FR2890080A1 - Procede in vitro pour tester la toxicite d'un compose et dispositif pour sa mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé et un dispositif destiné à tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés, par détermination du profil d'expression d'au moins un gène d'intérêt choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°51 qui sont définies dans la présente description.

Description

RESUME DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de l'étude toxicologique de composés, vis-à-vis de la santé de l'homme en particulier.

Plus précisément, la présente invention concerne des procédés et des dispositifs d'étude de la toxicité de composés qui sont réalisés sur des cellules en culture, sans nécessiter de recours à des tests in vivo sur des espèces modèles de l'homme.

Encore plus précisément, les procédés et les dispositifs de l'invention sont utilisés dans le domaine de la toxicogénomique, dans lequel la toxicité d'un io composé ou d'une combinaison de composés est déterminée par analyse du profil d'expression d'ensembles définis de marqueurs spécifiques (gènes, protéines et autres biomolécules).

ART ANTERIEUR

L'éventuelle toxicité de nombreux composés pour l'homme et son environnement est une préoccupation publique croissante.

En effet, bien que l'espérance de vie dans les pays industrialisés ait régulièrement progressé depuis 50 ans, il s'avère que l'accroissement de l'espérance de vie soit en grande partie liée aux progrès réalisés dans le domaine des soins néo-natals. En revanche, l'âge moyen des individus en bonne santé n'a pas ou peu changé depuis le début du vingtième siècle. Par exemple, en France, l'âge moyen des individus en bonne santé était de 56 ans en 2005 et est resté inchangé depuis plus de 80 ans, ce qui signifie que les chances de survie au-delà de cet âge moyen sont essentiellement dues aux progrès de la médecine. On note en particulier une progression importante d'affections neurologiques, d'affections allergiques et de cancers, qui sont en majorité dues à des causes environnementales. Parmi ces causes environnementales, une grande partie est constituée par les contacts fréquents, ou sur des longues périodes de temps, des individus avec les quelques 100 000 produits chimiques qui ont été introduits dans l'environnement.

C'est la raison pour laquelle, depuis quelques années, il est ressenti une nécessité d'évaluer le potentiel toxique pour la santé humaine et animale des nombreux produits chimiques présents dans l'environnement, y compris les pesticides, les divers solvants, les produits ménagers, les produits entrant dans la composition des aliments, les produits de cosmétiques, les médicaments.

Depuis plus d'un siècle, la toxicité d'une substance est testée sur des animaux, en particulier les rongeurs tels que les souris, les rats, les cobayes et les lapins.

Considérant qu'aucune espèce ne peut servir de modèle biologique fiable pour une autre, on a cherché à mettre au point des techniques de détermination de la toxicité de composés in vitro. On a notamment mis au point des techniques de toxicologie in vitro sur des cellules, notamment des techniques basées sur l'évaluation des modifications de la physiologie des cellules, par exemple des modifications des activités enzymatiques io intracellulaires, ou encore une atteinte à la viabilité cellulaire, susceptibles d'être provoquées par les composés testés, lorsque ceux-ci sont toxiques.

Beaucoup plus récemment, on a mis au point des techniques d'évaluation toxicologiques in vitro basées sur la détection des changements du profil d'expression de certains gènes susceptibles d'être induits par les composés testés. Ces techniques récentes sont globalement désignées comme appartenant au domaine de la toxicogénomique.

La mise en ceuvre de procédés d'évaluation toxicologique in vitro à l'aide de techniques de toxicogénomique est par exemple décrite dans les brevets américains n US 6,160,105, n US 6,372,431, n US 6,403,778 ou encore dans la demande de brevet américain publiée sous le n US 2004/0005547.

En général, la mise au point de dispositifs de tests toxicologiques in vitro utilisable en toxicogénomique implique la détermination préalable d'un ensemble de gènes dont une dérégulation de l'expression indique une toxicité pour les cellules, pour les organes ou pour l'organisme entier. Une fois qu'un ensemble de gènes physiologiquement pertinent a été défini, on fabrique des supports de test sur lesquels sont immobilisés des ligands capables de se fixer spécifiquement aux produits d'expression des gènes d'intérêt, essentiellement les ARN messagers et/ou les ADN complémentaires correspondants, mais parfois aussi les protéines ou d'autres biomarqueurs spécifiques correspondants.

Par exemple, les ligands consistent en des acides nucléiques capables de s'hybrider aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires générés au cours de l'expression des gènes d'intérêt. Ces biomarqueurs sont en général immobilisés sur un support solide sous la forme de matrices ordonnées en deux dimensions, encore appelées puces , à ADN, à protéines ou autres biomolécules.

Il existe donc un besoin dans l'état de la technique pour des procédés utiles pour la prédiction des effets toxiques ou le pouvoir pathologique de composés qui possèdent les nombreux avantages techniques des procédés de toxicogénomique.

DESCRIPTION DES FIGURES

io La Figure 1 présente un ensemble de 6 histogrammes qui constituent le résultat d'un test de toxicité d'une des substances étudiées, l'aldicarb. Les gènes étudiés sont classés dans 6 familles pathologiques. Pour chaque famille, la dérégulation éventuelle des gènes est indiquée par une barre, gris foncée pour la répression, gris claire pour la stimulation de l'expression du gène par l'insecticide aldicarb. Le chiffre dans ou derrière la barre indique le taux de dérégulation (référence: 1, pas de dérégulation; supérieur à 1: stimulation; inférieur à 1: répression). Les résultats pour chaque gène sont donnés par temps d'exposition (24 et 48h) sur deux lignes consécutives, les concentrations (ic5O et ic50/10) dans deux colonnes consécutives. Le chiffre en bas de chaque colonne donne le taux maximum observé dans la colonne. La figure 1 est relative à l'effet de l'aldicarb sur les cellules hépatiques.

La Figure 2, présente un ensemble de 6 histogrammes qui constituent le résultat d'un test de toxicité d'une des substances étudiées, l'aldicarb, effectué dans les mêmes conditions que pour la figure 1. La figure 2 est relative à l'effet de l'aldicarb sur les cellules neuronales.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Selon l'invention, il a été mis au point de nouveaux procédés et de nouveaux dispositifs utiles dans l'évaluation des effets toxiques et pathologiques de composés ou de combinaisons de composés, ces nouveaux procédés et nouveaux dispositifs étant basés sur les techniques de toxicogénomique.

Plus précisément, on a identifié selon l'invention un ensemble de gènes dont l'expression dans les cellules est altérée lorsque les cellules, mises en présence de composés s'engagent dans des voies pathologiques.

Les travaux expérimentaux du demandeur ont ainsi permis de définir de nouvelles familles de gènes dont une dérégulation de l'expression cellulaire indique une altération de la physiologie de la cellule susceptible d'entraîner une cytotoxicité, une toxicité pour un tissu ou un organe, ou une toxicité pour l'organisme entier.

Sur la base de ces travaux, le demandeur a mis au point des procédés et io des dispositifs qui permettent de détecter des modifications dans le profil d'expression d'un ou plusieurs des gènes d'intérêt englobés dans cet ensemble original de gènes et ainsi de prédire les éventuels effets toxiques ou pathologiques d'un composé à tester pour la cellule, pour un organe ou pour un organisme entier.

L'invention a pour objet un procédé in vitro pour tester la toxicité d'un agent physique ou chimique ou d'une combinaison d'agents physiques ou chimiques, comprenant les étapes suivantes: a) cultiver des cellules de mammifère en présence de l'agent chimique ou physique ou de la combinaison de composés à tester; b) déterminer, dans les cellules obtenues à la fin de l'étape a), le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt choisis dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51; c) comparer le profil d'expression dudit ou desdits gène(s) déterminé à l'étape b) avec le profil d'expression dudit ou desdits gènes lorsque l'étape a) est réalisée en l'absence du composé ou de la combinaison de composés à tester.

Par composé à tester ou composé testé , on entend selon l'invention tout type de composé naturel ou de composé obtenu, partiellement ou totalement, par synthèse chimique ou biologique, des mélanges en formulations de tels composés, ou des agents physiques (rayonnements y compris rayonnements ionisants et/ou micro-ondes et dont les éventuels effets toxiques ou pathologiques sur les cellules sont recherchés.

Par combinaison de composés à tester ou combinaison de composés testés , on entend selon l'invention un mélange ou une association de composés naturels ou de composés obtenus, partiellement ou totalement, par synthèse chimique ou biologique ou une association de ces composés avec des agents physiques. Il peut aussi s'agir de compositions complexes comprenant une combinaison de nombreux composés connus ou non connus, purifiés ou non purifiés, caractérisés ou non caractérisés. Une combinaison de composés selon l'invention englobe notamment des combinaisons de composés connus, comme par exemple des combinaisons ou formulations de composés pesticides ou de composés utilisés dans le domaine cosmétique ou pharmaceutique ou encore dans tout autre domaine de l'industrie. Une combinaison de composés selon l'invention englobe aussi des compositions io dans lesquelles aucun constituant n'est connu, ou dans lesquelles seulement certains des constituants sont connus, comme par exemple dans les effluents industriels dont on recherche les éventuels effets toxiques.

Selon l'invention on a montré que les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51 forment une ensemble large et original de séquences d'ADNc correspondant aux ARN messagers codés par des gènes dont une dérégulation de l'expression indique une toxicité ou une pathologie pour la cellule, pour un tissu ou un organe, ou pour un organisme entier.

De manière générale, cet ensemble large et original de séquences comprend des sous-ensembles de séquences dérivées de gènes dont une dérégulation prédispose à, ou provoque, respectivement, (i) une cancérogénèse génotoxique ou non-génotoxique, (ii) un stress cellulaire, (iii) une neurotoxicité, (iv) une réponse hormonale ou encore (iv) une modification dans le contrôle de la structure des protéines.

Plus précisément, comme cela est illustré dans le Tableau 1, l'ensemble 25 original de séquences selon l'invention comprend plusieurs sous- ensembles de séquences, respectivement: (i) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans le stress cellulaire, qui comprend les séquences SEQ ID N 1 à 9. Ce sous-ensemble comprend lui-même deux sous- ensembles, respectivement (i-1) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans le stress oxydatif, qui comprend les séquences SEQ ID N 1 à 5, et (i-2) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans l'inflammation, qui comprend les séquences SEQ ID N 6 à 9; (ii) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans 35 l'altération de l'ADN, qui comprend les séquences SEQ ID N 10 à 18. Ce sous-ensemble comprend lui-même trois sous-ensembles, respectivement (ii1) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire, qui comprend les séquences SEQ ID N 10 à 12, (ii-2) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans l'apoptose, qui comprend les séquences SEQ ID N 13 à 16, et (ii-3) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la stabilisation et la réparation de l'ADN, qui comprend les séquences SEQ ID N 17 à 18; (iii) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans io la régulation du cycle cellulaire, qui comprend les séquences SEQ ID N 19 à 27. Ce sous-ensemble comprend lui-même deux sous-ensembles, respectivement (iii-1) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la voie mitogène, qui comprend les séquences SEQ ID N 19 à 20, et (iii-2) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la survie cellulaire, qui comprend les séquences SEQ ID N 21 à 27; (iv) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la neurotoxicité, qui comprend les séquences SEQ ID N 28 à 35; (v) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la réponse cellulaire aux hormones, en particulier aux oestrogènes et aux androgènes, qui comprend les séquences SEQ ID N 36 à 45; et (vi) un sous-ensemble de séquences dérivées de gènes impliqués dans la réponse cellulaire à l'agrégation de protéines qui comprend les séquences SEQ IDN 46à51.

Dans certains modes de réalisation du procédé ci-dessus, le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé en valeur absolue, à l'aide de la technique de détermination appropriée.

Dans d'autres modes de réalisation du procédé ci-dessus, le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé en valeur relative, à l'aide de la technique de détermination appropriée, par comparaison avec le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes témoins ubiquitaires, dits de ménage .

De préférence, à l'étape b) du procédé, on détermine le profil d'expression d'au moins deux gènes d'intérêt choisis dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51. Ainsi, à l'étape b) du procédé, on détermine le profil d'expression d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 gènes d'intérêt choisis dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

Dans certains modes de réalisation avantageux du procédé ci-dessus, on détermine le profil d'expression de plusieurs des gènes ci-dessus dont au moins un gène est choisi dans chacun des sous-ensembles de gènes (i) (vi) définis ci-dessus.

Dans d'autres modes de réalisation avantageux du procédé ci-dessus, on détermine le profil d'expression de plusieurs des gènes ci-dessus dont au io moins un gène est choisi dans chacun des sous-ensembles de gènes (i-1), (i-2), (ii-1), (ii-2), (iii-3), (iii-1), (iii-2), (iv), (v) et (vi) définis ci-dessus.

Comme cela est illustré dans les exemples, le demandeur a réalisé des tests de toxicité avec 28 composés, y compris des pesticides, notamment des insecticides, des solvants, ainsi que divers autres produits industriels tels que des composés utilisés dans la chimie des polymères, des composés entrant dans la composition de produits alimentaires ou encore des composés entrant dans la composition de produits pharmaceutiques. La liste des 28 composés testés est décrite dans le Tableau 2, à la fin de la présente description.

Notamment, le procédé a été mis en ceuvre avec divers composés à tester dont la toxicité chez l'homme est soupçonnée, d'après les tests sur modèles animaux.

Les résultats qui ont été obtenus montrent que ces composés soupçonnés comme toxiques induisent quasi-systématiquement une dérégulation d'un sous-ensemble plus ou moins restreint de gènes, parmi les gènes d'intérêt de séquences SEQ ID N 1 à 51. Ces résultats ont permis au demandeur de définir un sous-ensemble minimal de gènes dont le profil d'expression est déterminé, à l'étape b) du procédé.

Avantageusement, à l'étape b) du procédé ci-dessus, on détermine le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25 SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 31, SEQ ID N 33, SEQ ID N 35, SEQ ID N 36, SEQ ID N 37, SEQ ID N 38, SEQ ID N 39, SEQ ID N 40, SEQ ID N 42, SEQ ID N 47, SEQ ID N 48, SEQ ID N 49, et SEQ ID N 50.

Les séquences ci-dessus ont été regroupées dans le Tableau 3, à la fin de la présente description.

De manière tout à fait préférée, à l'étape b) du procédé ci-dessus, on détermine le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 8, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 33, SEQ ID N 37, SEQ ID N 39, et SEQ ID N 48.

io Les séquences ci-dessus ont été regroupées dans le Tableau 4, à la fin

de la présente description.

Par profil d'expression d'un gène, au sens de l'invention, on entend le niveau d'ARN messager produit dans la cellule du fait de l'expression dudit gène, en qualité, ou à la fois en qualité et en quantité, ou encore le niveau d'ADN complémentaire (ADNc) correspondant.

Une différence dans le profil d'expression d'un gène d'intérêt parmi ceux définis ci-dessus, entre (i) celui qui est déterminé pour les cellules exposées au composé à tester et (ii) celui qui est déterminé pour les cellules cultivées en l'absence du composé à tester, indique que ledit composé est, au moins potentiellement, toxique pour les cellules, pour un organe ou encore pour l'organisme entier.

Préférentiellement, à l'étape b) du procédé, le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé par détection de l'ARN messager correspondant à chaque gène, qui est éventuellement produit par les cellules cultivées à l'étape a) du procédé. Selon une alternative, le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé par détection et quantification de l'ARN messager correspondant à chaque gène, qui est éventuellement produit par les cellules cultivées à l'étape a) du procédé Selon un autre mode de réalisation préférentiel, à l'étape b) du procédé, la détermination du profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est réalisée par mise en contact (i) des ARN messagers produits par les cellules cultivées à l'étape a) ou (ii) des ADN complémentaires synthétisés à partir de ces ARN messagers, avec au moins une sonde nucléotidique s'hybridant au dit ou aux dits gène(s) d'intérêt, dans des conditions appropriées pour la formation d'un complexe d'hybridation entre lesdits ARN messagers ou lesdits ADN complémentaires, d'une part, et ladite ou lesdites sondes nucléotidiques, d'autre part.

Par sonde nucléotidique , au sens de l'invention, on entend un polynucléotide qui s'hybride spécifiquement à un acide nucléique contenu dans un échantillon, cet acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène déterminé, ledit gène déterminé étant choisi parmi les gènes d'intérêt définis dans la présente description Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK ET AL. (Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), GLOVER (GLOVER (ed.), 1985. DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II Oligonucleotide Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.), GAIT (GAIT (ed.), (1984). Nucleic Acid Hybridization. ), RAMES et HIGGINS (NAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization: a practical approach, Rames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.) et AUSUBEL et al. (Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y).

Selon l'invention, on entend par acide nucléique un désoxyribonuléoside, un ribonucléoside, un polymère de désoxyribonucléotides, un polymère de ribonucléotides, indifféremment sous la forme d'une molécule simple brin ou d'une molécule double brin, y compris un ARN, un ADN ou une molécule hybride ARN/ADN. Le terme acide nucléique englobe les analogues non naturels des nucléotides naturels.

Ainsi, le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04064.

Les termes " acide nucléique ", "polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme double brin. i0

Selon l'invention, un acide nucléique résultant directement de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement le ou les ARN messagers synthétisés durant l'étape de transcription dudit gène.

Selon l'invention, un acide nucléique résultant indirectement de la transcription d'un gène déterminé englobe essentiellement un ADNc obtenu par la transcription inverse d'un ARN messager synthétisé durant l'étape de transcription dudit gène. En général, la transcription inverse de l'ARN messager est réalisée en présence d'une enzyme transcriptase inverse.

Une sonde nucléotidique de l'invention est spécifique d'un acide io nucléique résultant directement ou indirectement de la transcription d'un gène cible choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51 et ne s'hybride pas avec un quelconque autre acide nucléique également contenu dans le même échantillon, dans des conditions de stringence appropriées utilisées pour la réaction d'hybridation, qui sont de manière préférentielle des conditions de forte stringence.

Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes: Préhybridation: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.

Hybridation: x SSPE (0.9 M NaCl, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA) x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB) 100 pg/ml ADN de sperme de saumon 0.1% SDS durée: 1 nuit.

Lavaqes: 2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65 C 1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C 0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65 C 0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65 C.

Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Il

Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 81,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) -0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.545 9.62).

Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).

Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est io approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en-dessous de Tm.

Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en ceuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).

En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité 20 d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que: a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de 25 bases A-T ou A-U; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique; d) la force ionique: le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation; e) la température d'incubation; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent 35 la stringence de l'hybridation; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.

De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention possède une séquence nucléotidique exactement complémentaire à la séquence cible visée. Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation 5'-* 3' est inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G. Une sonde nucléotidique selon l'invention est une sonde nucléotidique hybridant spécifiquement, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique d'un ARN messager, ou de l'ADNc correspondant, qui est le produit de la transcription d'un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

Une sonde nucléotidique de l'invention a au moins 20 nucléotides de longueur et peut atteindre une longueur de plusieurs kilobases, par exemple jusqu'à 6 kilobases, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de la séquence cible visée. Avantageusement, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur allant de 20 à 500 bases de longueur, de préférence de 20 à 250 bases de longueur.

Par exemple, une sonde nucléotidique selon l'invention peut comprendre 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 110, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900 ou 4000 bases de longueur, la taille maximale de la sonde étant limitée par la taille de l'acide nucléique cible visé.

De manière générale, la longueur d'une sonde nucléotidique selon l'invention peut être définie par la formule suivante: Ls= x dans laquelle - Ls est la longueur en bases de la sonde, et - x est un entier égal ou supérieur à 20, et x est égal ou inférieur à la longueur en bases (La) de l'acide nucléique cible visé, résultant directement ou indirectement de la transcription d'un gène d'intérêt tel que défini dans la présente description.

Une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (Narang SA, Hsiung HM, Brousseau R, Methods Enzymol 1979; 68:90-98) ou de BROWN et al. (Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzymol 1979;68:109-151), la méthode aux diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (Beaucage et al., Tetrahedron Lett 1981, 22: 1859-1862) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen N EP 0 707 592.

Pour fabriquer une sonde nucléotidique selon l'invention, qui s'hybride avec le produit de transcription, ARN messager ou ADNc, d'un gène d'intérêt selon l'invention, l'homme du métier peut synthétiser un polynucléotide dont la séquence est identique à une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs de l'ADNc correspondant à ce gène, ou un polynucléotide complémentaire d'une séquence d'au moins 20 nucléotides consécutifs d'un ARN messager produit par ce gène. La taille de la séquence cible sera fonction de la taille recherchée pour la sonde nucléotidique, dans les limites spécifiées précédemment.

A partir de chacune des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, l'homme du métier peut aisément obtenir l'ARN messager complet ou l'ADNc complet correspondant à un gène d'intérêt selon l'invention.

Selon une première méthode, l'homme du métier peut rechercher la 35 séquence d'ARNm ou d'ADNc complète du gène unique comprenant l'une des séquences d'intérêt SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51 en sélectionnant, dans chacune des séquences d'intérêt, la séquence du polynucléotide à synthétiser pour fabriquer la sonde nucléotidique Selon une seconde méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'un ARN messager unique avec lequel ladite amorce s'hybride, dans les conditions d'hybridation appropriées, de préférence des conditions d'hybridation de forte stringence. L'étape d'hybridation, puis d'allongement de l'amorce peuvent être réalisées par l'homme du métier selon des techniques conventionnelles, par extraction préalable des ARN messagers présents dans des cellules de mammifère humain ou non humain, en culture primaire ou en lignée cellulaire, puis mise en contact de l'amorce spécifique dans les conditions d'hybridation appropriées, puis allongement de l'amorce en présence d'une transcriptase inverse. L'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit ci-dessus peut alors être directement utilisée comme sonde spécifique. Alternativement, l'amorce nucléotidique ayant subi l'allongement décrit ci-dessus peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'exonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Selon une troisième méthode, l'homme du métier peut synthétiser au moins une amorce nucléotidique spécifique d'un gène d'intérêt choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, puis utiliser cette amorce pour produire un ADNc complet à partir d'une collection de clones comprenant des vecteurs dans lesquels sont insérés des ADNc provenant de cellules de mammifère humain ou non humain, selon des techniques connues de l'homme du métier. L'ADNc complet ainsi généré peut alors être directement utilisé comme sonde spécifique. Alternativement, LADNc complet peut servir de produit de départ pour la fabrication de la sonde spécifique finale, par exemple par l'action d'exonucléases, ou encore par l'action d'endonucléases de restriction, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, la ou les sondes nucléotidiques sont choisies parmi les polynucléotides ayant au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, ou au moins 20 nucléotides consécutifs des séquences complémentaires aux séquences SEQI DN 1 à SEQ ID N 51.

Dans certains autres modes de réalisation du procédé de l'invention, chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à 51. Alternativement, chaque sonde nucléotidique consiste en un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de celle d'un polynucléotide inclus dans la séquence d'un ARN messager ou d'un ADNc correspondant à un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

A l'étape b) du procédé, on utilise au moins une sonde nucléotidique choisie parmi les sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.

Dans certains modes de réalisation du procédé, on utilise la totalité des sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé, on utilise à l'étape b) plusieurs sondes s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique déterminé, résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

Selon un premier aspect de cet autre mode de réalisation, pour un acide nucléique cible donné, on utilise à l'étape b) plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec la même séquence cible, le nombre de sondes nucléotidiques de séquences identiques pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, on peut réaliser encore plus aisément une mesure quantitative de l'acide nucléique cible contenu dans l'échantillon testé.

Selon un second aspect de cet autre mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, on utilise à l'étape b) plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique, le nombre de sondes pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, on peut réaliser le procédé de l'invention avec une grande sensibilité de détection, du fait de sa capacité à détecter ledit acide nucléique cible dans l'échantillon testé, même dans le cas où ledit acide nucléique cible a subi des altérations physiques dans l'échantillon, comme par exemple des coupures par des exo-ou des endo- nucléases présentes dans la matériel source de départ, par exemple dans un extrait cellulaire, ou présentes dans l'échantillon à tester.

Par échantillon , on entend selon l'invention un matériel résultant, directement ou indirectement, de l'extraction des ARN messagers cellulaires obtenus à partir des cellules cultivées à l'étape a) du procédé ou, dans certains modes de réalisation de ce procédé, à partir des cellules cultivées à l'étape a1) ou à l'étape a3) du procédé de l'invention. L'échantillon peut être aussi un milieu contenant des ADNc obtenus à partir des ARN messagers préalablement extraits à partir des cellules cultivées aux étapes a), a1) ou a3) du procédé de l'invention.

Selon encore d'autres modes de réalisation du procédé, pour un acide nucléique cible déterminé, on utilise à l'étape b) plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant spécifiquement avec ledit acide nucléique cible, comme cela est décrit pour les sondes s'hybridant avec les acide nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, ou une séquence complémentaire des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51 Avantageusement, à l'étape b) du procédé, on utilise au moins 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.

De manière générale, le nombre total de sondes utilisées à l'étape b) du procédé dépend en premier lieu du nombre d'acides nucléiques cibles distincts, correspondant chacun en un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, que l'on cherche à détecter qualitativement, ou à la fois qualitativement et quantitativement, dans l'échantillon, c'est à dire dont on cherche à déterminer le profil d'expression. Ainsi, le nombre minimum total de sondes utilisées à l'étape b) du procédé de l'invention est défini par la formule suivante: Nsmin-y, dans laquelle: - Nsmin est le nombre minimal de sondes; et - y représente le nombre d'acides nucléiques cibles distincts que l'on cherche à détecter, parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

De plus, le nombre total de sondes nucléotidiques utilisées à l'étape b) du procédé dépend également du nombre de sondes nucléotidiques identiques 35 s'hybridant avec la même séquence cible incluse dans un acide nucléique déterminé que l'on cherche à détecter et dépend aussi du nombre de sondes s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique cible. Ainsi, le nombre de sondes utilisées à l'étape b) du procédé de l'invention peut aussi être exprimé selon la formule suivante: Ntotal= [[(aal.Al ai) + (aa2.A1 a2) +...+ (any.Al ay)] + L(abl.A2a2) + (ab2.A2a2) +...+ (abny.A2ay)] +... + [(axl.AXax) + (ax2.A1 a2) +...+ (axny.AXay)]], dans laquelle: - Ntota, est le nombre total de sondes; et Al, A2, ..., AX représentent les acides nucléiques correspondant aux io produits de transcription (ARNm ou ADNc) des gènes Al, A2, ..., AX correspondant aux séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51; - X est un entier dont la valeur maximale est égale à 51; - Al ai, Al a2, ..., Al an représentent respectivement les séquences cibles distinctes al, a2, ..., an, contenues dans l'acide nucléique cible Al, pour lesquelles au moins une sonde s'hybride spécifiquement; - n est un entier compris entre 0 et 100, et est préférentiellement égal à 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20; - anl, an2, ..., any représentent le nombre de sondes identiques s'hybridant à la même séquence cible Al ai, Al a2, contenue dans l'acide nucléique cible Al et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20; Une condition obligatoire est qu'à l'étape b) du procédé, on utilise au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, ou avec une acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

Plus le nombre de sondes s'hybridant spécifiquement avec des acides nucléiques cibles distincts est grand, plus la précision concernant les effets toxiques du composé ou de la combinaison de composés à tester peut être grande.

Selon un autre mode de réalisation, on utilise à l'étape b) du procédé au moins une sonde s'hybridant avec chacun des acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, ou comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

En général à l'étape b) du procédé, on utilise aussi au moins une sonde nucléotidique s'hybridant avec un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi des gènes de ménage potentiels, et en particulier les gènes de séquences SEQ ID N 27, SEQ ID N 35, SEQ ID N 45 et SEQ ID N 51.

Selon encore un autre mode de réalisation du procédé, on utilise à l'étape b) certaines seulement des sondes nucléotidiques ci-dessus, en fonction du type d'effets toxiques qui sont suspectés pour le composé ou la combinaison io de composés à tester.

La mise en ceuvre pratique du procédé de test selon l'invention, comme décrit dans les exemples, a montré que, dans certains cas, seulement certains sous-ensembles de sondes sont nécessaires pour obtenir un résultat prédictif staisfaisants des effets toxiques du composé ou de la combinaison de composés à tester.

Chacune des sondes nucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marquée, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P 3H, 35S, ), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine), des molécules chimioluminescentes ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3' Les sondes nucléotidiques utilisées à l'étape b) du procédé de l'invention peuvent se présenter sous forme libre, en suspension dans une solution adaptée à la réalisation de la réaction d'hybridation avec les acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon à tester.

Selon une caractéristique avantageuse du procédé de l'invention, la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support.

Selon une autre caractéristique avantageuse du procédé de l'invention, la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support sous la forme 35 d'une matrice ordonnée en deux dimensions.

A l'étape a) du procédé, les cellules de mammifères qui sont cultivées sont choisies parmi les cellules en culture primaire et les lignées cellulaires.

Les cellules en culture primaire englobent tout type de cellules originaires de l'espèce sur laquelle on veut évaluer la toxicité, humaine ou non humaine, tels que des hépatocytes, des cellules neuronales, des cellules épithéliales, des cellules endothéliales, des cellules intestinales, des cellules rénales, et des cellules du système immunitaire, telles que les lymphocytes, les macrophages ou encore les neutrophiles, qui peuvent être isolées et maintenues en culture selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Les lignées cellulaires englobent toute lignée de cellules, de mammifère en particulier, y compris les lignées de cellules hépatocytes, de cellules neuronales, de cellules épithéliales ou encore de cellules endothéliales, que l'on peut se procurer aisément auprès de collections de culture nationales ou internationale, telle que I'ATCC (American Type Culture Collection, Etats-Unis).

Préférentiellement, s'agissant de tester la toxicité de composés ou d'agents physiques chez l'homme, les cellules en culture primaire ou les cellules de lignée cellulaires consistent en des cellules humaines.

Comme lignée de cellules d'hépatocytes, on peut utiliser la lignée cellulaire Hep G2, qui est commercialisée par I'ATCC sous le n HB-8065.

Comme lignée de cellules neuronales, on peut utiliser la lignée cellulaire SH-SY5Y, qui est commercialisée par I'ATCC sous le n CRL-2266.

On sait que de nombreux types de cellules, lorsqu'elles sont incubées avec un composé donné, internalisent ce composé qui peut être modifié chimiquement à l'intérieur des cellules, du fait des conditions physicochimiques intracellulaires (hydropathie du milieu, force ionique, conditions salines, pH, conditions d'oxydoréduction, etc.) et du fait de l'action catalytique des enzymes cellulaires. Puis, le composé qui a été chimiquement modifié à l'intérieur de la cellule peut y circuler ou être libéré à l'extérieur de la cellule et circuler localement dans l'espace intercellulaire, dans l'organe ou circuler de manière systémique, par exemple après son passage dans la circulation sanguine ou dans la circulation lymphatique. On connaît de nombreux exemples de composés qui subissent des modifications chimiques intracellulaire conduisant à la production de métabolites toxiques.

C'est la raison pour laquelle, dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, avant de réaliser l'étape b), le composé ou la combinaison de composés à tester est d'abord soumis à une étape de métabolisation intracellulaire, par un premier type de cellules de mammifère, puis l'éventuelle toxicité des métabolites produits dans ce premier type de cellules de mammifère est testé sur un second type de cellules de mammifère.

Ainsi, dans un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, l'étape a) comprend les étapes suivantes: a1) cultiver un premier type de cellules de mammifère en présence du composé ou de la combinaison de composés à tester; a2) récupérer le surnageant de culture de cellules à la fin de l'étape a1) ; io a3) cultiver un second type de cellules de mammifère en présence: - du surnageant de culture cellulaire obtenu à l'étape a2) ; ou - d'au moins une fraction purifiée du surnageant de culture cellulaire obtenu à l'étape a2) contenant des produits de la métabolisation du composé ou de la combinaison de composés à tester par les cellules cultivées à l'étape a1).

Avantageusement, à l'étape a1), le premier type de cellules de mammifère consiste en des hépatocytes en culture primaire ou en une lignée cellulaire d'hépatocytes. Il s'agit préférentiellement d'hépatocytes humains.

Selon un aspect illustratif, à l'étape a3), le second type de cellules de mammifère consiste en des cellules neuronales en culture primaire ou en une lignée de cellules neuronales. Il s'agit préférentiellement de cellules neuronales humaines.

La présente invention a encore pour objet un dispositif pour tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés qui est susceptible d'être utilisé dans le procédé de détection défini dans la présente description.

Dispositif selon l'invention pour tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés.

La présente invention a aussi pour objet un dispositif pour tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés, comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

Dans certains modes de réalisation, le dispositif de l'invention comprend aussi une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi parmi des gènes de ménage potentiels, et en particulier les gènes de séquences SEQ ID N 27, SEQ ID N 35, SEQ ID N 45 et SEQ ID N 51.

Dans certains modes de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans chacun des sous-ensembles de gènes (i) à (vi) définis précédemment dans le présente description.

Dans certains modes de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans chacun des sous-ensembles de gènes (i-1), (i-2), (ii-1), (ii-2), (iii-3), (iii-1), (iii-2), (iv), (v) et (vi) définis précédemment dans la présente description.

Dans certains modes de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25 SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 31, SEQ ID N 33, SEQ ID N 35, SEQ ID N 36, SEQ ID N 37, SEQ ID N 38, SEQ ID N 39, SEQ ID N 40, SEQ ID N 42, SEQ ID N 47, SEQ ID N 48, SEQ ID N 49, et SEQ ID N 50.

Dans certains modes de réalisation, le dispositif selon l'invention comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 8, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 33, SEQ ID N 37, SEQ ID N 39, et SEQ ID N 48.

De manière tout à fait préférée, le dispositif de détection selon l'invention est caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques contenues dans celui-ci sont immobilisées sur un support.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.

Selon un mode de réalisation préféré, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support sont ordonnées en matrices, comme dans les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N 5,143,854, dans les demandes PCT N WO 90/150 70 et io 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N 5,412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Selon une mode de réalisation particulièrement avantageux, les sondes contenues dans le dispositif de détection de l'invention sont immobilisées sur le support de manière ordonnée, par exemple sous la forme d'une matrice de sondes.

De manière tout à fait préférée, dans la matrice ordonnée de sondes, la position de chaque sonde distincte est prédéterminée et connue.

L'invention a aussi pour objet un dispositif de détection de la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ IDN 51, caractérisé en ce ledit dispositif comprend au moins une sonde nucléotidique ou une pluralité de sondes nucléotidiques telles que définies dans la présente description, la ou les sondes nucléotidiques étant immobilisées sur un support.

Selon un premier aspect, le dispositif ci-dessus est caractérisé en ce que la pluralité de sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.

Ledit support sur lequel sont immobilisées les sondes constitutives du le dispositif de détection selon l'invention consiste en un support solide. Les sondes nucléotidiques sont fixées sur ledit support, directement ou indirectement, par couplage d'une ou plusieurs molécules de liaison ( linkers ) sur le support, puis par couplage de chaque sonde sur une partie libre de la molécule de liaison. A titre illustratif, mais non limitatif, le support peut être un matériau polymère, un verre, une céramique, des fibres naturelles, un silicone, un métal et des matériaux composites des matériaux précédemment cités. Le support possède au moins une surface pratiquement plate. Par pratiquement plate , on entend une surface qui est macroscopiquement plane pour une fixation optimale des sondes nucléotidiques, par exemple sous la forme d'un réseau matriciel à deux dimensions.

La surface du support solide peut être fonctionnalisée par un silane, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain publiée sous le n US 2002/20081597 (Lowe et al.).

io Elle peut être aussi activée comme décrit dans la demande brevet américain publiée sous le numéro 2002/20076709 (Hevesi et al.). Dans ce cas, le support d'immobilisation des sondes comprend des groupes oléfiniques, soit que les groupes oléfiniques soient constitutifs du matériau support, soit qu'ils sont incorporés au matériau support par des réactions chimiques ou par le dépôt de surface de molécules contenant des groupes oléfiniques. Les groupes oléfiniques peuvent être apportés par exemple en les fixant avec des dérivés chlorosilane, puis en oxydant les groupes oléfiniques en aldéhyde.

La surface du support peut être également fonctionnalisée par des groupes thiols, comme décrit dans le brevet américain n US 5,412,087 (McGall et al. ).

Selon encore un autre mode de réalisation, les sondes nucléotidiques sont fixées de manière non covalent sur la surface du support, comme décrit par exemple dans la demande de brevet américain n 2002/20042069 (Myer et al.). Par exemple, les sondes nucléotidiques sont liées au support par des liaisons faibles telles, que des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des forces de Van der Waals, etc. De manière générale, un dispositif de détection selon l'invention, lorsqu'il se présente sous la forme d'une puce à ADN , peut être préparé selon les techniques décrites dans le brevet américain n US 6,403,320 (Read et al.) , la demande PCT publiée sous le n WO 95/11995 (Chee et al.) ou encore la demande PCT publiée sous le n WO 92/10092 (Fodor et al.).

Le dispositif de détection selon l'invention peut également se présenter sous la forme de matrices ou empilées ou stacked arrays , comme décrit dans la demande de brevet américain n 2002/20051995 (Kumar).

Pour les moyens mise en ceuvre pour la détection du ou des hybrides formés avec une sonde nucléotidique selon l'invention, immobilisée sur un support, et un acide nucléique contenu dans l'échantillon à tester, l'homme du métier se référera avantageusement aux différents demandes de brevet et brevet cités ci-dessus.

La détection des hybrides formés peut être réalisée notamment par mesure de fluorescence ou mesure de radioactivité, par exemple lorsque les acides nucléiques contenus dans l'échantillon ont été marqués, selon des techniques connues en soi, soit par une molécule fluorescente, soit par une io molécule radioactive, préalablement à leur mises en contact avec l'ensemble de moyens de détection ou avec le dispositif de détection selon l'invention.

La détection de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon peut être également réalisée par mesure de la variation de divers paramètres physiques du support, tels que la variation de la température, de la longueur d'onde d'un faisceau lumineux, de la conductivité ou de la résistivité de la surface du support, à l'endroit du support sur lequel est immobilisée une sonde qui s'est hybridée avec un acide nucléique présent dans l'échantillon à tester.

De manière tout à fait préférée, la localisation, sur la surface du support, de chaque sonde nucléotidique de séquence connue est prédéterminée. Ainsi, la mesure de la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon, en tout point de la surface du support sur lequel les sondes sont immobilisées, permet de déterminer dans un premier temps les différentes localisations de la surface du support auxquelles la présence d'un hybride sonde/acide nucléique de l'échantillon est détectée et/ou quantifiée. Dans un second temps, une comparaison des coordonnées spatiales en deux dimensions (pour les matrices ordonnées bidensionnelles) ou en trois dimensions (pour le matrices empilées ou stacked arrays ) avec une table préétablie de correspondance entre les différentes coordonnées spatiales du support et l'identité de la ou des sondesimmobilisées à ces coordonnées, permet directement de déterminer l'identité des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation qui sont actifs (si une hybridation avec la ou les sondes correspondantes est détectée) ou inactifs (si aucune hybridation avec la ou les sondes correspondantes n'est détectée).

L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la réalisation d'un profil d'expression de gènes choisis parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51, à partir d'un échantillon contenant les ARN messagers synthétisés par les cellules d'un mammifère humain ou non humain, ou des ADNc obtenus à partir desdits ARN messagers, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif de détection selon l'invention.

Selon un premier aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci-dessus comprend en outre les réactifs nécessaires pour effectuer la réaction d'hybridation entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit ensemble de moyens ou contenues dans ledit dispositif, c'est à dire les réactifs nécessaires à la réalisation d'un complexe d'hybridation entre les sondes io nucléotidiques comprises dans ledit dispositif et des acides nucléiques éventuellement présents dans l'échantillon à tester.

Selon un second aspect, le kit ou nécessaire tel que défini ci-dessus comprend en outre des moyens destinés à révéler les hybrides formés entre la ou les sondes nucléotidiques contenues dans ledit dispositif de détection et les acides nucléiques contenus dans l'échantillon.

La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

Exemple 1 Procédé de test de toxicité de composés selon l'invention.

Les hépatocytes Hep2G et les neuroblastes SH-SY5Y (fournies par DSMZ, Berlin) sont cultivés à confluence selon les indications du fournisseur, respectivement dans 90% RPMI16 et 10% FBS et 80% DMEM et 20% FBS (solutions fournies par Biochrom, Berlin). Les hépatocytes sont exposées aux substances examinées à deux concentrations, ic50 et ic50/10, pendant 24 et 48 heures. Après exposition, les hépatocytes sont récoltés, le surnageant récupéré et ajouté à la culture de neuroblastes, qui est ensuite cultivée dans les conditions de concentration et de temps d'exposition identiques à celles des hépatocytes dont on a prélevé le surnageant.

Les cellules sont lysées selon le principe mixer mill . L'ARN est extrait par la procédure FastPrep (Q-Biogene) et matrice D . L'ARN est fixé à haute salinité sur un gel de silice déposé sur une membrane, dans des conditions fortement dénaturantes (GITC) pour inhiber l'activité ARNasique, puis purifié avec le minikit RNeasy (Qiagen). Le contrôle de qualité de chaque échantillon est effectué sur un aliquot de 25-500 ng à l'aide du Bioanalyseur d'Agilent, qui en fournit la concentration (références 18S- et 28S- rRNA).

Le marquage fluorescent est effectué pour chaque échantillon en deux fois, partant de 20pg d'ARN réverse-transcrits en ADN, en présence de nucléotides portant les fluorochromes Cy3 (non exposé à la substance, vert) ou Cy5 (exposé, rouge) et d'amorces oligo(dT), suivi d'une étape de purification pour éliminer les nucléotides non incorporés. Pour l'évaluation quantitative du marquage, un aliquote est analysé par électrophorèse dans un micro-gel. Les io deux préparations d'ADN marquées sont ensuite réunies L'hybridation suit un protocole assurant la concordance entre les deux réplicats (chaque puce à ADN porte deux fois le même gène, et deux lames ( réplicats ) sont utilisées par substance, concentration, temps d'exposition et type de cellule), le contrôle positif (puce exposée à ARN non traité de neuroblastes comparé à ARN non traité d'hépatocytes) et le contrôle négatif (puce exposée au milieu de culture). Il y a donc 20 hybridations par substance (2 lignées cellulaires x 2 concentrations x 2 temps d'exposition x 2 réplicats, plus 2 contrôles x 2 réplicats), chacune exécutées en double (2 fois le même gène sur la puce). L'hybridation s'effectue sous une lame couvre-objet pendant 48 h à 42 C. Le matériel non hybridé ou partiellement hybridé est élué par lavages successifs de la lame à des astringences croissantes.

Les puces sont produites sur spécifications, par une technologie propriétaire de Scienion AG (Berlin). Les cDNA des gènes sélectionnés sont analysés par informatique pour identifier dans chacun la séquence de 60 bases consécutives assurant l'hybridation la plus forte. La séquence codante de ce tronçon est synthétisée (technique par phophoramidite), puis fixée par son extrémité 5' sur une lame de verre convenablement traitée au préalable (procédé Scienion) La puce est ensuite balayée par faisceau laser excitateur de fluorescence (532nm pour Cy3, non exposé, et 635nm pour Cy5, exposé) et l'intensité des fluorescences mesurée séquentiellement pour chaque spot (gène) et digitalisé sur 16 bits (dynamique de 0 à 65535). L'image de la puce est ensuite analysée à l'aide d'un logiciel dédié (GenePix Pro 4.1), qui comporte une fonction de reconnaissance et d'analyse des spots. A cette fin, une grille est superposée à la puce pour ségmenter l'image, permettant une séparation du signal du bruit de fond, et de localiser chaque spot pour en mesurer l'intensité et le bruit de fond local. Les mesures sont ensuite analysées, pour en évaluer la qualité, comparer le signal du gène non exposé à celui du même gène exposé, normaliser et classer les résultats.

io Example 2 Détail du test de toxicité d'une des substances étudiées: aldicarb Les gènes sont classés dans les 6 familles pathologiques. Pour chaque famille, la dérégulation éventuelle des gènes est indiquée par une barre de couleur, gris foncé pour la répression, gris clair pour la stimulation de l'expression du gène par l'insecticide aldicarb. Le chiffre dans ou derrière la barre indique le taux de dérégulation (référence: 1, pas de dérégulation). Les résultats pour chaque gène sont donnés par temps d'exposition (24 et 48h) sur deux lignes consécutives, les concentrations (ic50 et ic50/10) dans deux colonnes consécutives. Le chiffre en bas de chaque colonne donne le taux maximum observé dans la colonne. La figure 1 est relative à l'effet de l'aldicarb sur les cellules hépatiques, la figure 2, sur les cellules neuronales.

Exemple 3 Résumé des effets toxiques des 28 substances testées.

Les potentiels pathologiques des insecticides perméthrine, abamectine, méthoxychlore, carbaryl, chlorpyriphos, aldicarb, lindane, phosmet, heptachlor et dicofol fenazaquine, paraquat et rotenone sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique et non génotoxique, neurotoxicté, perturbation endocrinienne, toxicité pour la reproduction, induction des maladies conformationnelles (Alzheimer, Parkinson...).

Les potentiels pathologiques de l'insecticide aldrine sont: cancérigène génotoxique, perturbation endocrinienne, toxicité pour la reproduction, induction des maladies conformationnelles (Alzheimer, Parkinson...).

Les potentiels pathologiques de l'insecticide fipronil sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique, neurotoxicté.

Les potentiels pathologiques des additifs alimentaires quinoléine (E104), acide benzoique (E211) et propylparaben (E214) sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique et non génotoxique, neurotoxicté, perturbation endocrinienne, toxicité pour la reproduction, induction des io maladies conformationnelles (Alzheimer, Parkinson...).

Les potentiels pathologiques des ingrédients de produits cosmétiques et produits ménagers 3-aminophénol, bisphénol A, acétonitril, acrylamide, 4aminobiphényl, benzophénone-3, 2-butoxyethanol éthylène glycol sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique et non génotoxique, neurotoxicté, perturbation endocrinienne, toxicité pour la reproduction, induction des maladies conformationnelles (Alzheimer, Parkinson...).

Les potentiels pathologiques de l'ingrédients de produits cosmétiques 1-4 dioxane sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique et 20 non génotoxique Les potentiels pathologiques de l'acétaminophène (paracetamol) sont: cytotoxicité, réaction inflammatoire, cancérigène génotoxique et non génotoxique, neurotoxicté, perturbation endocrinienne, toxicité pour la reproduction, induction des maladies conformationnelles (Alzheimer, Parkinson...).

Tableau 1: Liste des séquences Locus Symbole Nom des séquences SEQ ID N

ID

Famille Stress 2937 GSS glutathione synthetase 1 2876 GPX1 glutathione peroxidase 1 2 2947 GSTM3 glutathione S-transferase M3 3 (brain) 6647 SOD1 superoxide dismutase 1, 4 soluble (amyotrophic lateral sclerosis 1 (adult)) 7226 TRPM2 transient receptor potential 5 cation channel, subfamily M, member 2 5743 PTGS2 prostaglandin-endoperoxide 6 synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) 3313 HSPA9B heat shock 70kDa protein 9B 7 (mortalin-2) 2052 EPHX1 epoxide hydrolase 1, 8 microsomal (xenobiotic) 4843 NOS2A nitric oxide synthase 2A 9 (inducible, hepatocytes) Fam.

ADN

Dommaq e 995 CDC25C cell division cycle 25C 10 1026 CDKNIA cyclindependent kinase 11 inhibitor lA (p21, Cip1) 1019 CDK4 cyclin-dependent kinase 4 12 317 APAF1 apoptotic protease activating 13 factor 472 ATM ataxia telangiectasia 14 mutated (includes complementation groups A, C and D) 581 BAX BCL2-associated X protein 15 4790 NFKB1 nuclear factor of kappa light 16 polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) 10111 RAD50 RAD50 homolog (S. 17 cerevisiae) 5888 RAD51 RAD51 homolog (RecA 18 homolog, E. coli) (S. cerevisiae) Fam. Cell Cycle 2353 FOS v-fos FBJ murine 19 osteosarcoma viral oncogene homolog 3725 JUN v-jun sarcoma virus 17 20 oncogene homolog (avian) 596 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 21 1647 GADD45 growth arrest and DNA- 22 A damage-inducible, alpha 4193 MDM2 Mdm2, transformed 3T3 cell 23 double minute 2, p53 binding protein (mouse) 7157 TP53 tumor protein p53 (Li- 24 Fraumeni syndrome) 1950 EGF epidermal growth factor 25 (beta-urogastrone) 5465 PPARA peroxisome proliferative 26 activated receptor, alpha 7277 TUBAI tubulin, alpha 1 (testis 27 specific) Fam.

Neurotox 43 ACHE acetylcholinesterase (YT 28 blood group) 1508 CTSB cathepsin B 29 1813 DRD2 dopamine receptor D2 30 706 BZRP benzodiazapine receptor 31 (peripheral) 7054 TH tyrosine hydroxylase 32 7057 THBS1 thrombospondin 1 33 3231 HOXD1 homeo box D1 34 6091 ROBOI roundabout, axon guidance 35 receptor, homolog 1 (Drosophila) Fam. Rép.

Hormone 7031 TFF1 trefoil factor 1 (breast 36 cancer, estrogen-inducible sequence expressed in) 1509 CTSD cathepsin D (lysosomal 37 aspartyl protease) 5241 PGR progesterone receptor 38 5901 RAN RAN, member RAS 39 oncogene family 367 AR androgen receptor 40 (d i hyd rotestosteron e receptor; testicular feminization; spinal and bulbar muscular atrophy; Kennedy disease) 1385 CREB1 cAMP responsive element 41 binding protein 1 2099 ESR1 estrogen receptor 1 42 811 CALR calreticulin 43 1588 CYP19AI aromatase 44 213 ALB albumin 45 Misconf ormation de Protéines 3309 HSPA5 heat shock 70kDa protein 5 46 (glucose-regulated protein, 78kDa) 7494 XBP1 X-box binding protein 1 47

22926 ATF6 activating transcription factor 48

2081 ERNI ER to nucleus signalling 1 49 10961 C12orf8 chromosome 12 open 50 reading frame 8 2 A2M alpha-2-macroglobulin 51 Tableau 2: Liste des 28 composés testés Substan Name CAS# Solvant concentration concentration ce 1 (Cl) 2 (C2) SI Propyl-paraben 94-13-3 EtOH 0,36 mM 0,036 mM S2 Acetonitril 75-05-8 Medium 736 mM 73,6 mM S3 Acrylamid 79-06-1 Medium 1, 61 mM 0,322 mM S4 Benzoic acid 65-85-0 Medium 15,7 mM 1,57 mM S5 1-4 Dioxane 123-91-1 Medium 76,2 mM 7,62 mM S6 Bisphenol A 80-05-7 EtOH 200 mM mM S7 Quinoline 91-22-5 EtOH 500 pM 92% pM S8 Chlorpyriphos 2921-88-2 EtOH 75 pM 7,5 pM S9 3-Aminophenol 591-27-5 EtOH 860 pM 86 pM S10 Acetaminophen 103-90-2 DMSO 2,71 mM 0,271 mM S11 Methoxychlor 72-43-5 EtOH 20 pM 2pM S12 2-Butoxyethanol 111-76-2 Medium 26 mM 2,6 mM S13 Ethylene glycole 107-21-1 Medium 555 mM 55,5 mM S14 Dicofol 115-32-2 EtOH 5,125 pM 0,5125 pM S15 Benzophenone-3 2835-78-1 EtOH 0,4225 mM (3- Aminobenzophenone) 0,04225 mM S16 Phosmet 732-11-6 EtOH 0,04412 mM 0, 004412 mM S17 Fenazaquine 120928-09-8 EtOH 0,1053 mM 0,01053 mM S18 Rotenone 83-79-4 DMSO 0,000065 mM 0,000013 mM S219 Lindan 58-89-9 DMSO 0, 41 mM 0,041 mM S20 Carbaryl 63-25-2 DMSO 0.26mM 0,026 mM S21 Abamectin 71751-41-2 DMSO 0,04776 mM 0,004776 mM S22 Fipronil 120068-37-3 EtOH 0,1 mM 0,01 mM S23 Paraquat 1910-42-5 Medium 0,054 mM 0,0054 mM S24 Heptachlor 52645-53-1 EtOH 0,059 mM 0,0059 mM S25 4-Aminobiphenyl 92-67-1 EtOH 0,591 mM 0,0591 mM S26 Aldrin 309-00-2 EtOH 0,067 mM 0,0067 mM S27 Permethrin 52645-53-1 DMSO 0,327 mM 0,0327 mM S28 Aldicarb 116-06-3 Medium 2,6 mM 0,26 mM Tableau 3: Liste des séquences préférées dans chaque famille patholoqique Locus Symbole Nom des séquences SEQ ID N

ID

Famille Stress 2937 GSS glutathione synthetase 1 2876 GPX1 glutathione peroxidase 1 2 3313 HSPA9B heat shock 70kDa protein 9B 7 (mortalin-2) 2052 EPHX1 epoxide hydrolase 1, microsomal 8 (xenobiotic) 4843 NOS2A nitric oxide synthase 2A (inducible, 9 hepatocytes) Fam. ADN Dommaqe 1019 CDK4 cyclin-dependent kinase 4 12 317 APAF1 apoptotic protease activating factor 13 472 ATM ataxia telangiectasia mutated 14 (includes complementation groups A, C and D) 581 BAX BCL2-associated X protein 15 4790 NFKB1 nuclear factor of kappa light 16 polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) 5888 RAD51 RAD51 homolog (RecA homolog, 18 E. coli) (S. cerevisiae) Fam. Cell Cycle 2353 FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma 19 viral oncogene homolog 596 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 21 7157 TP53 tumor protein p53 (Li-Fraumeni 24 syndrome) 1950 EGF epidermal growth factor (beta- 25 urogastrone) 5465 PPARA peroxisome proliferative activated 26 receptor, alpha 7277 TUBAI tubulin, alpha 1 (testis specific) 27 Fam.

Neurotox.

1508 CTSB cathepsin B 29 706 BZRP benzodiazapine receptor 31 (peripheral) 7057 THBS1 thrombospondin 1 33 6091 ROBOI roundabout, axon guidance 35 receptor, homolog 1 (Drosophila) Fam. Rép.

Hormone 7031 TFF1 trefoil factor 1 (breast cancer, 36 estrogen-inducible sequence expressed in) 1509 CTSD cathepsin D (lysosomal aspartyl 37 protease) 5241 PGR progesterone receptor 38 5901 RAN RAN, member RAS oncogene 39 family 367 AR androgen receptor 40 (dihydrotestosterone receptor; testicular feminization; spinal and bulbar muscular atrophy; Kennedy disease) 2099 ESR1 estrogen receptor 1 42 Misconfor mation de Protéines 7494 XBP1 X-box binding protein 1 47

22926 ATF6 activating transcription factor 6 48

2081 ERNI ER to nucleus signalling 1 49 10961 C12orf8 chromosome 12 open reading 50 frame 8 Tableau 4: Liste des 20 séquences préférées Locus Symbole Nom des séquences SEQ ID N

ID

2937 GSS glutathione synthetase 1 2876 GPX1 glutathione peroxidase 1 2 2052 EPHX1 epoxide hydrolase 1, 8 microsomal (xenobiotic) 1019 CDK4 cyclin-dependent kinase 4 12 317 APAF1 apoptotic protease activating 13 factor 472 ATM ataxia telangiectasia mutated 14 (includes complementation groups A, C and D) 581 BAX BCL2-associated X protein 15 4790 NFKB1 nuclear factor of kappa light 16 polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (p105) 5888 RAD51 RAD51 homolog (RecA 18 homolog, E. coli) (S. cerevisiae) 2353 FOS v-fos FBJ murine 19 osteosarcoma viral oncogene homolog 596 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 21 7157 TP53 tumor protein p53 (Li-Fraumeni 24 syndrome) 1950 EGF epidermal growth factor (beta- 25 urogastrone) 5465 PPARA peroxisome proliferative 26 activated receptor, alpha 7277 TUBAI tubulin, alpha 1 (testis specific) 27 1508 CTSB cathepsin B 29 7057 THBS1 thrombospondin 1 33 1509 CTSD cathepsin D (lysosomal 37 aspartyl protease) 5901 RAN RAN, member RAS oncogene 39 family

22926 ATF6 activating transcription factor 6 48

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Procédé in vitro pour tester la toxicité d'un agent physique ou chimique ou d'une combinaison, comprenant les étapes suivantes: s a) cultiver des cellules de mammifère en présence de l'agent chimique ou physique d'agents physiques ou chimiques de la combinaison d'agents à tester; b) déterminer, dans les cellules obtenues à la fin de l'étape a), le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt choisis dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51; c) comparer le profil d'expression dudit ou desdits gène(s) déterminé à l'étape b) avec le profil d'expression dudit ou desdits gènes lorsque l'étape a) est réalisée en l'absence du composé ou de la combinaison de composés à tester.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25 SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 31, SEQ ID N 33, SEQ ID N 35, SEQ ID N 36, SEQ ID N 37, SEQ ID N 38, SEQ ID N 39, SEQ ID N 40, SEQ ID N 42, SEQ ID N 47, SEQ ID N 48, SEQ ID N 49, et SEQ ID N 50.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, à l'étape b), on détermine le profil d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 8, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 33, SEQ ID N 37, SEQ ID N 39, et SEQ ID N 48.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce 35 que, à l'étape b), le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé par détection de l'ARN messager correspondant à chaque gène, qui est éventuellement produit par les cellules cultivées à l'étape a) du procédé

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que, à l'étape b), le profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est déterminé par détection et quantification de l'ARN messager correspondant à chaque gène, qui est éventuellement produit par les cellules cultivées à l'étape a) du procédé

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que, à io l'étape b), la détermination du profil d'expression du ou des gènes d'intérêt est réalisée par mise en contact (i) des ARN messagers produits par les cellules cultivées à l'étape a) ou (ii) des ADN complémentaires synthétisés à partir de ces ARN messagers, avec au moins une sonde nucléotidique s'hybridant au dit ou aux dits gène(s) d'intérêt, dans des conditions appropriées pour la formation d'un complexe d'hybridation entre lesdits ARN messagers ou lesdits ADN complémentaires, d'une part, et ladite ou lesdites sondes nucléotidiques, d'autre part.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la ou les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur un support sous la forme d'une matrice ordonnée en deux dimensions.

9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les cellules de mammifère cultivées à l'étape a) sont choisies parmi des cellules en culture primaire et des lignées cellulaires.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les cellules de mammifère cultivées à l'étape a) sont choisies parmi les cellules hépatiques, neuronales, endothéliales épithéliales, intestinales, rénales et les cellules du système immunitaire.

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les cellules de mammifères cultivées à l'étape a) consistent en des cellules humaines.

12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'étape a) comprend les étapes suivantes: a1) cultiver un premier type de cellules de mammifère en présence du composé ou de la combinaison de composés à tester; a2) récupérer le surnageant de culture de cellules à la fin de l'étape a1) ; io a3) cultiver un second type de cellules de mammifère en présence: - du surnageant de culture cellulaire obtenu à l'étape a2) ; ou - d'au moins une fraction purifiée du surnageant de culture cellulaire obtenu à l'étape a2) contenant des produits de la métabolisation du composé ou de la combinaison de composés à tester par les cellules cultivées à l'étape a1).

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, à l'étape a1) le premier type de cellules de mammifère consiste en des hépatocytes en culture primaire ou en une lignée cellulaire d'hépatocytes.

14. Procédé selon l'une des revendications 12 et 13, caractérisé en ce que, à l'étape a3), le second type de cellules de mammifère consiste en des cellules neuronales en culture primaire ou en une lignée de cellules neuronales.

15. Dispositif pour tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés, comprenant une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 51.

16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25 SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 31, SEQ ID N 33, SEQ ID N 35, SEQ ID N 36, SEQ ID N 37, SEQ ID N 38, SEQ ID N 39, SEQ ID N 40, SEQ ID N 42, SEQ ID N 47, SEQ ID N 48, SEQ ID N 49, et SEQ ID N 50.

17. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce en ce qu'il comprend une ou plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant aux ARN messagers ou aux ADN complémentaires produits par au moins un gène choisi dans le groupe constitué des acides nucléiques de séquences séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 8, SEQ ID N 12, SEQ ID N 13, SEQ ID N 14, SEQ ID N 15, SEQ ID N 16, SEQ ID N 18, SEQ ID N 19, SEQ ID N 21, SEQ ID N 24, SEQ ID N 25, SEQ ID N 26, SEQ ID N 27, SEQ ID N 29, SEQ ID N 33, SEQ ID N 37, SEQ ID N 39, et SEQ ID N 48.

18. Trousse ou kit pour tester la toxicité d'un composé ou d'une combinaison de composés, comprenant: - un dispositif selon l'une des revendications 15 à 17; et - un ou plusieurs réactifs nécessaires à la réalisation d'un complexe d'hybridation entre les sondes nucléotidiques comprises dans ledit dispositif et des acides nucléiques éventuellement présents dans un échantillon à tester.