EP1934583A1 - Dispositif et procede d'imagerie en luminescence - Google Patents

Dispositif et procede d'imagerie en luminescence

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EP1934583A1
EP1934583A1 EP06820149A EP06820149A EP1934583A1 EP 1934583 A1 EP1934583 A1 EP 1934583A1 EP 06820149 A EP06820149 A EP 06820149A EP 06820149 A EP06820149 A EP 06820149A EP 1934583 A1 EP1934583 A1 EP 1934583A1
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EP
European Patent Office
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light
sample
signal
luminescence
during
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06820149A
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German (de)
English (en)
Inventor
Serge Maitrejean
Pascal Asselin
Emilie Roncali
Bertrand Tavitian
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Biospace Lab
Original Assignee
Biospace Lab
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Filing date
Publication date
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Application filed by Biospace Lab filed Critical Biospace Lab
Publication of EP1934583A1 publication Critical patent/EP1934583A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6491—Measuring fluorescence and transmission; Correcting inner filter effect
    • G01N2021/6493—Measuring fluorescence and transmission; Correcting inner filter effect by alternating fluorescence/transmission or fluorescence/reflection
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    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Definitions

  • the present invention relates to luminescence imaging devices and methods. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • the invention relates principally to a luminescence imaging device comprising: a light-tight enclosure comprising a scene adapted to receive a sample to be imaged emitting a first light signal carrying a. luminescence information of the sample, a light source " adapted to generate incident light in the direction of the scene, the interaction of said incident light and the sample forming a second light signal, a detection device adapted to one detects light signals having a luminescence spectrum, and for storing a first image on the basis of light signals having a luminescence spectrum, and secondly for detecting light signals corresponding to the reflection of incident light from of said light source on the sample, and for storing a second image on the basis of the light signals corresponding to the reflection of incident light from said light source on the sample, an electronic control unit adapted to define a plurality of time frames, each time frame during a time corresponding to the acquisition and the tockage the second image, said electronic control unit being also adapted to control the light source to generate the incident illumination during each time frame,
  • the document WO 01/37, 1955 describes an example of such a device.
  • This device has a "live" mode for taking a plurality of photographic representations of the sample. Then, when the sample emits light due to a chemical reaction taking place inside the sample (luminescence phenomenon), this device can take luminescence images of the sample, thus detecting the amount of light emitted by the sample due to the chemical reactions in question.
  • this device does not make it possible to follow the rapid temporal evolution of the information relating to the luminescence. If the sample moves during measurement, (especially if it is necessary for the sample to move during the measurement, because the measurement corresponds to muscle activity that can not be recorded for an anesthetized sample), such installation will not be suitable.
  • the present invention is intended to provide a device for overcoming these disadvantages.
  • a device of the kind in question is characterized in that it comprises separation means adapted so that during each time frame, the detection device acquires both a first data relating to the luminescence information and a second data relating to the second light signal.
  • the detection device has a plurality of pixels each adapted to detect light signals coming from a given region of the enclosure; the detection device is adapted to store the first image according to a first sampling of time frames and to store the second image according to a second sampling of time frames, the first sampling having a frequency different from that of the second sampling; the frequency of the first sampling is lower than that of the second sampling; the second light signal comprises a light signal relating to the reflection of incident light from said light source on the sample, and a light signal of autofluorescence of the sample subjected to said incident light, and the imaging device; is adapted to separate the light signals having a luminescence spectrum from the autofluorescence and reflection light signals; the detection device comprises: a first detector adapted to detect light signals carrying a luminescence information, and - a second detector adapted to detect light signals corresponding to the reflection of incident light from said light source on the sample ; the separation means comprise a filter arranged at the input
  • the invention relates to a luminescence imaging method comprising the following steps: having a light-tight enclosure comprising a scene comprising a sample to be imaged emitting a first light signal carrying a luminescence information of the sample,
  • an electronic control unit defines a plurality of time frames, and controls a light source to generate incident light in the direction of the scene during each time frame, the interaction of said incident light and sample forming a second light signal, a combined light signal corresponding to a combination of the first and second light signals arriving at a detection device during each time frame,
  • the detection device which is adapted for firstly detecting light signals having a luminescence spectrum and for storing a first image on the base of the light signals having a luminescence spectrum, and secondly for detecting light signals corresponding to the reflection of incident light from said light source on the sample, and for storing a second image on the base light signals corresponding to the reflection of the incident light from said light source on the sample, acquires both a first data relating to the luminescence information and a second data relating to the second light signal, each frame of time during a time corresponding to the acquisition and storage of a second image.
  • each time frame is divided into a time light during which the light source emits, and a dark instant during which the light source does not emit, the combined light signal being a temporal combination of the first and second light signals, and, in step (b), controlling a first detector adapted to detect light signals having a luminescence spectrum from being in a detection state during the dark instant, from being in a state of non-detection during the clear state, and to a second detector adapted to detect light signals corresponding to the reflection of the incident light on the sample to be in a detection state at least during the clear moment; during step (b), a first detector detects the first light signal carrying the luminescence information, and a second detector detects the light signal corresponding to the reflection of incident light from said light source on the sample, preventing light signals corresponding to the reflection of incident light from said light source on the sample to reach the first detector; the detection device comprises a plurality of pixels, and during each
  • the invention relates to a luminescence imaging method comprising the following steps:
  • a sample to be imaged on a stage of a light-tight enclosure comprising an outer surface including an interior, the interior of said sample emitting, through the outer surface, a light signal in the chamber, the sample also emitting a second signal of a different nature of the light signal,
  • one or more of the following arrangements may be implemented: for each time frame, a luminescence image of the sample is formed directly by detection of the light signal, and for each time frame, a cinematic image of the sample is formed directly by detecting the second signal; for each time frame, a cinematic image of the sample is formed directly by detecting the second signal; during a detection subperiod, included in the detection period, and comprising at least the first and second time frames, an accumulated light signal is detected, and forming said luminescence image for each time frame by processing said signal luminous on the basis of said corresponding cinematographic images; for at least one time frame, and preferably for each time frame:
  • each image comprises a plurality of pixels (x, y) each corresponding to a zone (Du, Dv, Dw) of the enclosure;
  • the luminescence signal has a spectrum, and the second signal is a light signal having a spectrum remote from the spectrum of the luminescence signal;
  • each time frame has a clear time during which the sample is illuminated and during which the second signal is detected, and a dark time during which the sample is not illuminated and during which the first
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of an imaging device
  • FIG. 2 is a schematic plan view of the inside of the enclosure of the device of FIG. 1 according to a first embodiment
  • FIG. a schematic diagram of an example of data processing
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of processing carried out by the processing unit of FIG. 3, FIGS.
  • FIG. 5a, 5b and 5c are graphs showing the states of the light source, the second and the first detector, respectively, according to an alternative embodiment of the invention
  • - Figure 6 is a view corresponding to Figure 2 for a second embodiment of the invention
  • Figure 7 is a view corresponding to Figure 2 for a third embodiment.
  • FIG. 1 schematically represents an imaging device 1 intended to take an image of a sample 2 and a display screen 3 comprising a display 4 presenting an image of the sample 2.
  • the imaging device described here is a luminescence imaging device, for example in bioluminescence, that is to say intended to take an image of a sample 2, such as in particular a small laboratory animal, for example mammal, emitting a light from inside its body.
  • This light is for example produced following a chemical reaction inside the body of the small animal.
  • a chemical reaction one can for example having beforehand a small genetically modified laboratory animal to include a gene coding for a protein which has the particularity of emitting light when it reacts chemically with a given complementary chemical entity, such as a molecule, an atom or an ion.
  • said complementary molecule Before placing the small laboratory animal 2 in the imaging device 1, it is provided to it, for example by inoculation, said complementary molecule and, optionally, the time is allowed for it to reach the possible reaction site with the protein.
  • the quantity of light released locally by the chemical reaction is a factor of the quantity of the protein produced, and thus makes it possible to locally measure the level of expression of the gene.
  • the experiment in question may for example consist of measuring the muscular activity generated by an event in a laboratory animal, by detecting the amount of light emitted by the coelentherazine-Aequorin substrate-photoprotein pair which reacts with a complementary complementary chemical entity.
  • the entity in question is for example the calcium arriving in the vicinity of the photoprotein at the level of the axons.
  • the device described here can also be used to implement a phosphorescence or delayed luminescence imaging method.
  • a molecule adapted to emit light for a sufficiently long time, of the order of a few minutes, by phosphorescence is illuminated ex-vivo to trigger this phosphorescence.
  • the molecule is then introduced inside the small laboratory animal and can be used as a light tracer.
  • the concentration of the molecule in a location of the organism, for example because a certain reaction takes place at this location, and that the molecule in question participates in this reaction is detectable by the device described below and makes it possible to characterize the reaction in question quantitatively or qualitatively.
  • the small laboratory animal 2 is placed in a light-tight enclosure, for example by closing a door 6 or the like.
  • the chamber comprises, as represented in FIG. 2, a scene 7, for example forming the floor of the enclosure, on which the small laboratory animal 2 is placed, and a light source 8 generating incident lighting in the direction of scene 7 (for example transmitted by an optical fiber). Due to the reaction described above, the small laboratory animal 2 naturally emits a first light signal which carries luminescence information of the small animal. In addition, because of the light generated by the light source 8, a second light signal corresponding substantially to the reflection by the small laboratory animal 2 of the incident light 8 is also emitted in the enclosure 5.
  • This second light signal may also include a portion corresponding to the auto-fluorescence of the sample 2 due to the illumination by the light source 8.
  • the detection device comprises a first detector 10 adapted to detect light signals from sample 2 having a luminescence spectrum.
  • a first detector 10 is for example an ICCD, an EMCCD (internal multiplication CCD) or other, having a matrix of pixels arranged in rows and columns.
  • the detection device 9 also comprises a second detector 11, which is for example a conventional CCD camera or intensified having a large number of pixels arranged in columns and rows.
  • the first and second detectors 10, 11 are each disposed on a face distinct from the enclosure 5.
  • the scene 7 carrying the sample forming the floor of the enclosure, the scene is immobile with respect to the detection device at least during the entire observation period.
  • the light source 8 continuously emits incident light towards the scene so that the combined light signal corresponds to a spectral combination of the first (carrying the luminescence information) and the second light signal.
  • the combined light signal is separated by a splitter plate 12, which separates the signals on the basis of their wavelength.
  • a splitter plate 12 which separates the signals on the basis of their wavelength.
  • Such a separating blade is for example a dichroic mirror or "hot mirror” type mirror separating the visible from the infra-red.
  • the signal The illuminated luminescence information light is substantially completely transmitted to the first detector 10, while the second light signal is almost entirely transmitted to the second detector 11.
  • a filter 13 at the input of the first detector 10, adapted to prevent wavelengths that do not correspond to this signal from reaching the first detector 10.
  • the signal reaching the first detector 10 only corresponds to the luminescence from inside the sample 2
  • the auto-fluorescence signal emitted by the sample 2 under the effect of the light source 8 has a wavelength different from the signal in question.
  • a light source 8 which emits an incident light having a suitable spectrum, distributed beyond the range of wavelengths emitted by luminescence.
  • infrared illumination centered at a wavelength substantially equal to 800 nm may be used when the luminescence spectrum has a maximum wavelength of 700 nm or less. As shown in FIG.
  • an electronic control unit 14 which defines a plurality of time frames each lasting a few milliseconds, corresponding substantially to the time required to acquire and store a cinematographic representation of the scene 7 using the second detector 11.
  • This cinematographic representation comprises a plurality of coordinated data pairs, luminous property (intensity, ).
  • These time frames can be set to have a duration determined by the user, if the latter wishes a given acquisition rate, such as 24 images per second, for example or other.
  • the signal previously produced in the second detector 11 is read and stored in a second memory 21, as well as coordinate information relating to each pixel and a new acquisition starts at the second detector 11.
  • the signal produced by the first detector 10 is stored in a first memory 20 as well as coordinate information relating to each pixel.
  • a processing unit 15 is adapted to read the data stored in the first and second memory 20, 21, to store them and / or to display on the screen 4 the corresponding images.
  • the first detector 10 will be triggered to be read only approximately every 0.3 seconds, which remains a relatively short time in the dynamics of the phenomena observed.
  • the processing unit 15 is adapted to recalculate for each photographic representation acquired by the second detector 11 a significant value of the luminescence information for each of these representations, for example in the manner schematically shown in FIG.
  • FIG. 4 shows at the top four images of the sample 2 successively acquired by the second detector 11, at successive times T1, T2, T3 and T4. As shown roughly in Figure 4, sample 2 may have moved forward of the instant T1 at time T4, of a given displacement D, which is intentionally exaggerated in FIG. 4 for explanatory purposes.
  • the embodiment presented with reference to FIG. 2 implies a certain constraint at the level of the light source 8, because it must illuminate the sample 2 in a range of wavelengths such that the This fluorescence of the sample 2 has a spectrum that is far from the emission spectrum of the sample 2.
  • a pulsed lighting of the order of the video frequency is for example provided from a laser diode, or other.
  • the electronic control unit comprises a sequencer 17 which controls the light source 8 to generate the incident illumination during a clear time t c of the time frame T. This incident illumination is for example synchronized with the acquisition of the luminescence signal detector.
  • the electronic control unit controls the light source to generate incident light continuously, and therefore during each time frame.
  • incident lighting is emitted in the direction of the scene, so that a light signal mainly comprising a reflection of the incident light by sample 2 reaches the detection device 9.
  • the first detector 10 is then blinded, so that it can not detect any signal.
  • a mechanical shutter located at the input of the first detector 10 is used, or an electrical shutter obtained for example by a voltage inversion exerted at the terminals of the first detector 10 is used. detector.
  • the electronic control unit commands to cut off the incident lighting, so that a few moments after t c , only the luminescence coming from the sample 2 is detectable in the enclosure 5.
  • Au During this dark instant t o , the first detector 10 is again in the detection state, and detects the light signal carrying the luminescence information from the sample 2.
  • the combined light signal therefore substantially corresponds to a temporal combination of the first and second signals, the first light signal (luminescent) being predominant during the dark time, and the second light signal corresponding to the photographic representation of the light. sample being the majority during the clear moment t c .
  • the sample 2 also emits a signal carrying the luminescence information has no influence on the signal detected by the signal.
  • second detector 11 It can also remain in acquisition mode during dark time t o , as shown in Figure 5b, without significant influence on the measurement made by this detector.
  • FIG. 6 now presents a second embodiment of the invention, which applies both to case of a continuous light source in the case of a pulsed light source as presented above in relation to Figures 1 to 5c.
  • a splitter plate 12 is not necessarily used, and the separation of the combined light signal is carried out integrally by the filter 13.
  • a reconstruction unit of the processing unit 15 has been previously calibrated to report the images obtained by these two detectors in a common repository, which may be a reference linked to one or the other another of these detectors, or another repository.
  • the detection is performed by the first and second detectors 10, 11 during an observation period during which the enclosure is kept closed, containing the sample 2, which can move in the enclosure. During this observation period, a plurality of time frames are defined during which the detection takes place. The signal detected by each detector during each time frame can be converted directly into a luminescence image
  • each detector may comprise a plurality of pixels organized in rows and columns in a plane of the detector, each pixel being identifiable by its coordinates.
  • Each pixel of coordinates (x; y) detects a signal from a coordinate region (Du, Dv, Dw) of the enclosure corresponding for example to a cone whose base is formed by the pixel (x; y).
  • the device described in FIG. 6 makes it possible to implement the method described for the first embodiment, in its first variant, with reference to FIG. 2.
  • filter 13 may be dispensed with.
  • a luminous signal emitted by sample 2 has been used to obtain the cinematographic image, as in FIG. particularly the reflection by the sample of a light signal emitted by a light source 8.
  • the signal making it possible to obtain information on the position of the sample in the enclosure n ' is not necessarily an optical signal.
  • the first detector 10 any type of detector to obtain information on the position of the sample 2 in the chamber.
  • a detector may for example be constituted by a thermal detector adapted to detect a release of heat from the mammal 2. Therefore, in such an embodiment, it is no longer necessary to illuminate the sample 2 at the same time.
  • the luminescence signal detected by the second detector 11 and the thermal signal detected by the first detector 10 are of such a different nature that the separation of these signals is done naturally by the use of detectors of a very different nature. The thermal detector is not disturbed by the luminescence signal emitted by the sample and the detector of the luminescence signal is not disturbed by the signal thermal emitted by the sample.

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Abstract

Le dispositif d' imagerie en luminescence comprend : une scène recevant un échantillon (2) émettant une information de luminescence, une source de lumière (8) éclairant la scène, une unité électronique de commande définissant des trames de temps, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison de l'information de luminescence et de la réflexion de l'éclairage par l'échantillon. Au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9) acquiert à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE D^MAGERIE EN LUMINESCENCE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative aux dispositifs et aux procédés d'imagerie en luminescence. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
Plus particulièrement, l'invention se rapporte principalement à un dispositif d' imagerie en luminescence comprenant : une enceinte étanche à la lumière comprenant une scène adaptée pour recevoir un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une. information de luminescence de l'échantillon, une source de lumière "adaptée pour générer un éclairage incident en direction de la scène, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, un dispositif de détection adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondants à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, une unité électronique de commande adaptée pour définir une pluralité de trames de temps, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage de la deuxième image, ladite unité électronique de commande étant également adaptée pour commander à la source de lumière de générer l'éclairage incident au cours de chaque trame de temps, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant au dispositif de détection pendant chaque trame de temps . Le document WO 01/37,195 décrit un exemple d'un tel dispositif. Ce dispositif dispose d'un mode « live » pour prendre une pluralité de représentations photographiques de l'échantillon. Puis, lorsque l'échantillon émet une lumière suite à une réaction chimique prenant place à l'intérieur de l'échantillon (phénomène de luminescence), ce dispositif peut prendre des images en luminescence de l'échantillon, détectant ainsi la quantité de lumière émise par l'échantillon due aux réactions chimiques en question.
Toutefois, ce dispositif ne permet pas de suivre l'évolution temporelle rapide de l'information relative à la luminescence. Si l'échantillon se déplace pendant la mesure, (en particulier s'il est nécessaire que l'échantillon se déplace pendant la mesure, parce que la mesure correspond à une activité musculaire qui ne peut être enregistrée pour un échantillon anesthésié) , une telle installation ne sera pas adaptée.
La présente invention a notamment pour but de fournir un dispositif permettant de pallier ces inconvénients . RESUME DE L'INVENTION
A cet effet, selon l'invention, un dispositif du genre en question est caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de séparation adaptés pour qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux.
Grâce à ces dispositions, on acquière simultanément, à l'échelle de la trame de temps vidéo, une information correspondant à une représentation cinématographique de l'échantillon, et une information relative à la luminescence de l'échantillon.
Dans certains modes de réalisation de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou à l'autre des dispositions suivantes : le dispositif de détection présente une pluralité de pixels adaptés chacun pour détecter des signaux lumineux en provenance d'une région donnée respective de l'enceinte ; - le dispositif de détection est adapté pour stocker la première image selon un premier échantillonnage de trames de temps et pour stocker la deuxième image selon un deuxième échantillonnage de trames de temps, le premier échantillonnage présentant une fréquence différente de celle du deuxième échantillonnage ; la fréquence du premier échantillonnage est plus basse que celle du deuxième échantillonnage ; le deuxième signal lumineux comporte un signal lumineux relatif à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et un signal lumineux d' autofluorescence de l'échantillon soumis audit éclairage incident, et le dispositif d' imagerie est adapté pour séparer les signaux lumineux présentant un spectre de luminescence des signaux lumineux d' autofluorescence et relatifs à la réflexion; le dispositif de détection comporte : un premier détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux portant une information de luminescence, et - un deuxième détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon ; les moyens de séparation comprennent un filtre disposé en entrée du premier détecteur, ledit filtre étant adapté pour empêcher des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon d'être acquis par le premier détecteur ; - les moyens de séparation comprennent en outre une lame séparatrice adaptée pour transmettre au premier détecteur le premier signal lumineux, et pour transmettre au deuxième détecteur le deuxième signal lumineux ; les premier et deuxième détecteurs sont décalés angulairement l'un par rapport à l'autre, et reçoivent chacun directement le signal lumineux combiné, le dispositif d'imagerie comprenant de plus une unité de reconstruction adaptée pour associer les première et deuxième données à un référentiel lié à l'enceinte ; - la source lumineuse émet en continu, et le signal lumineux combiné est une combinaison spectrale des premier et deuxième signaux lumineux ; le premier signal lumineux présente un spectre distribué entre une longueur d'onde minimale et une longueur d'onde maximale, et la source lumineuse émet un éclairage incident distribué sensiblement au-delà de ladite longueur d'onde maximale ; les moyens de séparation comprennent un séquenceur adapté pour que l ' unité de commande commande à la source lumineuse de générer de manière puisée ledit éclairage incident, chaque trame de temps présentant un instant clair, pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, le séquenceur étant adapté pour commander au premier détecteur d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, et d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair ; - une unité de traitement adaptée pour rapporter l'information de luminescence dans un référentiel lié à 1' échantillon.
Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé d' imagerie en luminescence comprenant les étapes suivantes : disposant d'une enceinte étanche à la lumière comprenant une scène comportant un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon,
(a) une unité électronique de commande définit une pluralité de trames de temps, et commande à une source de lumière de générer un éclairage incident en direction de la scène au cours de chaque trame de temps, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant à un dispositif de détection pendant chaque trame de temps,
(b) on sépare le signal lumineux combiné de sorte qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection, qui est adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage d'une deuxième image.
Dans certains modes de réalisation de l'invention, on peut éventuellement avoir recours en outre à l'une et/ou l'autre des dispositions suivantes : au cours de l'étape (a), chaque trame de temps est divisée en un temps clair pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, et, au cours de l'étape (b) , on commande à un premier détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair, et à un deuxième détecteur adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident sur l'échantillon d'être dans un état de détection au moins pendant l'instant clair ; au cours de l'étape (b) , un premier détecteur détecte le premier signal lumineux portant l'information de luminescence, et un deuxième détecteur détecte le signal lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, en empêchant des signaux lumineux correspondants à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon de parvenir au premier détecteur ; - le dispositif de détection comporte une pluralité de pixels, et au cours de chaque trame de temps, on associe les première et deuxième données à une coordonnée d'une région de l'enceinte ; pour chaque trame de temps, on rapporte les premières données dans un référentiel lié à l'échantillon ; avant l'étape (a) , on déclenche une réaction chimique à l'intérieur de l'échantillon, ladite réaction chimique générant le premier signal lumineux, et après l'étape (b) , on extrait une information relative à la réaction chimique à partir des première et deuxième données ; avant l'étape (a) : on illumine au moins une molécule adaptée pour émettre un signal de phosphorescence suite à son illumination, et on introduit à l'intérieur de l'échantillon la molécule illuminée, le premier signal lumineux correspondant à une lumière émise par phosphorescence par la molécule depuis l'intérieur de l'échantillon.
Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un procédé d'imagerie en luminescence comprenant les étapes suivantes :
(c) on dispose d'un échantillon à imager sur une scène d'une enceinte étanche à la lumière, ledit échantillon comprenant une surface extérieure englobant un intérieur, l'intérieur dudit échantillon émettant, à travers la surface extérieure, un signal lumineux dans l'enceinte, l'échantillon émettant également un deuxième signal de nature différente du signal lumineux,
(d) pendant une période d'observation pendant l'intégralité de laquelle l'échantillon est contenu dans l'enceinte, on détecte ledit signal lumineux et ledit deuxième signal, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
(e) sur la base de la détection du signal lumineux, on forme, pour au moins une première et une deuxième trames de temps successives de la période d'observation, une image de luminescence de l'échantillon représentative du signal lumineux émis depuis l'intérieur de l'échantillon, et (f) sur la base de la détection du deuxième signal, on forme, pour au moins lesdites première et deuxième trames de temps, une image cinématographique de l'échantillon représentative de la position de l'échantillon dans l'enceinte.
Dans des modes de réalisation, on peut en outre mettre en œuvre l'une et/ou l'autre des dispositions suivantes : pour chaque trame de temps, on forme une image de luminescence de l'échantillon directement par détection du signal lumineux, et pour chaque trame de temps, on forme une image cinématographique de l'échantillon directement par détection du deuxième signal ; - pour chaque trame de temps, on forme une image cinématographique de l'échantillon directement par détection du deuxième signal ; pendant une sous-période de détection, incluse dans la période de détection, et comprenant au moins les première et deuxième trames de temps, on détecte un signal lumineux accumulé, et on forme ladite image de luminescence pour chaque trame de temps par traitement dudit signal lumineux sur la base desdites images cinématographiques correspondantes ; pour au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps :
(g) on affiche sur un écran une image superposée correspondant à la superposition de l'image cinématographique et de l'image de luminescence pour ladite trame de temps ; pour au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps :
(h) on identifie une région de l'image de luminescence, et (i) à l'aide d'au moins une image cinématographique, on associe ladite région à une zone de l'échantillon ; pour ladite au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps, (j) on obtient un paramètre relatif à une entité chimique se trouvant dans ladite zone à partir de l'image en luminescence ; au cours de l'étape (d) , le signal lumineux est détecté selon une première incidence, et le deuxième signal est détecté selon une deuxième incidence distincte de la première incidence, et pour chaque trame de temps au cours des étapes (e) et (f) , on forme l'image de luminescence et la deuxième image dans un même référentiel ; chaque image comprend une pluralité de pixels (x, y) correspondant chacun à une zone (Du, Dv, Dw) de l'enceinte ; le signal de luminescence présente un spectre, et le deuxième signal est un signal lumineux présentant un spectre distant du spectre du signal de luminescence ; chaque trame de temps présente un temps clair pendant lequel on illumine l'échantillon et pendant lequel on détecte le deuxième signal, et un temps obscur pendant lequel l'échantillon n'est pas illuminé et pendant lequel on détecte le premier signal, et le deuxième signal est un signal lumineux correspondant à la réflexion de l'illumination sur l'échantillon ; le deuxième signal est un signal thermique ; chaque trame de temps dure un temps correspondant à la durée de détection du deuxième signal.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description suivante de trois de ses formes de réalisation, donnée à titre d'exemple non limitatif, en regard des dessins joints . Sur les dessins : la figure 1 est une vue schématique en perspective d'un dispositif d'imagerie, la figure 2 est une vue plane schématique de l'intérieur de l'enceinte du dispositif de la figure 1 selon un premier mode de réalisation, la figure 3 est un schéma synoptique d'un exemple de traitement des données, la figure 4 est un schéma présentant un exemple de traitement effectué par l'unité de traitement de la figure 3, les figures 5a, 5b et 5c sont des graphiques montrant les états de la source de lumière, du deuxième et du premier détecteur, respectivement, selon une variante de réalisation de l'invention, - la figure 6 est une vue correspondant à la figure 2 pour un deuxième mode de réalisation de l'invention, et la figure 7 est une vue correspondant à la figure 2 pour un troisième mode de réalisation. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Sur les différentes figures, les mêmes références désignent des éléments identiques ou similaires.
La figure 1 représente schématiquement un dispositif d'imagerie 1 destiné à prendre une image d'un échantillon 2 et un écran de visualisation 3 comprenant un affichage 4 présentant une image de l'échantillon 2.
Le dispositif d' imagerie décrit ici est un dispositif d'imagerie en luminescence, par exemple en bioluminescence, c'est-à-dire destiné à prendre une image d'un échantillon 2, tel qu'en particulier un petit animal de laboratoire, par exemple mammifère, émettant une lumière depuis l'intérieur de son corps.
Cette lumière est par exemple produite suite à une réaction chimique à l'intérieur du corps du petit animal. Pour obtenir cette réaction chimique, on peut par exemple disposer préalablement d'un petit animal de laboratoire modifié génétiquement pour comprendre un gène codant pour une protéine gui présente la particularité d'émettre de la lumière lorsqu'elle réagit chimiquement avec une entité chimique complémentaire donnée, telle qu'une molécule, un atome ou un ion.
Avant d'avoir placé le petit animal de laboratoire 2 dans le dispositif d'imagerie 1, on fournit à celui-ci, par exemple par inoculation, ladite molécule complémentaire et, éventuellement, on laisse le temps à celle-ci d'atteindre le possible site de réaction avec la protéine. La quantité de lumière dégagée localement par la réaction chimique est un facteur de la quantité de la protéine produite, et permet donc de mesurer localement le niveau d'expression du gène.
En particulier, si on souhaite vérifier que le gène en question s'exprime particulièrement en réponse à un événement donné, on pourra mettre en œuvre la mesure explicitée ci-après d'une part pour un petit animal de laboratoire 2 pour lequel on a déclenché l'événement, et d'autre part pour un petit animal de laboratoire 2 pour lequel on n'a pas déclenché l'événement, afin de comparer les signaux émis par ces deux animaux.
Alternativement, l'expérience en question peut par exemple consister en la mesure de l'activité musculaire générée par un événement chez un animal de laboratoire, par la détection de la quantité de lumière émise par le couple substrat-photoprotéine coelentherazine-Aequorin qui réagit avec une entité chimique complémentaire donnée. L'entité en question est par exemple le calcium arrivant en la proximité de la photoprotéine au niveau des axones.
De tels événements ayant une signature temporelle très rapide, il est utile de pouvoir obtenir rapidement une information relative au taux de réaction. Le dispositif ici décrit peut également être utilisé pour mettre en œuvre un procédé d'imagerie par phosphorescence ou luminescence retardée. Lors d'un tel procédé, une molécule adaptée pour émettre de la lumière pendant un temps suffisamment long, de l'ordre de quelques minutes, par phosphorescence, est illuminée ex-vivo pour déclencher cette phosphorescence. La molécule est alors introduite à l'intérieur du petit animal de laboratoire et peut être utilisée comme traceur lumineux. La concentration de la molécule dans un emplacement de l'organisme, par exemple parce qu'une certaine réaction a lieu à cet emplacement, et que la molécule en question participe à cette réaction, est détectable par le dispositif décrit ci-après et permet de caractériser quantitativement ou qualitativement la réaction en question.
Comme représenté sur les figures 1 et 2 , le petit animal de laboratoire 2 est placé dans une enceinte 5 étanche à la lumière par exemple par la fermeture d'une porte 6 ou autre. L'enceinte comporte, comme représenté sur la figure 2, une scène 7, formant par exemple le plancher de l'enceinte, sur laquelle est disposé le petit animal de laboratoire 2, et une source de lumière 8 générant un éclairage incident en direction de la scène 7 (par exemple transmis par une fibre optique) . Du fait de la réaction décrite ci-dessus, le petit animal de laboratoire 2 émet naturellement un premier signal lumineux qui porte une information de luminescence du petit animal. De plus, du fait de l'éclairage généré par la source de lumière 8, un deuxième signal lumineux, correspondant sensiblement à la réflexion par le petit animal de laboratoire 2 de l'éclairage incident 8 est également émis dans l'enceinte 5. Ce deuxième signal lumineux peut également comporter une partie correspondant à l'auto-fluorescence de l'échantillon 2 du fait de l'éclairage par la source de lumière 8. Ces premier et deuxième signaux lumineux se combinent pour former un signal lumineux combiné arrivant à un dispositif de détection 9 représenté entouré en pointillé sur la figure 2. Dans le premier mode de réalisation présenté en relation avec la figure 2, le dispositif de détection comporte un premier détecteur 10 adapté pour détecter des signaux lumineux provenant de l'échantillon 2 présentant un spectre de luminescence. Un tel premier détecteur 10 est par exemple un ICCD, un EMCCD (CCD à multiplication interne) ou autre, présentant une matrice de pixels disposés en rangées et en colonnes. Le dispositif de détection 9 comporte également un deuxième détecteur 11, qui est par exemple une caméra CCD classique ou intensifiée présentant un grand nombre de pixels disposés en colonnes et en rangées. Dans l'exemple présenté sur la figure 2, les premier et deuxième détecteurs 10, 11 sont disposés chacun sur une face distincte de l'enceinte 5. La scène 7 portant l'échantillon formant le plancher de l'enceinte, la scène est immobile par rapport au dispositif de détection au moins pendant la période d'observation toute entière.
Toutefois, on pourrait prévoir de réaliser la scène mobile par rapport à l'enceinte pour déplacer la scène, avant ou après la période d'observation, par rapport aux détecteurs.
Dans l'exemple présenté, la source de lumière 8 émet en continu un éclairage incident en direction de la scène de sorte que le signal lumineux combiné correspond à une combinaison spectrale des premier (portant l'information de luminescence) et deuxième signaux lumineux. Le signal lumineux combiné est séparé par une lame séparatrice 12, qui sépare les signaux sur la base de leur longueur d'onde. Une telle lame séparatrice est par exemple un miroir dichroïque ou miroir de type «hot mirror » séparant le visible de l ' infra-rouge . Le signal lumineux portant l'information de luminescence est sensiblement intégralement transmis en direction du premier détecteur 10, alors que le deuxième signal lumineux est quasiment intégralement transmis au deuxième détecteur 11. Pour être sûr que seul le signal portant l'information de luminescence parvient au premier détecteur 10, on peut également disposer un filtre 13 en entrée du premier détecteur 10, adapté pour empêcher aux longueurs d'onde ne correspondant pas à ce signal d'atteindre le premier détecteur 10.
En pratique, pour être certain que le signal parvenant au premier détecteur 10 ne corresponde qu'à la luminescence depuis l'intérieur de l'échantillon 2, on fait en sorte que le signal d'auto-fluorescence émis par l'échantillon 2 sous l'effet de la source de lumière 8 présente une longueur d'onde différente du signal en question. A cet effet, on pourra choisir de travailler avec une source de lumière 8 qui émet un éclairage incident présentant un spectre adapté, distribué au-delà de la gamme des longueurs d'onde émises par luminescence. Par exemple, on peut utiliser un éclairage infra rouge centré sur une longueur d'onde sensiblement égale à 800 nm quand le spectre de luminescence présente une longueur d'onde maximale de 700 nm ou moins. Comme représenté sur la figure 3, on dispose une unité électronique de commande 14 qui définit une pluralité de trames de temps durant chacune quelques millisecondes, correspondant sensiblement au temps nécessaire pour acquérir et stocker une représentation cinématographique de la scène 7 à l'aide du deuxième détecteur 11. Cette représentation cinématographique comprend une pluralité de couples de données coordonnées, propriété lumineuse (intensité, ...) . On pourra régler ces trames de temps comme ayant une durée déterminée par l'utilisateur, si celui-ci souhaite un taux d'acquisition donné, tel que 24 images par seconde, par exemple ou autre. Au début de chaque trame de temps, le signal précédemment produit dans le deuxième détecteur 11 est lu et stocké dans une deuxième mémoire 21, ainsi qu'une information de coordonnée relative à chaque pixel et une nouvelle acquisition débute au niveau du deuxième détecteur 11.
De manière similaire, au début de chaque trame de temps, le signal produit par le premier détecteur 10 est stocké dans une première mémoire 20 ainsi qu'une information de coordonnée relative à chaque pixel. Une unité de traitement 15 est adaptée pour lire les données stockées dans les première et deuxième mémoire 20, 21, pour les stocker et/ou pour afficher sur l'écran 4 les images correspondantes . Toutefois, il peut survenir qu'il soit préférable de ne pas lire les données mesurées au niveau du premier détecteur 10 pour chaque trame de temps, mais plutôt toutes les n trames de temps, n étant strictement supérieur à 1, afin de laisser s'accumuler au niveau du premier détecteur 10 un signal suffisamment intense pour pouvoir être détecté. Par exemple, on ne déclenchera la lecture du premier détecteur 10 que toutes les 0,3 secondes environ, ce qui reste un temps relativement faible au niveau de la dynamique des phénomènes observés. Dans ce cas, on peut par exemple prévoir que l'unité de traitement 15 soit adaptée pour recalculer pour chaque représentation photographique acquise par le deuxième détecteur 11 une valeur significative de l'information de luminescence pour chacune de ces représentations, par exemple de la manière représentée schématiquement sur la figure 4.
Sur la figure 4, on a représenté en haut quatre images de l'échantillon 2 acquises successivement par le deuxième détecteur 11, à des temps successifs Tl, T2 , T3 et T4. Comme cela est représenté grossièrement sur la figure 4, l'échantillon 2 peut s'être déplacé vers l'avant de l'instant Tl à l'instant T4, d'un déplacement D donné, qui est volontairement exagéré sur la figure 4 à des fins explicatives .
Sur chaque image de l'échantillon 2 obtenue par le deuxième détecteur 11, on superpose une image portant une information de luminescence obtenue par le premier détecteur 10, représentée par la référence 16. Du fait que, du temps Tl au temps T4, une seule acquisition a été faite au niveau du premier détecteur 10, on obtient pour ces quatre instants du haut de la figure 4, une même image 16, qui apparaît floue, car elle correspond à une zone émettrice de l'échantillon 2 qui s'est déplacée entre les instants Tl et T4 , du fait du déplacement de l'échantillon lui-même . Une fois enregistrées les quatre images provenant du deuxième détecteur 11 pour les quatre instants Tl, T2 , T3 et T4, et l'image provenant du premier détecteur 10 pour l'instant durant entre Tl et T4, l'unité de traitement 15 peut calculer, à partir des quatre représentations photographiques fournies par le deuxième détecteur 11 la localisation, représentée en 16' sur les représentations photographiques de la figure 4, de la zone de l'échantillon 2 émettant l'information de luminescence. Il s'agit par exemple d'extraire des quatre représentations photographiques fournies par le deuxième détecteur 11, le champ de déplacement auquel a été soumis l'échantillon 2, par exemple par reconnaissance de forme sur les représentations photographiques. Puis, on applique à l'image obtenue par le premier détecteur 10 un traitement permettant d'obtenir, à partir de cette image unique, quatre images probables identiques correspondant à chacun des instants Tl, T2, T3 et T4. Puis, les quatre images probables identiques de luminescence sont superposées aux quatre représentations photographiques du deuxième détecteur 11 pour fournir la succession d'images représentées sur le bas de la figure 4.
Le mode de réalisation présenté en relation avec la figure 2 implique une certaine contrainte au niveau de la source de lumière 8, car il faut qua celle-ci éclaire l'échantillon 2 dans une gamme de longueur d'ondes telle que l'auto-fluorescence de l'échantillon 2 du fait de cet éclairage présente un spectre éloigné du spectre d'émission en luminescence de l'échantillon 2. Dans une variante de réalisation, explicitée ci-après en relation avec les figures 5a et 5c, on peut également mettre en œuvre un éclairage puisé de l'ordre de la fréquence vidéo. Un tel éclairage est par exemple fourni depuis une diode laser, ou autre. Dans cette variante de réalisation, l'unité électronique de commande comporte un séquenceur 17 qui commande à la source de lumière 8 de générer l'éclairage incident pendant un temps clair tc de la trame de temps T. Cet éclairage incident est par exemple synchronisé avec l'acquisition du détecteur du signal.de luminescence. On notera que dans le mode de réalisation présenté précédemment, l'unité électronique de commande commande à la source de lumière de générer l'éclairage incident en continu, et par conséquent au cours de chaque trame de temps. Dans la présente variante, au cours du temps clair tc, par exemple situé en début de trame T, un éclairage incident est émis en direction de la scène, de sorte qu'un signal lumineux comprenant principalement une réflexion de l'éclairage incident par l'échantillon 2 parvient au dispositif de détection 9.
Comme représenté sur la figure 5c, le premier détecteur 10 est alors aveuglé, de sorte que celui-ci ne peut détecter aucun signal . Pour obturer le premier détecteur 10, on a par exemple recours à un obturateur mécanique situé en entrée du premier détecteur 10, ou on a recours à une obturation électrique obtenue par exemple par une inversion de tension exercée aux bornes du premier détecteur. Puis, au bout du temps tc, l'unité électronique de commande commande de couper l'éclairage incident, de sorte que quelques instants après tc, seule la luminescence provenant de l'échantillon 2 est détectable dans l'enceinte 5. Au cours de cet instant obscur to, le premier détecteur 10 est à nouveau dans l'état de détection, et détecte le signal lumineux portant l'information de luminescence en provenance de l'échantillon 2. Au cours d'une trame de temps, dans cette variante de réalisation, le signal lumineux combiné correspond donc sensiblement à une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux, le premier signal lumineux (luminescent) étant majoritaire pendant le temps obscur, et le deuxième signal lumineux, correspondant à la représentation photographique de l'échantillon, étant majoritaire pendant l'instant clair tc. On notera que, du fait du niveau respectif des signaux, le fait que, pendant toute la trame de temps, l'échantillon 2 émette également un signal portant l'information de luminescence n'a pas d'influence sur le signal détecté par le deuxième détecteur 11. Celui-ci peut d'ailleurs rester en mode d'acquisition pendant le temps obscur to, comme représenté sur la figure 5b, sans influence notable sur la mesure effectuée par ce détecteur.
Pour la source lumineuse 8, dans la variante de réalisation qui vient d'être présentée, on pourra utiliser également une source lumineuse 2 de spectre ciblé sur 800 nanomêtres, comme dans le premier mode de réalisation.
Toutefois, on peut s'affranchir de cette contrainte en faisant en sorte que la détection par les détecteurs 10 ne se produise qu'une fois que le signal d'auto- fluorescence émis par l'échantillon 2 (même présentant un spectre superposé à celui du signal de luminescence) est dissipé dans l'enceinte 5.
La figure 6 présente maintenant un deuxième mode de réalisation de l'invention, qui s'applique aussi bien au cas d'une source lumineuse continue qu'au cas d'une source lumineuse puisée telles que présentées précédemment en relation avec les figures 1 à 5c. Dans ce deuxième mode de réalisation, on n'utilise pas nécessairement une lame séparatrice 12, et la séparation du signal lumineux combiné est effectué intégralement par le filtre 13. Toutefois, du fait du décalage spatial des informations détectées par les premier et deuxième détecteurs 10 et 11, on prévoit qu'une unité de reconstruction de l'unité de traitement 15 ait été préalablement calibrée pour rapporter les images obtenues par ces deux détecteurs dans un référentiel commun, qui peut être un référentiel lié à l'un ou à l'autre de ces détecteurs, ou un autre référentiel.
La détection est effectuée par les premier et deuxième détecteurs 10, 11 pendant une période d'observation durant l'intégralité de laquelle l'enceinte est maintenue fermée, contenant l'échantillon 2, celui-ci pouvant se déplacer dans l'enceinte. Pendant cette période d'observation, une pluralité de trames de temps sont définies pendant lesquelles la détection a lieu. Le signal détecté par chaque détecteur pendant chaque trame de temps peut être converti directement en une image de luminescence
(pour le premier détecteur) ou cinématographique (pour le deuxième détecteur) pour chaque trame de temps . En alternative, comme décrit en relation avec la figure 4, les images susmentionnées sont obtenues pour chaque trame de temps par calcul à partir d'une détection effectuée pendant une sous-période d'observation comprenant plusieurs trames de temps . Chaque détecteur peut comprendre une pluralité de pixels organisés en lignes et en colonnes dans un plan du détecteur, chaque pixel étant repérable par ses coordonnées
(x ; y) dans ce plan par rapport à une origine. Chaque pixel de coordonnées (x ; y) détecte un signal provenant d'une région de coordonnées (Du, Dv, Dw) de l'enceinte correspondant par exemple à un cône dont la base est formée par le pixel (x ; y) .
Le dispositif décrit sur la figure 6 permet de mettre en œuvre le procédé décrit pour le premier mode de réalisation, dans sa première variante, en relation avec la figure 2. Dans ce deuxième mode de réalisation du dispositif, si on souhaite mettre en œuvre le procédé décrit par relation avec les figures 5a à 5c, on peut éventuellement s'affranchir du filtre 13. Dans ce qui précède, on a utilisé, pour obtenir l'image cinématographique un signal lumineux émis par l'échantillon 2, tel qu'en particulier la réflexion par l'échantillon d'un signal lumineux émis par une source lumineuse 8. Toutefois, dans le cadre du procédé décrit ici, le signal permettant d'obtenir une information sur la position de l'échantillon dans l'enceinte n'est pas obligatoirement un signal optique. Dans le troisième mode de réalisation de l'invention, représenté sur la figure 7, on utilise, au titre du premier détecteur 10 tout type de détecteur permettant d'obtenir une information sur la position de l'échantillon 2 dans l'enceinte. Un tel détecteur peut par exemple être constitué par un détecteur thermique adapté pour détecter un dégagement de chaleur provenant du mammifère 2. Par conséquent, dans un tel mode de réalisation, il n'est plus nécessaire d'éclairer l'échantillon 2 à l'aide d'une source lumineuse 8. Par ailleurs, le signal de luminescence détecté par le deuxième détecteur 11 et le signal thermique détecté par le premier détecteur 10 sont de nature tellement différente que la séparation de ces signaux se fait naturellement par l'emploi de détecteurs de nature très différente. Le détecteur thermique n'est pas perturbé par le signal de luminescence émis par l'échantillon et le détecteur du signal de luminescence n'est pas perturbé par le signal thermique émis par l'échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif d'imagerie en luminescence comprenant : - une enceinte (15) êtanche à la lumière comprenant une scène adaptée pour recevoir un échantillon à imager (2) émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon, une source de lumière (8) adaptée pour générer un éclairage incident en direction de la scène, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, un dispositif de détection (9) adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondants à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, une unité électronique de commande (14) adaptée pour définir une pluralité de trames de temps, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage de la deuxième image, ladite unité électronique de commande (14) étant également adaptée pour commander à la source de lumière de générer l'éclairage incident au cours de chaque trame de temps, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant au dispositif de détection pendant chaque trame de temps, caractérisé en ce que le dispositif d' imagerie en luminescence comprend des moyens de séparation (12, 13 ; 17, 13) adaptés pour qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9) acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux.
2. Dispositif d'imagerie selon la revendication 1, dans lequel le dispositif de détection (9) présente une pluralité de pixels adaptés chacun pour détecter des signaux lumineux en provenance d'une région donnée respective de l'enceinte.
3. Dispositif d'imagerie selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel le dispositif de détection est adapté pour stocker la première image selon un premier échantillonnage de trames de temps et pour stocker la deuxième image selon un deuxième échantillonnage de trames de temps, le premier échantillonnage présentant une fréquence différente de celle du deuxième échantillonnage .
4. Dispositif d'imagerie selon la revendication 3 dans lequel la fréquence du premier échantillonnage est plus basse que celle du deuxième échantillonnage.
5. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le deuxième signal lumineux comporte un signal lumineux relatif à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon (2), et un signal lumineux d' autofluorescence de l'échantillon (2) soumis audit éclairage incident, et dans lequel le dispositif d'imagerie est adapté pour séparer les signaux lumineux présentant un spectre de luminescence des signaux lumineux d' autofluorescence et relatifs à la réflexion.
6. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le dispositif de détection comporte : un premier détecteur (10) adapté pour détecter des signaux lumineux portant une information de luminescence, et un deuxième détecteur (11) adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur 1 ' échantillon.
7. Dispositif d'imagerie selon la revendication 6, dans lequel les moyens de séparation comprennent un filtre (13) disposé en entrée du premier détecteur, ledit filtre étant adapté pour empêcher des signaux lumineux correspondants à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon d'être acquis par le premier détecteur.
8. Dispositif d'imagerie selon la revendication 7, dans lequel les moyens de séparation comprennent en outre une lame séparatrice (12) adaptée pour transmettre au premier détecteur le premier signal lumineux, et pour transmettre au deuxième détecteur le deuxième signal lumineux.
9. Dispositif d'imagerie selon la revendication 7, dans lequel les premier (10) et deuxième (11) détecteurs sont décalés angulairement l'un par rapport à l'autre, et reçoivent chacun directement le signal lumineux combiné, le dispositif d'imagerie comprenant de plus une unité de reconstruction adaptée pour associer les première et deuxième données à un référentiel lié à l'enceinte (5).
10. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel la source lumineuse (8) émet en continu, et dans lequel le signal lumineux combiné est une combinaison spectrale des premier et deuxième signaux lumineux.
11. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, dans lequel le premier signal lumineux présente un spectre distribué entre une longueur d'onde minimale et une longueur d'onde maximale, et dans lequel la source lumineuse (8) émet un éclairage incident distribué sensiblement au-delà de ladite longueur d'onde maximale .
12. Dispositif d'imagerie selon la revendication 6 dans lequel les moyens de séparation comprennent un séquenceur (17) adapté pour que l'unité de commande commande à la source lumineuse de générer de manière puisée ledit éclairage incident, chaque trame de temps présentant un instant clair, pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, le séquenceur étant adapté pour commander au premier détecteur (10) d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, et d'être dans un état de non- détection pendant l'état clair.
13. Dispositif d'imagerie selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une unité de traitement (15) adaptée pour rapporter l'information de luminescence dans un réfèrentiel lié à l'échantillon.
14. Procédé d'imagerie en luminescence comprenant les étapes suivantes : disposant d'une enceinte (5) étanche à la lumière comprenant une scène comportant un échantillon à imager émettant un premier signal lumineux portant une information de luminescence de l'échantillon,
(a) une unité électronique de commande (14) définit une pluralité de trames de temps, et commande à une source de lumière (8) de générer un éclairage incident en direction de la scène au cours de chaque trame de temps, l'interaction dudit éclairage incident et de l'échantillon formant un deuxième signal lumineux, un signal lumineux combiné correspondant à une combinaison des premier et deuxième signaux lumineux parvenant à un dispositif de détection pendant chaque trame de temps,
(b) on sépare le signal lumineux combiné de sorte qu'au cours de chaque trame de temps, le dispositif de détection (9) , qui est adapté pour d'une part détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence et pour stocker une première image sur la base des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence, et d'autre part pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, et pour stocker une deuxième image sur la base des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, acquière à la fois une première donnée relative à l'information de luminescence et une deuxième donnée relative au deuxième signal lumineux, chaque trame de temps durant un temps correspondant à l'acquisition et au stockage d'une deuxième image.
15. Procédé d'imagerie selon la revendication 14, dans lequel, au cours de l'étape (a), chaque trame de temps est divisée en un temps clair pendant lequel la source lumineuse émet, et un instant obscur pendant lequel la source lumineuse n'émet pas, le signal lumineux combiné étant une combinaison temporelle des premier et deuxième signaux lumineux, et, au cours de l'étape (b) , on commande à un premier détecteur (10) adapté pour détecter des signaux lumineux présentant un spectre de luminescence d'être dans un état de détection pendant l'instant obscur, d'être dans un état de non-détection pendant l'état clair, et à un deuxième détecteur (11) adapté pour détecter des signaux lumineux correspondant à la réflexion de l'éclairage incident sur l'échantillon d'être dans un état de détection au moins pendant l'instant clair.
16. Procédé d'imagerie selon la revendication 14, dans lequel, au cours de l'étape (b) , un premier détecteur
(10) détecte le premier signal lumineux portant l'information de luminescence, et un deuxième détecteur
(11) détecte le signal lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon, en empêchant des signaux lumineux correspondant à la réflexion de la lumière incidente provenant de ladite source de lumière sur l'échantillon de parvenir au premier détecteur (10) .
17. Procédé d'imagerie selon l'une des revendications 14 à 16 dans lequel, le dispositif de détection (9) comporte une pluralité de pixels, et dans lequel, au cours de chaque trame de temps, on associe les première et deuxième données à une coordonnée d'une région de l'enceinte.
18. Procédé d'imagerie selon la revendication 17, dans lequel pour chaque trame de temps, on rapporte les premières données dans un référentiel lié à l'échantillon
(2) .
19. Procédé d'imagerie selon l'une des revendications 14 à 18 dans lequel, avant l'étape (a), on déclenche une réaction chimique à l'intérieur de l'échantillon (2), ladite réaction chimique générant le premier signal lumineux, et dans lequel, après l'étape (b) , on extrait une information relative à la réaction chimique à partir des première et deuxième données.
20. Procédé d'imagerie selon la revendication 17 ou 18, avant l'étape (a) : on illumine au moins une molécule adaptée pour émettre un signal de phosphorescence suite à son illumination, et on introduit à l'intérieur de l'échantillon la molécule illuminée, W 2
28 le premier signal lumineux correspondant à l'émission de lumière par la molécule depuis l'intérieur de l' échantillon.
21. Procédé d'imagerie en luminescence comprenant 5 les étapes suivantes :
(c) on dispose d'un échantillon à imager (2) sur une scène d'une enceinte (5) étanche à la lumière, ledit échantillon comprenant une surface extérieure englobant un intérieur, l'intérieur dudit échantillon émettant, à 0 travers la surface extérieure, un signal lumineux dans l'enceinte, l'échantillon émettant également un deuxième signal de nature différente du signal lumineux,
(d) pendant une période d'observation pendant l'intégralité de laquelle l'échantillon est contenu dans 5 l'enceinte, on détecte ledit signal lumineux et ledit deuxième signal , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : (e) sur la base de la détection du signal lumineux, on forme, pour au moins une première et une deuxième trames 0 de temps successives de la période d'observation, une image de luminescence de l'échantillon représentative du signal lumineux émis depuis l'intérieur de l'échantillon, et
(f) sur la base de la détection du deuxième signal, on forme, pour au moins lesdites première et deuxième 5 trames de temps, une image cinématographique de l'échantillon représentative de la position de l'échantillon de l'enceinte.
22. Procédé d'imagerie en luminescence selon la revendication 21, dans lequel pour chaque trame de temps, 0 on forme une image de luminescence de l'échantillon directement par détection du signal lumineux, et dans lequel pour chaque trame de temps, on forme une image cinématographique de l'échantillon (2) directement par détection du deuxième signal. 5
23. Procédé d'imagerie en luminescence selon la revendication 21, dans lequel pour chaque trame de temps, on forme une image cinématographique de l'échantillon directement par détection du deuxième signal, dans lequel pendant une sous-période de détection, incluse dans la période de détection, et comprenant au moins les première et deuxième trames de temps, on détecte un signal lumineux accumulé, et dans lequel on forme ladite image de luminescence pour chaque trame de temps par traitement dudit signal lumineux sur la base desdites images cinématographiques correspondantes .
24. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, dans lequel pour au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps :
(g) on affiche sur un écran une image superposée correspondant à la superposition de l'image cinématographique et de l'image de luminescence pour ladite trame de temps.
25. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, dans lequel pour au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps :
(h) on identifie une région de l'image de luminescence, et
(i) à l'aide d'au moins une image cinématographique, on associe ladite région à une zone de l'échantillon.
26. Procédé d'imagerie en luminescence selon la revendication 25, dans lequel pour ladite au moins une trame de temps, et de préférence pour chaque trame de temps, (j) on obtient un paramètre relatif à une entité chimique générant le signal lumineux et se trouvant dans ladite zone à partir de l'image en luminescence.
27. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 26 dans lequel au cours de l'étape (d) , le signal lumineux est détecté selon une première incidence, et le deuxième signal est détecté selon une deuxième incidence distincte de la première incidence, et dans lequel pour chaque trame de temps au cours des étapes (e) et (f) , on forme l'image de luminescence et la deuxième image dans un même référentiel .
28. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 27, dans lequel chaque image comprend une pluralité de pixels (x, y) correspondant chacun à une zone (Du, Dv, Dw) de l'enceinte.
29. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque revendications 21 à 28, dans lequel le signal de luminescence présente un spectre, et dans lequel le deuxième signal est un signal lumineux présentant un spectre distant du spectre du signal de luminescence.
30. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 28, dans lequel chaque trame de temps présente un temps clair pendant lequel on illumine l'échantillon et pendant lequel on détecte le deuxième signal, et un temps obscur pendant lequel l'échantillon n'est pas illuminé et pendant lequel on détecte le premier signal, et dans lequel le deuxième signal est un signal lumineux correspondant à la réflexion de l'illumination sur l'échantillon.
31. Procédé d'imagerie en luminescence selon l'une quelconque des revendications 21 à 28, dans lequel le deuxième signal est un signal thermique.
32. Procédé d'imagerie selon l'une quelconque des revendications 21 à 31 dans lequel chaque trame de temps dure un temps correspondant à la durée de détection du deuxième signal .
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