendant le temps obscur, et le deuxième signal lumineux, correspondant à la représentation photographique de l'échantillon, étant majoritaire pendant l'instant clair tc. On notera que, du fait du niveau respectif des signaux, le fait que, pendant toute la trame de temps, l'échantillon 2 émette également un signal portant l'information de luminescence n'a pas d'influence sur le signal détecté par le deuxième détecteur 11. Celui-ci peut d'ailleurs rester en mode d'acquisition pendant le temps obscur to, comme représenté sur la figure 5b, sans influence notable sur la mesure effectuée par ce détecteur. Pour la source lumineuse 8, dans la variante de réalisation qui vient d'être présentée, on pourra utiliser également une source lumineuse 2 de spectre ciblé sur 800 nanomètres, comme dans le premier mode de réalisation. Toutefois, on peut s'affranchir de cette contrainte en faisant en sorte que la détection par les détecteurs 10 ne se produise qu'une fois que le signal d'auto-fluorescence émis par l'échantillon 2 (même présentant un spectre superposé à celui du signal de luminescence) est dissipé dans l'enceinte 5. La figure 6 présente maintenant un deuxième mode de réalisation de l'invention, qui s'applique aussi bien au cas d'une source lumineuse continue qu'au cas d'une source lumineuse pulsée telles que présentées précédemment en relation avec les figures 1 à 5c. Dans ce deuxième mode de réalisation, on n'utilise pas nécessairement une lame séparatrice 12, et la séparation du signal lumineux combiné est effectué intégralement par lefiltre 13. Toutefois, du fait du décalage spatial des informations détectées par les premier et deuxième détecteurs 10 et 11, on prévoit qu'une unité de reconstruction de l'unité de traitement 15 ait été préalablement calibrée pour rapporter les images obtenues par ces deux détecteurs dans un référentiel commun, qui peut être un référentiel lié à l'un ou à l'autre de ces détecteurs, ou un autre référentiel.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Dispositif d'imagerie en luminescence comprenant : - une enceinte (5) étanche à la lumière comprenant une scène adaptée pour recevoir un échantillon à imager (2) émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon, une source de lumière (8) adaptée pour générer un éclairage incident en direction de la scène, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, - un dispositif de détection (9) adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondants à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, une unité électronique de commande (14) adaptée pour définir une pluralité de trames de temps, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage de la deuxième image, ladite unité électronique de commande (14) étant également adaptée pour commander à la source de lumière de générer l'éclairage incident au cours de chaque trame de temps, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant au dispositif de détection pendant chaque trame de temps,caractérisé en ce que le dispositif d'imagerie en luminescence comprend des moyens de séparation (12, 13 ; 17, 13) adaptés pour qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9) acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux.

2. Dispositif d'imagerie selon la revendication 1, dans lequel le dispositif de détection (9) présente une pluralité de pixels adaptés chacun pour détecter des signaux lumineux en provenance d'une région donnée respective de l'enceinte.

3. Dispositif d'imagerie selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel le dispositif de détection est adapté pour stocker la première image selon un premier échantillonnage de trames de temps et pour stocker la deuxième image selon un deuxième échantillonnage de trames de temps, le premier échantillonnage présentant une fréquence différente de celle du deuxième échantillonnage.

4. Dispositif d'imagerie selon la revendication 3 dans lequel la fréquence du premier échantillonnage est plus basse que celle du deuxième échantillonnage.

5. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième signal lumineux comporte un signal lumineux relatif à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon (2), et un signal lumineux d'autofluorescence de l'échantillon (2) soumis audit éclairage incident, et dans lequel le dispositif d'imagerie est adapté pour séparer les signaux lumineux présentant un spectre de luminescence des signaux lumineux d'autofluorescence et relatifs à la réflexion.

6. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif de 35 détection comporte :- un premier détecteur (10) adapté pour détecter des signaux lumineux portant une information de luminescence, et - un deuxième détecteur (11) adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon.

7. Dispositif d'imagerie selon la revendication 6, dans lequel les moyens de séparation comprennent un filtre (13) disposé en entrée du premier détecteur, ledit filtre étant adapté pour empêcher des signaux lumineux correspondants à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon d'être acquis par le premier détecteur.

8. Dispositif d'imagerie selon la revendication 7, dans lequel les moyens de séparation comprennent en outre une lame séparatrice(12) adaptée pour transmettre au premier détecteur le premier signal lumineux, et pour transmettre au deuxième détecteur le deuxième signal lumineux.

9. Dispositif d'imagerie selon la revendication 7, dans lequel les premier (10) et deuxième (11) détecteurs sont décalés angulairement l'un par rapport à l'autre, et reçoivent chacun directement le signal lumineux combiné, le dispositif d'imagerie comprenant de plus une unité de reconstruction adaptée pour associer les première et deuxième données à un référentiel lié à l'enceinte (5).

10.Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel la source lumineuse (8) émet en continu, et dans lequel le signal lumineux combiné est une combinaison spectrale des premier et deuxième signaux lumineux.

11.Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel le premier signal lumineux présente un spectre distribué entre une longueurd'onde minimale et une longueur d'onde maximale, et dans lequel la source lumineuse (8) émet un éclairage incident distribué sensiblement au-delà de ladite longueur d'onde maximale.

12.Dispositif d'imagerie selon la revendication 6 dans lequel les moyens de séparation comprennent un séquenceur (17) adapté pour que l'unité de commande commande à la source lumineuse de générer de manière pulsée ledit éclairage incident, chaque trame de temps présentant un instant clair, pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, le séquenceur étant adapté pour commander au premier détecteur (10) d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, et d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair.

13.Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une unité de traitement (15) adaptée pour rapporter l'information de luminescence dans un référentiel lié à l'échantillon.

14.Procédé d'imagerie en luminescence comprenant les étapes suivantes : disposant d'une enceinte (5) étanche à la lumière comprenant une scène comportant un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon, (a)une unité électronique de commande (14) définit une pluralité de trames de temps, et commande à une source de lumière (8) de générer un éclairage incident en direction de la scène au cours de chaque trame de temps, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, un signal lumineux combiné correspondant à unecombinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant à un dispositif de détection pendant chaque trame de temps, (b)on sépare le signal lumineux combiné de sorte qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9), qui est adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage d'une deuxième image.

15.Procédé d'imagerie selon la revendication 14, dans lequel, au cours de l'étape (a), chaque trame de temps est divisée en un temps clair pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, et, au cours de l'étape (b), on commande à un premier détecteur (10) adapté pour détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair, et à un deuxième détecteur (11) adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident sur l'échantillon d'être dans un état de détectionau moins pendant l'instant clair.

16.Procédé d'imagerie selon la revendication 14, dans lequel, au cours de l'étape (b), un premier détecteur (10) détecte le premier signal lumineux portant l'information de luminescence, et un deuxième détecteur (11) détecte le signal lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, en empêchant des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon de parvenir au premier détecteur (10).

17.Procédé d'imagerie selon l'une des revendications 14 à 16, dans lequel, le dispositif de détection (9) comporte une pluralité de pixels, et dans lequel, au cours de chaque trame de temps, on associe les première et deuxième données à une coordonnée d'une région de l'enceinte.

18.Procédé d'imagerie selon la revendication 17, dans lequel pour chaque trame de temps, on rapporte les 20 premières données dans un référentiel lié à l'échantillon (2).

19.Procédé d'imagerie selon l'une des revendications 14 à 18 dans lequel, avant l'étape (a), on déclenche une réaction chimique à l'intérieur de 25 l'échantillon (2), ladite réaction chimique générant le premier signal lumineux, et dans lequel, après l'étape (b), on extrait une information relative à la réaction chimique à partir des première et deuxième données.

20.Procédé d'imagerie selon la revendication 17 ou 30 18 dans lequel, avant l'étape (a) . - on illumine au moins une molécule adaptée pour émettre un signal de phosphorescence suite à son illumination, et - on introduit à l'intérieur de l'échantillon la 35 molécule illuminée,le premier signal lumineux correspondant à l'émission de lumière par la molécule depuis l'intérieur de l'échantillon.