FR2878164A1 - Nouvelles utilisations de ligands de la neogenine - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un ligand de la néogénine, ou le cas échéant d'une séquence nucléotidique codant pour un ligand de la néogénine, ou d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ligand, ou d'une cellule hôte transformée par ledit vecteur, ou d'un anticorps anti-idiotypique dirigé contre ledit ligand, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.

Description

NOUVELLES UTILISATIONS DE LIGANDS DE LA NÉOGÉNINE
La présente invention a pour objet de nouvelles utilisations de ligands de la néogénine, tels que les nétrines, à savoir la nétrine 1, la nétrine 3, la nétrine G ou la nétrine 4, et les RGM ("repulsive guidance molecule"), en association avec un agent de chimiothérapie, notamment dans le cadre de la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
La nétrine 4 appartient à la famille des nétrines, qui sont des molécules de guidage des axones. A ce jour, 4 membres de cette famille sont connus (nétrines 1, G, 3, 4). La nétrine 4 est une protéine constituée d'un domaine basique C-terminal interagissant avec l'héparine, de 3 domaines de type EGF et d'un domaine de type laminine (Yurchenko et al., 2004).
La nétrine 1 stimule l'attraction quand elle est liée au récepteur dcc (ou à la néogénine) et la répulsion quand elle est liée aux récepteurs dcc et un des récepteurs de la famille UNC5H (Livesey, 1999; Mehlen et al. , 2003; Cooper et al., 1999). De plus, la nétrine 1 peut se lier au récepteur A2 et modifier le taux d'AMPc cellulaire, l'attraction ou la répulsion étant aussi contrôlées par le taux AMPc/GMPc (Corset et al., 2000).
La nétrine G représente une famille de genes différant des autres nétrines par la présence d'un domaine C-terminal hydrophobe se liant au glycosyl phosphoinositolphosphate (Nakashiba et al., 2000). Leur fonction est encore inconnue. En revanche, il a été rapporté que la nétrine G ne se lie ni à dcc ni à UNC5H1, H2, H3 (Nakashiba et al., 2002).
La nétrine 3 stimule l'attraction des neurones quand elle est liée à un récepteur dcc ou néogénine et induit leur répulsion quand elle est liée à un récepteur de la famille des récepteurs UNC5H (Livesey et al., 1999).
Les molécules RGM ("repulsive guidance molecule") sont des molécules impliquées dans le guidage des axones des neurones. Il en existe 3 gènes dénommés RGM-A, RGM-B, RGM-C. On sait depuis peu que le RGM-A est un ligand de la néogénine (Matsunaga et al., 2004) et qu'un variant du gène RGM-C est le gène de transport du fer dénommé HFE (Papanicolaou et al., 2004).
Il a été récemment publié que la nétrine 1 et la nétrine 4 inhibent l'activité des cellules endothéliales par l'intermédiaire du récepteur UNC5H2 (Lu et al., 2004) et inhibent la vascularisation de la rétine.
La présente invention a pour but de fournir un traitement de combinaison 5 permettant d'augmenter l'efficacité des traitements anti-tumoraux conventionnels.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux agents anti- angiogéniques.
UTILISATION COMBINÉE D'UN AGENT ANTI-ANGIOGÉNIQUE ET D'UN AGENT DE CHIMIOTHÉRAPIE La présente invention concerne l'utilisation d'un ligand de la néogénine, ou le cas échéant d'une séquence nucléotidique codant pour un ligand de la néogénine, ou d'un vecteur contenant une séquence nucléotidique codant pour ledit ligand, ou d'une cellule hôte transformée par ledit vecteur, ou d'un anticorps anti-idiotypique dirigé contre ledit ligand, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
La combinaison d'un agent anti-angiogénique, choisi parmi ledit ligand de la néogénine ou ladite séquence nucléotidique ou ledit vecteur ou ladite cellule hôte ou ledit anticorps anti-idiotypique, avec un agent de chimiothérapie permet d'obtenir un effet synergique et d'induire une moindre résistance aux traitements anti-tumoraux conventionnels.
Parmi les agents de chimiothérapie préférés selon l'invention, on peut notamment citer la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, les inhibiteurs de l'aromatase, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol et le taxotère.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation selon l'invention est 30 caractérisée en ce que le ligand ou la séquence nucléotidique ou l'anticorps antiidiotypique est choisi parmi: l'une des protéines suivantes: la nétrine 1 représentée par SEQ ID NO: 502 ou SEQ ID NO: 504, la nétrine G1 représentée par SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 508, la nétrine 3 représentée par SEQ ID NO: 510, la nétrine 4 représentée par SEQ ID NO: 498 ou SEQ ID NO: 500, l'une des molécules RGM représentées par SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, ou la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des 5 séquences SEQ ID NO: 2n, n variant de 1 à 248, ou une séquence nucléotidique codant pour l'une des protéines susmentionnées, notamment représentée par l'une des séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 523, ou l'une des séquences SEQ ID NO: 2n-1, n variant de 1 à 248, ou un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci-dessus.
Les séquences SEQ ID NO: 2n susmentionnées correspondent aux séquences 15 protéiques SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 496.
Les séquences SEQ ID NO: 2n susmentionnées correspondent aux séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, 0L17: ON QI MS 8917: ON QI ëHS 9917: ON QI ëas t7917: ON QI â S Z9i7: ON QI ëiS 0917: ON QI â s 8S1 ON QI â S 9S17: ON QI â S 17St7: ON QI â s ZS'v: ON QI ëiS OS1: ON QI âHS 8177: ON QI ?MS 91717: ON QI ëiS 17it ON QI âqS Zt717: ON QI ëqS Ott: ON QI ëiS 8ì7: ON QI ëas 917: ON QI ëqS 1717: ON QI ë31s Z17 ON QI ëqS 0t: ON QI ëiS 8Z17 ON (I â s '9Z'17: ON QI â S t7Z17: ON QI ëiS ZZI7 ON QI âqS OZ17 ON QI â s 8117: ON QI ëHS 9117: ON QI ?MS 17117 ON QI b s Z i ti: ON QI bis 'Olt: ON GR â s 801: ON QI ëHS 9017: ON QI ëqS 17017: ON QI ëHS Z017: ON QI âqS 0017: ON QI ëIS 86 : ON QI âaS 96 : ON QI ëiS 176 : ON QI ëHS Z6 : ON QI ëqS 06 : ON QI âqS 88 : ON QI âqS 98 : ON QI ù s 18 : ON QI ëHS Z8 : ON QI ?MS 08 : ON QI ëqS 8L : ON QI ëqS 9L : ON QI ëHS 1L : ON QI ëqS ZL : ON QI ëES OL : ON QI ?MS 89 : ON ëHS 99 : ON QI ëqS 179 ON QI â3S Z9 : ON QI ë3S 09 : ON (I ëS 8S : ON QI ëJS 9S : ON ai â s 17S : ON QI â s ZS : ON QI âqS OS : ON QI bas 817 : ON QI bas 917 : ON QI bas 177 : ON ai bas Z17 : ON QI bas 017 : ON QI bas 8 : ON QI bas 9 : ON QI âqS 17 : ON QI ëaS Z : ON QI ëaS o : ON QI âqS 8z : ON QI âqS 9Z : ON QI âqS 'PU: ON QI ëaS ZZ : ON QI ëaS OZ : ON QI ?MS '81 ON QI â IS '91 : ON QI bas 't1 : ON UI bas Z I : ON QI bas '01 : ON ai âqS 80 : ON QI bas 90 : ON QI bas 170 : ON QI bis ZO : ON QI bas 00 : ON QI âqS 86Z: ON f âqS 96Z: ON QI ?MS 176Z: ON QI ëaS Z6Z ON QI âqS 06z: ON QI bas 88Z ON QI bas 98Z: ON QI bas 178Z: ON QI bas Z8z: ON QI âqS 08Z: ON QI bas 8LZ: ON QI b S 9LZ: ON QI b is 17LZ: ON QI bas ZLZ: ON QI bas OLZ: ON QI bas 89Z: ON QI b s 99Z: ON QI bas 179Z: ON QI bas Z9Z: ON QI ëqS 09Z ON QI bas 8SZ ON QI bas 9SZ ON QI ëas 17SZ: ON QI ëqS ZSZ: ON QI bas OSZ: ON QI bas '87Z: ON (I bas 917Z ON QI ëqS 1177: ON QI ëaS Z17Z: ON QI ëaS 017Z: ON QI âqS 8Z: ON QI âqS 9Z: ON CI bas 17Z: ON QI bas ZZ: ON GI bas 0Z: ON QI ëaS 8ZZ: ON QI ?MS 9ZZ: ON QI ëaS 17ZZ: ON QI ëaS ZZZ: ON QI ëaS oZZ: ON QI ëaS '8I Z: ON QI ëaS '9I Z: ON QI ëaS '17I Z: ON QI âqS Z I Z: ON QI âqS '01Z ON QI âqS 80Z: ON QI ëaS 90Z ON QI ëaS 170Z ON QI ëaS ZOZ ON QI ëHS 00Z: ON QI bas 861: ON ai âqS 961: ON QI bas 1761: ON QI bas Z61: ON QI bas 061: ON QI bas 881: ON QI bas 981: ON QI bas 1781: ON QI bas 'Z8 I: ON QI bas 081: ON QI bas '8L I: ON QI bas '9L I: ON QI bas '17L I: ON QI âqS ZL I: ON ai âqS OL 1: ON ai âqS 891: ON QI ëaS 991: ON QI âqS t o sz oz Si oi s 179 I8L8Z SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494 ou SEQ ID NO: 496.
Les séquences SEQ ID NO: 2n-1 susmentionnées correspondent aux séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 495.
Les séquences SEQ ID NO: 2n-1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO: 2n, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 1 codant pour SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 codant pour SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 codant pour SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 codant pour SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 codant pour SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 codant pour SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 codant pour SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 codant pour SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 codant pour SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 codant pour SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 codant pour SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 codant pour SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 codant pour SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 codant pour SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 codant pour SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 codant pour SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 codant pour SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 codant pour SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 codant pour SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 codant pour SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 codant pour SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 codant pour SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 codant pour SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 codant pour SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 codant pour SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 codant pour SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 codant pour SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 codant pour SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 codant pour SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 codant pour SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 codant pour SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 codant pour SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 codant pour SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 codant pour SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 codant pour SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 codant pour SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 codant pour SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 codant pour SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 codant pour SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 codant pour SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 codant pour SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 codant pour SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 codant pour SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 codant pour SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 codant pour SEQ ID NO: 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NO: 277 codant pour SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 codant pour SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 codant pour SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 codant pour SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 codant pour SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 codant pour SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 codant pour SEQ D NO: 290, SEQ ID NO: 291 codant pour SEQ D NO: 292, SEQ ID NO: 293 codant pour SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 codant pour SEQ D NO: 296, SEQ ID NO: 297 codant pour SEQ D NO: 298, SEQ ID NO: 299 codant pour SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301 codant pour SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303 codant pour SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 codant pour SEQ ID NO: 306, SEQ D NO: 307 codant pour SEQ D NO: 308, SEQ D NO: 309 codant pour SEQ D NO: 310, SEQ ID NO: 311 codant pour SEQ ID NO: 312, SEQ D NO: 313 codant pour SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315 codant pour SEQ D NO: 316, SEQ ID NO: 317 codant pour SEQ D NO: 318, SEQ D NO: 319 codant pour SEQ D NO: 320, SEQ ID NO: 321 codant pour SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 codant pour SEQ ID NO: 324, SEQ D NO: 325 codant pour SEQ ID NO: 326, SEQ D NO: 327 codant pour SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329 codant pour SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331 codant pour SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 codant pour SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 codant pour SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 codant pour SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339 codant pour SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 codant pour SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 codant pour SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 codant pour SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347 codant pour SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349 codant pour SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351 codant pour SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353 codant pour SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355 codant pour SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357 codant pour SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359 codant pour SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361 codant pour SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363 codant pour SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365 codant pour SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 367 codant pour SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 369 codant pour SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371 codant pour SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373 codant pour SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 codant pour SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377 codant pour SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379 codant pour SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 codant pour SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 codant pour SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 codant pour SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 codant pour SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 codant pour SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 codant pour SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393 codant pour SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395 codant pour SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397 codant pour SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399 codant pour SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401 codant pour SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403 codant pour SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405 codant pour SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407 codant pour SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409 codant pour SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 codant pour SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413 codant pour SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415 codant pour SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417 codant pour SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419 codant pour SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421 codant pour SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423 codant pour SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425 codant pour SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427 codant pour SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429 codant pour SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431 codant pour SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 codant pour SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 codant pour SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 codant pour SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 codant pour SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 codant pour SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 codant pour SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 codant pour SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447 codant pour SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449 codant pour SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 codant pour SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453 codant pour SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455 codant pour SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 codant pour SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459 codant pour SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 codant pour SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463 codant pour SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 codant pour SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 codant pour SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 codant pour SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 codant pour SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473 codant pour SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475 codant pour SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 codant pour SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 codant pour SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 codant pour SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 codant pour SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 codant pour SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 codant pour SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 codant pour SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 codant pour SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493 codant pour SEQ ID NO: 494 ou SEQ ID NO: 495 codant pour SEQ ID NO: 496.
La séquence SEQ ID NO: 498 correspond à la protéine humaine nétrine 4 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 497, et la séquence SEQ ID NO: 500 correspond à la protéine humaine nétrine 4 susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 499. La séquence SEQ ID NO: 498 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 500 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 498 allant du résidu 20 au résidu 628.
La séquence SEQ ID NO: 502 correspond à la protéine humaine nétrine 1 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 501, et la séquence SEQ ID NO: 504 correspond à la protéine humaine nétrine 1 susmentionnee sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 503. La séquence SEQ ID NO: 502 comprend 604 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 504 comprend 580 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 502 allant du résidu au résidu 604.
La séquence SEQ ID NO: 506 correspond à la protéine humaine nétrine G1 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 505, et la séquence SEQ ID NO: 508 correspond à la protéine humaine nétrine GI susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 507. La séquence SEQ ID NO: 506 comprend 438 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 508 comprend 410 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 506 allant du résidu 29 au résidu 438.
La séquence SEQ ID NO: 510 correspond à la protéine humaine nétrine 3 codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 509. La séquence SEQ ID NO: 510 comprend 580 acides aminés.
La séquence SEQ ID NO: 512 correspond à la molécule RGM-A codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 511. La séquence SEQ ID NO: 512 comprend 450 acides aminés.
La séquence SEQ ID NO: 514 correspond à la molécule RGM-B codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 513, et la séquence SEQ ID NO: 518 correspond à la molécule RGM-B susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 517. La séquence SEQ ID NO: 514 comprend 437 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 518 comprend 392 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 514 allant du résidu 46 au résidu 437.
La séquence SEQ ID NO: 516 correspond à la molécule RGM-C codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 515, et la séquence SEQ ID NO: 520 correspond à la molécule RGM-C susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 519. La séquence SEQ ID NO: 516 comprend 426 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 520 comprend 391 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 516 allant du résidu 36 au résidu 426.
La séquence SEQ ID NO: 522 correspond à la protéine humaine nétrine 4 mutée codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 521, et la séquence SEQ ID NO: 524 correspond à la protéine humaine nétrine 4 mutée susmentionnée sans le peptide signal, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 523. La séquence SEQ ID NO: 522 comprend 628 acides aminés et la séquence SEQ ID NO: 524 comprend 609 acides aminés et correspond à un fragment de la séquence SEQ ID NO: 522 allant du résidu 20 au résidu 628.
La nétrine 4 mutée, représentée par la séquence SEQ ID NO: 522, correspond à la protéine nétrine 4 représentée par SEQ ID NO: 498 présentant les 9 mutations ponctuelles suivantes: - remplacement de la cystéine en position 13 par une arginine, remplacement de la lysine en position 68 par une thréonine, remplacement de la sérine en position 183 par une proline, remplacement de l'histidine en position 205 par une tyrosine, remplacement de la cystéine en position 234 par une tyrosine, remplacement de l'alanine en position 331 par une asparagine, remplacement de la cystéine en position 332 par une arginine, remplacement de l'asparagine en position 353 par une sérine, remplacement de l'asparagine en position 515 par une lysine.
La séquence SEQ ID NO: 360 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 359. Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 362 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 361. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 364 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 363. Ce fragment comprend 113 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 516 au résidu 628 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 366 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 délétée de la séquence SEQ ID NO: 364, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 365. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 1 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 8 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 7. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 2 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1. Ce fragment comprend 60 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 261 au résidu 320 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 4 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 3. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO: 498.
La séquence SEQ ID NO: 6 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 5. Ce fragment comprend 52 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 allant du résidu 394 au résidu 445 de la séquence SEQ ID NO: 498.
Les fragments de la protéine nétrine 4 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 10 à SEQ ID NO: 126 et aux séquences protéiques SEQ ID NO: 368 et SEQ ID NO: 370, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 9 à SEQ ID NO: 125 et les séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 367 et SEQ ID NO: 369 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 498 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 9 1-260 + 516-628 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 11 261-628 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 13 1-320 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 15 1-260 + 332-387 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 17 1-260 + 394-445 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 19 32-320 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 21 32-260 + 332-387 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 23 32-260 + 394-445 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 25 261-320 + 332-387 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 27 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 29 261-320 + 394-445 SEQID NO: 32 SEQ ID NO: 31 261-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 33 1-320 + 332-387 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 35 1-260 + 332- 387 + 394-445 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 37 1-320 + 394-445 SEQ ID NO: 40 SEQ ID NO: 39 32-320 + 332-387 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 41 32-260 + 332- 387 + 394-445 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 43 32-320 + 394-445 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 45 1-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 47 32-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 49 261-320 + 516-628 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 51 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 53 394445 + 516-628 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 55 32-260 + 516-628 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 57 32-320 + 516-628 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 59 32-260 + 332387 + 516-628 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 61 32-260 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 63 1-320 + 516-628 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 65 1-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 67 1-260 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 69 261-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 71 261-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 73 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 75 261-320 + 332-387 + 394445 + 516-628 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 77 1-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 79 1-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 81 1-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 83 32- 320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 85 32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 87 32-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 89 1-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 91 32-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 93 20-260 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 95 20-516 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 97 20-260 + 516-628 SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 99 20-320 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 101 20-260 + 332-387 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 103 20-260 + 394-445 SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 105 20-320 + 332-387 SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 107 20-260 + 332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 109 20-320 + 394-445 SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 111 20-320 +332-387 + 394-445 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 113 20-320 + 516-628 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 115 20-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 117 20-260 + 394- 445 + 516-628 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 119 20-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 121 20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 123 20-320 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 125 20-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 368 SEQ ID NO: 367 32-515 SEQ ID NO: 370 SEQ ID NO: 369 32-628 La séquence SEQ ID NO: 128 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 127. Ce fragment comprend 283 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu 283 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 130 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 129. Ce fragment comprend 204 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu 487 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 132 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 131. Ce fragment comprend 117 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 488 au résidu 604 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 372 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 1 délétée de la séquence SEQ ID NO: 132, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 371. Ce fragment comprend 487 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 1 au résidu 487 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 140 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 139. Ce fragment comprend 235 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 49 au résidu 283 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 134 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 133. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 284 au résidu 331 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 136 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 135. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 341 au résidu 396 de la séquence SEQ ID NO: 502.
La séquence SEQ ID NO: 138 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 137. Ce fragment comprend 48 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 1 allant du résidu 403 au résidu 450 de la séquence SEQ ID NO: 502.
Les fragments de la protéine nétrine 1 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 142 à SEQ ID NO:262, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 141 à SEQ ID NO: 261 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 502 SEQ ID NO: 142 SEQ ID NO: 141 1-283 + 488-604 SEQ ID NO: 144 SEQ ID NO: 143 284-604 SEQ ID NO: 146 SEQ ID NO: 145 49-487 SEQ ID NO: 148 SEQ ID NO: 147 49-604 SEQ ID NO: 150 SEQ ID NO: 149 1-331 SEQ ID NO: 152 SEQ ID NO: 151 1-283 + 341-396 SEQ ID NO: 154 SEQ ID NO: 153 1-283 + 403-450 SEQ ID NO: 156 SEQ ID NO: 155 49-331 SEQ ID NO: 158 SEQ ID NO: 157 49-283 + 341-396 SEQ ID NO: 160 SEQ ID NO: 159 49-283 + 403-450 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 161 284-331 + 341-396 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 163 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 166 SEQ ID NO: 165 284-331 + 403-450 SEQ ID NO: 168 SEQ ID NO: 167 284-331 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 170 SEQ ID NO: 169 1-331 + 341-396 SEQ ID NO: 172 SEQ ID NO: 171 1-283 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 174 SEQ ID NO: 173 1-331 + 403-450 SEQ ID NO: 176 SEQ ID NO: 175 49-331 + 341-396 SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 177 49-283 + 341-396 + 403- 450 SEQ ID NO: 180 SEQ ID NO: 179 49-331 + 403-450 SEQ ID NO: 182 SEQ ID NO: 181 1-331 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 184 SEQ ID NO: 183 49-331 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 186 SEQ ID NO: 185 284-331 + 488-604 SEQ ID NO: 188 SEQ ID NO: 187 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 190 SEQ ID NO: 189 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 192 SEQ ID NO: 191 49-283 + 488-604 SEQ ID NO: 194 SEQ ID NO: 193 49-331 + 488-604 SEQ ID NO: 196 SEQ ID NO: 195 49283 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 198 SEQ ID NO: 197 49-283 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 200 SEQ ID NO: 199 1-331 + 488-604 SEQ ID NO: 202 SEQ ID NO: 201 1-283 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 204 SEQ ID NO: 203 1-283 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 206 SEQ ID NO: 205 284-331 + 341-396 + 488604 SEQ ID NO: 208 SEQ ID NO: 207 284-331 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 210 SEQ ID NO: 209 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 211 284-331 + 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 213 1331 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 215 1-283 + 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 217 1-331 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 219 49-331 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO: 221 49-283 + 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 223 49-331 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 225 1-331 + 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 227 49-331 + 341396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 229 25-283 SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 231 25-487 SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 233 25-2.83 + 488-604 SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 235 25-331 SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 237 25-283 + 341-396 SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 239 25-283 + 403-450 SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 241 25-331 + 341-396 SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 243 25-283 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 245 25-331 + 403-450 SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 247 25-331 + 341-396 + 403-450 SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 249 25-331 + 488-604 SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 251 25-283 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 253 25-283 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 255 25-331 + 341-396 + 488-604 SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 257 25-283 + 341-396 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 259 25-331 + 403-450 + 488-604 SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 261 25-331 + 341- 396 + 403-450 + 488-604 La séquence SEQ ID NO: 264 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 263. Ce fragment comprend 295 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 1 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO: 506.
La séquence SEQ ID NO: 266 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 265. Ce fragment comprend 143 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 296 au résidu 438 de la séquence SEQ ID NO: 506.
La séquence SEQ ID NO: 268 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 267. Ce fragment comprend 225 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 71 au résidu 295 de la séquence SEQ ID NO: 506.
La séquence SEQ ID NO: 270 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 269. Ce fragment comprend 47 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 296 au résidu 342 de la séquence SEQ ID NO: 506.
La séquence SEQ ID NO: 272 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine G1, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 271. Ce fragment comprend 37 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine G1 allant du résidu 373 au résidu 409 de la séquence SEQ ID NO: 506.
Les fragments de la protéine nétrine G1 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 274 à SEQ ID NO: 296, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 273 à SEQ ID NO: 295, sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO 273 1-342 SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO 275 1-295 + 373-409 SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 277 1-342 + 373-409 SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 279 71-438 SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 281 71-342 SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 283 71-295 + 373-409 SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 285 296-342 + 373-409 SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 287 71-342 + 373-409 SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 289 29-295 SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 291 29-342 SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO 293 29-295 + 373-409 SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 295 29-342 + 373-409 La séquence SEQ ID NO: 298 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine 2878164 18 humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 297. Ce fragment comprend 253 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 1 au résidu 253 de la séquence SEQ ID NO: 510.
La séquence SEQ ID NO: 300 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 299. Ce fragment comprend 220 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 34 au résidu 253 de la séquence SEQ ID NO: 510.
La séquence SEQ ID NO: 302 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 301. Ce fragment comprend 180 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu 433 de la séquence SEQ ID NO: 510.
La séquence SEQ ID NO: 304 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 303. Ce fragment comprend 46 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 254 au résidu 299 de la séquence SEQ ID NO:510.
La séquence SEQ ID NO: 306 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 305. Ce fragment comprend 50 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 373 au résidu 422 de la séquence SEQIDNO:510.
La séquence SEQ ID NO: 308 correspond au fragment de liaison à l'héparine de la protéine humaine nétrine 3, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 307. Ce fragment comprend 148 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 3 allant du résidu 433 au résidu 580 de la séquence SEQ ID NO: 510.
Les fragments de la protéine nétrine 3 correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 310 à SEQ ID NO: 352, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 309 à SEQ ID NO: 351 sont regroupés dans le tableau qui suit: i Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 510 SEQ ID NO: 310 SEQ ID NO: 309 1-422 SEQ ID NO: 312 SEQ ID NO: _ _ 311 254-433 SEQ ID NO: 314 SEQ ID NO: 313 _ 1-253 + 433-580 SEQ ID NO: 316 SEQ ID NO: 315 _ 1-299 SEQ ID NO: 318 SEQ ID NO: 317 1-253 + 373-422 SEQ ID NO: 320 SEQ ID NO: 319 1-299 + 373-422
_
SEQ ID NO: 322 SEQ ID NO: 321 254-299 + 433-580 SEQ ID NO: 324 SEQ ID NO: 323 _ 373-422 + 433-580 _ SEQ ID NO: 326 _ 254-299 + 373-422 SEQ ID NO: 325 _ SEQ ID NO: 328 SEQ ID NO: _ _ 327 _ 254-299 + 373-422 + 433-580 _ SEQ ID NO: 330 SEQ ID NO: 329 _ 1-299 + 433-580 _ SEQ ID NO: 332 SEQ ID NO: 331 1-253 + 373-422 + 433-580 SEQ ID NO: 334 SEQ ID NO: 333 1-299 + 373-422 + 433-580 _ SEQ ID NO: 336 SEQ ID NO: 335 _ 34-433 _ SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 337 34-253 + 433-580 SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 339 34-299 SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 341 _ 34-253 + 373-422 SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 343 _ 34-580 SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 345 _ 34-299 + 373-422 SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 347 34-299 + 433-580 _ SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO: 349 34-253 + 373-422 + 433-580
_
SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO: 351 34-299 + 373-422 + 433-580 La séquence SEQ ID NO: 354 correspond à un fragment de la protéine RGM-A, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 353. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-A allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO: 512.
La séquence SEQ ID NO: 356 correspond à un fragment de la protéine RGM-B, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 355. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-B allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO: 514.
La séquence SEQ ID NO: 358 correspond à un fragment de la protéine RGM-C, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 357. Ce fragment comprend 111 acides aminés et correspond au fragment de la protéine RGM-C allant du résidu 180 au résidu 290 de la séquence SEQ ID NO: 516.
La séquence SEQ ID NO: 374 correspond à un fragment de type laminine (protéine de la matrice extracellulaire se liant à certaines intégrines) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 373. Ce fragment comprend 260 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 1 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 522.
La séquence SEQ ID NO: 376 correspond à un fragment de type EGF (domaine de répétition facteur EGF) de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant 5 codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 375. Ce fragment comprend 255 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 261 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 522.
La séquence SEQ ID NO: 378 est un fragment correspondant à la protéine humaine nétrine 4 mutée délétée de la séquence SEQ ID NO: 364, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 377. Ce fragment comprend 515 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 1 au résidu 515 de la séquence SEQ ID NO: 522.
La séquence SEQ ID NO: 386 est un fragment de type laminine de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 385. Ce fragment comprend 229 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 32 au résidu 260 de la séquence SEQ ID NO: 522.
La séquence SEQ ID NO: 384 est un fragment de type EGF de la protéine humaine nétrine 4 mutée, ledit fragment étant codé par la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 383. Ce fragment comprend 56 acides aminés et correspond au fragment de la protéine nétrine 4 mutée allant du résidu 332 au résidu 387 de la séquence SEQ ID NO: 522.
Les fragments de la protéine nétrine 4 mutée correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 380 à SEQ ID NO: 496, ainsi que les séquences nucléotidiques correspondantes SEQ ID NO: 379 à SEQ ID NO: 495 sont regroupés dans le tableau qui suit: Séquence protéique Séquence nucléotidique Positions du fragment par rapport à la séquence SEQ ID NO: 522 SEQ ID NO: 380 SEQ ID NO: 379 32-515 SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO: 381 32628 SEQ ID NO: 384 SEQ ID NO: 383 332-387 SEQ ID NO: 386 SEQ ID NO: 385 32-260 SEQ ID NO: 388 SEQ ID NO: 387 1-260 + 516-628 SEQ ID NO: 390 SEQ ID NO: 389 261-628 SEQ ID NO: 392 SEQ ID NO: 391 1-320 SEQ ID NO: 394 SEQ ID NO: 393 1-260 + 332-387 8Z9-9I S + OZ-OZ 817: ON CII â s 17817: ON CII bS 51717-176 + L8-Z+ OZ-OZ 1817: ON CII Ms 2817: ON CII â s S**- *6 + OZ-OZ 6L* ON CII biS 08* ON CII bS St7trt6 + L8-Z + 09Z-OZ LLb: ON a âIS 8Lt ON a 5q- -L8-z + ou-OZ SL* : ON CII bris 9L* : ON CII bas S*17-176 + 09Z-OZ L* : ON CII bas 17L* ON CII bas L8-Z + 09Z- OZ T L17: ON QI bas ZL17: ON CII bas ou-oz 6917: ON Cri bris 0L17: ON Cri bas 8Z9-9I S + 09Z-0Z L917: ON CH baS 8917: ON Cri bas 9I S-0Z 5917 ON CII baS 9917 ON CE bas 09Z-OZ 917: ON Cri bas 17917: ON Cri bas 8Z9-9I S + S*17-*6 + L8-Z + OZ-Z 1917 ON CQ bas Z917 ON Cri bIS 8Z9-91S + 51717-176 + L8-Z + OZ-I 6517: ON CII baS 0917: ON CII bas 8Z9-91S + 5117-176 + OZ-Z LS17: ON CQ âq5 8517: ON CII âqS 8Z9-9I S + 51717-176 + L8-Z + 09Z-Z SS17 ON CQ bas 9517: ON Cri bas 8Z9-91S+L8-Z+OZ-Z ç17 ONGI baS 17517:ONGIbas 8Z9-9I S + 51717-176 + OZ-I 1517: ON CII bas ZS* : ON CII bas 8Z9-9IS + 51717-176 + L8-Z + 09Z-1 61717 ON CII bas OS17: ON CII bas 8Z9-91S + L8-Z + OZ-1 L1717: ON CII bas 817* : ON Cri bas 8Z9-9I S + 51717-*6 + L8-Z + OZ-192 51717: ON CII bas 91717: ON CII ?MS 8Z9-9I S + S**-176 + L8-Z 1717: ON CII bas 171717: ON CII bris 8Z9-9TS + L8-Z + 0Z-19Z 11717 ON CII bas 21717: ON CII bas 8Z9-91S + S*17-176 + 09Z-1 617: ON CII bas 01717: ON CII bas 8Z9- 9IS + L8-Z + 09Z-I L17 ON CII bris 817: ON CII bas 8Z9-9IS + OZ-I S17: ON CII bas 917: ON CII ?MS 8Z9-9I S + 51717-176 + 09Z-Z 17: ON CII bas 1717: ON CII bas 8Z9-9I S + L8-Z + 09Z-Z l 1t: ON CII bas 217 ON al bas 8Z9-9I S + OZ-Z 6Z17: ON Cri bas 017: ON CII bas 8Z9-9I S + 09Z-Z LZI: ON CII bas 8217: ON CII bas 8Z9-91S + L8-Z SZ17: ON b3S 9217: ON Cri bas 51717-176 + L8-Z+ OZ-Z 217: ON CII bas 17217: ON CII bas 51717-176 + L8-Z+ OZ-I TZ17: ON CII bas ZZ17: ON CII bas S**-176 + 0Z-Z 6117: ON Cri bris OZ* : ON CII bas 51717-*6 + L8-Z + 09Z-Z Lit: ON CII bas 8117: ON CII bas L8-Z + OZ-Z Si* : ON CII bas 9117: ON CII bas 51717-176 + OZ-I 117: ON CII bas 17117: ON CII bas 51717-176 + L8-Z + 09Z-1 ut: ON CII bas Zi17: ON CII bas L8-Z + OZ-1 6017: ON CII bris 0117: ON Cri bas 51717-176 + L8-Z+ OZ-19Z L017: ON OT bas 8017: ON CII bas 51717-176 + L8-Z sot: ON CII bas 9017: ON Cri bas L8-Z + OZ-19Z 017: ON CII bas 170* : ON CQ bas 51717-176 + 09Z-Z 10* : ON CII bris Z017: ON Cri bris L8-Z + 09Z-Z 66 : ON CII bas 0017: ON CII bris OZ-Z L6 : ON Cri ()US 86 : ON Cri bris 5117-176 + 09Z-1 S6 : ON Cri baS 96 : ON Cri bris
IZ
179 I8L8Z SEQ ID NO: 486 SEQ ID NO: 485 20-260 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO: 487 20-260 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 490 SEQ ID NO: 489 20-320 + 332-387 + 516-628 SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 491 20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628 SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 493 20-320 + 394445 + 516-628 SEQ ID NO: 496 SEQ ID NO: 495 20-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628 La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'agent de chimiothérapie est choisi parmi: la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, les inhibiteurs de l'aromatase, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofene, le taxol ou le taxotère.
La présente invention concerne également un produit de combinaison comprenant au moins un ligand de la néogénine, ou le cas échéant d'une séquence nucléotidique codant pour un ligand de la néogénine, notamment choisi parmi: l'une des protéines suivantes: la nétrine 1 représentée par SEQ ID NO: 502 ou SEQ ID NO: 504, la nétrine G1 représentée par SEQ ID NO: 506 ou SEQ ID NO: 508, la nétrine 3 représentée par SEQ ID NO: 510, la nétrine 4 représentée par SEQ ID NO: 498 ou SEQ ID NO: 500, l'une des molécules RGM représentées par SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, ou la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2n, n variant de 1 à 248, ou une séquence nucléotidique codant pour l'une des protéines susmentionnées, notamment représentée par l'une des séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 523, ou l'une des séquences SEQ ID NO: 2n-1, n variant de 1 à 248, ou un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci- dessus, et au moins un agent de chimiothérapie, notamment choisi parmi: la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, les inhibiteurs de l'aromatase, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol ou le taxotère, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement du cancer.
Dans le cadre de la présente invention, les doses de l'agent antiangiogénique sont comprises d'environ 10 à environ 20 000 gg/kg de poids corporel. La périodicité des injections est notamment déterminée par analogie à la posologie du traitement antiangiogénique existant actuellement sur le marché sous le nom d'Avastin.
NOUVEAUX FRAGMENTS DE NÉTRINE 4 La présente invention concerne également de nouveaux fragments de la protéine nétrine 4, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: * une séquence SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63, ou * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO: 498, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité antiangiogénique.
Les séquences SEQ ID NO: 2p susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 2 à SEQ ID NO: 126, à savoir les séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124 ou SEQ ID NO: 126, telles que définies précédemment.
Les fragments SEQ ID NO: 2p sont de nouveaux fragments de la nétrine 4, présentant une activité d'inhibition de l'angiogenèse.
Les séquences SEQ ID NO: 2p-1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO: 2p, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 1 codant pour SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 codant pour SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 codant pour SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 codant pour SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 codant pour SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 codant pour SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 codant pour SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 codant pour SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 codant pour SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 codant pour SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 codant pour SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 codant pour SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 codant pour SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 codant pour SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 codant pour SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 codant pour SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 codant pour SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 codant pour SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 codant pour SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 codant pour SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 codant pour SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 codant pour SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 codant pour SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 codant pour SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 codant pour SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 codant pour SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 codant pour SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 codant pour SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 codant pour SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 codant pour SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 codant pour SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 codant pour SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 codant pour SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 codant pour SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 codant pour SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 codant pour SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 codant pour SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 codant pour SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 codant pour SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 codant pour SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 codant pour SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 codant pour SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 codant pour SEQ IDNO: 86, SEQ ID NO: 87 codant pour SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 codant pour SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 codant pour SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 codant pour SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 codant pour SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 codant pour SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 codant pour SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 codant pour SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 codant pour SEQ ID NO: 104, SEQ D NO: 105 codant pour SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 codant pour SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 codant pour SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 codant pour SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113 codant pour SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115 codant pour SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 codant pour SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119 codant pour SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 codant pour SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 codant pour SEQ ID NO: 124 ou SEQ ID NO: 125 codant pour SEQ ID NO: 126.
L'activité d'inhibition de l'angiogenèse est également désignée activité antiangiogénique. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la différenciation, de cellules endothéliales par les fragments susmentionnés de la nétrine 4.
La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence du fragment dont on souhaite évaluer l'activité. La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence du fragment à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure. La mesure de l'inhibition de la différenciation (tubulogenèse) des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence du fragment à tester.
Parmi les modèles classiques de mesure d'angiogenèse, on peut citer les modèles par délivrance locale comme: l'injection sous-cutanée de Matrigel (Becton Dickinson) imprégné du composé de l'invention (Inoki et al., 2002), ou le dépôt sur la membrane chorio-allantoïdienne de poulet d'un implant contenant un composé de l'invention (Celerier et al., 2002).
Alternativement, les fragments de l'invention peuvent être injectés par voie systémique (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée) à des animaux chez qui on a créé une maladie angiogénique expérimentale. Les fragments de l'invention peuvent aussi être injectés directement dans une tumeur. Alternativement les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention (décrits ci-après) peuvent être délivrés par une méthode de thérapie génique par voie locale ou systémique par toute méthode permettant l'expression des fragments ou des anticorps anti- idiotypiques selon l'invention. Alternativement les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention peuvent être insérés dans un plasmide qui est transfecté dans les cellules cancéreuses. Tous ces procédés de mesure sont notamment décrits dans l'article de Jain et al. (1997).
On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression, voire la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant 20 pour une protéine telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, la séquence nucléotidique selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 2p-1 codant pour SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2p-1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 2p, telle que définie ci-dessus, p variant de 1 à 63, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60 C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que 0,1X SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50 C.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment SEQ ID NO: 2p-1, p variant de 1 à 63.
Un vecteur avantageux selon l'invention contient les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, notamment SEQ ID NO: 2p-1, p variant de 1 à 63, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant telle que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que mentionnée ci-dessus, à savoir un fragment de la nétrine 4, notamment représenté par SEQ ID NO: 2p, p variant delà 63.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active, une protéine telle que définie cidessus, correspondant aux fragments de la nétrine 4, et de préférence l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 30 à 63, ou une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment l'une des séquences SEQ ID NO: 2p-1, p variant de 1 à 63, ou un anticorps tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63.
La présente invention concerne également l'utilisation: d'une protéine telle que définie ci-dessus, correspondant aux fragments de la nétrine 4, et de préférence l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63, ou d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, notamment l'une des séquences SEQ ID NO: 2p-1, p variant de 1 à 63, ou d'un anticorps tel que défini ci-dessus, notamment dirigé contre l'une des séquences SEQ ID NO: 2p, p variant de 1 à 63.
pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes: les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
L'expression "inhibition de la prolifération endothéliale" désigne toute substance capable de freiner la prolifération de cellules endothéliales selon le test de prolifération décrit ci-après.
La mesure de l'activation de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une "blessure" sur un tapis de cellules et en incubant ensuite les cellules en présence de la protéine, ou de la séquence nucléotidique ou de l'anticorps anti-idiotypique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure.
La mesure de l'activation de la prolifération des cellules endothéliales peut être 25 réalisée en plaçant cellules endothéliales dans un milieu de culture approprié et en mesurant ensuite le nombre total de cellules.
UTILISATION DE RGM ET NOUVEAUX FRAGMENTS DE RGM
La présente invention concerne l'utilisation: d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: * la séquence SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 150 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 ou SEQ ID NO: 358, * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, ou d'un fragment défini ci- dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 180 et 290 de la séquence SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 518 ou SEQ ID NO: 520, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique, ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant: * soit pour la protéine telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine telle que définie ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine telle que définie ci-dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine telle que définie ci- dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 511 codant pour SEQ ID NO: 512, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 513 codant pour SEQ ID NO: 514, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 515 codant pour SEQ ID NO: 516, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 517 codant pour SEQ ID NO: 518, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 519 codant pour SEQ ID NO: 520, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 353 codant pour SEQ ID NO: 354, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 355 codant pour SEQ ID NO: 356, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 357 codant pour SEQ ID NO: 358, ou d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies non tumorales nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, to notamment dans le cadre des pathologies suivantes: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
La présente invention concerne également des fragments de RGM, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: * une séquence SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 ou SEQ ID NO: 358, ou * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 180 et 290 de SEQ ID NO: 512, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti- angiogénique.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour l'un des fragments de RGM tels que définis ci-dessus.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355 ou SEQ ID NO: 357, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 ou SEQ ID NO: 358, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 ou SEQ ID NO: 358, telle que définie cidessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ l0 50%, avec la séquence SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 355 ou SEQ ID NO: 357, codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 356 ou SEQ ID NO: 358, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60 C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que 0,1X SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50 C.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, ledit vecteur recombinant contenant de préférence les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammiferes, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre l'un des fragments de RGM susmentionnés.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active, - l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou une séquence nucléotidique telle que définie cidessus, codant pour l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de RGM susmentionnés.
La présente invention concerne également l'utilisation de l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou d'une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour l'un des fragments de RGM susmentionnés, ou d'un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de RGM susmentionnés, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes: les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
UTILISATION DE FRAGMENTS DE NÉTRINE 1, DE NÉTRINE 3 ET DE SES FRAGMENTS, DE NÉTRINE GI ET DE SES FRAGMENTS ET DE NÉTRINE 4 MUTÉE, AINSI QUE LES NOUVEAUX FRAGMENTS CORRESPONDANTS La présente invention concerne l'utilisation: d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: * la nétrine G1 représentée par la séquence SEQ ID NO: 506 ou par la séquence SEQ ID NO: 508, ou la nétrine 3 représentée par la séquence SEQ ID NO: 510, ou la nétrine 4 mutée représentée par la séquence SEQ ID NO: 522 ou par la séquence SEQ ID NO: 524, * un fragment de l'une de ces protéines ou de la nétrine 1 représentée par la séquence SEQ ID NO: 502 ou SEQ ID NO: 504, sous réserve que ce fragment présente une activité anti-angiogénique, ledit fragment comprenant 10 15 notamment environ 40 à environ 400 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2m, m variant de 64 à 176 et de 187 à 248, ou par la séquence SEQ ID NO: 372, * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou d'un fragment défini ci-dessus, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti- angiogénique, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524 ou d'un fragment défini ci-dessus, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 296 et 438 de la séquence SEQ ID NO: 506, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique, ou d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant: * soit pour l'une des protéines telles que définies ci-dessus, * soit pour un fragment de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de l'une des protéines telles que définies 20 ci-dessus, * soit pour une séquence homologue de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 505 codant pour SEQ ID NO: 506, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 507 codant pour SEQ ID NO: 508, ou à la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 509 codant pour SEQ ID NO: 510, ou à une séquence SEQ ID NO: 2m-1 codant pour SEQ ID NO: 2m, m variant de 64 à 176 et de 187 à 248, ou à la séquence SEQ ID NO: 371 codant pour SEQ ID NO: 372, ou d'un anticorps anti-idiotypique de l'une des protéines telles que définies ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes: les cancers et les leucémies, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite psoriasique, les angiomes, les angiosarcomes, la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi, ou dans le cadre du traitement de l'obésité ou de la néovascularisation rétinienne.
Les séquences SEQ ID NO: 2m susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 128 à SEQ ID NO: 352 et SEQ ID NO: 374 à SEQ ID NO: 496, c'est-à-dire aux séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 494 ou SEQ ID NO: 496.
Les séquences SEQ ID NO: 2m-1 susmentionnées codent pour les séquences protéiques susmentionnées SEQ ID NO: 2m, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 127 codant pour SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 codant pour SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 codant pour SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 codant pour SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 codant pour SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 codant pour SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 codant pour SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 codant pour SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 codant pour SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 codant pour SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 codant pour SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 codant pour SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 codant pour SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153 codant pour SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 codant pour SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 codant pour SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 codant pour SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 codant pour SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163 codant pour SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 codant pour SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 codant pour SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 codant pour SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 codant pour SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 codant pour SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 codant pour SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 codant pour SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179 codant pour SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 codant pour SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 codant pour SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 codant pour SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187 codant pour SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 codant pour SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 codant pour SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 codant pour SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 codant pour SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 codant pour SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 codant pour SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 codant pour SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 codant pour SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 codant pour SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 codant pour SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 codant pour SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 codant pour SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 codant pour SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215 codant pour SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217 codant pour SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 codant pour SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 codant pour SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 codant pour SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 codant pour SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 codant pour SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 codant pour SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231 codant pour SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 codant pour SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235 codant pour SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237 codant pour SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 codant pour SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 codant pour SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 codant pour SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 codant pour SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 codant pour SEQ D NO: 248, SEQ ID NO: 249 codant pour SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 codant pour SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 codant pour SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255 codant pour SEQ ID NO: 256, SEQ D NO: 257 codant pour SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 codant pour SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261 codant pour SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263 codant pour SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 codant pour SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 codant pour SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269 codant pour SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 codant pour SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 codant pour SEQ ID NO: 274, SEQ D NO: 275 codant pour SEQ D NO: 276, SEQ D NO: 277 codant pour SEQ D NO: 278, SEQ ID NO: 279 codant pour SEQ D NO: 280, SEQ ID NO: 281 codant pour SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 codant pour SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 codant pour SEQ D NO: 286, SEQ ID NO: 287 codant pour SEQ D NO: 288, SEQ ID NO: 289 codant pour SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 codant pour SEQ D NO: 292, SEQ ID NO: 293 codant pour SEQ ID NO: 294, SEQ D NO: 295 codant pour SEQ D NO: 296, SEQ D NO: 297 codant pour SEQ D NO: 298, SEQ ID NO: 299 codant pour SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301 codant pour SEQ ID NO: 302, SEQ D NO: 303 codant pour SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 codant pour SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307 codant pour SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309 codant pour SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311 codant pour SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 codant pour SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315 codant pour SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317 codant pour SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319 codant pour SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321 codant pour SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 codant pour SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325 codant pour SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 codant pour SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329 codant pour SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331 codant pour SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 codant pour SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 codant pour SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 codant pour SEQ ID NO 338, SEQ ID NO: 339 codant pour SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 codant pour SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 codant pour SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 codant pour SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347 codant pour SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349 codant pour SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351 codant pour SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 373 codant pour SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 codant pour SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377 codant pour SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379 codant pour SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 codant pour SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 codant pour SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 codant pour SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 codant pour SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 codant pour SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 codant pour SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393 codant pour SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395 codant pour SEQID NO: 396, SEQ ID NO: 397 codant pour SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399 codant pour SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401 codant pour SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403 codant pour SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405 codant pour SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407 codant pour SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409 codant pour SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 codant pour SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413 codant pour SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415 codant pour SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417 codant pour SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419 codant pour SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421 codant pour SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423 codant pour SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425 codant pour SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427 codant pour SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429 codant pour SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431 codant pour SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 codant pour SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 codant pour SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 codant pour SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 codant pour SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 codant pour SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 codant pour SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 codant pour SEQ D NO: 446, SEQ ID NO: 447 codant pour SEQ D NO: 448, SEQ D NO: 449 codant pour SEQ D NO: 450, SEQ ID NO: 451 codant pour SEQ D NO: 452, SEQ ID NO: 453 codant pour SEQ ID NO: 454, SEQ D NO: 455 codant pour SEQ ID NO: 456, SEQ D NO: 457 codant pour SEQ D NO: 458, SEQ D NO: 459 codant pour SEQ D NO: 460, SEQ ID NO: 461 codant pour SEQ D NO: 462, SEQ ID NO: 463 codant pour SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 codant pour SEQ ID NO: 466, SEQ D NO: 467 codant pour SEQ D NO: 468, SEQ ID NO: 469 codant pour SEQ D NO: 470, SEQ ID NO: 471 codant pour SEQ D NO: 472, SEQ D NO: 473 codant pour SEQ ID NO: 474, SEQ D NO: 475 codant pour SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 codant pour SEQ D NO: 478, SEQ ID NO: 479 codant pour SEQ D NO: 480, SEQ ID NO: 481 codant pour SEQ D NO: 482, SEQ ID NO: 483 codant pour SEQ ID NO: 484, SEQ D NO: 485 codant pour SEQ ID NO: 486, SEQ D NO: 487 codant pour SEQ D NO: 488, SEQ D NO: 489 codant pour SEQ D NO: 490, SEQ ID NO: 491 codant pour SEQ D NO: 492, SEQ D NO: 493 codant pour SEQ ID NO: 494 ou SEQ ID NO: 495 codant pour SEQ ID NO: 496.
La présente invention concerne également les fragments de la nétrine 1, 20 caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: une séquence SEQ ID NO: 2i, i variant de 64 à 131, ou toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que 25 cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 284 et 487 de SEQ ID NO: 502, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ D NO: 2i susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ D NO: 128 à SEQ ID NO: 262, c'est-à-dire les séquences protéiques suivantes: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ D NO: 148, SEQ D NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 260 ou SEQ ID NO: 262.
La présente invention concerne également les fragments de la nétrine G1, 15 caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: une séquence SEQ ID NO: 2j, j variant de 132 à 148, ou toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que 20 cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 296 et 438 de SEQ ID NO: 506, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO: 2j susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 264 à SEQ ID NO: 296, c'est-à-dire: SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO: 272, SEQ NO: 274, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 294 ou SEQ ID NO: 296.
La présente invention concerne également les fragments de la nétrine 3, caractérisés en ce qu'ils comprennent ou sont constitués par l'une des séquences suivantes: - une séquence SEQ ID NO: 2k, k variant de 149 à 176, ou toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 254 et 433 de SEQ ID NO: 510, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité anti-angiogénique.
Les séquences SEQ ID NO: 2k susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 298 à 352, c'est-à-dire aux séquence protéiques suivantes: SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 350 ou SEQ ID NO: 352.
La présente invention concerne également une protéine, caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par l'une des séquences suivantes: * la séquence SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou * un fragment de l'une de ces protéines, sous réserve que ce fragment présente une activité antiangiogénique, ledit fragment comprenant notamment environ 40 à environ 450 acides aminés, et de préférence d'environ 40 à environ 230 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2q, q variant de 187 à 248, * toute séquence dérivée de l'une des séquences susmentionnées, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité anti-angiogénique, ou * toute séquence homologue de l'une des séquences susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50% avec la région comprise entre les acides aminés en position 261 et 515 de SEQ ID NO: 522, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité antiangiogénique.
La protéine SEQ ID NO: 522 susmentionnée est une nouvelle protéine correspondant à la protéine nétrine 4 mutée et la protéine SEQ ID NO: 524 susmentionnée correspond à la protéine SEQ ID NO: 522 sans peptide signal.
Les fragments susmentionnés, correspondant aux séquences protéiques SEQ ID NO: 374 à SEQ ID NO: 496, sont de nouveaux fragments correspondant à des fragments de la nétrine 4 mutée susmentionnée.
Les séquences SEQ ID NO: 2q susmentionnées correspondent aux séquences protéiques SEQ ID NO: 374 à 496, c'est-à-dire aux séquence protéiques suivantes: SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ D NO: 408, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ D NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428, SEQ D NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 438, SEQ D NO: 440, SEQ ID NO: 442, SEQ D NO: 444, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 480, SEQ D NO: 482, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 492, SEQ D NO: 494 ou SEQ D NO: 496.
La présente invention concerne également une séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour les fragments de la nétrine 1, de la nétrine G1, de la nétrine 3 ou de la nétrine 4 mutée.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce 30 qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 2i-1, i variant de 64 à 131, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ D NO: 2i, i variant de 64 à 131, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO: 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2i-1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 2i, i variant de 64 à 131, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
Les séquences SEQ ID NO: 2i-1 susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 1 susmentionnés, représentés par SEQ ID NO: 2i, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 127 codant pour SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 codant pour SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 codant pour SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133 codant pour SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 codant pour SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137 codant pour SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139 codant pour SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141 codant pour SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143 codant pour SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 codant pour SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147 codant pour SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149 codant pour SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151 codant pour SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153 codant pour SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 codant pour SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 codant pour SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159 codant pour SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161 codant pour SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163 codant pour SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 codant pour SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 codant pour SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169 codant pour SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171 codant pour SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 codant pour SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175 codant pour SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 codant pour SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179 codant pour SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181 codant pour SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 codant pour SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185 codant pour SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187 codant pour SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 codant pour SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191 codant pour SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 codant pour SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 codant pour SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197 codant pour SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 codant pour SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 codant pour SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 codant pour SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205 codant pour SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 codant pour SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209 codant pour SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211 codant pour SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 codant pour SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215 codant pour SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217 codant pour SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219 codant pour SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221 codant pour SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 codant pour SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225 codant pour SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227 codant pour SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229 codant pour SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231 codant pour SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 codant pour SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235 codant pour SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237 codant pour SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239 codant pour SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 codant pour SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 codant pour SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245 codant pour SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247 codant pour SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249 codant pour SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251 codant pour SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253 codant pour SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255 codant pour SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257 codant pour SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259 codant pour SEQ ID NO: 260 ou SEQ ID NO: 261 codant pour SEQ ID NO: 262.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce 25 qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 2j-1, j variant de 132 à 148, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO: 2j, j variant de 132 à 148, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO: 2j, j variant de 132 à 148, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2j-1 codant pour une protéine homologue de l'une des séquences SEQ ID NO: 2j, j variant de 132 à 148, telle que définie ci- dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
l0 Les séquences SEQ ID NO: 2j-1 susmentionnées codent pour les fragments de nétrine Gl susmentionnés, représentés par SEQ ID NO: 2j, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 263 codant pour SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265 codant pour SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267 codant pour SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269 codant pour SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271 codant pour SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273 codant pour SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275 codant pour SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277 codant pour SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279 codant pour SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281 codant pour SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283 codant pour SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285 codant pour SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287 codant pour SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289 codant pour SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 codant pour SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293 codant pour SEQ ID NO: 294 ou SEQ ID NO: 295 codant pour SEQ ID NO: 296.
Une séquence nucléotidique avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 2k-1, k variant de 149 à 176, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO: 2k, k variant de 149 à 176, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de l'une des séquences SEQ ID NO: 2k, k variant de 149 à 176, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2k-1 codant pour une protéine homologue de l'une des séquences SEQ ID NO: 2k, k variant de 149 à 176, telle que définie ci- dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
Les séquences SEQ ID NO: 2k-1 susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 3 susmentionnés, représentés par SEQ ID NO: 2k, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 297 codant pour SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299 codant pour SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301 codant pour SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303 codant pour SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305 codant pour SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307 codant pour SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309 codant pour SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311 codant pour SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313 codant pour SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315 codant pour SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317 codant pour SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319 codant pour SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321 codant pour SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323 codant pour SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325 codant pour SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327 codant pour SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329 codant pour SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331 codant pour SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333 codant pour SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 codant pour SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337 codant pour SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339 codant pour SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341 codant pour SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343 codant pour SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345 codant pour SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347 codant pour SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349 codant pour SEQ ID NO: 350 ou SEQ ID NO: 351 codant pour SEQ ID NO: 352.
Une séquence nucléotidique préférée selon l'invention est une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par: la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 521 codant pour SEQ ID NO: 522, ou la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 523 codant pour SEQ ID NO: 524, un fragment de l'une de ces séquences nucléotidiques, et notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2q-1, q variant de 187 à 248, ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, et codant pour une protéine représentée par l'une des séquences SEQ ID NO: 2q, q variant de 187 à 248, ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO: 2q, q variant de 187 à 248, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique homologue de l'une des séquences nucléotidiques susmentionnées, ayant de préférence une identité d'au moins environ 50%, avec l'une des séquences SEQ ID NO: 2q-1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO: 2q, telle que définie ci-dessus, ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences 15 susmentionnées, ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences susmentionnées.
L'expression "hybrider dans des conditions stringentes" correspond notamment à un tampon d'hybridation tel que 0,5X SSC, à une température d'hybridation de 60 C, ainsi qu'à un milieu de lavage tel que 0,1X SSC additionné de 1% de SDS et à une température de lavage de 50 C.
Les séquences SEQ ID NO: 2q-1 susmentionnées codent pour les fragments de nétrine 4 mutée susmentionnés, représentés par SEQ ID NO: 2q, et correspondent aux séquences nucléotidiques suivantes: SEQ ID NO: 373 codant pour SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 codant pour SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377 codant pour SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379 codant pour SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381 codant pour SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383 codant pour SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 codant pour SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387 codant pour SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389 codant pour SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391 codant pour SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393 codant pour SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395 codant pour SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397 codant pour SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399 codant pour SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401 codant pour SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403 codant pour SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405 codant pour SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407 codant pour SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409 codant pour SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411 codant pour SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413 codant pour SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415 codant pour SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417 codant pour SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419 codant pour SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421 codant pour SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423 codant pour SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425 codant pour SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427 codant pour SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429 codant pour SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431 codant pour SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433 codant pour SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435 codant pour SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437 codant pour SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439 codant pour SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441 codant pour SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443 codant pour SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445 codant pour SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447 codant pour SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449 codant pour SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451 codant pour SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453 codant pour SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455 codant pour SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457 codant pour SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459 codant pour SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461 codant pour SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463 codant pour SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465 codant pour SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467 codant pour SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469 codant pour SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471 codant pour SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473 codant pour SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475 codant pour SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477 codant pour SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479 codant pour SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481 codant pour SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483 codant pour SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485 codant pour SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487 codant pour SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489 codant pour SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 codant pour SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493 codant pour SEQ ID NO: 494 ou SEQ ID NO: 495 codant pour SEQ ID NO: 496.
La présente invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, à savoir une séquence nucléotidique codant pour l'un des fragments de nétrine 1, de nétrine 3, de nétrine G ou de nétrine 4 mutée, ledit vecteur recombinant étant notamment caractérisé en ce qu'il contient les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques susmentionnés, insérés dans ledit vecteur.
La présente invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé de manière spécifique contre une protéine telle que définie ci-dessus, notamment dirigé contre un fragment de la nétrine 1, de la nétrine 3, de la nétrine G ou de la nétrine 4 mutée tels que définis ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, 10 comprenant à titre de substance active, l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, de la nétrine G ou de la nétrine 4 mutée susmentionnés, ou une séquence nucléotidique telle que définie cidessus, codant pour l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, de la nétrine G ou de la nétrine 4 mutée 15 susmentionnés, ou un anticorps tel que défini ci-dessus, dirigé contre l'un des fragments de la nétrine 1, de la nétrine 3, de la nétrine G ou de la nétrine 4 mutée susmentionnés.
Protéines Séquence protéique Séquence nucléotidique Nétrine 4 (avec peptide signal)(1-628) SEQ ID NO: 498 SEQ ID NO: 497 Nétrine 4 (sans peptide signal)(20-628) SEQ ID NO: 500 SEQ ID NO: 499 Nétrine 1 (avec peptide signal)(1-604) SEQ ID NO: 502 SEQ ID NO: 501 Nétrine 1 (sans peptide signal)(25-604) SEQ ID NO: 504 SEQ ID NO: 503 Nétrine G1 (avec peptide signal)(1-438) SEQ ID NO: 506 SEQ ID NO: 505 Nétrine G1 (sans peptide signal)(29-438) SEQ ID NO: 508 SEQ ID NO: 507 Nétrine 3 (1-580) SEQ ID NO: 510 SEQ ID NO: 509 RGMA (1-450) SEQ ID NO: 512 SEQ ID NO: 511 RGMB (1-437) SEQ ID NO: 514 SEQ ID NO: 513 RGMC (1-426) SEQ ID NO: 516 SEQ ID NO: 515 RGMB sans peptide signal (46-437) SEQ ID NO: 518 SEQ ID NO: 517 RGMC sans peptide signal (36-426) SEQ ID NO: 520 SEQ ID NO: 519 Nétrine 4 mutée (avec peptide signal)(1-628) SEQ ID NO: 522 SEQ ID NO: 521 Nétrine 4 mutée (sans peptide signal)(20-628) SEQ ID NO: 524 SEQ ID NO: 523 Fragments de nétrine 4 Séquence protéique Séquence nucléotidique 1 (1-260) SEQ ID NO: 360 SEQ ID NO: 359 2 (261-515) SEQ ID NO: 362 SEQ ID NO: 361 3 (516-628) SEQ ID NO: 364 SEQ ID NO: 363 1+2 (1-515) SEQ ID NO: 366 SEQ ID NO: 365 6 : ON al bas Ob: ON al bas (L8-Z + OZ-I9Z + 09Z- Z) qZ+BZ+Ei L : ON al bas 8 : ON bas (St.-176Ê + OZ-I9Z + 09Z-I) 3Z+ 'Z+i g : ON al bas 9 : ON âIS (Sfrt'-i'6 + L8-Z + 09Z-I) 3Z+qZ+i ON al bas b : ON al bas (L8-Z + OZ-I9Z + 09Z-I) qZ+ tZ+T 1 ON al bas z : ON UI â is (Sbt'-t'6 + L8-Z+ OZ-I9Z) 3Z+qZ+tZ 6Z: ON (IF âIS O : ON au bas (St''-'6É" + OZ-I9Z) 3Z+'Z LZ: ON cu bas 8Z: ON al bas (Sf t'-f'6 + L8-Z) 3Z+qz SZ: ON al bas 9Z: ON CR ?MS (L8-Z + OZ-[9Z) qZ+'Z Z ON QI bas tZ: ON Eu bas (Sfr11-t'6 + 09Z-Z) 3Z+'i tZ ON cu bas ZZ: ON al bas (L8-Z + 09Z-Z) qZ+'T 61: ON G1 â S OZ: ON cu bas (OZ-19Z + 09Z-Z) Z+I L I: ON al bas 81: ON al bis (St't'-'6 + 09Z- I) 3Z-FI St: ON au bas 91: ON al bas (L8-Z + 09Z-D qZ+1 1 = ON UI bas i7t: ON bas (OZ-[9Z + 09Z-I) 'Z+I i t: ON QI âIS ZI: ON Eu bas (SZ9-I9Z) +Z 6: ON (H âaS Ot: ON al bis (i9-9[S + 09Z-I) +i L:ONal bas 8:ONal bas (09Z-Z) S: ON QI bas 9: ON CH â S (St''-t-60 3Z : ON QI bas p: ON ( bas (LS-Z) qZ U ON (Z (OZ-I9Z) EZ : ON al bas 69E: ON QI âIS OL : ON al bas (8Z9-Z) +Z+'T L9 : ON CH âIS 89E: ON al bas (SIS-Z) Z+ ti 8 ON QI â S t8: ON QI âiS (8Z9-9IS + L8-Z + OZ-I9Z + 09Z-Z) +qZ+ 'Z+ t1 18 ON CEE âqS Z8: ON UT aS (8Z9-9IS + Sbf7-fr6 + OZ-[9Z + 09Z-I) + 3Z+EZ+I 6L: ON QI â S 08: ON QI âiS (8D-91S + Sfrfr-tr6 + L8-Z + 09Z- I) +3Z+qZ+i LL: ON UT âiS 8L: ON UT â s (8Z9-9IS + L8-Z + OZ-19Z + 09Z-I) +qZ+uZ+i SL: ON â s 9L: ON QI â S (8Z9-9IS + SfP-f6 + L8-Z + OZ-19Z) +3Z+qZ+uZ L ON CI âIS bL: ON QI âIS (8Z9-9IS + SfrP-P6 + L8-Z) +3Z+qz IL: ON UT â S ZL: ON CUI â S (8D-91S + Sfr/-176 + OZ-I9Z) +3Z+EZ 69: ON UT âiS OL: ON UI P M (8Z9-9IS + L8-Z + OZ-I9Z) +qZ+'Z L9: ON UT âiS 89: ON UT PqS (8Z9-9IS + S1711-f'6 + 09Z-I) +3Z+T S9: ON Cll â IS 99: ON b S (8Z9-9IS + LS-Z + 09Z I +qZ+I 9: ON UT ë S 179: ON CR âiS (8Z9-91S + OZ-I9Z + 09Z-I) +EZ+I 19: ON CEE PUS Z9: ON UT âIS (8D-91S + Strb-116 + 09Z-Z) +3Z+ti 6S: ON bas 09: ON CR bas (8Z9-9IS + L8-Z + 09Z-Z) +qZ+ui LS: ON CU PMS 8S: ON (HbaS (8Z9-9IS + OZ-I9Z + 09Z-Z) +iZ+iI SS: ON C bas 9S: ON UT bas (8Z9-9IS + 09Z-Z) +cl S ON UT bas tS: ON UT bas (8Z9-9IS + Sbb-fr6) +3Z I: ON UI bas ZS: ON bas (8Z9-9IS + L8-Z) +qz 617: ON QI bas OS: ON QI bas (8Z9-9IS + OU-I9Z) +tZ Lb: ON QI bas 8b: ON UT bas (Sbf'-66 + L8-Z+ OZ-19Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+'Z+ui Sig: ON bas 917: ON UT PIS (SPP-P6 + L8-Z+ OZ-I9Z + 09ZI) 3Z+qZ+1Z+T b: ON UT PUS 1717: ON Cll bas (Sf'fr-176E + OZ-I9Z + 09ZZ) 3Z+'Z+t 1 117: ON UT bas Zi: ON UT bas (Stt'-176î + L8-Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+gT la+2b+2c+3 (32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 85 la+2a+2c+3 (32-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 87 1+2a+2b+2c+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ D NO: 90 SEQ ID NO: 89 la+2a+2b+2c+3 (32-260 + 261-320 + 332387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 91 1 sans peptide signal (20-260) SEQ ID NO: 94 SEQ D NO: 93 1+2 sans peptide signal (20- 516) SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 95 1+3 sans peptide signal (20-260 + 516- 628) SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 97 1+2a sans peptide signal (20-260 + 261- 320) SEQ ID NO: 100 SEQ D NO: 99 1+2b sans peptide signal (20-260 + 332- 387) SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 101 1+2c sans peptide signal (20-260 + 394- 445) SEQ D NO: 104 SEQ ID NO: 103 1+2a+2b sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387) SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 105 1+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 107 1+2a+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445) SEQ ID NO: 110 SEQ ID NO: 109 1+2a+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 +332-387 + 394- 445) SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 111 1+2a+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 113 1+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 115 1+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 117 1+2a+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 516- 628) SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 119 1+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 121 1+2a+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 124 SEQ D NO: 123 1+2a+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332- 387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 125 S9I: ON Ol bas 991: ON OI ëqS (OStr-Òi, + I -t'BZ) aZ+uZ 91: ON OI ëaS f791: ON QI ëiS (OStr-06 + 96Î-[tf) aZ+aZ 191: ON QI â S Z91: ON QI â IS (96-I tr + I 8Z) aZ+uz 6ST: ON OI ëiS 091: ON OI bas (OSf-Òf + 8Z-6tr) aZ+uT LST ON QI ëjS 8SI: ON QI bas (96-If' + 8Z-6fr) aZ+uT (I-t;'8Z + 8Z- 6fr) uZ+ui SSI: ON QI ëqS 9S1: ON QI bas SI ON OI bas pST: ON QI ?MS (OSfi-0i7 + 8Z-I) aZ+i 1SI ON QI bas ZSI: ON CH bas (96-Ifr + 8Z-I) aZ+I 6171: ON OI bas OS1: ON QI bas (I-t,8Z + 8Z-I) uZ+i L171: ON QI bas 8171: ON OI bas (t'09-6r) +Z+u1 Sbi: ON OI bas 9171: ON QI bas (L8tr- 6t) Z+ui bi ON QI bas 17171: ON QI ëaS (tr09-68Z) +Z 1171: ON OI bas Z171: ON OI ëaS (fr09-88f + 8Z-I) +I 61: ON QI bas 0171: ON QI bas (8Z-6r) el L1: ON QI bas 81: ON OI bas (OSb-06) aZ SÌ: ON OI ëaS 91: ON QI ëaS (96-I17) aZ ì: ON 0I bas t'1: ON QI bas (I-b8Z) uZ TL : ON OI bas ZL : ON QI bas (L8t7-1) Z+i 11: ON CE bas Zì: ON QI bas (1709-88tr) 6ZT: ON QI bas 01: ON QI bas (L817-/78Z) Z LZ1: ON QI bas 8Zi: ON QI ëaS (8Z-I) I anb!ppe,91ontu aouônb9s onhoind oouonb9g T aUll3a1 ah sluaulâtilI 60Z ON QI â IS 01Z: ON QI âIS (1709-8817 + OS17- 017 + 96-117) +3Z+qZ LOZ: ON QI â as 80Z: ON QI â S (1709-8817 + OS17- 017 + I -1782) +JZ+'Z SOZ: ON QI âiS 90Z: ON QI bas (1709-8817 + 96- 117 + 1 -1782) +qZ+'Z ÒZ ON QI bas 170Z: ON QI bas (1709-8817 + 0517- 017 + 8Z-I) +)Z+i 10Z ON QI bas ZOZ: ON QI bas (1709-8817 + 96-117 + 8Z-I) +qZ+I 661 = ON QI bas OOZ: ON QI bas (1709-8817 + 1 ES-178Z + 8Z- I) +'Z+I L61: ON QI bis 861: ON QI bas (1709-8817 + OS17-017 + 82-617) +3Z+ii S6T: ON QI bas 961: ON QI bas (1709-8817 + 96-117 + 82-617) + qZ+'i 6I: ON QI bas 1761: ON QI bas (1709-8817 + 1-1782 + SZ-617) + 'Z+'i 161: ON QI biS Z6I: ON QI bas (1709-8817 + 82-617) +' i 681: ON QI bas 061: ON QI bas (1709-8817 + OS17-017) +3Z L81: ON QI b3S 881: ON QI bas (1709-8817 + 96-117) +qZ ç8 l ON QI bas 981: ON QI bas (609- 8817 + I1782) +uz 8I: ON QI bas 1781: ON QI bas (0517-017 + 96-117 + I-1782 + 8Z-617) 3Z+qZ+tZ+'i 181: ON QI bas Z81: ON QI bas (OS17- Òtr + 96-117 + I -1782 + 8Z-I) 'Z+qZ+'Z+I 6L1: ON QI bas 081: ON QI bas (OS17-017 + I-178Z + 8Z-617) 3Z+'Z+ti LLI ON QI bas 8L1: ON QI bas (0517-017 + 96-117 + 8Z-617) JZ+qZ+'i SLi: ON QI bas 9LI: ON QI bas (96-117 + I-178Z + 8Z-617) qZ+tZ+'i Li ON QI bas 1L1: ON QI bas (OS17-017 + I-1782 + 8Z-I) 3Z+'Z+i ILI ON QI bas ZL1: ON QI bas (0517017 + 96-I17 + 8Z-I) 3Z+qZ+1 691: ON QI bas OLI: ON QI bas (96-117 + I-1782 + 8Z-I) qZ+'Z+I L9I: ON QI baS 891: ON QI bas (0517-017 + 96Ì b + I -1782) 3Z+qZ+'Z 2a+2b+2c+3 (284-331 + 341-396 + 403-450 + 488604) SEQ ID NO: 212 SEQ ID NO: 211 1+2a+2b+3 (1-283 + 284-331 + 341-396 + 488-604) SEQ ID NO: 214 SEQ ID NO: 213 1+2b+2c+3 (1-283 + 341-396 + 403450 + 488-604) SEQ ID NO: 216 SEQ ID NO: 215 1+2a+2c+3 (1-283 + 284-331 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 218 SEQ ID NO: 217 la+2a+2b+3 (49-283 + 284331 + 341-396 + 488-604) SEQ ID NO: 220 SEQ ID NO: 219 la+2b+2c+3 (49-283 + 341-396 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 222 SEQ ID NO: 221 la+2a+2c+3 (49-283 + 284-331 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 224 SEQ ID NO: 223 1+2a+ 2b+2c+3 (1-283 + 284-331 + 341-396 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 226 SEQ ID NO: 225 la+2a+2b+2c+3 (49-283 + 284-331 + 341-396 + 403-450 + 488- 604) SEQ ID NO: 228 SEQ ID NO: 227 1 sans peptide signal (25-283) SEQ ID NO: 230 SEQ ID NO: 229 1+2 sans peptide signal (25-487) SEQ ID NO: 232 SEQ ID NO: 231 1+3 sans peptide signal (25-283 + 488-604) SEQ ID NO: 234 SEQ ID NO: 233 1+2a sans peptide signal (25-283 + 284-331) SEQ ID NO: 236 SEQ ID NO: 235 1+2b sans peptide signal (25-283 + 341-396) SEQ ID NO: 238 SEQ ID NO: 237 1+2c sans peptide signal (25-283 + 403-450) SEQ ID NO: 240 SEQ ID NO: 239 1+2a+2b sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 341-396) SEQ ID NO: 242 SEQ ID NO: 241 1+2b+2c sans peptide signal (25-283 + 341- 396 + 403-450) SEQ ID NO: 244 SEQ ID NO: 243 1+2a+2c sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 403-450) SEQ ID NO: 246 SEQ ID NO: 245 1+2a+2b+2c sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 341-396 + 403-450) SEQ ID NO: 248 SEQ ID NO: 247 1+2a+3 sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 488-604) SEQ ID NO: 250 SEQ ID NO: 249 1+2b+3 sans peptide signal (25-283 + 341- 396 + 488-604) SEQ ID NO: 252 SEQ ID NO: 251 1+2c+3 sans peptide signal (25-283 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 254 SEQ ID NO: 253 1+2a+2b+3 sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 341-396 + 488-604) SEQ ID NO: 256 SEQ ID NO: 255 1+2b+2c+3 sans peptide signal (25-283 + 341-396 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 258 SEQ ID NO: 257 1+2a+2c+3 sans peptide signal (25- 283 + 284-331 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 260 SEQ ID NO: 259 1+2a+2b+ 2c+3 sans peptide signal (25-283 + 284-331 + 341-396 + 403-450 + 488-604) SEQ ID NO: 262 SEQ ID NO: 261 Fragments de nétrine G1 Séquence protéique Séquence nucléotidique 1 (1-295) SEQ ID NO: 264 SEQ ID NO: 263 2 (296-438) SEQ ID NO: 266 SEQ ID NO: 265 la (71-295) SEQ ID NO: 268 SEQ ID NO: 267 2a (296-342) SEQ ID NO: 270 SEQ ID NO: 269 2b (373-409) SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 271 1+2a (1-295 + 296-342) _ SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 273 1+ 2b (1-295 + 373-409) SEQ ID NO: 276 SEQ ID NO: 275 1+2a+2b (1-295 + 296- 342 + 373-409) SEQ ID NO: 278 SEQ ID NO: 277 la+2 (71-295 + 296-438) SEQ ID NO: 280 SEQ ID NO: 279 la+2a (71-295 + 296-342) SEQ ID NO: 282 SEQ ID NO: 281 la+2b (71-295 + 373-409) SEQ ID NO: 284 SEQ ID NO: 283 2a+2b (296- 342 + 373-409) SEQ ID NO: 286 SEQ ID NO: 285 la+2a+2b (71-295 + 296-342 + 373-409) SEQ ID NO: 288 SEQ ID NO: 287 1 sans peptide signal (29-295) SEQ ID NO: 290 SEQ ID NO: 289 1+2a sans peptide signal (29-295 + 296-342) SEQ ID NO: 292 SEQ ID NO: 291 1+2b sans peptide signal (29-295 + 373-409) SEQ ID NO: 294 SEQ ID NO: 293 1+2a+2b sans peptide signal (29-295 + 296-342 + 373-409) SEQ ID NO: 296 SEQ ID NO: 295 s : oN bas 9 : ON UT bas (fr'SZ + SZ-t') z+ui ON UI bas b : ON bas (085-P + ZZ6-L + 66Z6SZ + SZ-I) +qZ+uZ+i I ON bas z : ON bas (0ss-b + Z 't'-L + SZI) +qZ+I 6Z : ON QI bas 0 : ON QI bas (08ç-tr + 66Z-PSZ + SZ-I) + uZ+i LZ : ON c âas 8Z : ON ai bas (085-P + ZZf-L + 66Z-PST) +qZ+uz SZ : ON a âas 9Z : ON ai bas (ZZ'-L + 66Z-PST) qz+uz Z ON ( bas 17Z : ON ai bas (085-/7 + ZZ6-L ) +qz IZ ON ( bus ZZ : ON ai bas (085-/7 + 66Z-PST) +uZ 61 : ON UT bas ou: ON bas (ZZtr-L + 66Z-fÇZ + SZ-I) qz+uz+i Lu : ON ai ais 81 : ON ai bas (ZZt7-L + SZ-I) qZ+ I S i : ON âqs 91 : ON ui aaS (66Z-D uZ+I i : ON bas 17i : ON ai bas (085-b + 5Z-I) +I I 1 : ON ai bas z i : ON ai bas (f-t'çz) + Z 60 : ON ai aaS 0i : ON CH âas (ZZt7-I) Z+i LO : ON QI bas 80 : ON ai bas (085-t7) SO : ON ai bas 90 : ON UT bas (ZZf-L) qz 0 ON ai bas 170 : ON ai bas (66Z-PST) uZ i0 : ON ai bas ZO : ON ai bas (fi-t7SZ) z 66Z: ON ai bas 00 : ON ai bas (SZ-i7) ui L6Z: ON CH bas 86Z: ON ai bas (SZ-D I auplau ap sluaiueu.iJ anbtpgoaionu aouanba5 anbtaloid aouanba5 la+3 (y-253 + 433-580) SEQ ID NO: 338 SEQ ID NO: 337 la+2a (34-253 + 254-299) SEQ ID NO: 340 SEQ ID NO: 339 la+2b (34-253 + 373-422) SEQ ID NO: 342 SEQ ID NO: 341 la+2+3 34-253 + 254-433 + 433-580) SEQ ID NO: 344 SEQ ID NO: 343 la+2a+2b (34-253 + 254-299 + 373-422) SEQ ID NO: 346 SEQ ID NO: 345 la+2a+3 (34-253 + 254-299 + 433-580) SEQ ID NO: 348 SEQ ID NO: 347 la+2b+3 (34-253 + 373-422 + 433-580) SEQ ID NO: 350 SEQ ID NO: 349 la+2a+2b+3 (34-253 + 254-299 + 373-422 + 433-580) SEQ ID NO: 352 SEQ ID NO: 351 Fragments de RGM Séquence protéique Séquence nucléotidique RGMA (180-290) SEQ ID NO: 354 SEQ ID NO: 353 RGMB (180-290) SEQ ID NO: 356 SEQ ID NO: 355 RGMC (180-290) SEQ ID NO: 358 SEQ ID NO: 357 Fragments de nétrine 4 mutée Séquence protéique Séquence nucléotidique 1 (1-260) SEQ ID NO: 374 SEQ ID NO: 373 2 (261-515) SEQ ID NO: 376 SEQ ID NO: 375 1+2 (1-515) SEQ ID NO: 378 SEQ ID NO: 377 la+2 (32- 515) SEQ ID NO: 380 SEQ ID NO: 379 la+2+3 (32-628) SEQ ID NO: 382 SEQ ID NO: 381 SZ17 ON QI âIS 9217: ON QI âqS (SZ9-91S + L8-Z) +qZ Z17 ON QI âHS 17Z17: ON QI âIS (Sf't-fr6 + L81-Z+ 0U-19Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+'Z+ ui IZ17: ON cil b[S ZZ17: ON OI âqS (S6fr-fr6î + LS-Z+ OZ-19Z + 09Z-I) 3Z+qZ+'Z+I 6117: ON QI âaS OZ17: ON CH biS (St'17-t'6 + OZ-19Z + 09Z- Z) DZ+EZ+tI L117: ON QI âqS 8117: ON QI âaS (Sbt'-b6 + L8-Z + 09Z-Z) 3Z+qZ+ii SU' ON QI bIS 9117: ON QI âIS (LS-Z + OZ-I9Z + 09Z-Z) qZ+ iZ+Ei 117: ON (1 biS 17117: ON QI âIS (St'fi-t'6 + 0U-19Z + 09Z-I) 3Z+ 'Z+I 1117: ON QI âqS ZT17: ON QI â S + LS-Z + 09Z-I) 3Z+qZ+i 6017: ON QI âaS 0117: ON QI bas (L8-Z + OZ-I9t + 09Z-I) qZ+EZ+1 L017: ON QI âIS 8017: ON OI âqS (Sfrt'-176 + LS-Z+ OZ-I9Z) 3Z+qZ+uZ S017: ON QI baS 9017: ON QI bas (Sbtr-r6 + L8-Z) z)Z+qZ 017: ON QI baS 17017: ON 41 baS (L8-Z + OZ-19Z) qZ+'Z 1017: ON QI bas Z017: ON QI bas (S6b- fr6 + 09Z-Z) 3Z+ui 66 : ON QI baS 0017: ON OI baS (L8-Z + 09Z-Z) qZ+'i L6 : ON OI baS 86 : ON QI baS (0Z-19Z + 09Z-Z)'Z+'I S6 : ON QI baS 96 : ON QI âaS (St.t'-tr6 + 09Z-I) zZ+I 6 : ON QI baS 176 : ON QI baS (LS-Z + 09Z-I) qZ+I I6 : ON QI âqS Z6 : ON QI âqS (OZ-I9Z + 09Z-I) 'Z+I 68 : ON QI baS 06 : ON QI baS (8Z9-I9Z) +Z L8 : ON QI baS 88 : ON QI baS (8Z9-9IS + 09Z-I) +I S8 : ON QI baS 98 : ON QI baS (09Z-Z)'i 8 ON QI baS 178 : ON QI âIS (L8-Z) qZ la+3 (32-260 + 516- 628) SEQ ID NO: 428 SEQ ID NO: 427 la+2a+3 (32-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 430 SEQ ID NO: 429 la+2b+3 (32-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 432 SEQ ID NO: 431 la+2c+3 (32-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 434 SEQ ID NO: 433 1+2a+3 (1-260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 436 SEQ ID NO: 435 1+2b+3 (1-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 438 SEQ ID NO: 437 1+2c+3 (1-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 440 SEQ ID NO: 439 2a+ 2b+3 (261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO 442 SEQ ID NO: 441 2b+2c+3 (332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 444 SEQ ID NO 443 2a+2b+2c+3 (261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 446 SEQ ID NO 445 1+2a+ 2b+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 448 SEQ ID NO: 447 1+2b+2c+3 (1-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 450 SEQ ID NO: 449 1+2a+2c+3 (1-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 452 SEQ ID NO: 451 la+2a+2b+3 (32-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO 454 SEQ ID NO: 453 la+2b+2c+3 (32-260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 456 SEQ ID NO 455 la+2a+2c+3 (32-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 458 SEQ ID NO 457 1+2a+2b+2c+3 (1-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 460 SEQ ID NO: 459 la+2a+2b+2c+3 (32-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 462 SEQ ID NO: _ 1 sans peptide signal (20-260) SEQ ID NO: 464 SEQ ID NO: 463 1+2 sans peptide signal (20-516) SEQ ID NO 466 SEQ ID NO: 465 1+3 sans peptide signal (20- 260 + 516-628) SEQ ID NO: 468 SEQ ID NO: 467 1+2a sans peptide signal (20- 260 + 261-320) SEQ ID NO: 470 SEQ ID NO: 469 1+2b sans peptide signal (20- 260 + 332-387) SEQ ID NO: 472 SEQ ID NO: 471 1+2c sans peptide signal (20- 260 + 394-445) SEQ ID NO: 474 SEQ ID NO: 473 1+2a+2b sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387) SEQ ID NO: 476 SEQ ID NO: 475 1+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 478 SEQ ID NO: 477 1+2a+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445) SEQ ID NO: 480 SEQ ID NO: 479 1+2a+2b+2c sans peptide signal (20-260 + 261-320 +332-387 + 394-445) SEQ ID NO: 482 SEQ ID NO: 481 1+2a+3 sans peptide signal (20- 260 + 261-320 + 516-628) SEQ ID NO: 484 SEQ ID NO: 483 1+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 486 SEQ ID NO: 485 1+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 488 SEQ ID NO: 487 1+2a+2b+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 516-628) SEQ ID NO: 490 SEQ ID NO: 489 1+2b+2c+3 sans peptide signal (20- 260 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 492 SEQ ID NO: 491 1+2a+2c+ 3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 494 SEQ ID NO: 493 1+2a+2b+2c+3 sans peptide signal (20-260 + 261-320 + 332-387 + 394-445 + 516-628) SEQ ID NO: 496 SEQ ID NO: 495 62 PARTIE EXPÉRIMENTALE La Figure 1 correspond au test de migration des cellules HUAEC. Les cellules sont comptées dans 8 champs et la moyenne et l'écart- type sont représentés sur l'axe des ordonnées. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 4 en ng/ml en présence (V 50) ou absence de 50 ng/ml de VEGF (facteur de croissance endothéliale vasculaire).
La Figure 2 correspond au test de prolifération des cellules HUAEC. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 4 (500 ng/ml) en présence de 2 ng/ml de VEGF ou FGF2 comme indiqué sur la figure et l'axe des ordonnées au pourcentage de prolifération. Les colonnes noires correspondent au témoin; les colonnes blanches correspondent au pourcentage de prolifération en présence de 500 ng/ml de nétrine 4 et les colonnes grises correspondent au pourcentage de prolifération en présence de 500 ng/ml de nétrine 4 et de 5 g/ml d'IgG dirigées contre le récepteur néogénine.
La Figure 3 correspond au test d'apoptose des cellules HUAEC. L'axe des abscisses correspond à la concentration de la protéine nétrine 4 (500 ng/ml) en présence de 50 ng/ml de VEGF ou FGF2 comme indiqué sur la figure et l'axe des ordonnées au pourcentage de cellules apoptotiques. Les colonnes blanches correspondent au témoin sans nétrine 4; les colonnes grises correspondent au pourcentage d'apoptose en présence de 500 ng/ml de nétrine 4.
La Figure 4 correspond à un test de prolifération de cellules HUAEC afin de déterminer l'effet des surnageants des cellules PC3 transfectées avec la nétrine 4 mutée. L'axe des ordonnées représente le pourcentage de prolifération. La colonne 1 correspond au témoin (DMEM seul) ; la colonne 2 correspond à l'addition de 2 ng/ml de VEGF seul; la colonne 3 correspond aux cellules PC3 non transfectées; la colonne 4 correspond au pool de cellules transfectées; la colonne 5 correspond au clone 1 de PC3; la colonne 6 correspond au clone 2 de PC3; la colonne 7 correspond au clone 3 de PC3; la colonne 8 correspond au clone 4 de PC3; la colonne 9 correspond au clone de PC3 et la colonne 10 correspond au clone 6 de PC3.
La Figure 5 représente la séquence protéique de la nétrine 4 (SEQ ID NO: 498) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 497).
La Figure 6 représente la séquence protéique de la nétrine 1 (SEQ ID NO: 502) et 5 la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 503) .
La Figure 7 représente la séquence protéique de la nétrine 3 (SEQ ID NO: 510) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 509).
La Figure 8 représente la séquence protéique de la nétrine G1 (SEQ ID NO: 506) et la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 497).
La Figure 9A représente la séquence protéique de RGM-A (SEQ ID NO: 512) et la Figure 9B représente la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 511).
La Figure 10A représente la séquence protéique de RGM-B (SEQ ID NO: 514) et la Figure 10B représente la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 513).
La Figure 11A représente la séquence protéique de RGM-C (SEQ ID NO: 516) et 20 la Figure 11B représente la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 515).
La Figure 12A représente la séquence protéique de la nétrine 4 mutée (SEQ ID NO: 522) et la Figure 12B représente la séquence nucléotidique correspondante (SEQ ID NO: 521).
PARTIE EXPÉRIMENTALE Matériels: Les molécules nétrine 1 (SEQ ID NO: 502), nétrine 4 (SEQ ID NO: 498), nétrine G1 (SEQ ID NO: 506), nétrine 3 (SEQ ID NO: 510) et nétrine 4 mutée (SEQ ID NO: 522) sont des protéines recombinantes. Les molécules nétrine 1, nétrine 4 et nétrine G1 sont disponibles dans le commerce auprès de R&D.
L'isoforme de 165 acides aminés du VEGF est produite par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant l'ADNc correspondant (Plouët et al., 1997).
Des cellules endothéliales artérielles ombilicales humaines (HUAEC) ont été isolées à partir d'artères ombilicales perfusées avec de la collagènase (Sigma) pour digérer la membrane basale. Les cellules HUAEC ont été maintenues dans du milieu EBM (Clonetics) additionné de 15% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur, 100 g/ml de pénicilline et 100 gg/ml de streptomycine à 37 C dans 10% de CO2. Les cultures souches ont reçu 2 ng/ml de VEGF chaque jour pair.
Tests de migration Des cellules endothéliales vasculaires d'artères ombilicales humaines (HUAEC) sont inoculées dans des puits de 4 cm2 à haute densité (50 000 cellules/puits). Quand la monocouche est confluente, la prolifération est arrêtée par l'incubation, pendant une nuit, en présence de M199 (Life Sciences) contenant 2% de SVF. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche à l'aide d'un grattoir mousse, permettant de délimiter une surface libre de toute cellule. Les monocouches sont ensuite lavées 3 fois par du M199 pour enlever les cellules non adhérentes. Une photographie est alors prise pour délimiter la surface avant toute migration cellulaire. Les puits sont ensuite incubés en M199 et 2% de SVF seul ou en présence de 50 ng/ml de VEGF en présence de concentrations variables de nétrine 4 (NET-4) ou nétrine 1 (NET-1) ou nétrine G1 (NET-G1). Après 24 heures, les puits sont lavés 3 fois et colorés au May-Grunwald-Giemsa et photographiés. Les photographies prises avant et après l'expérience sont alors superposées pour permettre le comptage des cellules ayant migré.
Les résultats de ces tests pour la nétrine 4 sont indiqués dans la Figure 1.
D'après la Figure 1, on constate que l'addition de NET-4 en l'absence de VEGF n'a pas d'effet sur la migration basale des cellules HUAEC. En revanche, NET-4 inhibe l'activité du VEGF et 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 200 ng/ml de NET-4.
Tests de prolifération Des plaques de culture à 96 puits ont été ensemencées avec 2 000 cellules HUAEC par puits dans du EBM additionné de 10% de SVF. Les cellules ont été stimulées ou non avec 2 ng/ml de VEGF165 et différentes concentrations de nétrine 1 ou lo nétrine 4. Dans certains puits, 5 mg/ml d'anticorps anti-néogénine ont été ajoutés. Au bout de 5 jours, les puits ont été rincés doucement avec du DMEM et les cellules ont été fixées dans 1% de glutaldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al., 1989) : les cellules ont été incubées dans 0,1% de cristal violet (Sigma) pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant violet cristallisé incorporé a ensuite été solubilisé par 100 l de 10% d'acide acétique par puits. Les lectures de densité optique ont été effectuées à 595 nm. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois expériences séparées (voir Figure 1). Les valeurs indiquées sont des densités optiques moyennes de 6 puits SD.
Les protéines nétrine 1 ou nétrine 4 utilisées seules n'ont pas d'effet significatif sur la prolifération basale (due au sérum seul). En revanche, la protéine nétrine 4 inhibe la prolifération induite par le VEGF sur un mode dépendant de la dose. 50% de l'effet maximal est obtenu avec une concentration de 200 ng/ml. L'addition d'anticorps anti-néogénine inverse complètement l'activité inhibitrice de la prolifération induite par la nétrine 1 ou la nétrine 4.
Test d'apoptose 000 cellules HUAEC sont déposées sur des puits de culture préalablement gélatinisées dans du milieu EBM contenant 10% de SVF et 2 ng/ml de VEGF. 2 jours après les cellules sont incubées une nuit dans du milieu EBM contenant 2% de SVF et les facteurs nétrine ou FGF ou VEGF sont ajoutés ou non. Les cellules sont ensuite rincées et incubées avec du iodure de propidium, fixées et examinées au microscope à fluorescence. Les cellules présentant des noyaux fragmentés sont comptées en fluorescence et les cellules totales sont comptées sous éclairage direct. L'opération est effectuées dans au moins 8 champs représentant un minimum de 300 cellules. Le pourcentage de cellules présentant un noyau fragmenté est alors calculé.
La nétrine 4 utilisée seule n'a pas d'effet significatif sur l'apoptose. En revanche, 5 la protéine nétrine 4 inhibe totalement l'effet antiapoptotique exercé par le VEGF ou le FGF-2 (voir Figure 3).
Tests d'adhésion cellulaire Des plaques ELISA à 96 puits (Nunc) ont été recouvertes de protéine VEGF165 selon le protocole décrit dans l'article de Hutchings et al. (2003), diluée dans du tampon carbonate 0, 05 M à pH 9,6 pendant la nuit à 4 C. Les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués pendant 1 heure à 37 C avec 5 mg/ml de BSA (sérum albumine bovine) dans du tampon carbonate et lavés deux fois avec du DMEM avant les expériences. Les cellules ont été trypsinisées, lavées et remises en suspension dans 5 ml de DMEM avec 10% de SVF dans un tube de plastique non traité et incubées pendant 1 heure à 37 C avec 10% de CO2. Les cellules ont ensuite été concentrées par centrifugation et remises en suspension dans un mélange DMEM + 0,2% BSA sans sérum et la suspension cellulaire a été traitée pendant 20 minutes (37 C, 10% de CO2) avec la protéine nétrine 4 utilisée pour moduler l'adhésion. 40 000 cellules par puits ont été distribuées dans les puits dans un volume de 100 l de DMEM + 0,2% de BSA. Les cellules ont été laissées adhérer à 37 C sous 10% de CO2 pendant le temps voulu. Les puits ont été lavés doucement trois fois avec du DMEM pour retirer les cellules non adhérentes et les cellules adhérentes ont été fixées avec 1% de glutaraldéhyde pendant 20 minutes à température ambiante.
Les cellules fixées ont été quantifiées par incorporation de cristal violet (Kueng et al., 1989) : les cellules ont été incubées avec 0,1% de violet cristallisé (Sigma) dilué dans 0,2 M de tampon borate à pH 9,5 pendant 20 minutes à température ambiante, le colorant non incorporé a été éliminé en lavant complètement les puits avec de grandes quantités d'eau et le colorant cristal violet incorporé a ensuite été solubilisé par 100 l de 10% d'acide acétique par puits.
Production d'anticorps anti-idiotypiques Dans un premier temps on prépare un anticorps neutralisant de nétrine 1, 3, G1 ou 4 ou de l'un de ses fragments susmentionnés (SEQ ID NO: 2 à 352) en injectant à un animal, notamment une souris, ladite nétrine ou ledit fragment mélangée avec de l'adjuvant complet de Freund (1 volume par volume de nétrine ou de fragment de nétrine). On choisira une quantité de nétrine ou de fragment de nétrine comprise entre 10 et 500 g/kg de poids corporel pour immuniser l'animal. La même opération est effectuée à 15 et 30 jours d'intervalle, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet. Au jour 40 une saignée est pratiquée, le sérum est séparé et les immunoglobulines sont purifiées par toute méthode de fractionnement habituelle, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, chromatographie d'affinité pour la protéine A ou G. On mesure l'activité neutralisante des immunoglobulines par n'importe quel test décrit (par exemple, dans le cas de la nétrine 4 ou de l'un de ses fragments, liaison de la nétrine 4 marquée au domaine extracellulaire de l'un quelconque de ses récepteurs, prolifération, migration, adhésion cellulaire). Ainsi, un lot d'immunoglobulines sera dit neutralisant quand il aura la capacité d'inhiber l'interaction de la nétrine 1, 3, 4 ou G1 avec soit le domaine extracellulaire de dcc, de néogénine, de UNC5H1, de UNC5H2, de UNC5H3 ou de UNC5H4.
Dans un deuxième temps, on prépare des anticorps anti-idiotypiques de la nétrine 1, 3, G1 ou 4, ou de l'un de leurs fragments en injectant à des souris par voie sous-cutanée 1-100 g de la préparation des immunoglobulines neutralisant l'activité de ladite nétrine ou dudit fragment précédemment décrites en association avec 100 l d'adjuvant, notamment de l'adjuvant complet de Freund (Sigma). L'injection est répétée 15, 30 et 45 jours après. Cinquante-cinq jours après la première injection, on injecte à des souris 10 g du même anticorps par voie intrapéritonéale. Cinquante-huit jours après la première injection, les souris sont sacrifiées et leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu ISCOVE pour libérer les splénocytes. Les splénocytes sont fusionnés avec des cellules de myélome de souris, notamment des cellules AG8X 63 (Kearney et al., 1979), et incubés à raison de 100 000 cellules/puits. La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 l de polyéthylène glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. Quatre ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37 C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une période d'incubation de 4 minutes à 37 C, 4 ml sont ajoutés. La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau foetal et du HAT 1X (50X: Hypoxanthine 5 mM, Aminoptérine 20 M et Thymidine 0,8 mM) etdistribuées à raison de 100 l par puits sur les macrophages. Après 5 jours, 100 l de milieu HAT sont ajoutés, et entre 8 et 14 jours le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer par ELISA les anticorps dirigés contre les anticorps ayant servi d'agent immunogène, c'est à dire les anticorps anti- nétrine 1, 3, G1 ou 4. On mesure alors l'activité des anticorps anti- idiotypiques par un test ELISA: Les fragments Fab des immunoglobulines anti-nétrine 1, 3, G1 ou 4, préparés par toute technique conventionnelle, notamment une digestion à la papaïne, sont immobilisés sur des plaques de microtitration (0,1-20 g/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS (solution tampon phosphate) contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps anti- idiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
Les hybridomes sélectionnés par leur capacité à sécréter des anticorps dirigés contre des anticorps anti-nétrine 1, 3, G1 ou 4 sont alors clonés, c'est-à-dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé.
On met en oeuvre alors un second ELISA: des immunoglobulines de chèvre dirigées contre les domaines Fc des IgG humaines sont incubées sur des plaques de microtitration (0,1-20 gg/ml dans du tampon carbonate 50 mM pH 9,6). Après saturation des sites non spécifiques par une solution de sérum albumine diluée à 5 mg/ml dans le même tampon, les protéines contenant les domaines extracellulaires des récepteurs des nétrines fusionnés à une séquence Fc d'IgG humaine sont immobilisés sur les plaques de microtitration (incubation à une concentration comprise entre 1 et 100 pg/ml). Les surnageants de cultures d'hybridomes sont ajoutés dilués pour moitié dans du tampon PBS contenant 0,05% de Tween 20. Après rinçages, les anticorps antiidiotypiques sont révélés par adjonction d'une concentration appropriée d'anticorps anti-Fc de souris couplé à la peroxydase. La quantité d'anticorps anti-idiotypique fixé est alors mesurée par révélation de la peroxydase et est proportionnelle à l'intensité de la réaction colorimétrique.
Une fois les clones identifiés, leur nature monoclonale est affirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal. Un troisième clonage est alors effectué exactement dans les mêmes conditions pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux.
Les anticorps anti-idiotypiques monoclonaux sont criblés par une batterie de tests, notamment par un test ELISA sur domaines extracellulaires de néogénine, de néogénine, d'inhibition de la prolifération ou de la migration des cellules HUAEC ou des tests de mesure in vivo d'une activité anti-angiogénique.
Les anticorps anti-idiotypiques sont donc des mimes de domaines de nétrines. Le but est de fabriquer une "image interne" d'un domaine de nétrine et donc de pouvoir obtenir un anticorps liant 1 récepteur de nétrine sans lier tous les récepteurs. Une fois la spécificité attestée, on détermine la fonction agoniste ou antagoniste de cet anticorps donné en mesurant son activité sur des cellules, par exemple: agoniste de néogénine: inhibe les fonctions des HUAEC sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les VSM; antagoniste de néogénine: inhibe l'action inhibitrice des nétrines sur les fonctions des HUAEC sans inhiber ou stimuler les fonctions des nétrines sur les VSM.
L'intérêt général de ces anticorps est de pouvoir mimer une fonction des nétrines sur une cible cellulaire sans affecter d'autres cibles. Ainsi, il serait intéressant de stimuler les fonctions des péricytes sans induire l'apoptose des cellules endothéliales ou inhiber leur migration, leur prolifération, leur différenciation dans certaines pathologies: la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, à un stade précoce où la raréfaction des péricytes précède la néovascularisation, le glaucome néovasculaire, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, en particulier la polyarthrite psoriasique, les angiomes, l'athérosclérose, l'obésité, les cancers.
Angiogenèse in vitro Quatre queues de rat ont été dépiautées et disséquées pour récupérer les faisceaux blancs qui sont constitués en majeure partie de collagène de type I. Le collagène est extrait de ces fibres dans 50 ml d'acide acétique 0,5 M froid et agités sur une nuit. Le liquide est ensuite centrifugé à 5000g pendant 40 minutes et le surnageant est récupéré. L'extraction est refaite une fois avec 20 ml d'acide acétique, les surnageants sont mélangés et puis dialysés contre 1 1 d'acide acétique 0,2 M. La concentration en collagène est ajustée à 3 mg/ml par pesée. La préparation des gels pour l'angiogenèse in vitro s'effectue sur de la glace pour conserver la solution de collagène sous forme liquide. Un ml de collagène (5 mg/ml) est mélangé à 0,5 ml de DMEM 10X (contenant une concentration 10X en antibiotiques et en glutamine), 0, 9 ml de H2O stérile et 0,1 ml de bicarbonate de sodium 1M. Une fois le pH ajusté à 7,4, il est ajouté un volume égal de matrigel (Becton Dickinson). Le gel est coulé dans des puits de culture (2 mm d'épaisseur) et incubé à 37 C pour se solidifier. Les cellules sont rajoutées après 15 minutes (100 000 cellules/cm2) sur la surface du gel. Après 2 heures, les différents facteurs solubles sont ajoutés et les cellules sont observées et photographiées après 24 heures.
IDENTIFICATION D'UNE NÉTRINE 4 MUTÉE Clonage de la nétrine 4 mutée Les ARN totaux des cellules de l'artère de cordon ombilical humain (HUAEC) ont été extraits à l'aide du TriPure (Roche). Ensuite les ARN ont été transcrits en utilisant le kit pour RT-PCR (AMV) de Roche selon les indications du fabricant.
Les amorces (5')-TT CTA GAC ATG GGG AGC TGC GCG CGG-(3') (sens) et (5')-C ATT AAC GTC GAA CTG ACA GGT ATC-(3') (sens contraire) ont servi à l'amplification de la séquence 1-1039 de la nétrine 4, tandis que les amorces (5')-AG CAC TGT GCC CCG TTA TAC AAT GA-(3') (sens) et (5')-CGG GAT CCA CTT GCA CTC TCT TTT TAA AAT ATC C-(3') (sens contraire) ont été utilisés pour amplifier la séquence 914-1884 de la nétrine 4.
Les conditions adoptées pour l'amplification ont été : 35 cycles avec dénaturation à 94 C pendant 1 minute; hybridation à 55 C pendant 1 minute; et extension à 72 C pendant 1 minute.
Les produits obtenus ont été mélangés et utilisés pour effectuer une nouvelle PCR avec les amorces (5')-TT CTA GAC ATG GGG AGC TGC GCG CGG-(3') (sens) et (5')-CGG GAT CCA CTT GCA CTC TCT TTT TAA AAT ATC C-(3') (sens contraire) dans les mêmes conditions décrites précédemment, avec un nombre de cycles de 25 au lieu de 35. Ce produit PCR contenant toute la séquence de la nétrine 4 a été clonée dans le vecteur intermédiaire pCR2. 1 (Invitrogen). Après digestion par Xba I et Bam HI, la séquence de la nétrine 4 a été extraite de ce vecteur et insérée dans le vecteur pcDNA3. 1 (-)/His myc C digéré par les mêmes enzymes de restriction. Ce dernier vecteur contenant la séquence complète de la nétrine 4 mutée a servi pour transfecter des cellules PC3.
Transfection de cellules cancéreuses PC3 Les cellules de cancer de la prostate sont cultivées en milieu DMEM additionnée d'antibiotiques et de 10% de sérum de veau foetal. Le protocole de transfection a été 15 établi comme suit: J1: inoculation de cellules à basse densité (10000 cellules/cm2) dans une boîte de 10 cm de diamètre J2: transfection par pcDNA3-NET4 g de plasmide sont mélangés avec 5 l de lipofectine et 100 pl de DMEM (sans antibiotiques) pendant une demi-heure à température ambiante et agités doucement. Le mélange est ensuite dilué à 5 ml dans du DMEM et déposé goutte à goutte dans la boite contenant les cellules PC3. Après 6 heures d'incubation dans une étuve à 37 C, le milieu est aspiré et remplacé par 10 ml de milieu frais.
J3: rinçage de la boite et incubation pendant 24 heures avec du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal et les antibiotiques J4: trypsinisation des cellules, incubation dans 4 boîtes de 10 cm de diamètre dans du milieu DMEM complet additionné de 500 g/ml de geneticine (Sigma) J17: prélèvement de clones de cellules (100-400 cellules/clone) à l'aide d'une micropipette et transfert dans des puits de 2 cm2 J24: trypsinisation et incubation des clones cellulaires dans des boîtes de 12 puits (120000 cellules/puits) J27: rinçage des puits et inoculation dans du milieu DMEM sans sérum J30: collecte des milieux conditionnés et analyse de la quantification de nétrine 4 dans chaque milieu Le contenu de nétrine 4 de chaque milieu a été mesuré comme décrit précédemment dans le paragraphe concernant le test de prolifération. 10 gl de milieu conditionné ont été ajoutés à 100 l de milieu de culture. Les résultats sont exprimés en pourcentage de prolifération par rapport au contrôle (puits contenant 10 l de milieu DMEM).
Il apparaît sur la figure 4 que le milieu de cellules non transfectées ou le pool des cellules transfectées ainsi que les clones 2, 3 et 6 induisent une prolifération équivalente des cellules HUAEC, de l'ordre de 300% par rapport au contrôle.
En revanche le milieu conditionné des clones 1, 5 et 4 stimulent la prolifération des cellules HUAEC de seulement 200%, ce qui correspond à environ 50% de la prolifération induite par le milieu conditionné des cellules PC3. Sachant que la concentration de nétrine 4 requise pour induire 50% d'inhibition de la prolifération est d'au moins 500 ng/ml, on peut affirmer que 10 l de milieu conditionné des clones 1, 4 ou 5 contiennent une concentration apparente d'au moins 50 ng, ce qui équivaut à une concentration de 5 g/ml de nétrine 4 dans les milieux conditionnés.
Sachant que la concentration habituelle de protéine recombinante produite par les cellules PC3 transfectées par ce même vecteur est de l'ordre de 100-300 ng/ml, on en déduit que la protéine nétrine 4 produite par la séquence mutée présente une activité anti-angiogénique au moins 10 fois plus forte que des concentrations équivalentes de nétrine 4 sauvage.
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Claims (3)

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un ligand de la néogénine, choisi parmi: la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des séquences SEQ ID NO: 2q, q variant de 187 à 248, en association avec un agent de chimiothérapie, pour la préparation d'un 1 o médicament destiné au traitement des cancers.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de chimiothérapie est choisi parmi: la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol ou le taxotère.
3. Produit de combinaison comprenant au moins un ligand de la néogénine choisi parmi: la nétrine 4 mutée représentée par SEQ ID NO: 522 ou SEQ ID NO: 524, ou un fragment de l'une des ces protéines, notamment représenté par l'une des séquences SEQ B) NO: 2q, q variant de 187 à 248, et au moins un agent de chimiothérapie, notamment choisi parmi: la doxorubicine, le méthotrexate, la vinblastine, la vincristine, la cladribine, le fluorouracile, la cytarabine, les anthracyclines, le cisplatine, le cyclophosphamide, la fludarabine, la gemcitabine, l'irinotecan, la navelbine, l'oxaliplatine, le taxofène, le taxol ou le taxotère, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps destiné au traitement du cancer.
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