EP1583834A1 - PROTEINE DE FUSION INDUCTRICE DE L'EXPRESSION D'UN GENE ET PROCEDE DE CONTROLE DE L’INDUCTION DE L'EXPRESSION D'UN GENE - Google Patents

PROTEINE DE FUSION INDUCTRICE DE L'EXPRESSION D'UN GENE ET PROCEDE DE CONTROLE DE L’INDUCTION DE L'EXPRESSION D'UN GENE

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EP1583834A1
EP1583834A1 EP04702354A EP04702354A EP1583834A1 EP 1583834 A1 EP1583834 A1 EP 1583834A1 EP 04702354 A EP04702354 A EP 04702354A EP 04702354 A EP04702354 A EP 04702354A EP 1583834 A1 EP1583834 A1 EP 1583834A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
fusion protein
expression
cell
post
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04702354A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christel Boutonnet
Stephan Vagner
Jean-Charles Faye
Gilles Favre
Abdelhakim Kharrat
Khalil Bouayadi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
MilleGen SA
Universite de Toulouse
Original Assignee
MilleGen SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MilleGen SA filed Critical MilleGen SA
Publication of EP1583834A1 publication Critical patent/EP1583834A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor

Definitions

  • the subject of the invention is a method for controlling the induction of post-transcriptional expression of a gene, and in particular a method for controlling the induction of the translation of a gene.
  • Gene therapy can also have important applications in the delivery of proteins, such as for example cyto ines, anti-oncogenes, hormones or antibodies, said proteins having therapeutic activity in the treatment of pathologies such as cancer or infections viral.
  • Patent application WO 99/11801 also describes the activation of the transcription of a gene, using a transcription factor released from the cell membrane by a protease.
  • the mode of action here is a proteolytic cleavage.
  • it is again activation that is sought and discussed, and not a control of gene expression.
  • patent application WO 00/53779 describes a method for translational induction of the expression of a gene, using a ribosome recruitment protein, that is to say a protein analogous to eIF4G or a derivative or a translationally active fragment thereof.
  • This protein is fused with a protein or a protein fragment or derivative, capable of binding to a heterologous protein binding site or HBS ("heterologous protein-binding site") present on the mRNA.
  • HBS heterologous protein binding site
  • An example of a protein that binds to mRNA is IRP-1.
  • An example of HBS is the Iron Responsive Element (IRE).
  • IRE Iron Responsive Element
  • the present invention therefore relates to an external, permanent and modular control method for induction of post-transcriptional expression of a gene, said control making it possible to trigger, stop and modulate induction at any time.
  • induction of post-transcriptional expression is meant the induction of any post-transcriptional stage of gene expression, that is to say in particular the translation, the splicing of the pre-mRNAs, the polyadenylation of pre-mRNAs, etc., and in particular translation.
  • the induction of the post-transcriptional expression of a gene is implemented by the expression of a specific fusion protein, called the inducing fusion protein.
  • the inducing fusion protein used to induce the post-transcriptional expression of a gene comprises, on the one hand, a peptide domain binding to ribonucleic acids and a domain activating the expression of said gene, and, on the other hand, a domain allowing delocalization to the cell membrane.
  • any protein or polypeptide known to a person skilled in the art for inducing the expression of a gene can be used as an inducing fusion protein according to the invention, either as such if it comprises a domain. allowing a delocalization towards the membranes in addition to the activating domain of the expression of the gene, either as a fusion protein or polypeptide in association with a domain allowing a delocalization towards the membranes.
  • any fusion protein known to a person skilled in the art for inducing translation can be used, and in particular those described in the patent application WO00 / 53779 mentioned previously, namely any fusion protein between a protein analogous to eIF4G or to a derivative or translationally active fragment thereof, fused with a protein or a protein fragment or derivative binding to mRNA. Mention will be made, without being exhaustive, of the fusion protein between eIF-4G1 and IRP-1.
  • the inducing fusion protein according to the invention therefore comprises a domain allowing membrane delocalization.
  • This domain is intrinsically present or is fused with a peptide domain binding to ribonucleic acids and an expression activator domain.
  • a domain allowing membrane delocalization is a peptide domain which is the site of a post-translational modification of the protein allowing delocalization to cell membranes.
  • the post-translational modification may be a modification of a cysteine, in the carboxy-terminal CAAX domain of the protein of interest using enzymes of the farnesyl transferase or geranylgeranyl transferase type.
  • CAAX means "Cysteine-Aliphatic amino acid-Aliphatic amino acid-amino acid X ⁇ , where X can be a methionine, a glutamine, a serine or a threonine.
  • the post-translational modification can be, by way of nonlimiting examples, farnesylation, geranylgeranylation, myristilation, or palmytoylation, or any other modification known to those skilled in the art
  • farnesylation geranylgeranylation
  • myristilation myristilation
  • palmytoylation or any other modification known to those skilled in the art
  • the method for controlling the induction of post-transcriptional expression of a gene comprises permanent and modular external control of the induction of gene expression by modulating the post-modification state of translational of the fusion protein inducing the post-transcriptional expression of the gene and more particularly of the domain allowing a membrane delocalization.
  • This control is implemented by the use of an appropriate inhibitor of said post-translational modification.
  • a suitable inhibitor is a farnesyl transferase inhibitor, such as FTI 277.
  • a suitable inhibitor is a geranyl transferase inhibitor, such as GGTI 298.
  • post-translational modification of the inducing fusion protein will take place.
  • the fusion protein once synthesized and provided with the peptide sequence inducing the post-translational modification, will be anchored in a cell membrane, and therefore will not be able to play its role of activator of the expression of the gene.
  • post-translational modification will not occur, and the inducing fusion protein will no longer be addressed to the membrane and may therefore play its role in activating the expression of the uncomfortable.
  • the subject of the invention is a fusion protein inducing the expression of a gene comprising, on the one hand, a peptide domain for binding to ribonucleic acids and an activator domain for the post-transcriptional expression of said gene, and, on the other hand, a domain allowing delocalization to the cytoplasmic membrane.
  • CAAX described as responsible for the relocation of the protein to the membrane.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid comprising a sequence coding for the expression-inducing fusion protein according to the invention.
  • This nucleic acid can be double-stranded or single-stranded DNA, cDNA, RNA such as mRNA.
  • the subject of the invention is also an expression vector, in particular a plasmid, comprising a nucleic acid according to the invention.
  • the invention also relates to a recombinant cell comprising a nucleic acid according to the invention integrated into its genome, as well as a cell line comprising such a nucleic acid. Mention will be made, by way of nonlimiting examples, of SKHep-1 human hepatoma cells, HeLa cells or CHO cells.
  • the invention also relates to a transgenic non-human organism, for example a mouse, comprising as transgene a nucleic acid according to the invention.
  • the method of external, permanent and modular control of the induction of post-transcriptional expression of a gene of a recombinant cell or of a transgenic non-human organism comprising a nucleic acid comprising a sequence coding for an inducing fusion protein according to the invention, or comprising a vector comprising said nucleic acid involves the modulation of the post-translational modification state of the fusion protein inducing the expression of the gene by the use an appropriate inhibitor of post-translational modification of said fusion protein.
  • the control of the induction of the post-transcriptional expression of the gene is therefore simple, modular and permanent: it is possible at any time to start, stop, resume the addition of the appropriate post-translational modification inhibitor, to modify the quantities added, in order to control the induction both qualitatively and quantitatively. Furthermore, given the high induction rates that can be obtained, it is possible to use the fusion protein inhibitor at a low concentration, thereby possibly avoiding toxicity problems.
  • One of the advantages of the present invention is the possibility of making a cell express a reporter gene and an effector gene, the reporter gene comprising a binding site for a polypeptide and at least one gene of interest, and the effector gene coding for an inducing fusion protein according to the invention comprising at least said polypeptide recognized by the binding site.
  • the invention therefore also relates to a cell, expressing a reporter gene and an effector gene, the reporter gene comprising a binding site for a polypeptide and at least one gene of interest, and the effector gene coding for a fusion protein. inducer according to the invention comprising at least said polypeptide recognized by the binding site.
  • the expression of these genes in the cell can be done by transfection of a reporter plasmid and an effector plasmid, or any other means known to those skilled in the art.
  • the cell is a eukaryotic cell and the polypeptide is a non-eukaryotic polypeptide, in particular of bacteriophage, and more particularly the capsid protein of bacteriophage R17.
  • the fusion protein will comprise the capsid protein of bacteriophage R17.
  • the reporter gene is expressed from a bicistronic RNA, comprising a first cistron and a second cistron.
  • the intercistronic space may include a binding site for the inducing fusion protein.
  • the invention is of great interest in gene therapy. It is possible to complete the defective genome of an organism with an x gene, the expression of which will be precisely controlled using modular concentrations of the appropriate inhibitor. It is also possible to express, in a variable and controlled concentration, one or more genes capable of killing or inhibiting the proliferation of cells of the organism (for example gene coding for the soluble fraction of membrane receptor, gene coding for scFv d fragments 'antibodies etc.). It is also possible to control the expression and therefore to have anti-oncogenes (for example p53, p70), cytokines or interleukins, growth factors, negative dominants of certain proteins, xenogens expressed in varying concentrations.
  • the invention can also be used for the screening of inhibitors of post-translational modification. This screening can be carried out using a screening kit: kit obtained by stable integration of plasmids according to the invention in cell lines, or kit obtained by temporary transfection or "naked plasmids".
  • kit according to the invention can also comprise a cell according to the invention comprising a reporter gene as described above.
  • a kit according to the invention makes it possible to evaluate the influence of the presence of a given agent on the post-translational modification of an inducing fusion protein, and therefore makes it possible to determine whether or not said agent is an inhibitor.
  • screened inhibitors examples include antifarnesyl prenyl transferase inhibitors, antigenanyl-geranyl prenyl transferase inhibitors, palmitoylation inhibitors, myristylation inhibitors, etc.
  • the invention can also be used in basic research to select the expression of certain genes in cells in culture or in tissues of laboratory animals (in vitro).
  • One can generate the induction and the specific or long term modulation of the expression of any protein; rapid induction and repression of protein expression can be obtained.
  • agents that are already known and in the clinical phase may be used for other applications (in particular inhibitors) and which are known to have no toxic effects.
  • Example 1 The purpose of this example is to demonstrate the control of the induction of the expression of a gene in mammalian cells in ex vivo culture.
  • the expression step that is induced is translation
  • the post-translational modification of the inducing fusion protein is farnesylation
  • Plasmids pCRL30 or pCRL138 (control) do not contain this site.
  • effector plasmids which will be able to express in cells: a fusion protein between the phage capsid protein RI7 and the C-terminal region of the translation initiation factor eIF4G, for the plasmid pCI R17-4G, a fusion protein between the phage capsid protein RI7, the C-terminal region of the translation initiation factor eIF4G and a farnesylation protein domain (of protein sequence CVLS), for the plasmid pCI R17-4G-CVLS.
  • SKHep-1 human hepatoma cells are transiently transfected using cationic liposomes using 10 pmol of reporter plasmids and 5 pmol of activating plasmids per 1 million cells. 24 hours after transfection, the cells are treated for different periods (1 to 8 hours) with a farnesyl transferase inhibitor, Cys-Val-3 (2- Naphthyl) Ala-Met; Sigma C4433, at a final concentration of 15 ⁇ M in the culture medium.
  • a farnesyl transferase inhibitor Cys-Val-3 (2- Naphthyl) Ala-Met
  • the LucR and LucF activities are assayed using the “Dual-Luciferase (TM) Reporter System” kit (Promega E1980) on a luminescence device of the Berthold LB96B type.
  • the LucF / LucR report represents the translation activity of the second cistron which is under the control of the inducibility system.
  • the graphs in FIG. 1 represent the evolution of the LucF / LucR ratio as a function of the processing time for the two types of reporter plasmid pCRL30 and pCRL30-R17.
  • the graph a shows the evolution of the ratio in the absence of effector plasmid.
  • Graph b shows the evolution of the ratio in the presence of plasmids expressing the R17-4G fusion protein.
  • Graph c shows the evolution of the ratio in the presence of plasmids expressing the inducing fusion protein R17-4G-CVLS.
  • the increase in translation induced by the inducing fusion protein R17-4G-CAAX is modulated by the use of the farnesyl transferase inhibitor, and more particularly is dependent on the time of treatment with the farnesyl transferase inhibitor.
  • SKHep can be extended to other cell lines and in particular HeLa cells (from an uterine adenocarcinoma).
  • This HeLa line was used to achieve permanent integrations of effector plasmids expressing the R17-4G-CVLS fusion protein or of "reporter" plasmids containing (pCRL30-R17 or pCRL138-R17) or not (pCRL30 or pCRL138) the RNA structure recognized by the protein R17.
  • These permanent transfections associated with a G418 resistance gene enabled the selection of cell clones. Among the clones obtained, those which made it possible to have the best activation signal with respect to the background noise were selected. Two types of studies were carried out depending on the stable clone used.
  • CVLS is integrated into the genome of HeLa cells. Transient transfections of the reporter plasmids pCRL138 and pCRL138-R17 are carried out in this clone. The products acting on the farnesylation of R17-4G-CVLS are then sought. 04/067745
  • FIG. 2A confirms the effect of the farnesyl transferase inhibitor FTI 277.
  • DMSO is the solvent in which the products (FTI 277 and GGTI 298) added to the culture medium are dissolved, and therefore represents an induction control.
  • the final concentration of DMSO in the culture medium does not exceed 0.1%.
  • the white rectangles represent the RNA which carries the recognition sequence of the R17 protein.
  • the black rectangles represent the activities obtained under the same conditions with a similar RNA sequence but no longer carrying the R17 recognition, it is therefore the negative control of the first construction.
  • the induction is represented by the quotient of the LucF and LucR values measured directly in the presence of an agent (FTI 277 or GGTI 28), relative to the DMSO control.
  • FTI 277 has an inducing effect, and that the maximum activation effect is obtained at 8 hours of treatment.
  • GGTI 298 a geranylgeranyl transferase inhibitor
  • Figure 2B shows that the activation effect of FTI 277 is reversible.
  • the cells were treated for 8 h with 1 ⁇ M FTI 277 then the product was removed and a rapid decrease in the LucF / LucR activation ratio was observed at the different times indicated.
  • HMGCoA-reductase which synthesizes melavonate, is involved in isoprenylation, a post-translational modification of proteins such as 4G-CVLS.
  • statins lovastatin, simvastatin etc.
  • the cells used during these tests are HeLa stably transfected with the plasmid coding for the fusion protein R17-4G-CVLS, and transiently transfected with the bicistronic reporter plasmids pCRL138 and pCRL138 -R17.
  • results are presented in the form of a LucF / LucR activity report in the presence of different pharmacological agents in the culture medium, compared with a DMSO control.
  • statin inhibits HMGCoA-reductase, therefore presylation, the fusion protein is therefore not addressed to the membrane and plays its role of activator.
  • Lanes 13, 14 and 15 show the results obtained with steroid anti-estrogens from the companies ICI and Roussel Uclaf, having a strong affinity for the estrogen receptor, at different concentrations. These antiestrogens have no inhibitory activity on HMGCoA-reductase.
  • PBPE another anti-estrogen, designed and manufactured by the inventors, which does not bind to the estrogen receptor but binds to a protein complex called AEBS (“antiestrogen binding site”) has been shown to be inhibitor of the 'HMGCoA-reductase (lanes 10 and 11), its inhibitory activity being, as for the previous inhibitors, compensated by the presence of mevalonate.
  • This enzyme is necessary for the biosynthesis of farnesylpyrophosphates. Its inhibition therefore also inhibits the prenylation of proteins.
  • the reporter sequences pCRL138 or pCRL138-R17 are integrated into the genome of HeLa cells, and various constructs R17-4G-CAAX - where CAAX can be farnesylated “CVLS", or geranylgeranylated “CVLL", or can no longer undergo post-modification such translational "SVLS" - are transiently transfected in these two clones. After transfection, the cells are treated with FTI 277 (farnesyl transferase inhibitor) or GGTI 298 (geranyl transferase inhibitor).
  • these boxes were fused with the protein YFP ("yellow Fluorescent protein”), and all of the fusion proteins were cloned with an HA sequence in N-terminal.
  • the constructs were transiently transfected into HeLa cells, and the location of the fusion proteins was monitored by fluorescence microscopy after immunofluorescence with an anti-HA antibody (Fig. 6A and B, in color).
  • fusion proteins containing CVLS or CVLL boxes have a predominant membrane location. It can also be noted that treatment with FTI 277 (8 hours) relocates only the proteins YFP-CVLS and R17-4G-CVLS to the cytoplasm, which is not the case with treatment with GGTI 298.
  • Example 3 The reporter plasmid constructed in the context of this example makes it possible to transcribe into mammalian cells in ex vivo culture a bicistronic RNA coding for a truncated protein H2-Kk ("mouse MHC class I molecule") as a marker for selection of the transfected cells. and for the protein p27Kipl which is a cell cycle inhibitor protein.
  • the bicistronic RNA also contains in the intercistronic space a binding site for the capsid protein of bacteriophage R17. This bicistronic RNA is very schematically represented in Figure 7.
  • CHO Choinese Hamster Ovaries
  • CHO cells are transiently transfected using cationic liposomes using 10 pmol of reporter plasmids and 5 pmol of activating plasmids per 1 million cells. Twelve hours after transfection, the cells are treated for 8 hours with the farnesyl transferase inhibitor (Cys-Val-3 (2-Naphthyl) Ala-Met; Sigma C4433) at a final concentration of 1 ⁇ M in the culture medium. .
  • the selection of transfected cells is done with the "MACSelect TM Kk" kit (Milteny Biotech).
  • the protein extracts are deposited on an SDS-PAGE gel.
  • the results are presented in FIG. 7.
  • the expression of the protein p27 (line op27) is examined by western blot with a monoclonal antibody (Ref. 610241, BD Bioscience Pharmingen).
  • the expression of the fusion protein R17-4G-CVLS (line ⁇ .HA) is detected by western blot using a monoclonal antibody against the peptide HA (Eurogentec) located at the NH2-terminal end of the protein R17- 4G-CVLS.
  • the "Mock” column is the control column, which represents the expression of the p27 protein and of the fusion protein in cells not transfected with the reporter and effector plasmids.
  • the R17-4G-CVLS column represents the expression of the p27 protein and of the fusion protein in the cells transfected in the absence of inhibitor.
  • Column R17-4G-CVLS + FTI277 represents the expression of the p27 protein and of the fusion protein in the co-transfected cells after the treatment with the inhibitor.

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Abstract

L'invention a pour objet une protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène comprenant, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides ribonucléiques et un domaine activateur de l'expression post-transcriptionnelle du gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique. L'invention a également pour objet un procédé de contrôle externe permanent et modulable de l'induction de l'expression d'un gène par modulation de l'état de modification post-traductionnelle de la protéine de fusion inductrice de l'expression dudit gène.

Description

PROTEINE DE FUSION INDUCTRICE DE L'EXPRESSION D'UN GENE ET PROCEDE DE CONTROLE DE L'INDUCTION DE L'EXPRESSION
D'UN GENE
L'invention a pour objet un procédé de contrôle de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène, et en particulier un procédé de contrôle de l'induction de la traduction d'un gène.
Dans le domaine du traitement de maladies héréditaires ou génétiques, des traitements de type thérapie génique, permettant de remplacer ou corriger des gènes défectueux sont en cours de développement. La thérapie génique peut également avoir des applications importantes dans la délivrance de protéines, telles que par exemple des cyto ines, des anti-oncogènes, des hormones ou des anticorps, lesdites protéines ayant une activité thérapeutique dans le traitement de pathologies de type cancer ou infections virales .
Cependant, même si l'on peut induire l'expression d'un gène, donc de la protéine codée par le gène, l'absence de moyens de contrôle de l'expression de cette protéine est une barrière à l'utilisation de telles techniques, en particulier dans le cadre d'une thérapie génique. Un moyen simple et sûr de contrôle de l'induction de l'expression d'un gène, et donc de la protéine qu'il code, trouverait des applications aussi bien dans des protocoles de thérapie génique, que dans l'établissement de lignées cellulaires exprimant un transgène ou encore dans l'obtention d'animaux transgéniques .
On connaît déjà des moyens d'induction de l'expression d'un gène. Cependant, la plupart des moyens décrits sont basés sur des inductions transcriptionnelles et présentent des inconvénients majeurs pour une utilisation en thérapie génique. On citera en particulier l'article de Mills (2001) Changing colors in mice: an inducible system that delivers, GÈNES & DEVELOPMENT, 15:1461-1467. Les protéines chimères activatrices de ces différents systèmes de l'art antérieur provoquent des réactions immunogèniques et/ou les inducteurs pharmacologiques utilisés (tétracycline, rapamycine) entraînent des réactions cellulaires et tissulaires non souhaitées.
On citera également le document GB 2 273 708, qui décrit principalement un procédé de criblage de composés modulant l'association protéine/membrane cellulaire, ledit procédé utilisant une protéine hétérologue incluant une séquence de reconnaissance pour l'adhésion à la membrane cellulaire et un activateur transcriptionnel . L'ensemble de la description fait référence à l'activation de la transcription. Par ailleurs, il est fait référence aux possibilités d'activation ou induction (« switch on ») d'un gène grâce à la protéine de fusion, mais le contrôle en tant que tel, c'est-à-dire la maîtrise, de l'expression n'est jamais discuté ni suggéré.
La demande de brevet WO 99/11801 décrit également l'activation de la transcription d'un gêne, en utilisant un facteur de transcription libéré de la membrane cellulaire par une protéase. Le mode d'action est ici un clivage proteolytique. De plus, c'est de nouveau l'activation qui est recherchée et discutée, et non un contrôle de l'expression du gène. Par ailleurs, la demande de brevet WO 00/53779 décrit un procédé d' induction traductionnelle de l'expression d'un gène, utilisant une protéine de recrutement des ribosomes, c'est-à-dire une protéine analogue à eIF4G ou un dérivé ou fragment traductionnellement actif de celle-ci. Cette protéine est fusionnée avec une protéine ou un fragment ou dérivé de protéine, capable de se fixer sur un site de fixation de protéine hétérologue ou HBS (« heterologous protein-binding site ») présent sur l'ARNm. Un exemple de protéine se fixant à l'ARNm est l'IRP-1. Un exemple d'HBS est l'IRE (« Iron Responsive Elément ») . La protéine de fusion obtenue peut se fixer sur un HBS, et joue le rôle d'un activateur de la traduction de l'ARNm donc de l'expression de la ou des protéines codées par cet ARNm en aval de l'HBS.
Ce document explique également que l'expression de la ou des protéines peut être contrôlée. Ce contrôle est effectué par l'utilisation de différents HBS sur l'ARNm. Il s'agit donc d'un contrôle a priori, exercé au début du traitement ou de l'expérience, plutôt que d'une réelle maîtrise de l'induction. Une fois le nombre et la nature des HBS choisis, l'induction de la traduction n'est plus modulable. Par conséquent, il existe encore un réel besoin d'un moyen de contrôle modulable de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gêne, contrôle qui doit pouvoir s'exercer à tout moment au cours de la mise en œuvre de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle, aussi bien qualitativement que quantitativement.
La présente invention a donc pour objet un procédé de contrôle externe, permanent et modulable de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène, ledit contrôle permettant de déclencher, d'arrêter et de moduler l'induction à tout moment. Par induction de l'expression post-transcriptionnelle, on entend l'induction de toute étape post- transcriptionnelle de l'expression d'un gène, c'est-à- dire notamment la traduction, l'épissage des pré-ARNm, la polyadénylation des pré-ARNm, etc., et en particulier la traduction. Dans le cadre de l'invention, l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène est mise en œuvre par l'expression d'une protéine de fusion spécifique, appelée protéine de fusion inductrice.
La protéine de fusion inductrice mise en œuvre pour induire l'expression post-transcriptionnelle d'un gène selon l'invention comprend d'une part un domaine peptidique de liaison aux acides ribonucléiques et un domaine activateur de l'expression dudit gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cellulaire.
Toute protéine ou polypeptide connu de l'homme du métier pour induire l'expression d'un gène peut être utilisé comme protéine de fusion inductrice selon l'invention, soit en tant que tel (le) s' il (elle) comprend un domaine permettant une délocalisation vers les membranes en plus du domaine activateur de l'expression du gêne, soit en tant que protéine ou polypeptide de fusion en association avec un domaine permettant une délocalisation vers les membranes. En particulier, toute protéine de fusion connue de l'homme du métier pour induire la traduction peut être utilisée, et notamment celles décrites dans la demande de brevet WO00/53779 mentionnée précédemment, à savoir toute protéine de fusion entre une protéine analogue à eIF4G ou à un dérivé ou fragment traductionnellement actif de celle-ci, fusionnée avec une protéine ou un fragment ou dérivé de protéine se fixant à l'ARNm. On citera à titre non exhaustif la protéine de fusion entre eIF-4Gl et IRP-1.
La protéine de fusion inductrice selon l'invention comprend donc un domaine permettant une délocalisation membranaire. Ce domaine est présent intrinsèquement ou est fusionné avec un domaine peptidique de liaison aux acides ribonucléiques et un domaine activateur de l'expression.
Un domaine permettant une délocalisation membranaire est un domaine peptidique qui est le site d'une modification post-traductionnelle de la protéine permettant la délocalisation aux membranes cellulaires
(cytoplasmique, nucléaire, mitochondriale etc..) de la protéine comprenant ledit domaine. En particulier, la modification post-traductionnelle peut être une modification d'une cystéine, dans le domaine CAAX carboxy-terminal de la protéine d'intérêt à l'aide d'enzymes de type farnésyl-transférase ou géranylgéranyl-transférase. CAAX signifie "Cystéine- acide aminé Aliphatique-acide aminé Aliphatique-acide aminé X^, où X peut être une méthionine, une glutamine, une serine ou une thréonine . La modification post- traductionnelle peut être, à titre d'exemples non limitatifs, une farnésylation, une géranylgéranylation, une myristilation, ou une palmytoylation, ou toute autre modification connue de l'homme du métier. Lorsqu'elle est munie de la séquence peptidique résultant de la modification post-traductionnelle, la protéine est adressée à la membrane. 04/067745
L'utilisation de la farnésylation a déjà été envisagée dans des traitements anti-cancéreux afin de rendre inactives certaines protéines (petites protéines G etc.) impliquées dans des pathologies, mais elle n'a jamais été utilisée dans le cadre d'une induction de l'expression d'un gène.
Le procédé de contrôle de 1 ' induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène selon 1 ' invention comprend le contrôle externe permanent et modulable de l'induction de l'expression du gène par modulation de l'état de modification post- traductionnelle de la protéine de fusion inductrice de l'expression post-transcriptionelle du gène et plus particulièrement du domaine permettant une délocalisation membranaire. Ce contrôle est mis en œuvre par l'utilisation d'un inhibiteur approprié de ladite modification post-traductionnelle. Si la modification post-traductionnelle de la protéine de fusion est une farnésylation, un inhibiteur approprié est un inhibiteur de la farnesyl transferase, tel que FTI 277. Si la modification post-traductionnelle de la protéine de fusion est une géranylgéranylation, un inhibiteur approprié est un inhibiteur de la géranyl transferase, tel que GGTI 298. L'homme du métier saura déterminer l'inhibiteur approprié compte tenu du domaine de modification post-traductionnelle présent.
En l'absence d'inhibiteur, la modification post- traductionnelle de la protéine de fusion inductrice aura lieu. La protéine de fusion, une fois synthétisée et munie de la séquence peptidique induisant la modification post-traductionnelle, sera ancrée dans une membrane cellulaire, et ne pourra donc jouer son rôle d' activateur de l'expression du gêne. A l'inverse, en présence d'un inhibiteur approprié, la modification post-traductionnelle ne se produira pas, et la protéine de fusion inductrice ne sera plus adressée à la membrane et pourra donc jouer son rôle d' activateur de l'expression du gène.
L'invention a pour objet une protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène comprenant, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides ribonucléiques et un domaine activateur de l'expression post-transcriptionnelle dudit gêne, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique .
A titre d'exemple de protéine de fusion inductrice selon l'invention, on citera les protéines de fusion R17-4G-CVLS où CVLS correspond à un domaine
"CAAX" décrit comme responsable de la délocalisation de la protéine à la membrane.
L'invention a également pour objet un acide nucléique comprenant une séquence codant pour la protéine de fusion inductrice de l'expression selon l'invention. Cet acide nucléique peut être un ADN double brin ou monobrin, un ADNc, un ARN tel qu'un ARNm.
L'invention a également pour objet un vecteur d'expression, en particulier un plasmide, comprenant un acide nucléique selon l'invention.
L'invention a également pour objet une cellule recombinée comprenant un acide nucléique selon l'invention intégré dans son génome, ainsi qu'une lignée cellulaire comprenant un tel acide nucléique. On citera à titre d'exemples non limitatifs les cellules d'hépatome humaines SKHep-1, les cellules HeLa ou les cellules CHO. L'invention a également pour objet un organisme non humain transgénique, par exemple une souris, comprenant en tant que transgêne un acide nucléique selon l'invention. Plus précisément, selon l'invention, le procédé de contrôle externe, permanent et modulable de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène d'une cellule recombinée ou d'un organisme non humain transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion inductrice selon l'invention, ou comprenant un vecteur comprenant ledit acide nucléique, implique la modulation de l'état de modification post- traductionnelle de la protéine de fusion induisant l'expression du gène par l'utilisation d'un inhibiteur approprié de la modification post-traductionnelle de ladite protéine de fusion.
Le contrôle de l'induction de l'expression post- transcriptionnelle du gène est donc simple, modulable et permanent : il est possible à tout moment de commencer, arrêter, reprendre l'addition de l'inhibiteur de la modification post-traductionnelle approprié, de modifier les quantités ajoutées, afin de contrôler l'induction aussi bien qualitativement que quantitativement. Par ailleurs, compte tenu des taux d'induction élevés pouvant être obtenus, il est possible d'utiliser l'inhibiteur de la protéine de fusion à une concentration faible, en évitant ainsi éventuellement des problèmes de toxicité. L'un des avantages de la présente invention est la possibilité de faire exprimer par une cellule un gène rapporteur et un gène effecteur, le gène rapporteur comprenant un site de liaison pour un polypeptide et au moins un gène d'intérêt, et le gène effecteur codant pour une protéine de fusion inductrice selon 1 ' invention comprenant au moins ledit polypeptide reconnu par le site de liaison. L'invention a donc également pour objet une cellule, exprimant un gène rapporteur et un gène effecteur, le gêne rapporteur comprenant un site de liaison pour un polypeptide et au moins un gène d'intérêt, et le gène effecteur codant pour une protéine de fusion inductrice selon 1 ' invention comprenant au moins ledit polypeptide reconnu par le site de liaison. L'expression de ces gènes dans la cellule peut se faire par transfection d'un plasmide rapporteur et d'un plasmide effecteur, ou tout autre moyen connu de l'homme du métier.
De préférence, la cellule est une cellule eucaryote et le polypeptide est un polypeptide non- eucaryote, en particulier de bacteriophage, et plus particulièrement la protéine de capside du bacteriophage R17. Dans ce dernier cas, la protéine de fusion comprendra la protéine de capside du bacteriophage R17. L'intérêt est que le couple gène rapporteur/gène effecteur est alors totalement exogène par rapport au système eucaryote dans lequel il est exprimé, ce qui évite le bruit de fond parfois important lié à 1 ' induction non souhaitée de gènes endogènes .
Dans un mode de réalisation particulier,- le gène rapporteur est exprimé à partir d'un ARN bicistronique, comprenant un premier cistron et un deuxième cistron. L'espace intercistronique peut comprendre un site de liaison pour la protéine de fusion inductrice. Une telle structure bicistronique permet une grande , „ntε 4/067745
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variabilité de gènes rapporteurs, multipliant ainsi les possibilités de sélection, localisation, marquage d'expression, etc.
De nombreuses applications de l'invention peuvent être envisagées.
En particulier, l'invention présente un grand intérêt en thérapie génique. Il est possible de compléter le génome défectueux d'un organisme avec un gêne x dont l'expression sera contrôlée de façon précise à l'aide de concentrations modulables de l'inhibiteur approprié. Il est également possible de faire exprimer en concentration variable et contrôlée un ou des gènes capables de tuer ou d'inhiber la prolifération des cellules de l'organisme (par exemple gène codant pour la fraction soluble de récepteur membranaire, gène codant pour fragments scFv d'anticorps etc..) . Il est aussi possible de contrôler l'expression et donc de faire exprimer en concentration variable des anti-oncogènes (par exemple p53, p70) , des cytokines ou interleukines, des facteurs de croissance, des dominants négatifs de certaines protéines, des xénogènes .
L'invention peut également être utilisée pour le criblage d'inhibiteurs de modification post- traductionnelle. Ce criblage peut être effectué grâce à un kit de criblage : kit obtenu par intégration stable de plasmides selon l'invention dans des lignées cellulaires, ou kit obtenu par transfection provisoire ou « plasmides nus » . Un kit selon 1 ' invention peut également comprendre une cellule selon l'invention comprenant un gène rapporteur telle que décrite ci- dessus. Un kit selon l'invention permet d'évaluer l'influence de la présence d'un agent donné sur la modification post-traductionnelle d'une protéine de fusion inductrice, et permet donc de déterminer si ledit agent est ou non un inhibiteur. A titre d'exemples d'inhibiteurs criblés, on peut citer les inhibiteurs de prényl transferase antifarnésyl, les inhibiteurs de prényl transferase antigéranyl-géranyl, les inhibiteurs de palmitoylation, les inhibiteurs de myristylation, etc.
L'invention peut également être utilisée en recherche fondamentale pour sélectionner l'expression de certains gènes dans des cellules en culture ou dans des tissus d'animaux de laboratoire (in vitro). On peut générer l'induction et la modulation ponctuelle ou à long terme de l'expression de n'importe quelle protéine ; on peut obtenir une induction et une répression rapides de l'expression de protéine.
On pourra notamment utiliser des agents déjà connus et en phase clinique pour d'autres applications (en particulier des inhibiteurs) et dont on sait qu'ils n'ont pas d'effets toxiques.
Exemple 1 Cet exemple a pour objet la mise en évidence du contrôle de l'induction de l'expression d'un gène dans des cellules mammifères en culture ex vivo.
Dans cet exemple, l'étape de l'expression qui est induite est la traduction, et la modification post- traductionnelle de la protéine de fusion inductrice est une farnésylation.
On utilisera des plasmides de deux types : 1. des plasmides "reporteurs" permettant de transcrire dans les cellules un ARN bicistronique codant pour les protéines reportrices LucR (Luciferase renilia) en premier cistron et LucF (Luciferase firefly) en deuxième cistron. Les plasmides pCRL30-R17 ou pCRL138-R17 contiennnent en outre dans l'espace intercistronique de l'ARNm un site de liaison pour la protéine de capside du bacteriophage R17 (plasmide) . Les plasmides pCRL30 ou pCRL138 (contrôle) ne contiennent pas ce site.
2. des plasmides effecteurs qui vont pouvoir exprimer dans les cellules : une protéine de fusion entre la protéine de capside de phage RI7 et la région C- terminale du facteur d'initiation de la traduction eIF4G, pour le plasmide pCI R17-4G, une protéine de fusion entre la protéine de capside de phage RI7, la région C- terminale du facteur d'initiation de la traduction eIF4G et un domaine protéique de farnésylation (de séquence protéique CVLS) , pour le plasmide pCI R17-4G-CVLS.
On procède de la façon suivante. Des cellules d'hépatome humaines SKHep-1 sont transfectées transitoirement à l'aide de liposomes cationiques en utilisant 10 pmoles de plasmides reporteurs et 5 pmoles de plasmides activateurs pour 1 million de cellules. 24 heures après la transfection, les cellules sont traitées durant différentes périodes (1 à 8 heures) par un inhibiteur de farnesyl transferase, le Cys-Val-3 (2- Naphthyl) Ala-Met ; Sigma C4433, à une concentration finale de 15 μM dans le milieu de culture.
Après lyse des cellules, les activités LucR et LucF sont dosées à l'aide du kit « Dual-Luciferase (TM) Reporter System » (Promega E1980) sur un appareil à luminescence de type Berthold LB96B. Le rapport LucF/LucR représente l'activité de traduction du deuxième cistron qui est sous contrôle du système d' inductibilité . Les graphes de la figure 1 représentent l'évolution du rapport LucF/LucR en fonction du temps de traitement pour les deux types de plasmide reporteur pCRL30 et pCRL30-R17. Le graphe a montre l'évolution du rapport en absence de plasmide effecteur. Le graphe b montre l'évolution du rapport en présence de plasmide exprimant la protéine de fusion R17-4G. Le graphe c montre l'évolution du rapport en présence de plasmide exprimant la protéine de fusion inductrice R17-4G-CVLS.
On peut observer que le rapport est faible dans le cas où les plasmides reporteurs sont transfectes en l'absence de plasmides effecteurs. La traduction du deuxième cistron est donc faible dans ce cas (graphe a) . L'expression de la protéine de fusion R17-4G permet une augmentation du niveau1 de traduction du deuxième cistron de l'ARN bicistronique reporteur contenant le site R17 (pCRL 30R17) , mais pas de celui ne contenant pas le site R17 (pCRL 30) (graphe b) . On peut observer enfin (graphe c) que le niveau de traduction induite par l'expression de la protéine de fusion R17-4G n'est pas modulé par le traitement avec l'inhibiteur de farnesyl transferase. Au contraire, l'augmentation de traduction induite par la protéine de fusion inductrice R17-4G-CAAX est modulée par l'utilisation de l'inhibiteur de farnesyl transferase, et plus particulièrement est dépendante du temps de traitement par l'inhibiteur de farnesyl transferase.
Exemple 2
Les travaux réalisés sur les SKHep peuvent être étendus à d'autres lignées cellulaires et notamment les cellules HeLa (issue d'un adénocarcinome utérin) .
Cette lignée HeLa a été utilisée pour réaliser des intégrations permanentes de plasmides effecteurs exprimant la protéine de fusion R17-4G-CVLS ou de plasmides "reporteurs" contenant (pCRL30-R17 ou pCRL138-R17) ou non (pCRL30 ou pCRL138) la structure ARN reconnue par la protéine R17. Ces transfections permanentes associées à un gène de résistance au G418 ont permis la sélection de clones cellulaires. Parmi les clones obtenus, ceux qui permettaient d'avoir le meilleur signal d'activation par rapport au bruit de fond ont été sélectionnés. Deux types d'études ont été réalisés en fonction du clone stable utilisé.
Première étude .
a) Confirmation de l'effet de l'inhibiteur de farnesyl transferase FTI 277.
L'acide nucléique codant pour la protéine R17-4G-
CVLS est intégré dans le génome de cellules HeLa. On réalise des transfections transitoires des plasmides reporteurs pCRL138 et pCRL138-R17 dans ce clone. On recherche ensuite les produits agissant sur la farnésylation de R17-4G-CVLS. 04/067745
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La figure 2A confirme l'effet de l'inhibiteur de farnesyl transferase FTI 277.
Le DMSO est le solvant dans lequel sont dissous les produits (FTI 277 et GGTI 298) ajoutés dans le milieu de culture, et représente donc un contrôle de l'induction. La concentration finale en DMSO dans le milieu de culture ne dépasse pas 0,1%.
Les rectangles blancs représentent l'ARN qui porte la séquence de reconnaissance de la protéine R17. Les rectangles noirs représentent les activités obtenues dans les mêmes conditions avec une séquence d'ARN semblable mais ne portant plus la reconnaissance R17, il s'agit donc du témoin négatif de la première construction. L'induction est représentée par le quotient des valeurs LucF et LucR mesurées directement en présence d'un agent (FTI 277 ou GGTI 2 8), par rapport au contrôle DMSO.
Ainsi, la cinétique d'action de FTI 277 représentée en figure 2A montre que FTI 277 a un effet inducteur, et que l'effet d'activation maximal est obtenu à 8 heures de traitement. Il faut également noter que le traitement des cellules par un inhibiteur de géranylgéranyl transferase, le GGTI 298, n'a pas d'effet d'activation, ce qui démontre la spécificité du mécanisme.
La figure 2B montre que l'effet d'activation du FTI 277 est réversible. Dans cette expérience, on a traité les cellules pendant 8 h avec du FTI 277 1 μM puis on a enlevé le produit et on a observé une diminution rapide du rapport d'activation LucF/LucR aux différents temps indiqués. b) Confirmation de l'effet de l'inhibiteur de l'HMGCoA-réductase et criblage d'inhibiteurs
L'HMGCoA-réductase, qui synthétise le mélavonate, est impliquée dans l' isoprénylation, une modification post-traductionnelle des protéines telles que 4G-CVLS.
Cette enzyme est inhibée par les statines (lovastatine, simvastatine etc..) .
Dans la figure 3, les cellules utilisées au cours de ces essais sont des HeLa transfectées de manière stable par le plasmide codant pour la protéine de fusion R17-4G-CVLS, et transfectées transitoirement par les plasmides reporteurs bicistroniques pCRL138 et pCRL138 -R17.
Les résultats sont présentés sous forme de rapport d'activité LucF/LucR en présence de différents agents pharmacologiques dans le milieu de culture, par rapport à un témoin DMSO.
On voit en pistes 3 et 6 de la figure 3 que la présence de statine inhibe l'HMGCoA-réductase, donc la presylation, la protéine de fusion n'est donc pas adressée à la membrane et joue son rôle d' activateur .
On voit en pistes 2, 4 et 5 que la présence de mévalonate, synthétisé par l'HMGCoA-réductase, permet, même en présence d'un inhibiteur de l'HMGCoA-réductase, 1' isoprénylation c'est-à-dire la modification post- traductionnelle de la protéine de fusion qui sera donc adressée à la membrane et qui ne pourra jouer un rôle d' activateur d'où des rapports LucF/LucR identiques ou très proches de celui du témoin. Le modèle utilisé a également permis de cribler des agents inhibiteurs potentiels de l'HMGCoA- réductase. On voit en pistes 7 et 8 que le tamoxifêne, un anti-œstrogène, inhibe cette enzyme même à de faibles concentrations. Cette activité inhibitrice est indépendante de l'œstradiol et du récepteur des oestrogènes (absent dans les cellules HeLa utilisées) et est inversée ou compensée par le mévalonate (piste 9) .
D'autres anti-oestrogènes ont été testés.
En pistes 13, 14 et 15 sont représentés les résultats obtenus avec des anti-oestrogènes steroïdiens des sociétés ICI et Roussel Uclaf, ayant une forte affinité pour le récepteur des oestrogènes, à différentes concentrations. Ces anti-oestrogènes n'ont pas d'activité inhibitrice de l'HMGCoA-réductase. Par contre un autre anti-œstrogène, appelé PBPE, conçu et fabriqué par les inventeurs, ne se liant pas au récepteur des oestrogènes mais se liant à un complexe protéique dit AEBS (« antiestrogen binding site ») s'est révélé être inhibiteur de l'HMGCoA- reductase (pistes 10 et 11) , son activité inhibitrice étant, comme pour les inhibiteurs précédents, compensée par la présence de mévalonate.
c) Molécules inhibitrices de la farnesyl pyrophosphate-synthase également appelée FPP-synthase.
Cette enzyme est nécessaire à la biosynthèse des farnésylpyrophosphates . Son inhibition inhibe donc également la prénylation des protéines .
Dans ces essais représentés dans la figure 4, le même modèle cellulaire qu'en b) , transfecté de manière stable avec R17-4G-CVLS, est utilisé.
Les résultats des pistes 2 à 6 et 9 montrent que les biphosphonates, habituellement utilisés comme antalgiques dans le traitement des métastases osseuses, sont également des inhibiteurs de la farnésylation et que leur présence augmente donc le rapport LucF/LucR.
Les résultats des pistes 7 et 8 montrent que la présence de mévalonate ne compense pas l'activité inhibitrice des biphosphonates . Au contraire, la présence de farnésol (pistes 11 et 12) inverse ou compense l'activité inhibitrice des biphosphonates, ce qui montre que cette activité n'est pas liée à l'inhibition de la l'HMGCoA-réductase, mais qu'ils agissent en aval dans la cascade de biosynthèse des isoprènes et sans doute au niveau de la FPP-synthase.
Les résultats obtenus en présence de tamoxifène (pistes 12 à 16) montrent que le tamoxifène est également un inhibiteur de la FPP-synthase.
Ce modèle a donc permis de montrer que certaines molécules inhibent de façon inattendue la biosynthèse des isoprényls en agissent sur la prénylation protéique. Il a mis en évidence que deux familles de médicaments (antiestrogènes et biphosphonates) parmi les plus utilisés en cancérothérapie du fait de leur grande innocuité, sont également capables d'inhiber la f rnésylation .
Deuxième étude .
Les séquences reportrices pCRL138 ou pCRL138-R17 sont intégrées dans le génome des cellules HeLa, et différentes constructions R17-4G-CAAX - où CAAX peut être farnésylé "CVLS", ou géranylgéranylé "CVLL", ou ne pouvant plus subir de modifications post- traductionelles de ce type "SVLS" - sont transfectées de manière transitoire dans ces deux clones . Après transfection, les cellules sont traitées par du FTI 277 (inhibiteur de farnesyl transferase) ou du GGTI 298 (inhibiteur de géranyl transferase) .
On observe les résultats suivants, représentés en figure 5 , par rapport aux témoins DMSO : pour R17-4G-CVLS (qui contient une boite de farnésylation) , seul le FTI 277 est capable d'activer la traduction, pour R17-4G-CVLL (qui contient une boite de géranylation) , seul le GGTI 298 est capable d'activer la traduction, pour R17-4G-SVLS (qui ne peut être ni farnésylé, ni géranylé) , aucune des deux molécules n'est capable d'activation. Cette expérience montre donc une très bonne spécificité d'action des inhibiteurs, ce qui permet un contrôle précis de l'induction.
Par ailleurs, la localisation subcellulaire de protéines contenant les boites CVLS, CVLL ou SVLS a été contrôlée.
Pour ce faire, ces boites ont été mises en fusion avec la protéine YFP (« yellow Fluorescent protein ») , et toutes les protéines de fusion ont été clonées avec une séquence HA en N-terminal. Les constructions ont été transfectées de façon transitoire dans des cellules HeLa, et la localisation des protéines de fusion a été suivie en microscopie à fluorescence après immunofluorescence avec un anticorps anti-HA (Fig. 6A et B, en couleur) .
On remarque que les protéines de fusion contenant des boites CVLS ou CVLL sont à localisation membranaire prédominante . On peut également noter que le traitement par le FTI 277 (8 heures) relocalise uniquement les protéines YFP-CVLS et R17-4G-CVLS vers le cytoplasme, ce qui n'est pas le cas du traitement par le GGTI 298.
Exemple 3 Le plasmide rapporteur construit dans le cadre de cet exemple permet de transcrire dans des cellules mammifères en culture ex vivo un ARN bicistronique codant pour une protéine tronquée H2-Kk (« mouse MHC class I molécule ») comme marqueur de sélection des cellules transfectées et pour la protéine p27Kipl qui est une protéine inhibitrice du cycle cellulaire. L'ARN bicistronique contient également dans l'espace intercistronique un site de liaison pour la protéine de capside du bacteriophage R17. Cet ARN bicistronique est très schématiquement représenté en Figure 7.
Le plasmide effectuer utilisé est celui permettant d'exprimer la protéine de fusion R17-4G-CVLS. Des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovaries ») sont transfectées transitoirement à l'aide de liposomes cationiques en utilisant 10 pmoles de plasmides reporteur et 5 pmoles de plasmides activateur pour 1 million de cellules. Douze heures après la transfection, les cellules sont traitées pendant 8 heures par l'inhibiteur de farnesyl transferase (Cys- Val-3 (2-Naphthyl)Ala-Met ; Sigma C4433) à une concentration finale de 1 μM dans le milieu de culture. La sélection des cellules transfectées se fait avec le kit « MACSelect™ Kk » (Milteny Biotech) . Après lyse des cellules sélectionnées, les extraits protéiques sont déposés sur gel SDS-PAGE. Les résultats sont présentés sur la figure 7. L'expression de la protéine p27 (ligne op27) est examinée par western-blot avec un anticorps monoclonal (Réf. 610241, BD Bioscience Pharmingen) . L'expression de la protéine de fusion R17-4G-CVLS (ligne α.HA) est détectée par western-blot en utilisant un anticorps monoclonal contre le peptide HA (Eurogentec) localisé à l'extrémité NH2-terminale de la protéine R17-4G-CVLS.
La colonne "Mock" est la colonne contrôle, qui représente l'expression de la protéine p27 et de la protéine de fusion dans des cellules non-transfectées par les plasmides rapporteur et effecteur. La colonne R17-4G-CVLS représente l'expression de la protéine p27 et de la protéine de fusion dans les cellules co- transfectées en absence d'inhibiteur. La colonne R17- 4G-CVLS + FTI277 représente l'expression de la protéine p27 et de la protéine de fusion dans les cellules co- transfectées après le traitement avec l'inhibiteur.
On observe une augmentation de la quantité de p27 dans les cellules cotransfectées avec les vecteurs pR17-4G-CVLS et pK-R17-p27 en présence d'inhibiteur de farnesyl transferase. Cette augmentation est indépendante de la quantité de protéine de fusion produite, identique avec ou sans traitement avec l'inhibiteur. Par contre, en présence de l'inhibiteur, la protéine de fusion n'est pas adressée à la membrane et peut jouer son rôle d' activateur, d'où l'augmentation de la quantité de p27.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine de fusion inductrice de l'expression d'un gène caractérisé en ce qu'elle comprend, d'une part, un domaine peptidique de liaison aux acides ribonucléiques et un domaine activateur de l'expression post-transcriptionnelle du gène, et, d'autre part, un domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique .
2. Protéine de fusion selon la revendication 1, caractérisée en ce que le domaine activateur de l'expression est un domaine activateur de la traduction.
3. Protéine de fusion selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le domaine permettant une délocalisation à la membrane cytoplasmique est un domaine de farnésylation.
4. Acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Vecteur d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 4.
6. Cellule recombinée comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur d'expression selon la revendication 5.
7. Lignée cellulaire de cellules recombinées comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un vecteur d'expression selon la revendication 5, notamment lignées cellulaires SKHep et HeLa.
8. Cellule exprimant un gêne rapporteur et un gène effecteur, le gène rapporteur comprenant un site de liaison pour un polypeptide et au moins un gène d'intérêt, et le gène effecteur codant pour une protéine de fusion inductrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 comprenant au moins ledit polypeptide reconnu par le site de liaison.
9. Cellule selon la revendication 8, dans laquelle la cellule est eucaryote et le polypeptide est non-eucaryote .
10. Cellule selon l'une ou l'autre des revendications 8 et 9, dans laquelle le gène rapporteur est exprimé à partir d'un ARN bicistronique, comprenant un premier cistron et un deuxième cistron.
11. Organisme non humain transgénique comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou un plasmide selon la revendication 5.
12. Procédé in vitro de contrôle externe, permanent et modulable de l'induction de l'expression post-transcriptionnelle d'un gène d'une cellule recombinée ou d'un tissu non humain transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une protéine de fusion selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou comprenant un vecteur d'expression comprenant ledit acide nucléique, par modulation de l'état de modification post- traductionnelle de la protéine de fusion par l'utilisation d'un inhibiteur approprié de ladite modification post-traductionnelle .
13. Kit de criblage d'agents comprenant au moins une cellule selon l'une quelconque des revendications 6 à 10.
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