FR2849853A1 - Proteine de fusion inductrice de l'expression d'un gene et procede de controle de l'induction de l'expression d'un gene - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet une protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène comprenant, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides nucléiques et un domaine activateur de l'expression du gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique. L'invention a également pour objet un procédé de contrôle externe permanent et modulable de l'induction de l'expression d'un gène par modulation de l'état de modification post-traductionnelle de la protéine de fusion inductrice de l'expression dudit gène.
Description
PROTEINE DE FUSION INDUCTRICE DE L'EXPRESSION D'UN GENE
ET PROCEDE DE CONTROLE DE L'INDUCTION DE L'EXPRESSION D'UN GENE L'invention a pour objet un procédé de contrôle de l'induction de l'expression d'un gène, et en particulier un procédé de contrôle de l'induction de la traduction d'un gène.
Dans le domaine du traitement de maladies 10 héréditaires ou génétiques, des traitements de type thérapie génique, permettant de remplacer ou corriger des gènes défectueux sont en cours de développement. La thérapie génique peut également avoir des applications importantes dans la délivrance de protéines, telles que 15 par exemple des cytokines, des antioncogènes, des hormones ou des anticorps, lesdites protéines ayant une activité thérapeutique dans le traitement de pathologies de type cancer ou infections virales.
Cependant, même si l'on peut induire l'expression 20 d'un gène, donc de la protéine codée par le gène, l'absence de moyens de contrôle de l'expression de cette protéine est une barrière à l'utilisation de telles techniques, en particulier dans le cadre d'une thérapie génique. Un moyen simple et sr de contrôle de 25 l'induction de l'expression d'un gène, et donc de la protéine qu'il code, trouverait des applications aussi bien dans des protocoles de thérapie génique, que dans l'établissement de lignées cellulaires exprimant un transgène ou encore dans l'obtention d'animaux 30 transgéniques.
On connaît déjà des moyens d'induction de l'expression d'un gène.
Cependant, la plupart des moyens décrits sont basés sur des inductions transcriptionnelles et présentent des inconvénients majeurs pour une utilisation en thérapie génique. On citera en 5 particulier l'article de Mills (2001) Changing colors in mice: an inducible system that delivers, GENES & DEVELOPMENT, 15:1461-1467. Les protéines chimères activatrices de ces différents systèmes de l'art antérieur provoquent des réactions immunogèniques et/ou 10 les inducteurs pharmacologiques utilisés (tétracycline, rapamycine) entraînent des réactions cellulaires et tissulaires non souhaitées.
Par ailleurs, la demande de brevet WO00/53779 décrit un procédé d'induction traductionnelle de 15 l'expression d'un gène, utilisant une protéine de recrutement des ribosomes, c'est-à-dire une protéine analogue à eIF4G ou un dérivé ou fragment traductionnellement actif de celle-ci. Cette protéine est fusionnée avec une protéine ou un fragment ou 20 dérivé de protéine, capable de se fixer sur un site de fixation de protéine hétérologue ou HBS (" heterologous protein-binding site ") présent sur l'ARNm. Un exemple de protéine se fixant à l'ARNm est l'IRP-l. Un exemple d'HBS est l'IRE (" Iron Responsive Element "). La 25 protéine de fusion obtenue peut se fixer sur un HBS, et joue le rôle d'un activateur de la traduction de l'ARNm donc de l'expression de la ou des protéines codées par cet ARNm en aval de l'HBS.
Ce document explique également que l'expression 30 de la ou des protéines peut être contrôlée. Ce contrôle est effectué par l'utilisation de différents HBS sur l'ARNm. Il s'agit donc d'un contrôle a priori, exercé au début du traitement ou de l'expérience, plutôt que d'une réelle maîtrise de l'induction. Une fois le nombre et la nature des HBS choisis, l'induction de la traduction n'est plus modulable.
Par conséquent, il existe encore un besoin d'un moyen de contrôle modulable de l'induction de l'expression d'un gène, contrôle qui doit pouvoir s'exercer à tout moment au cours de la mise en oeuvre de l'induction de l'expression, aussi bien qualitativement 10 que quantitativement.
La présente invention a donc pour objet un procédé de contrôle externe, permanent et modulable de l'induction de l'expression d'un gène, ledit contrôle permettant de déclencher, d'arrêter et de moduler 15 l'induction à tout moment. Par induction de l'expression, on entend induction de toute étape de l'expression d'un gène, c'est-à-dire notamment la traduction, la transcription, l'épissage des pré-ARNm, la polyadénylation des pré-ARNm, etc. Dans le cadre de l'invention, l'induction de l'expression d'un gène est mise en oeuvre par l'expression d'une protéine de fusion spécifique, appelée protéine de fusion inductrice.
La protéine de fusion inductrice mise en oeuvre 25 pour induire l'expression d'un gène selon l'invention comprend d'une part un domaine peptidique de liaison aux acides nucléiques et un domaine activateur de l'expression dudit gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane 30 cytoplasmique. Le domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique est un domaine de régulation post- traductionnel qui permet la délocalisation de la protéine hors du cytoplasme, par un adressage cellulaire de cette protéine à la membrane plasmique, suite à la modification post-traductionnelle d'une cystéine, dans le domaine CAAX carboxy-terminal 5 de la protéine d'intérêt à l'aide d'enzymes de type farnésyl-transférase ou géranylgéranyl-transférase.
CAAX signifie "Cystéine-acide aminé Aliphatique-acide aminé Aliphatiqueacide aminé XI', o X peut être une méthionine, une glutamine, une sérine ou une thréonine. 10 Toute protéine ou polypeptide connu de l'homme du métier pour induire l'expression d'un gène peut être utilisé comme protéine de fusion inductrice selon l'invention, soit en tant que tel s'il comprend un domaine permettant une délocalisation vers les 15 membranes en plus du domaine activateur de l'expression du gène, soit en tant que protéine ou polypeptide de fusion en association avec un domaine activateur de l'expression du gène. En particulier, toute protéine de fusion connue de l'homme du métier pour induire la 20 traduction peut être utilisée, et notamment celles décrites dans la demande de brevet WO00/53779 mentionnée précédemment, à savoir toute protéine de fusion entre une protéine analogue à eIF4G ou à un dérivé ou fragment traductionnellement actif de celle25 ci, fusionnée avec une protéine ou un fragment ou dérivé de protéine se fixant à l'ARNm. On citera à titre non exhaustif la protéine de fusion entre eIF-4G1 et IRP-1.
La protéine de fusion inductrice selon 30 l'invention comprend donc un domaine permettant une délocalisation membranaire. Ce domaine est présent intrinsèquement ou est fusionné avec le domaine peptidique de liaison aux acides nucléiques et le domaine activateur de l'expression.
Un domaine permettant une délocalisation membranaire est un domaine peptidique qui est le site 5 d'une modification post-traductionnelle de la protéine permettant la délocalisation aux membranes cellulaires (cytoplasmique, nucléaire, mitochondriale etc...) de la protéine comprenant ledit domaine. La modification post-traductionnelle peut être, à titre d'exemples non 10 limitatifs, une farnésylation, une géranylgéranylation, une myristilation, ou une palmytoylation, ou toute autre modification connue de l'homme du métier.
Lorsqu'elle est munie de la séquence peptidique résultant de la modification post-traductionnelle, la 15 protéine est adressée à la membrane.
L'utilisation de la farnésylation a déjà été envisagée dans des traitements anti-cancéreux afin de rendre inactives certaines protéines (petites protéines G etc.) impliquées dans des pathologies, mais elle n'a 20 jamais été utilisée dans le cadre d'une induction de l'expression d'un gène.
Le procédé de contrôle de l'expression d'un gène selon l'invention comprend le contrôle externe permanent et modulable de l'induction de l'expression 25 du gène par modulation de l'état de modification posttraductionnelle de la protéine de fusion inductrice de l'expression du gène et plus particulièrement du domaine permettant une délocalisation membranaire. Ce contrôle est mis en oeuvre par l'utilisation d'un 30 inhibiteur approprié de ladite modification posttraductionnelle. Si la modification posttraductionnelle est une farnésylation, un inhibiteur approprié est un inhibiteur de la farnésyl transférase, tel que FTI 277. Si la modification posttraductionnelle est une géranylgéranylation, un inhibiteur approprié est un inhibiteur de la géranyl 5 transférase, tel que GGTI 298. L'homme du métier saura déterminer l'inhibiteur approprié compte tenu du domaine de modification post-traductionnelle présent.
En l'absence d'inhibiteur, la modification posttraductionnelle de la protéine de fusion inductrice 10 aura lieu. La protéine de fusion, une fois synthétisée et munie de la séquence peptidique induisant la modification post-traductionnelle, sera ancrée dans une membrane cellulaire, et ne pourra donc jouer son rôle d'activateur de l'expression du gène.
A l'inverse, en présence d'un inhibiteur approprié, la modification posttraductionnelle ne se produira pas, et la protéine de fusion inductrice ne sera plus adressée à la membrane et pourra donc jouer son rôle d'activateur de l'expression du gène.
L'invention a pour objet une protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène comprenant, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides nucléiques et un domaine activateur de l'expression dudit gène, et, d'autre part, un domaine permettant une 25 délocalisation à la membrane cytoplasmique.
A titre d'exemple de protéine de fusion inductrice selon l'invention, on citera les protéines de fusion R17-4G-CVLS o CVLS correspond à un domaine "CAAX" décrit comme responsable de la délocalisation de 30 la protéine à la membrane.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant pour la protéine de fusion inductrice de l'expression selon l'invention. Cet acide nucléique peut être un ADN double brin ou monobrin, un ADNc, un ARNm.
L'invention a également pour objet un vecteur 5 d'expression, en particulier un plasmide, comprenant un acide nucléique selon l'invention.
L'invention a également pour objet une cellule recombinée comprenant un acide nucléique selon l'invention intégré dans son génôme, ainsi qu'une 10 lignée cellulaire comprenant un tel acide nucléique. On citera à titre d'exemples non limitatifs les cellules d'hépatome humaines SKHep-l ou les cellules HeLa.
L'invention a également pour objet un organisme non humain transgénique, par exemple une souris, 15 comprenant en tant que transgène un acide nucléique selon l'invention.
Plus précisément, selon l'invention, le procédé de contrôle externe, permanent et modulable de l'induction de l'expression d'un gène d'une cellule 20 recombinée ou d'un organisme non humain transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion inductrice selon l'invention, ou comprenant un vecteur comprenant ledit acide nucléique, implique la modulation de l'état de 25 modification post-traductionnelle de la protéine de fusion induisant l'expression du gène par l'utilisation d'un inhibiteur approprié de la modification posttraductionnelle de ladite protéine de fusion.
Le contrôle de l'induction de l'expression du 30 gène est donc simple, modulable et permanent: il est possible à tout moment de commencer, arrêter, reprendre l'addition de l'inhibiteur de la modification posttraductionnelle approprié, de modifier les quantités ajoutées, afin de contrôler l'induction aussi bien qualitativement que quantitativement.
De nombreuses applications de l'invention peuvent être envisagées.
En particulier, l'invention présente un grand intérêt en thérapie génique. Il est possible de compléter le génôme défectueux d'un organisme avec un gêne x dont l'expression sera contrôlée de façon 10 précise à l'aide de concentrations modulables de l'inhibiteur approprié. Il est également possible de faire exprimer en concentration variable et contrôlée un ou des gènes capables de tuer ou d'inhiber la prolifération des cellules de l'organisme (par exemple 15 gène codant pour la fraction soluble de récepteur membranaire, gène codant pour fragments scFv d'anticorps etc...) . Il est aussi possible de contrôler l'expression et donc de faire exprimer en concentration variable des antioncogènes (par exemple p53, p70), des 20 cytokines ou interleukines, des facteurs de croissance, des dominants négatifs de certaines protéines, des xénogènes.
L'invention peut également être utilisée pour le criblage d'inhibiteurs de modification post25 traductionnelle. Ce criblage peut être effectué grâce à un kit de criblage: kit obtenu par intégration stable de plasmides selon l'invention dans des lignées cellulaires, ou kit obtenu par transfection provisoire ou " plasmides nus ". Un kit selon l'invention permet 30 d'évaluer l'influence de la présence d'un agent donné sur la modification post-traductionnelle d'une protéine de fusion inductrice, et permet donc de déterminer si ledit agent est ou non un inhibiteur. A titre d'exemples d'inhibiteurs criblés, on peut citer les inhibiteurs de prényl transférase antifarnésyl, les inhibiteurs de prényl transférase antigéranyl-géranyl, 5 les inhibiteurs de palmitoylation, les inhibiteurs de myristylation, etc. L'invention peut également être utilisée en recherche fondamentale pour sélectionner l'expression de certains gènes dans des cellules en culture ou dans 10 des tissus d'animaux de laboratoire (in vitro). On peut générer l'induction et la modulation ponctuelle ou à long terme de l'expression de n'importe quelle protéine; on peut obtenir une induction et une répression rapides de l'expression de protéine.
On pourra notamment utiliser des agents déjà connus et en phase clinique pour d'autres applications (en particulier des inhibiteurs) et dont on sait qu'ils n'ont pas d'effets toxiques.
Exemple 1
Cet exemple a pour objet la mise en évidence du contrôle de l'induction de l'expression d'un gène dans des cellules mammifères en culture ex vivo.
Dans cet exemple, l'étape de l'expression qui est 25 induite est la traduction, et la modification posttraductionnelle de la protéine de fusion inductrice est une farnésylation.
On utilisera des plasmides de deux types 1. des plasmides "reporteurs" permettant de 30 transcrire dans les cellules un ARN bicistronique codant pour les protéines reportrices LucR (Luciferase renilia) en premier cistron et LucF (Luciferase firefly) en deuxième cistron. Les plasmides pCRL30-R17 ou pCRL138-R17 contiennnent en outre dans l'espace intercistronique de l'ARNm un site de liaison pour la protéine de capside du bactériophage R17 (plasmide). 5 Les plasmides pCRL30 ou pCRL138 (contrôle) ne contiennent pas ce site.
2. des plasmides effecteurs qui vont pouvoir exprimer dans les cellules: une protéine de fusion entre la protéine 10 de capside de phage R17 et la région Cterminale du facteur d'initiation de la traduction eIF4G, pour le plasmide pCI R17-4G, - une protéine de fusion entre la protéine 15 de capside de phage R17, la région Cterminale du facteur d'initiation de la traduction eIF4G et un domaine protéique de farnésylation (de séquence protéique CVLS), pour le plasmide pCI R17-4G-CVLS. 20 On procède de la façon suivante. Des cellules d'hépatome humaines SKHep-1 sont transfectées transitoirement à l'aide de liposomes cationiques en utilisant 10 pmoles de plasmides reporteurs et 5 pmoles 25 de plasmides activateurs pour 1 million de cellules. 24 heures après la transfection, les cellules sont traitées durant différentes périodes (1 à 8 heures) par un inhibiteur de farnésyl transférase, le Cys-Val-3(2Naphthyl)Ala-Met; Sigma C4433, à une concentration 30 finale de 15 tM dans le milieu de culture.
Après lyse des cellules, les activités LucR et LucF sont dosées à l'aide du kit " Dual-Luciferase (TM) il Reporter System " (Promega E1980) sur un appareil à luminescence de type Berthold LB96B. Le rapport LucF/LucR représente l'activité de traduction du deuxième cistron qui est sous contrôle du système d'inductibilité.
Les graphes de la figure 1 représentent l'évolution du rapport LucF/LucR en fonction du temps de traitement pour les deux types de plasmide reporteur pCRL30 et pCRL30-R17. Le graphe a montre l'évolution du 10 rapport en absence de plasmide effecteur. Le graphe b montre l'évolution du rapport en présence de plasmide exprimant la protéine de fusion R17-4G. Le graphe c montre l'évolution du rapport en présence de plasmide exprimant la protéine de fusion inductrice R17-4G-CVLS. 15 On peut observer que le rapport est faible dans le cas o les plasmides reporteurs sont transfectés en l'absence de plasmides effecteurs. La traduction du deuxième cistron est donc faible dans ce cas (graphe a). L'expression de la protéine de fusion R17-4G permet 20 une augmentation du niveau de traduction du deuxième cistron de l'ARN bicistronique reporteur contenant le site R17 (pCRL 30R17), mais pas de celui ne contenant pas le site R17 (pCRL 30) (graphe b). On peut observer enfin (graphe c) que le niveau de traduction induite 25 par l'expression de la protéine de fusion R17-4G n'est pas modulé par le traitement avec l'inhibiteur de farnésyl transférase. Au contraire, l'augmentation de traduction induite par la protéine de fusion inductrice R17-4G-CAAX est modulée par l'utilisation de 30 l'inhibiteur de farnésyl transférase, et plus particulièrement est dépendante du temps de traitement par l'inhibiteur de farnésyl transférase.
Exemple 2
Les travaux réalisés sur les SKHep peuvent être étendus à d'autres lignées cellulaires et notamment les cellules HeLa (issue d'un adénocarcinome utérin).
Cette lignée HeLa a été utilisée pour réaliser des intégrations permanentes de plasmides effecteurs exprimant la protéine de fusion R174G-CVLS ou de plasmides "reporteurs" contenant (pCRL30-R17 ou 10 pCRL138R17) ou non (pCRL30 ou pCRL138) la structure ARN reconnue par la proteine R17. Ces transfections permanentes associées à un gène de résistance au G418 ont permis la sélection de clônes cellulaires. Parmi les clônes obtenus, ceux qui permettaient d'avoir le 15 meilleur signal d'activation par rapport au bruit de fond ont été sélectionnés.
Deux types d'études ont été réalisés en fonction du clône stable utilisé.
Première étude.
a) Confirmation de l'effet de l'inhibiteur de farnésyl transférase FTI 277.
L'acide nucléique codant pour la protéine R17-4G25 CVLS est intégré dans le génome de cellules HeLa. On réalise des transfections transitoires des plasmides reporteurs pCRL138 et pCRL138-R17 dans ce clone. On recherche ensuite les produits agissant sur la farnésylation de R17-4G-CVLS.
La figure 2A confirme l'effet de l'inhibiteur de farnésyl transférase FTI 277.
Le DMSO est le solvant dans lequel sont dissous les produits (FTI 277 et GGTI 298) ajoutés dans le milieu de culture, et représente donc un contrôle de l'induction. La concentration finale en DMSO dans le milieu de culture ne dépasse pas 0,1%.
Les rectangles blancs représentent l'ARN qui porte la séquence de reconnaissance de la protéine R17.
Les rectangles noirs représentent les activités obtenues dans les mêmes conditions avec une séquence 10 d'ARN semblable mais ne portant plus la reconnaissance R17, il s'agit donc du témoin négatif de la première construction.
L'induction est représentée par le quotient des valeurs LucF et LucR mesurées directement en présence 15 d'un agent (FTI 277 ou GGTI 298), par rapport au contrôle DMSO.
Ainsi, la cinétique d'action de FTI 277 représentée en figure 2A montre que FTI 277 a un effet inducteur, et que l'effet d'activation maximal est 20 obtenu à 8 heures de traitement. Il faut également noter que le traitement des cellules par un inhibiteur de géranylgéranyl transférase, le GGTI 298, n'a pas d'effet d'activation, ce qui démontre la spécificité du mécanisme.
La figure 2B montre que l'effet d'activation du FTI 277 est réversible. Dans cette expérience, on a traité les cellules pendant 8 h avec du FTI 277 1 IiM puis on a enlevé le produit et on a observé une diminution rapide du rapport d'activation LucF/LucR aux 30 différents temps indiqués.
b) Confirmation de l'effet de l'inhibiteur de l'HMGCoA-réductase et criblage d'inhibiteurs L'HMGCoA-réductase, qui synthétise le mélavonate, est impliquée dans l'isoprénylation, une modification posttraductionnelle des protéines telles que 4G-CVLS.
Cette enzyme est inhibée par les statines (lovastatine, simvastatine etc...).
Dans la figure 3, les cellules utilisées au cours de ces essais sont des HeLa transfectées de manière 10 stable par le plasmide codant pour la protéine de fusion R17-4G-CVLS, et transfectées transitoirement par les plasmides reporteurs bicistroniques pCRL138 et pCRL138-R17.
Les résultats sont présentés sous forme de 15 rapport d'activité LucF/LucR en présence de différents agents pharmacologiques dans le milieu de culture, par rapport à un témoin DMSO.
On voit en pistes 3 et 6 de la figure 3 que la présence de statine inhibe l'HMGCoA-réductase, donc la 20 présylation, la protéine de fusion n'est donc pas adressée à la membrane et joue son rôle d'activateur.
On voit en pistes 2, 4 et 5 que la présence de mévalonate, synthétisé par l'HMGCoA-réductase, permet, même en présence d'un inhibiteur de l'HMGCoAréductase, 25 l'isoprénylation c'est-à-dire la modification posttraductionnelle de la protéine de fusion qui sera donc adressée à la membrane et qui ne pourra jouer un rôle d'activateur d'o des rapports LucF/LucR identiques ou très proches de celui du témoin.
Le modèle utilisé a également permis de cribler des agents inhibiteurs potentiels de l'HMGCoAréductase.
On voit en pistes 7 et 8 que le tamoxifène, un anti-oestrogène, inhibe cette enzyme même à de faibles concentrations. Cette activité inhibitrice est indépendante de l'oestradiol et du récepteur des 5 oestrogènes (absent dans les cellules HeLa utilisées) et est inversée ou compensée par le mévalonate (piste 9).
D'autres anti-oestrogènes ont été testés.
En pistes 13, 14 et 15 sont représentés les 10 résultats obtenus avec des anti-oestrogènes stérodiens des sociétés ICI et Roussel Uclaf, ayant une forte affinité pour le récepteur des oestrogènes, à différentes concentrations. Ces anti-oestrogènes n'ont pas d'activité inhibitrice de l'HMGCoA-réductase.
Par contre un autre anti-oestrogène, appelé PBPE, conçu et fabriqué par les inventeurs, ne se liant pas au récepteur des oestrogènes mais se liant à un complexe protéique dit AEBS (" antiestrogen binding site ") s'est révélé être inhibiteur de l'HMGCoA20 réductase (pistes 10 et 11), son activité inhibitrice étant, comme pour les inhibiteurs précédents, compensée par la présence de mévalonate.
c) Molécules inhibitrices de la farnésyl 25 pyrophosphate-synthase également appelée FPP-synthase.
Cette enzyme est nécessaire à la biosynthèse des farnésylpyrophosphates. Son inhibition inhibe donc également la prénylation des protéines.
Dans ces essais représentés dans la figure 4, le 30 même modèle cellulaire qu'en b), transfecté de manière stable avec R17-4G-CVLS, est utilisé.
Les résultats des pistes 2 à 6 et 9 montrent que les biphosphonates, habituellement utilisés comme antalgiques dans le traitement des métastases osseuses, sont également des inhibiteurs de la farnésylation et que leur présence augmente donc le rapport LucF/LucR.
Les résultats des pistes 7 et 8 montrent que la présence de mévalonate ne compense pas l'activité inhibitrice des biphosphonates. Au contraire, la présence de farnésol (pistes 11 et 12) inverse ou compense l'activité inhibitrice des biphosphonates, ce qui montre que cette activité n'est pas liée à l'inhibition de la l'HMGCoA-réductase, mais qu'ils agissent en aval dans la cascade de biosynthèse des isoprènes et sans doute au niveau de la FPP-synthase.
Les résultats obtenus en présence de tamoxifène (pistes 12 à 16) montrent que le tamoxifène est également un inhibiteur de la FPP-synthase.
Ce modèle a donc permis de montrer que certaines 20 molécules inhibent de façon inattendue la biosynthèse des isoprényls en agissent sur la prénylation protéique. I1 a mis en évidence que deux familles de médicaments (antiestrogènes et biphosphonates) parmi les plus utilisés en cancérothérapie du fait de leur 25 grande innocuité, sont également capables d'inhiber la farnésylation.
Deuxième étude.
Les séquences reportrices pCRL138 ou pCRL138-R17 30 sont intégrées dans le génome des cellules HeLa, et différentes constructions R17-4G-CAAX - o CAAX peut être farnésylé "CVLS", ou géranylgéranylé "CVLL", ou ne pouvant plus subir de modifications posttraductionelles de ce type "SVLS" - sont transfectées de manière transitoire dans ces deux clones.
Après transfection, les cellules sont traitées 5 par du FTI 277 (inhibiteur de farnésyl transférase) ou du GGTI 298 (inhibiteur de géranyl transférase).
On observe les résultats suivants, représentés en figure 5, par rapport aux témoins DMSO: - pour R17-4G-CVLS (qui contient une boite de 10 farnésylation), seul le FTI 277 est capable d'activer la traduction, pour R17-4G-CVLL (qui contient une boite de géranylation), seul le GGTI 298 est capable d'activer la traduction, - pour R17-4G-SVLS (qui ne peut être ni farnésylé, ni géranylé), aucune des deux molécules n'est capable d'activation.
Cette expérience montre donc une très bonne spécificité d'action des inhibiteurs, ce qui permet un 20 contrôle précis de l'induction.
Par ailleurs, la localisation subcellulaire de protéines contenant les boites CVLS, CVLL ou SVLS a été contrôlée.
Pour ce faire, ces boites ont été mises en fusion avec la protéine YFP (" yellow Fluorescent protein "), et toutes les protéines de fusion ont été clonées avec une séquence HA en N-terminal. Les constructions ont été transfectées de façon transitoire dans des cellules 30 HeLa, et la localisation des protéines de fusion a été suivie en microscopie à fluorescence après immunofluorescence avec un anticorps anti-HA (Fig. 6A et B, en couleur).
On remarque que les protéines de fusion contenant des boites CVLS ou CVLL sont à localisation membranaire prédominante.
On peut également noter que le traitement par le FTI 277 (8 heures) relocalise uniquement les protéines YFP-CVLS et R17-4G-CVLS vers le cytoplasme, ce qui n'est pas le cas du traitement par le GGTI 298.
Claims (10)
1. Protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène caractérisé en ce qu'elle comprend, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides 5 nucléiques et un domaine activateur de l'expression du gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique.
2. Protéine de fusion selon la revendication 1, caractérisée en ce que le domaine activateur de 10 l'expression est un domaine activateur de la traduction.
3. Protéine de fusion selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le domaine permettant une délocalisation à la membrane 15 cytoplasmique est un domaine de farnésylation.
4. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine selon l'une quelconque des
revendications 1 à 3.
5. Vecteur d'expression comprenant un acide 20 nucléique selon la revendication 4.
6. Cellule recombinée comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur d'expression selon la revendication 5.
7. Lignée cellulaire de cellules recombinées 25 comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur d'expression selon la revendication 5, notamment lignée cellulaire SKHep et HeLa.
8. Organisme non humain transgénique comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un plasmide selon la revendication 5.
9. Procédé in vitro de contrôle externe, 5 permanent et modulable de l'induction de l'expression d'un gène d'une cellule recombinée ou d'un tissu non humain transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, 10 ou comprenant un vecteur d'expression comprenant ledit acide nucléique, par modulation de l'état de modification post-traductionnelle de la protéine de fusion par l'utilisation d'un inhibiteur approprié de ladite modification post- traductionnelle.
10. Kit de criblage d'agents comprenant au moins une cellule selon l'une ou l'autre des
revendications 6 et 7.
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Patent Citations (3)
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