FR2878960A1 - Procede pour mettre en oeuvre un test d'agglutination dans un microcanal - Google Patents
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Abstract
Dans le procédé pour mettre en oeuvre un test d'agglutination, on met en mouvement continu dans un microcanal (6) un fluide comprenant des particules de détection et susceptible de comprendre des molécules cibles aptes à former des agrégats avec les particules de détection.
Description
L'invention concerne les tests d'agglutination, utiles notamment dans le
domaine médical.
Les tests d'agglutination décrits à ce jour sont principalement utilisés pour détecter des antigènes et/ou anticorps en vue du diagnostic. Ces tests sont notamment appliqués à des dosages biologiques (tests de grossesse, tests de coagulation) ou au diagnostic de maladies infectieuses.
Les tests d'agglutination sont basés sur l'agrégation de particules en présence d'une molécule cible possédant par exemple au moins deux sites réactifs. La particule est par exemple une bille. On greffe des molécules de détection sur les billes. S'il y a présence d'une molécule cible dans l'échantillon, les billes s'agrègent entre elles suivant une configuration bille-molécule cible-bille et forment un précipité dans le tube où l'analyse est effectuée.
Ainsi, le document WO 03/044532 divulgue une méthode de détection de molécules en présence d'un champ magnétique. Si les molécules cibles sont présentes dans le fluide, elles forment des chaînes avec les particules de détection sous l'effet du champ magnétique et ces chaînes persistent après coupure du champ magnétique.
Un intérêt important de ces tests est leur faible coût. Le matériel utilisé est très peu onéreux et le résultat est obtenu sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un appareil de laboratoire tel qu'un spectromètre. L'inconvénient de ces tests est leur caractère qualitatif, leur faible sensibilité et leur lenteur.
Lorsque l'on souhaite obtenir des données plus fines sur la présence d'une molécule à partir d'une reconnaissance de type immunologique, il est possible de recourir au test Elisa. Cette méthode est plus sensible que les méthodes d'agglutination et elle permet d'effectuer des tests en parallèle. Toutefois, le test Elisa est lent, ne possède pas la simplicité de mise en oeuvre des tests d'agglutination et consomme une quantité d'échantillon relativement importante. Très sensible, le test Elisa est par ailleurs complexe à mettre en oeuvre.
Un but de l'invention est de proposer un test peu coûteux, permettant une analyse quantitative, pouvant être mis en oeuvre à partir d'une quantité d'échantillon très faible, et offrant un temps d'analyse réduit et une grande sensibilité.
A cet effet, on prévoit selon l'invention un procédé pour mettre en oeuvre un test d'agglutination dans lequel on met en mouvement continu dans un microcanal un fluide comprenant des particules de détection et susceptible de comprendre des molécules cibles aptes à former des agrégats avec les particules de détection.
Ainsi, la mise en mouvement continu du fluide dans le microcanal engendre un cisaillement hydrodynamique qui favorise le rapprochement rapide des molécules cibles et des particules de détection. Ce rapprochement accélère la formation d'agrégats signalant la présence des molécules cibles. La mise en oeuvre du test, en flux continu, dans le microcanal, induit de nombreux avantages. Les agrégats sont détectés au besoin un par un, dans des volumes extrêmement réduits. La sensibilité du test s'en trouve augmentée. Le test est très rapide. De plus, le procédé permet une détection quantitative et non plus seulement qualitative.
Le procédé selon l'invention pourra présenter en outre au moins l'une quelconque des caractéristiques suivantes: - on détermine si le fluide comprend des agrégats; - on détermine pendant le mouvement si le fluide comprend des agrégats; - on interrompt le mouvement et on détermine si le fluide comprend des agrégats; - on applique un champ magnétique dans le microcanal; et - on applique le champ durant le mouvement.
On prévoit également selon l'invention un dispositif pour mettre en oeuvre un test d'agglutination, comprenant un microcanal et des moyens pour mettre un fluide en mouvement continu dans le microcanal.
Le dispositif selon l'invention pourra comprendre des moyens pour déterminer si le fluide comprend des agrégats et/ou des moyens pour générer un champ magnétique dans le microcanal.
Avantageusement, le microcanal présente une section transversale ayant une plus petite dimension inférieure ou égale à 2 millimètres et de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre.
Les applications de l'objet de la présente invention sont nombreuses, notamment dans le domaine médical ou écologique.
Outre les applications classiques du type détection et/ou dosage d'antigènes-anticorps, ou d'acides nucléiques, on pourra également utiliser l'invention pour détecter, par exemple, des substances biologiques aussi diverses que des hormones, des marqueurs tumoraux, des drogues (amphétamines, barbituriques, cocaïne, marijuana, morphines, etc.) dans des échantillons tels que les urines, le sang, la salive et, plus généralement, n'importe quel fluide biologique.
Parmi les autres applications intéressantes de l'objet de l'invention, on citera notamment la détection d'analytes, et plus particulièrement d'analytes organiques, tels que des pesticides, des composés organiques polyaromatiques, des toxines organiques, des microorganismes (bactéries, champignons, etc...), dans des échantillons issus de l'environnement, tels que l'eau, les effluents et eaux usées, le sol, les boues, etc...
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront encore dans la description suivante de deux modes préférés de réalisation de l'invention donnés à titre d'exemples non limitatifs en référence aux dessins annexés sur lesquels: - la figure 1 est un schéma illustrant les agrégats formés lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention; - la figure 2 est un schéma d'un prernier mode de réalisation du dispositif selon l'invention; et - la figure 3 est un schéma analogue à la figure 2 montrant un deuxième mode de réalisation du dispositif.
Dans le premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention illustré à la figure 2, le dispositif 2 comprend un circuit de circulation de fluide 4, par exemple en circuit ouvert, dont une partie est constituée par un microcanal 6 tel qu'un capillaire. Le dispositif comprend des moyens 8 d'introduction dans le circuit d'un fluide à analyser, formés par exemple par un pousse-seringue ou une seringue. Ces moyens assurent également la circulation du fluide dans le microcanal 6.
Le fluide comprend des particules de détection 10, par exemple sous la forme de billes 10 sur lesquelles ont été greffées des molécules de détection 12. Le fluide par ailleurs est susceptible de comprendre des molécules cibles 14 (également et indifféremment appelés analytes ) possédant par exemple au moins deux sites réactifs 16 aptes à se lier aux molécules de détection 12. Les billes 10 et les molécules 14 sont aptes à s'agréger pour former des chaînes 15, suivant la configuration illustrée sur la figure 1 à titre d'exemple, constituées par une succession de molécules et de billes en alternance.
Les molécules de détection 12 peuvent être immobilisées à la surface des billes 10 par des interactions d'adsorption, covalentes et/ou de haute affinité.
Le couplage covalent, peut, par exemple, être réalisé à partir de groupements réactifs chimiques présents à la surface des billes. Des exemples de tels groupements sont notamment les groupements carboxyle, amino, aldéhyde et époxy.
L'immobilisation par interaction de haute affinité fait généralement intervenir deux partenaires d'un couple de liaison à haute affinité tels que (poly)carbohydrate/électine, biotine ou composés biotinylés/avidine ou streptavidine, récepteur de protéines et son ligand spécifique, haptène/anticorps, etc...
Enfin, la fixation des molécules de détection 12 à la surface des billes 10 peut être réalisée soit directement soit en utilisant des bras espaceurs, également connus sous les noms de linkers ou spacers .
Ces interactions covalentes ou de haute affinité permettent d'immobiliser des molécules de détection naturelles ou synthétiques, telles que des peptides; des protéines, y compris les glycoprotéines, les lipoprotéines et autres structures voisines ou dérivées, sous forme libre ou complexée; des immunoglobulines; des acides nucléiques comme l'ADN ou l'ARN et leurs homologues; des saccharides comme les monosaccharides ou bisaccharides, oligosaccharides et polysaccharides.; des lipides; des hormones; des récepteurs; des métabolites; ou autres substances biologiques.
Les molécules cibles 14 peuvent, sous leur forme naturelle, réagir avec au moins deux molécules de détection 12 distinctes, à l'image par exemple des antigènes et anticorps qui possèdent souvent plusieurs sites d'association.
Dans le cas contraire, on peut, préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention, effectuer un prétraitement du fluide à analyser, afin de rendre les molécules cibles 14 réactives vis-à- vis d'au moins deux molécules de détection 12, via l'introduction, sur lesdites molécules cibles, d'au moins deux sites réactifs 16. La réalisation de ce type de prétraitement relève des compétences de l'homme de l'art.
Pour mettre en oeuvre le procédé, on commence par introduire les billes 10 dans un fluide susceptible de contenir les molécules cibles 14. On mélange le fluide, puis à l'aide du pousse-seringue 8 on introduit le fluide dans le dispositif. Le fluide est mis en circulation dans le microcanal 6 grâce au pousse-seringue 8. Le dispositif comprend en l'espèce un microscope 20 permettant d'observer le microcanal 6 pour détecter la présence éventuelle d'agrégats pendant le mouvement continu, puis à l'issue de celui-ci. La formation des agrégats 15 est accélérée grâce au cisaillement hydrodynamique du fluide en mouvement dans le microcanal. Lorsque des agrégats apparaissent, on peut considérer que la molécule cible est présente dans l'échantillon. La détection d'un seul agrégat suffit pour conclure à la présence d'une molécule cible. La méthode offre une grande sensibilité par le simple fait que le système échantillonne des quantités infimes d'analytes et détecte les agrégats individuellement.
Un autre mode de réalisation de l'invention est illustré à la figure 3. Cette fois, le fluide comprenant les billes et éventuellement les molécules cibles circule dans le canal 6 en présence d'un champ magnétique généré par au moins un aimant permanent 30 placé près du canal. Les lignes de champ 32 générées par cet aimant ont été illustrées sur la figure 3. Cette fois, les billes 10 sont superparamagnétiques. L'échantillon mélangé aux billes 10 fonctionnalisées avec les molécules de détection 12 est injecté continûment dans le microcanal grâce au pousse-seringue 8. Dans le canal, des chaînes se forment rapidement sous l'effet du champ magnétique et grâce à l'effet de cisaillement hydrodynamique qui accélère considérablement le processus d'agrégation magnétique. Lorsque le champ magnétique est coupé, ces chaînes, analogues à celles de la figure 1, persistent si la molécule recherchée 14 est présente dans l'échantillon. Dans le cas contraire, les chaînes se désagrègent rapidement du fait de la présence du cisaillement. La persistance de cette agrégation ou au contraire la désagrégation est détectée à nouveau au moyen du microscope 20. On remarquera que le nombre de chaînes restant après coupure du champ magnétique est lié à la concentration de l'échantillon en molécules cibles. Cela implique que le test est quantitatif. On donnera de préférence au champ magnétique une intensité supérieure ou égale à 20 Gauss.
En vue de réaliser un cisaillement satisfaisant, on pourra prévoir que le microcanal présente une section transversale courante, perpendiculaire à sa direction longitudinale, dont une plus petite dimension est inférieure ou égale à 2 millimètres et de préférence est inférieure ou égale à 1 millimètre. Si le microcanal a une section circulaire, cette dimension sera le diamètre de la section. S'il présente une section rectangulaire, il s'agira de la plus petite dimension du rectangle. On pourra également prévoir que la section transversale du microcanal a une surface inférieure ou égale à 1 millimètre carré.
A titre d'exemple, on a analysé un échantillon de protéine A biotinylée, à l'aide du dispositif de la figure 3. On a utilisé des billes superparamagnétiques de 0,83 microns de diamètre fonctionnalisées avec de la streptavidine. L'échantillon de protéine A biotinylée, mélangé aux billes, a été injecté dans le microcanal avec un débit de 10 nanolitres par minute. Le microcanal 6 est micromoulé en PDMS et a comme dimensions, longueur: 20 millimètres, largeur: 200 micromètres, hauteur: 20 micromètres, en ayant une forme rectiligne à section rectangulaire. Un champ magnétique de 170 Gauss est imposé grâce aux aimants permanents. Le seuil de détection minimal obtenu avec ce système est de 1O 14 Mole / litre pour un temps d'analyse de 10 minutes. La quantité totale analysée est de 1 microlitre.
L'invention offre un temps d'analyse très faible, permet une analyse quantitative, requiert seulement une très faible quantité d'échantillon et offre un test de grande sensibilité.
Plus généralement, le volume d'analyse consommé pourra par exemple être inférieur à 1 microlitre, le temps de mesure de quelques minutes et les concentrations minimales de l'ordre de 10-14 Mole / litre.
L'invention permet une mesure rapide et sensible de concentration de molécules chimiques ou biochimiques en phase liquide.
De même que dans le test Elisa, une parallélisation des tests est envisageable.
Bien entendu, on pourra apporter à l'invention de nombreuses modifications sans sortir du cadre de celle-ci.
Le microcanal pourra avoir les formes les plus variées.
Il pourra ainsi présenter une section de forme ronde, ovale, rectangulaire, etc. Le champ magnétique pourra être un champ alternatif.
L'orientation de ce champ, par ailleurs, n'est pas critique.
On pourra générer le champ magnétique au moyen d'une bobine.
On pourra prévoir que l'introduction du fluide dans le circuit et sa mise en mouvement dans le microcanal sont assurées par des moyens distincts.
Claims (1)
- 9 REVENDICATIONS1. Procédé pour mettre en oeuvre un test d'agglutination, caractérisé en ce qu'on met en mouvement continu dans un microcanal (6) un fluide comprenant des particules de détection (10) et susceptible de comprendre des molécules cibles (14) aptes à former des agrégats (15) avec les particules de détection.2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'on détermine si le fluide comprend des agrégats (15).3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en qu'on détermine pendant le mouvement si le fluide comprend des agrégats (15).4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on interrompt le mouvement et on détermine si le fluide comprend des agrégats (15).5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on applique un champ magnétique dans le microcanal.6. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'on applique le champ durant le mouvement.7. Dispositif pour mettre en oeuvre un test d'agglutination, comprenant un microcanal (6), caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (8, 9) pour mettre un fluide en mouvement continu dans le microcanal. lo8. Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour déterminer si le fluide comprend des agrégats (15).9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour générer un champ magnétique dans le microcanal.10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le microcanal présente une section transversale ayant une plus petite dimension inférieure ou égale à 2 millimètres et de préférence inférieure ou égale à 1 millimètre.
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Citations (2)
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WO2003044532A1 (fr) * | 2001-11-20 | 2003-05-30 | Diagnostica Stago | Methode de detection d'analyte(s) a l'aide de particules magnetiques colloidales |
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ST | Notification of lapse |
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