FR2840072A1 - Biopuce presentant une organisation amelioree - Google Patents

Abstract

Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3) avec un réseau de sites élémentaires (Xn)disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisé en ce que les sites élémentaires sont distribués entre une zone centrale (4) affectée à une détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant ladite zone centrale, présentant des angles exempts de tout site élémentaire.

Description

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La présente invention concerne les biopuces, et plus particulièrement le mode d'organisation de ses sites de liaison, pour servir d'outils en analyse biologique moléculaire.

Par biopuce , on entend un ensemble fonctionnel, à usage unique ou non, généralement mis en oeuvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire, agencé pour et/ou destiné à coopérer avec au moins un appareil ou instrument distinct et complémentaire, et recevant un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, comprenant au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, par exemple une biomolécule, éventuellement marquée, et délivrant au moins un signal de sortie en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure ? et/ou la quantité de ladite espèce cible.

Cette biopuce comprend au moins : - un support comportant une face utile comprenant une surface opératoire au contact de l'échantillon ; le matériau ou la matière du support est inerte, et non substantiellement conducteur de l'électricité, au moins selon ladite surface opératoire, au sens où ledit matériau n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, et en particulier l'espèce cible, par liaison forte du type liaison chimique covalente, ou par liaison faible, par exemple liaison hydrogène, d'autres interactions de type physique, telles que tension superficielle, n'étant pas par ailleurs exclues ; le matériau constitutif d'un tel support est par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, par exemple un polypropylène ou une résine polyacrylamide, un réseau ou matrice de sites élémentaires distribués de manière méthodique ou ordonnée sur la surface opératoire, à la manière de pixels, selon au moins deux axes de référence, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à-dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques dans tout repère formé par les axes de références ; ces sites élémentaires sont euxmêmes traités ou non, en vue de la fixation ou de l'ancrage des ligands, dont il sera question ci-après ; ce traitement peut par exemple consister en un revêtement avec une couche d'un polymère conducteur électronique, par exemple polypyrrole modifié, selon les techniques exposées dans les documents FR 2703359 , W09422889, EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391, et WO 0036145, - le cas échéant, un ensemble de connexions, ou circuit, par exemple électrique, avec respectivement les différents sites élémentaires, ledit ensemble de

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connexions étant agencé pour relier individuellement chaque site élémentaire, de manière indépendante par rapport aux autres sites élémentaires, par exemple par adressage (conférer le document FR- A- 2741475), ledit ensemble de connexions est par exemple un circuit électrique multiplexé d'électrodes et contre-électrodes disposées respectivement dans lesdits sites élémentaires ; - une multiplicité de ligands, ou sondes, identiques attachés ou ancrés, par tous moyens appropriés, dans chaque site élémentaire; - éventuellement, des moyens formant avec la surface opératoire une cavité de circulation ou séjour de l'échantillon liquide, comportant au moins une entrée et une sortie pour ce dernier ; - éventuellement, des moyens d'observation, transmission, ou émission du signal ou des signaux de sortie, correspondant à la liaison de l'espèce cible avec les ligands, respectivement en un ou plusieurs sites de liaison ;
Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour : - obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ; - traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ; - traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement le ou les signaux de sortie.

Lorsque la biopuce, ou biochip , ou "micro-array", est associée ou comprend en outre ces moyens de laboratoire, dans le secteur technique concerné, on parlera alors de labopuce (ou lab on a chip ). En pareil cas, le support comprend un ensemble de canaux et/ou puits, par exemple réactionnels, reliés entre eux et avec la cavité de circulation ou séjour, ainsi que divers réactifs ou agents de traitement, à l'état sec ou liquide, disposés sur le support en fonction de la circulation et du ou des traitements retenus pour l'échantillon de départ ou l'échantillon d'intérêt.

Les dimensions de ces biopuces, par exemple de l'ordre de 1 mm2 à quelques cm2, requièrent normalement pour leur réalisation ou production, la mise en oeuvre de techniques dites micro ou nano-technologies , par exemple par lithographie ou micro-usinage.

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Mais la Demanderesse n'entend pas être limitée à des dimensions particulières, notamment de l'ordre du m ou du nm, lorsqu'elle utilise le terme biopuce dans la présente description et dans les revendications en annexe, considérant que la même structure ou le même agencement que celui défini ciaprès peut être mis en oeuvre avec des dimensions de l'ordre de quelques mm2, comme avec des dimensions beaucoup plus importantes.

Bien entendu, une biopuce telle que considérée par la présente invention ne peut fonctionner de manière autonome, sauf à embarquer avec elle sa propre source d'énergie. Par conséquent, cette biopuce est agencée pour coopérer, par exemple de façon amovible, d'une part avec des moyens extérieurs permettant de faire circuler ou séjourner, en contact de la surface opératoire et des ligands, l'échantillon liquide d'intérêt, mais aussi d'autres fluides ou liquides,tels que liquide de lavage, et d'autre part avec des moyens de détection et de traitement du ou des signaux de sortie, le tout étant en général contrôlé et commandé, par des moyens électroniques extérieurs, analogiques ou informatiques, par exemple selon toute logique ou organigramme de traitement.

Par biomolécule , on entend toute entité, en particulier biochimique, ou biologique, identique à ou dérivée de toute espèce moléculaire existant dans la nature. Au rang des biomolécules considérées par la présente invention, on peut citer certains biopolymères, par exemple l'ADN, l'ARN, les oligo et polynucléotides, les protéines fonctionnelles ou structurales, les peptides, les oligo et polypeptides, les polysaccharides, etc.

Par marquage ou marqué , on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, par exemple l'espèce cible, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel qu'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal, dit précédemment signal de sortie.

Les marqueurs préférés selon la présente invention sont : - les haptènes (exemple : la biotine fixant un conjugué streptavidine- phycoérythrine) - les fluorophores : par exemple fluorescéine, cyanine, phycoérythrine - les luminophores : luminol, isoluminol, ABEI (~N-4-amino-butyl-N-ethyl- isoluminol)

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- les enzymes : par exemple d'oxydation d'un chromogène ; horse-radish peroxydase, phosphatase alcaline
Par détermination , on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée analyte dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative.

Ressortent selon la présente invention de l'expression détermination , tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.

Le ou les signaux de sortie considérés par la présente invention peuvent avoir toute nature appropriée, en fonction des marqueurs mis en oeuvre, et du type de détection requis. Il peut s'agir de signaux lumineux, visibles ou invisibles, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc.... Par ailleurs, ces signaux peuvent le cas échéant être détectés séparément, compte tenu, d'une part de l'adressage des sites élémentaires de la biopuce, et d'autre part de l'ensemble de connexion respectivement avec les différents sites élémentaires, éventuellement présents sur la biopuce.

Par ligand , on entend toute entité, cellulaire, biologique, ou biomolécule ayant une affinité, spécifique ou non, pour une espèce cible.

Affinité exprimant qu'il se forme, dans les conditions (notamment température, pH, force ionique, etc. ) de la mise en contact de l'espèce cible avec le ligand, un appariement ou complexe stable entre ladite espèce cible et ledit ligand. A titre d'exemple de ligand, on citera tout oligonucléotide susceptible de se lier par liaisons faibles, on dira dans ce cas de s'hybrider, avec un brin d'ADN (espèce cible), comportant une séquence complémentaire avec celle du ligand.

Chaque ligand est attaché ou ancré en chaque site élémentaire de la biopuce, éventuellement après fonctionnalisation de la surface opératoire du support, par tout moyen approprié, par exemple chimique, par liaison covalente, par exemple par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ou par adsorption, absorption, etc.

S'agissant de sites élémentaires revêtus comme indiqué précédemment avec un polymère de type polypyrrole modifié ou polythiophène, et électriquement adressés, la fixation des ligands peut être effectuée selon les techniques électrochimiques décrites par les documents
FR 2789401, EP 1 152 821 et WO 0047317, FR2 742 451, EP 0 868 464 et WO 9722648.

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Par espèce cible, on entend toute espèce cellulaire, biologique, ou biochimique, susceptible de se lier par liaison faible à un ou plusieurs ligands.

S'agissant d'une biopuce, en l'état actuel du secteur technique considéré, on peut distinguer deux voies d'obtention de ligands respectivement différents, fixés chacun en nombre multiple respectivement sur les différents sites élémentaires : - une voie in situ, qui consiste, par une série d'opérations successives, incrémentées, à synthétiser sur la surface opératoire elle-même, les différents ligands, ensemble, motif élémentaire par motif élémentaire, par exemple mer par mer, à partir d'un premier motif fixé en différents sites élémentaires, et ce dans l'ordre des séquences respectivement retenues pour les différents ligands ; à cet égard, on se référera aux documents
FR 2703359, EP 0 691 978, W09422889, US 5744305, US 6 015 880,
WO 9525116, et EP 0 750 629, - et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer chacun en nombre multiple les différents ligands dans leurs sites élémentaires respectivement différents, par des méthodes d'impression (avec ou sans contact) ou par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires ; conférer les documents
FR 2703359, EP 0 691 978 et W09422889, WO 0151689,
US 6 090 933.

Aujourd'hui, les biopuces sont des outils, simples ou complexes, bien adaptés à toutes sortes d'analyse de biologie moléculaire ; conférer "DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics". M. Cuzin. Transfusion clinique et Biologique 2001 ; 8:291-6. "How to make a DNA chip" Mickael C Pirrung. Angew.chem.lnt.ed 2002,41, 1276,1289. De manière générale, une biopuce telle que décrite précédemment est disposée au fond d'un puits, par exemple d'une plaque de micro-titration, au sein duquel l'échantillon liquide comprenant l'espèce cible est introduit, séjourne, puis est évacué.

La présente invention a pour objet d'organiser la surface opératoire, le réseau des sites élémentaires, et les ligands ou sondes de la biopuce, en sorte de pouvoir, non seulement déterminer une ou plusieurs espèces cibles, mais également contrôler sur le support de la biopuce cette détermination et ses conditions opératoires.

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En d'autres termes, l'invention a pour objet une biopuce embarquant les moyens permettant de contrôler la détermination biologique effectuée à titre principal avec ladite biopuce.

Par ailleurs, la présente invention a pour objet une biopuce, pour laquelle les signaux de sortie, par exemple de type lumineux, ne sont pas perturbés par l'environnement géométrique de ladite biopuce, quelque soit le site élémentaire considéré.

Une biopuce selon l'invention comprend de manière générale un support dont une face utile comprend une surface opératoire avec un réseau de sites élémentaires disposé sur la surface opératoire et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.

Selon l'invention, les sites élémentaires sont distribués entre, d'une part une zone centrale affectée à la détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires actifs, comportant chacun en nombre multiples des ligands dits actifs, respectivement différents, intervenant directement dans la détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant au moins en partie la zone centrale, comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comportant le cas échéant des ligands dits de contrôle.

Préférentiellement, le contour de la surface opératoire a une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis. Et, à titre d'exemple, à cette fin, les sites élémentaires sont distribués entre une zone centrale dont le contour a une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, et la zone périphérique circonscrivant au moins en partie la zone centrale, dont le contour a généralement la forme d'une ligne brisée, par exemple rectangulaire, ouverte ou fermée, la dite zone périphérique présentant des angles exempts de tous sites élémentaires.

La présente invention est maintenant décrite, par référence au dessin annexé, dans lequel : - la figure 1 représente une biopuce selon l'invention, vue de dessus et à échelle agrandie, de manière schématique - la figure 2 et la figure 3 représentent les plans de dépôts de ligands ou sondes dans des biopuces à l'identique de la représentation selon figure 1.

Conformément à la figure 1, une biopuce selon l'invention comprend un support (2) dont une face utile (2a), par exemple supérieure, comprend une surface opératoire (3) supportant un réseau de sites élémentaires (Xn), disposés sur la dite surface, et une multiplicité de ligands (non représentés, et par conséquent non

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référencés numériquement), fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.

Comme le montre la figure 1, les sites élémentaires repérés chacun par une lettre (A à Z) et par un chiffre (0 à 13) sont distribués entre, d'une part une zone centrale 4, de forme rectangulaire, correspondant aux rangées A à H et aux colonnes 1 à 12, affectée à une détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires dits actifs, car intervenant directement dans la détermination biologique de l'espèce cible, comprenant chacun en nombre multiple des ligands dits actifs pour les mêmes raisons, respectivement différents, et d'autre part une zone périphérique (5), constituée par les rangées 1 et Z et les colonnes 0 et 13, circonscrivant au moins en partie la zone centrale (4), comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comprenant le cas échéant des ligands dits de contrôle, au sens où lesdits sites et ligands n'interviennent pas directement dans la détermination biologique de ladite espèce cible, et de manière optionelle un nombre y de sites élémentaires dits d'identification du type de biopuce ainsi réalisé.

Comme montré par la Figure 1, le contour de la surface opératoire (3) a donc une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis. Et à cette fin, tous les sites élémentaires (Xn), sont distribués entre la zone centrale (4) et la zone périphérique (5), précédemment définie, circonscrivant au moins en partie la zone centrale (4), et dont le contour a généralement la forme d'une ligne brisée par exemple rectangulaire, ouverte ou fermée, cette zone périphérique (5) présentant des angles exempts de tous sites élémentaires.

A titre d'exemples, on décrit ci-après l'obtention, la construction et l'utilisation de biopuces identiques à celle décrite par référence à la figure 1 et à la description précédente. Ces biopuces sont réalisées et obtenues à partir d'un support à base de silicium, selon la technique généralement décrite dans les documents FR2787582, EP1141391 et W00036145 avec les étapes principales essentielles suivantes : a) Structuration d'un substrat de manière à obtenir sur ce substrat des microcuvettes comprenant dans leur fond une couche d'un matériau capable d'initier et de promouvoir l'adhésion sur celle-ci d'un film d'un copolymère de pyrrole fonctionnalisé par électropolymérisation, b) Electropolymérisation collective, de manière à former un film électropolymérisé d'un copolymère de pyrrole et de pyrrole

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fonctionnalisé sur le fond desdites microcuvettes, sur la couche dudit matériau, à partir d'une solution de pyrrole et de pyrrole fonctionnalisé, en présence de réactifs chimiques approprié pour ladite électropolymérisation, c) Fixation directe, ou indirecte, d'une sonde biologique sur le pyrrole fonctionnalisé, par injection d'une solution de la sonde biologique, au choix dans une ou plusieurs microcuvette (s) en présence de réactifs chimiques nécessaires à la fixation directe, ou indirecte, de cette sonde biologique sur le pyrrole fonctionnalisé.

Exemple 1 Modèle biologique pour la mise en évidence des profils différentiels des ARN messagers et leur seuil de détection
Dans le but de mettre en évidence les changements qui s'opèrent au niveau des profils des ARNs messagers au sein d'une unité biologique (par exemple entre deux situations physiologiques différentes), nous avons mis en place un modèle biologique renfermant des gènes dont les niveaux d'expression impliquent trois classes d'ARN messager (ARNm très abondant (10 %) ; 2. ARNm moyennement abondant (1 %) ; 3. ARNm faiblement abondant (de l'ordre d'une copie ou plus). Nous avons choisi le système de détoxication du cadmium chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) comme modèle biologique. En effet, ce système bien documenté renferme dix gènes dont les niveaux d'expression répondent parfaitement à nos critères. Ces dix gènes sont répartis en 5 classes suivant leur réponse à la présence du cadmium :
Classe constitutive : Act1(1 X), Opi3 (1X)
Classe moyennement induite : Ynl208W, Ydr411C ( # 5 X)
Classe fortement induite : Seo 1, Gre1 (#30 X)
Classe moyennement réprimée : Rps3l, Krr1 (1/5 X)
Classe fortement réprimée : Yef3, Yjl200C (=1/16 X)

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Tableau 1 : Nombre de copies d'ARNm par cellule correspondant à ces gènes

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<tb> Actl <SEP> Grel <SEP> Krrl <SEP> Opi3 <SEP> Rps3l <SEP> Seol <SEP> Ydr411 <SEP> Yef3 <SEP> Yjl200C <SEP> Ynl208W
<tb> Copies <SEP> 21,1 <SEP> ND <SEP> 1,9 <SEP> 1,7 <SEP> 52,5 <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 26,4 <SEP> 1,5 <SEP> 6,5
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(D'après la référence

http:/lweb.wi.mit.edulyoun /cexpression/glossary.html# ypddesc).

Les séquences codantes de ces 10 gènes ont été extraites du site web SGD dédié au génome complet de la levure (http://genome-www.stanford.edu/ Saccharomyces/).

Le choix de la levure réside d'une part du fait que c'est un organisme eucaryote ancestral, et d'autre part dans sa proximité organisationnelle du génome avec celui des cellules eucaryotes supérieurs. De plus, il est facile à manipuler et son génome est entièrement séquence (6430 gènes répartis sur 16 chromosomes).

Il est aussi bien documenté et largement utilisé comme modèle biologique dans des études de pharmacologie, de toxicologie et d'oncologie.

# Préparation des échantillons
I. 1. Culture des levures
La souche de levure utilisée est YPH 499 de génotype : MATa ura3-52 his3-?200 ade2-101 uaa trp1-# 63 lys2-801 uag leu2-# 1.

La croissance a lieu en milieu YNB (milieu minimum contenant du sulfate d'ammonium 5,7g/l) complémenté par 30mg d'uracile, d'adénine, de lysine, d'histidine, de tryptophane et de leucine et contenant 4% de glucose comme source de carbone.

A partir d'une culture fraîche de la souche YPH 499, le milieu YNB, réparti en deux erlens est ensemencé à raison d'une DO de 0.15. Après 3 heures à 30 C sous agitation (200 rpm), le cadmium est ajouté dans un seul erlen à une concentration finale de 1 mM. Les deux erlens sont ensuite maintenus dans les mêmes conditions pendant 1 heure de plus.

Les cellules sont récoltées par centrifugation, lavées à l'eau DEPC puis resuspendues dans un volume de tampon phosphate (sorbitol 1,2M, KH2P04/K2HP04 20 mM) à raison d'une DO de 15 unités.

I. 2. Extraction et purification des ARN totaux

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Le protocole utilisé est celui du kit QIAGEN adapté aux sphéroplastes de la levure. Ces derniers sont obtenus après une digestion enzymatique de la paroi par la zymoliase (5mg/ml). Après centrifugation, les sphéroplastes sont resuspendus dans un tampon du tampon de lyse (Qiagen) puis sont lysés au dounce par 10 allers et retours dans la glace pour faciliter leur éclatement.

L'extraction des ARN totaux est réalisée suivant le protocole décrit dans le kit QIAGEN Rneasy Midi (QIAGEN S. A, Courtaboeuf). Afin d'éliminer toute contamination possible par de l'ADN génomique, ces ARN totaux subissent un traitement à la Dnase 1 pendant 30 min à 37 C.

La qualité des ARN est vérifiée sur gel d'agarose et sa quantité est estimée à l'aide du spectrophotomètre (D0260/D0230 > 2: absence de contamination par des protéines ou de l'ADN et D0260/D0280 1,8-2,1 ; D0260 = 1 # concentration ARN = 40 g/ml) et d'une RT-PCR utilisant des oligos spécifiques de l'actine {Actif : gaagtgtgatgtcgatgtcc ; Act1R: tagatggaccactttcgtcg).

I. 3. Synthèse et marquage des ADNc
Le marquage spécifique des ARNm se fait à l'aide d'une inverse transcriptase en présence de d'oligonucéotides poly-dT et d'un dNTP-biotine pour obtenir du cDNA marqué (voir figure 3).

La transcription inverse se déroule comme suit :
Dénaturation de 50 g d'ARN total pendant 5 min à 65 C.

Refroidir sur de la glace puis :
Ajouter le tampon de réaction et un inhibiteur de l'ARnase (DTT) ainsi que les dNTPs dont l'un est marqué avec de la biotine (dUTP).

Ajouter l'enzyme SuperScript Il (ADN polymérase ARN dépendante) une fois que le mélange atteint la température ambiante.

Incuber pendant 1 heure à 37 C pour obtenir le premier brin d'ADNc.

Un deuxième cycle dans la même condition permet de synthétiser le second brin.

L'ADNc double brin ainsi obtenu est purifié à l'aide de colonnes de type microcons (Millipore). L'ADNc peut être utilisé directement ou concentré après séchage au speedvac.

Il. Choix de sondes pyrroles
Les sondes ont été choisies à l'aide du logiciel OLIGO 6 qui tient compte de leur affinité, de leur pourcentage de G-C et de leur Tm (température de fusion). Dans un premier temps, ces sondes terminées par un groupement amine

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ont été qualifiées sur lame de verre avec des produits PCR et de l'ADNc. Les sondes uniques ainsi retenues sont des 50 mers sur lesquelles a été greffé un spacer de type dT 10 terminé par un groupement pyrrole en position 5'.

III Choix de calibrateurs
Les calibrateurs internes C1 (Porphyromonas gingivalis W83), C2 (Arabidopsis Thaliana) et C3 (Plectovirus) ont été choisis suivant les mêmes critères fixés pour les sondes pyrroles de la levure. Ces calibrateurs ainsi que les cibles uniques correspondantes ne possèdent aucune homologie significative avec nos séquences d'intérêt en l'occurrence celles du génome de la levure. Les cibles des calibrateurs C 1, C2 et C3 sont ajoutées dans cet ordre à des concentrations permettant d'obtenir des signaux croissant avec des facteurs de 102.(exp : Signal C3 = (Signal C2)2 = (Signal C1)4. Ceci permettra d'estimer le nombre de copies cibles présentent dans l'échantillon biologique d'intérêt.

IV. Adressage des sondes pyrroles
L'adressage est réalisé à partir des monomères pyrroles dont l'azote est substituée par des oligonucléotides 50 mers synthétisés et contrôlés préalablement. Toutes les sondes seront porteuses en leur extrémité 5' d'un espaceur de type dT,o adjacent au groupement polypyrrole et qui assure une accessibilité maximum. Les 128 microélectrodes sont successivement adressées selon le plan de dépôt décrit dans la présente invention. L'électrocopolymérisation a lieu dans une solution aqueuse contenant un sel inerte : 0,2 M LiClO4 comme électrolyte et un mélange de pyrrole 20 mM et 1 M de ODN-pyrrol.

L'électropolymérisation s'effectue sous un potentiel de 1 V vs/ECS. Entre chaque dépôt la puce est abondement rincée à l'eau déionisée. A la fin de cette étape la matrice est séchée, stockée sous Argon à 4 C jusqu'à son utilisation.

V. Hybridation sur puce MICAM
Solution d'hybridation (100 /il) est composée de : 1 l de cible biotinylée (10 M) ; 99 /il de tampon d'hybridation (1,3% Denhart 5X ; 66,7% Sperme de Saumon ; 31,9% du tampon A)
L'hybridation est réalisée comme suit :
On dépose 20 l de la solution d'hybridation sur la puce. La puce est ensuite recouverte d'une lamelle pour une étanchéité maximale. L'incubation se fait pendant 45 minutes à 45 C dans une chambre humide.

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Le lavage post-hybridation se fait avec 4 X 25,u1 du tampon (0,01 M PBS ; M NaCI ; 2,7 mM KCI ; 0,05 % Tween 20). la Streptavidine-Phycoérythrine (0.1 mg/ml) est utilisée pendant 10 min à l'obscurité pour la révélation.

Les lavages post-révélation se font dans 4 X 25 l de tampon de lavage.

Tampon A : 0,02 M ; NaCI :
Séquences nucléotidiques des sondes pyrroles et des calibrateurs (le numéro de la sonde correspond à la position de celle-ci sur la séquence codante du gène correspondant).

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Code <SEP> Position
<tb> Sondes <SEP> uence <SEP> /Puce
<tb> Sondes~~~~~~~~~~Séquence~~~~~~~~~~~~~~~~~
<tb> TTTTTTTTTTGAAGCTCCAATGAACCCTAAATCAAACAGAGAAAA <SEP> Pyrrole <SEP> ACT1 <SEP> Al
<tb> ACTI-627P <SEP> GATGACTCAAATTAT
<tb>

TTTTTTTCTGGTATTGTTTTGGATTCCGGTGATGGTGTTACTC Pyrrole ACT2 A2

<tb>
<tb> ACTl-754P <SEP> ACGTCGTTCCAATT
<tb>

TTACGTCGTTCCAATTTACGCTGGTTTCTCTCTACCTC Pyrrole ACT3 A3

<tb>
<tb> ACTl-790P <SEP> ACGCCATTTTGAGA
<tb>

CTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACA ACT4 A4 ACT1-908P CAAGGAAAAACTAT Pyrrole TTTTTTTACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACATCAAGGA ACT5 AS

<tb>
<tb> ACT1-915P <SEP> AAAACTATGTTACGT <SEP> Pyrrole
<tb> CTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACA <SEP> Pyrrole <SEP> ACT6 <SEP> A6 <SEP>
<tb> ACTl-908P <SEP> CAAGGAAAAACTAT
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TTTTTTTAGACAACAGCGTCATGAAAAACATCAACAGAGGGA GRE1 A7

<tb>
<tb> GREl-88P <SEP> ATTCAGGAATCAAGG <SEP> Pyrrole
<tb>

TTAACAGCAAAAACAAGGTCGTACAAGAGGTGCTCAA Pyrrole GRE2 AS

<tb>
<tb> GRE1-368P <SEP> AGTAACCGCTACCAA
<tb>

ATCTGTCTGGGTCAGGAAACGATGAATATGATGAT Pyrrole GRE3 A9 GRE146P GATAGTGGGAACCAA ITrTTTTTTTCATAGCGTGTGTTCTAGATTTAGTCGAAGGTTCTAT KRR1 AIO

<tb>
<tb> KRRl-204P <SEP> GACAGTAAAAACAA <SEP> Pyrrole
<tb>

CGAGÀTCCGTTCCTTTCCCGCAAGCCGTTAAGATC KRR2 All KRR1-314P CTACAAGATGACATG Pyrrole TTTTTTTTTTAeItIGGCT'Ï1'GGtItCT'T'Ci'rltICTAAATGTTACAT KRR3 A12

<tb>
<tb> KRRl-456P <SEP> TCTAGTACAAGGTA <SEP> Pyrrole
<tb>

TTGi;GCTTGAAGGAGGTCCGTCGAGTAGTAGAAGATT Pyrrole KRR4 Bl KRR1-534P GTATGAAAAATATTC TTTTTTTT1'GCCAGAAAGAAACCCAÀGÂAGÀTCAGAAACGTCGA KRR5 B2 KRRl-697P AAAGAAGGTCTATAC Pyrrole TTTTTTTTCGTCAGAGACATGGTGTACGAGTCTGCATTGCGT OPIl B3

<tb>
<tb> OPI3-218P <SEP> GAACAGCCTACGTGT <SEP> Pyrrole
<tb>

TICTGGGTGTGGCTCTCITTGGTITGGGGCAAGTGCT OPI2 B4

<tb>
<tb> OPI3-298P <SEP> TGTTTTGAGTTCCAT <SEP> Pyrrole
<tb>

GTACAAGCTGGGTATCACAGGGACGTACTTGGGTG OPI3 B5

<tb>
<tb> OPI3-348P <SEP> ACTATTTCGGCATCC <SEP> Pyrrole
<tb>

TTTTAGCTGGGTATCACAGGGACGTACTTGGGTGACTAT OPI4 B6

<tb>
<tb> OPI3-353P <SEP> CGGCATCCTGATG <SEP> Pyrrole
<tb>

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'l'i'T1"l'i"i'i'CGTCtIGiIGÂCÂTGGTGT.àiCGïIGTCT'GCrITTGCGT Pyrrole OPIS B7

<tb>
<tb> OPI3-218P <SEP> GAACAGCCTACGTGT
<tb>

TTTTATCTACTCTACACTTGGTCTTGAGATTGAGAGGTG RPS1 B8

<tb>
<tb> RPS31-192P <SEP> GTGGTAAGAAGAGAA <SEP> Pyrrole
<tb>

GAAGGTCTACACCACCCCAAAGAAGATCAAGCACA Pyrrole RPS2 B9 RPS31-246P AGCACAAGAAGGTCA rll-11-1'=CAtCACCCCAAAGAÀGATCAÂGCACAiGCACAAGA RPS3 Bit RPS31-255P AGGTCAAGTTGGCTG Pyrrole rTTTiTÏTri'GGTAÀGGTTACCAÀATTGAGAAGAGAATGTAGCAA RPS4 Bll RPS31-334P CCCAACTTGTGGTGC Pyrrole TTTTTCGTTAAATGGTGTIPi.4TGGTTT'IGïGGGrIT'GGAG SE01 B12 SE01-865P ATGGAACTTTATTAT Pyrrole TTTTTTTTTÀ'i'GG1'Ï'Ï'rlGiGGGi'TGGrIGËITGGAÀCTTTATTATT SE02 CI

<tb>
<tb> SE01-881P <SEP> GACGCTATTGTGTCT <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTTTTTTAGGGATGGAGATGGAACTTTATTATTGACGCTATT <SEP> SE03 <SEP> C2
<tb> SEOl-890P <SEP> GTGTCTGTCGTAGTG <SEP> Pyrrole
<tb>

- TTTfGGTGACCCATACAACTGTIATICTATITTCTTAACT SE04 C3 SEOl-967P GATGATGAAATTAG Pyrrole T'l'T1'TTTTTGTTTiGGTtITGG'T1"i'?iT'fTGÀTG'i'TACTGGTATTA S905 C4 SE01-1256P GCAGATAAATTA Pyrrole TTTTTTTGTATGGTTTATTTGATGCTTACTGGTATTATTGCAG SE06 C5 SE01-1262P ATAAATTACACTCT Pyrrole 'ITITITTCGACAATGCCAACGtG-CAGAïCATGïT1i'AïGGTIT YDR1 C6 YDR411-492P GATTCCTGTTTGGG Pyrrole - - CCCïTAATICAAt'tGïTiAtCtct'ïTCG'i1Tïi'AA't YDR2 C7 YDR411C-553P AGGGTGATTTCGT Pyrrole l11nllITGGGGGATGATÀTCCAG GCTGATCCAACCtAc" - - YDR3 C8

<tb>
<tb> YDR411 <SEP> -674P <SEP> GGAATCTCGCCCAAT <SEP> Pyrrole
<tb>

GGTACGGCCCCTGCAACÀTTGTCTCÀAACCAGTGG YDR4 C9 YDR411C-874P CACAGATTCAGGCAG Pyrrole TTTTG1'CTCÀÀtICCrIGTGGCiCrIGËI'TTCË1GGCAGAGCTT YDR5 C10 YDR411C-894P CTGGAAGTCAATTAA Pyrrole ?iCÀrlG1'T?iTTGCT'CC1'fTCTTGGGTAAATTGTTGCC YEF1 Cil

<tb>
<tb> YEF3-840P <SEP> AGGTTTGAAGAGTA <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTTTTTTTGTTGAAGGACGAAACCGTTGCTCCAAGATTTAAG <SEP> YEF2 <SEP> C12
<tb> YEF3-1043P <SEP> ATTGTCGTCGAGTAC <SEP> Pyrrole
<tb>

UUhmumm.m mGÁ GGACGÁ À.CCGTIG"{::rCCAAGÁ11"fAAGAT YEF3 Dl YEF3-1045P GTCGTCGAGTACAT Pyrrole TTTI'CTrA'rGTAACfGTG T1'CTCfITGGCfTATGGTGC YEF4 D2

<tb>
<tb> YEF3-1290P <SEP> TAAAATCTTGTTGA <SEP> Pyrrole
<tb>

ÀCACGACATTGÀTGGTÀCTCÀCTCTGACACTTCCGT YEF5 D3 YEF3-1488P CTTGGATTTCGTTT Pyrrole m.u...mmmGC'ITI'G1'CTAAGGë"'ITt'GAAGGMTITGAAGGTGG - YEF6 D4 YEF3-2800P rGTTATTATCATTAC Pyrrole TITTT1.TGGAGCfGAAATCGGTGCTACAÂCGTCAACTITCCC Pyrrole YJL1 D5

<tb>
<tb> YJL200C-850P <SEP> ACCAAGAAGCTCA
<tb>

GCTTGAAACCACGTATCCCCITCTTTGTCACCCCTG YJL2 D6 YJL200C-1220P GTTCAGAACAAATT Pyrrole TITITITTITGCATGCGGCCCTIGtATCGGACAAtGGM1'AGGG YJL3 D7 YJL200C-1338P AAGATGTCTCGAAAA Pyrrole 'ITITITf1TTGAGACAAACTTGAAGA CAAGGTGTGTTGCCAT YJL4 D8 YJL200C-2091P TGACTTTTGCCAACG Pyrrole TITfATATGGTGCCGACAATGGtAACcCCAACGGTGAAC Pyrrole Î'N1.1 D9

<tb>
<tb> YNL208W-93P <SEP> GTGGTTTATTTTCCA
<tb>

<Desc/Clms Page number 14>

<tb>
<tb> TTTTTTTTTCGGCCCTGGCGGTCAAGGTTTCGGAAGACAAGGCC <SEP> YNL2 <SEP> D10
<tb> YNL208W-389P <SEP> CACAAGGATTTGGAG <SEP> Pyrrole
<tb>

Tl'CCr1'1TCTAtIGTTGAGTGGTGTGCTGGGCGCCATAG YNL3 Dll

<tb>
<tb> YNLI208W-195P <SEP> GTGGTGCATTCCTTG <SEP> Pyrrole
<tb>

CCTCAGGAATTCGGGGGCCrIAGGTCGTCAAGGATT YNL4 D12 YNL208W-542P CAATGGCGGTTCACG Pyrrole rTTTTTTTTTGAAGCTCCAATGAACCCTAAATCAAACAGAGAAAA Pyrrole ACT1 El ACTl-627P GATGACTCAAATTAT TTTTCTGGTATTGTTTTGGATTCCGGTGATGGTGTTACTC Pyrrole ACT2 E2 ACTl-754P ACGTCGTTCCAATT TTTACCTCGTTCCAÀTTTACYCTGGITTCTCTCTACCTC Pyrrole ACT3 E3

<tb>
<tb> ACTl-790P <SEP> ACGCCATTTTGAGA
<tb> rTTTTTTTTTCTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACA <SEP> ACT4 <SEP> E4
<tb> ACTl-908P <SEP> TCAAGGAAAAACTAT <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTTTTTTACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACATCAAGGA <SEP> ACT5 <SEP> ES
<tb> ACT1-915P <SEP> AAAACTATGTTACGT <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTCTCCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTCCGTGACA <SEP> Pyrrole <SEP> ACT6 <SEP> E6
<tb> ACTl-908P <SEP> TCAAGGAAAAACTAT
<tb>

AGICèIÀCiIGCGTCiTGéïCr1'i'CAACAGAGGGA GRÉ1 E7 GREl-88P ATTCAGGAATCAAGG Pyrrole TTTTTTTTTMCAGCAAAAACAAGGTCGTACAAGAGGTGCTCAA Pyrrole GRE2 E8 GREl-368P GTAACCGCTACCAA TTTTATCTGTCTGGG'TC?rGGrMCGi1'TGrITATGATGAT Pyrrole GRE3 E9 GREl-446P GATAGTGGGAACCAA CA1'AGCGTGTGTTCTAGAt'ïtÁGTCGMGGTTCTAT KROL E10

<tb>
<tb> KRRl-204P <SEP> GACAGTAAAAACAA <SEP> Pyrrole
<tb>

CGAGATCCGTTCCTITéCCGC ÀGCCGTTAAGATC KRR2 Ell KRR1-314P CTACAAGATGACATG Pyrrole 'ITt'iTIi'tTîTtAA.AGGC'Ï'i"rGGAACTtcrAACr AAA TGTT ACAT KRR3 E12

<tb>
<tb> KRRl-456P <SEP> TCTAGTACAAGGTA <SEP> Pyrrole
<tb>

GGGC1'fGriGGAGGTCCGTCGiIGTAGTAGAAGATT Pyrrole KRR4 FI KRRl-534P GTATGAAAAATATTC TÏ=Ï'l'TT'f'ÏTGCCÂGïÀtlGtltiCCCr1?ïGtlAGtITCAGAAACGTCGA KRR5 F2 KRRl-697P AAAGAAGGTCTATAC Pyrrole TTTTTCGTCAGAGACATGGTGTACGAGTCTGCÀTTGCGT OPI1 F3 OPI3-218P GAACAGCCTACGTGT Pyrrole CTGGGTG1'GGCTCTCITrGGTTTGGGGCAAGTGCT OPI2 F4 OPI3-298P rGTTTTGAGTTCCAT Pyrrole -"''ÏTÏ''TGTÁCAAGtTGGGTATCACAGGGÁCGTACTTGGGTG - - OPI3 F5 OPI3-348P ACTATTTCGGCATCC Pyrrole rIGCTGGGT?i'i'Ct;,C?iGGGÂCGi'.^iCTTGGGTGACTAT 6Pf4 F6 OPI3-353P CGGCATCCTGATG Pyrrole TT1T1'CGTC1GAGACrITGGTGTACGAGTCTGCATTGCGT Pyrrole OPI5 F7

<tb>
<tb> OPI3-218P <SEP> GAACAGCCTACGTGT
<tb> ATCTACTCTACACTTGGTCTTGAGATTGAGAGGTG <SEP> RPS1 <SEP> F8
<tb> RPS31-192P <SEP> GTGGTAAGAAGAGAA <SEP> Pyrrole
<tb>

- TTGAAGGTCTACACCACCCC AAGAAGATCAAGCACA Pyrrole RPS2 F9 RPS31-246P AGCACAAGAAGGTCA rlCCtICCCCÀÀtIGAiGr1'i'CÀïGC?ïCAAGCACAAGA RPS3 F10 RPS31-255P AGGTCAAGTTGGCTG Pyrrole TTGGTiiGG1"i'ïlCCtlIÀTTG.IGe1?iGrIGAATGTAGCAA RPS4 Fil RPS31-334P CCCAACTTGTGGTGC Pyrrole CtsTTTGG1'GTéléi'TGGTTTAGAGGGATGGAG SEOI F12

<tb>
<tb> SEOl-865P <SEP> TGGAACTTTATTAT <SEP> Pyrrole
<tb>

<Desc/Clms Page number 15>

1'l l'ITrFMATGGTITKeÀÜaeeeCKlUÂYGC UTRFATTATT SE02 Gl

<tb>
<tb> SE01-881P <SEP> GACGCTATTGTGTCT <SEP> Pyrrole
<tb>

AGGGATGGAGATGGAACTTTATTATTGACGCTATT SE03 G2

<tb>
<tb> SEOI-890P <SEP> GTGTCTGTCGTAGTG <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTTTTTTTGGTGACCCATACAACTGTTATTCTATTTTCTTAACT <SEP> SE04 <SEP> G3
<tb> SEOl-967P <SEP> GATGATGAAATTAG <SEP> Pyrrole
<tb>

GTTTAGGTATGGTTTATTTGATGCTTACTGGTATTA SE05 G4

<tb>
<tb> SEOl-1256P <SEP> TTGCAGATAAATTA <SEP> Pyrrole
<tb>

GTATGGTTTATTTGATGCTTACTGGTATTATTGCAG SE06 G5 SE01-1262P ATAAATTACACTCT Pyrrole TTTTTTTTTCGACAATGCCAACGTGCAGATCATGTTTTATGGTTI' YDR1 G6 YDR411-492P GATTCCTGTTTGGG Pyrrole TTTTTTTCCCTTAATTCAATTGTTTATCTCTTTCGTTTTTAATG YDR2 G7

<tb>
<tb> YDR411C-553P <SEP> AGGGTGATTTCGT <SEP> Pyrrole
<tb> GGGGGATGATATCCAGAAAAGCTGATCCAACCTAC <SEP> YDR3 <SEP> G8
<tb> YDR411 <SEP> -674P <SEP> GGAATCTCGCCCAAT <SEP> Pyrrole
<tb>

TTTTTTTTTTGGTACGGCCCCTGCAACATTGTCTCAAACCAGTGG YDR4 G9

<tb>
<tb> YDR411C-874P <SEP> CACAGATTCAGGCAG <SEP> Pyrrole
<tb>

GTCTCAAACCAGTGGCACAGATTCAGGCAGAGCTT YDR5 G10 YDR411C-894P CTGGAAGTCAATTAA Pyrrole TTTTTTTTTACAAGTTATTGCTCCTTTCTTGGGTAAATTGTTGCC YEF1 Gll YEF3-840P AGGTTTGAAGAGTA Pyrrole TTTTTTTTTTGTTGAAGGACGAAACCGTTGCTCCAAGATTTAAG YEF2 G12

<tb>
<tb> YEF3-1043P <SEP> ATTGTCGTCGAGTAC <SEP> Pyrrole
<tb>

TTTTTTGAAGGACGAAACCGTTGCTCCAAGATTTAAGAT YEF3 Hl YEF3-1045P GTCGTCGAGTACAT Pyrrole TTTTTTTTTCTTATGTAACTGTGAATTCTCTTTGGCTTATGGTGC YEF4 H2

<tb>
<tb> YEF3-1290P <SEP> TAAAATCTTGTTGA <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTACACGACATTGATGGTACTCACTCTGACACTTCCG <SEP> YEF5 <SEP> H3
<tb> YEF3-1488P <SEP> CTTGGATTTCGTTT <SEP> Pyrrole
<tb>

Pyrrole YE F6 H4 Pyrrole Le TTTTGCTTTGTCTAAGGCTTTGAAGGAATTTGAAGGTGG

<tb>
<tb> YEF3-2800P <SEP> rGTTATTATCATTAC
<tb>

GGAGCTGAAATCGGTGCTACAACGTCAACTTTCCC Pyrrole YJL1 H5

<tb>
<tb> YJL200C-850P <SEP> ACCAAGAAGCTCA
<tb>

GCTTGAAACCACGTATCCCCTTCTTTGTCACCCCTG YJL2 H6

<tb>
<tb> YJL200C-1220P <SEP> GTTCAGAACAAATT <SEP> Pyrrole
<tb>

TTTTTTTTTGCATGCGGCCCTTGTATCGGACAATGGAATAGGG YJL3 H7

<tb>
<tb> YJL200C-1338P <SEP> AAGATGTCTCGAAAA <SEP> Pyrrole
<tb> GAGACAAACTTGAAGAAACAAGGTGTGTTGCCAT <SEP> YJL4 <SEP> H8
<tb> YJL200C-2091P <SEP> TGACTTTTGCCAACG <SEP> Pyrrole
<tb> TTTTTTTTTATATGGTGCCGACAATGGTAACCCCAACGGTGAAC <SEP> Pyrrole <SEP> YNL1 <SEP> H9
<tb> YNL208W-93P <SEP> GTGGTTTATTTTCCA
<tb>

TTTTTTTCGGCCCTGGCGGTCAAGGTTTCGGAAGACAAGGCC YNL2 H10

<tb>
<tb> YNL208W-389P <SEP> CACAAGGATTTGGAG <SEP> Pyrrole
<tb> CCATTCTAAGTTGAGTGGTGTGCTGGGCGCCATAG <SEP> YNL3 <SEP> H11
<tb> YNL1208W-195P <SEP> GTGGTGCATTCCTTG <SEP> Pyrrole
<tb>

TT'I"I"CtTTTCCTCAGGAATTCGGGGGCCAAGGTCGTCAAGGATT YNL4 H12

<tb>
<tb> YNL208W-542P <SEP> CAATGGCGGTTCACG <SEP> Pyrrole
<tb>

<Desc/Clms Page number 16>

GCtICTTGTGCTCTCCCiTCGCTTCGCTË1CCCGTGTtITGCAC Cl Bl Pgingivalis-Cl GT Pyrrole GCÂCTTGTGCTCCTCCAACCATCGCTTCGCTACCCGTGTATGCAC Cl Cl

<tb>
<tb> Pgingivalis-C1 <SEP> TTTGT <SEP> Pyrrole
<tb>

rCGGGTGGGTTGAACTGGCTTGGGGTGTTTÂTCÂGGÂGATTTCT C2 Dl

<tb>
<tb> Thaliana-C2 <SEP> CGGAGT <SEP> Pyrrole
<tb> rCGGGTGGGTTGAACTGGCTTGGGGTGTTTATCAGGAGATTTCT <SEP> C2 <SEP> El
<tb> Thaliana-C2 <SEP> CGGAGT <SEP> Pyrrole
<tb>

GCAGÀTTTTGCTGGTGTTCTrGCTGATTGGGCGATrGCTTTTACT C3 FI

<tb>
<tb> Plectovirus-C3 <SEP> AACTG <SEP> Pyrrole
<tb> GCAGATTTTGCTGGTGTTCTTGCTGATTGGGCGATTGCTTTTACT <SEP> C3 <SEP> G1
<tb> Plectovirus-C3 <SEP> AACTG <SEP> Pyrrole
<tb> Pyrrole <SEP> CP <SEP> DO <SEP>
<tb> CPNS04 <SEP> TTTTTTTTTTGCCTTGACGATACAGCTA
<tb>

........................................................................................................... Pyrrole. CN..CO Pyrrole CN Co M5 CGCCAGCAGCTCCAA
Le plan de dépôt des sondes est montré à la figure 2, dans la zone centrale (4) correspondant aux rangées A à H , et aux colonnes 1 à 12. Cette disposition reproduit exactement le format des 96 positions d'une plaque de microtitration. Il conserve l'indexation qui sert de référence à l'homme du métier.

Exemple 2
Détection des mutations ponctuelles par mini-séquençage des gènes p53 et K-ras, les plus fréquemment décrites dans les cancers humains colo-rectaux
Ces mutations ponctuelles sont définies dans le tableau ci-après.

<tb>
<tb>

3'- <SEP> %
<tb> Nom <SEP> Séquence <SEP> 5'-3' <SEP> S'-end <SEP> end <SEP> Taille <SEP> GC <SEP> Tm <SEP> Organisme <SEP> Gène
<tb> non
<tb> CP <SEP> CGGCACCACCACTTCGACATC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 21 <SEP> 61,9 <SEP> 72,4 <SEP> humain
<tb> non
<tb> CN <SEP> CCTACCGTACCCCCTCCCGT <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 20 <SEP> 70 <SEP> 71,2 <SEP> humain
<tb> CQ <SEP> : <SEP> ACS <SEP> TTCACCACCACGGCCGAG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 66,7 <SEP> 69,9 <SEP> Humain <SEP> béta <SEP> Actine <SEP>
<tb> CQ:ACAS <SEP> CTTAATGTCACGCACGATTTCCC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 23 <SEP> 47,8 <SEP> 70,1 <SEP> Humain <SEP> béta <SEP> Actine <SEP>
<tb> P72S <SEP> AGAATGCCAGAGGCTGCTCCCC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 22 <SEP> 54,5 <SEP> 70,6 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 4
<tb> P72AS <SEP> GCTGGTGCAGGGGCCACG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 77,8 <SEP> 74,4 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 4
<tb> 175S1 <SEP> GCACATGACGGAGGTTGTGAGG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 22 <SEP> 59,1 <SEP> 71,5 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 5
<tb>

<Desc/Clms Page number 17>

<tb>
<tb> 175S2 <SEP> CAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 22 <SEP> 59,1 <SEP> 71,5 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 5
<tb> 175AS1 <SEP> GCTCATGG <SEP> TGGGGGCAGC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 72,2 <SEP> 70,9 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 5
<tb> 175AS2 <SEP> CGCTCATGGTGGGGGCAG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 72,2 <SEP> 71,9 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 5
<tb> 24851 <SEP> TGCATGGGCGGCATGAAC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 61,1 <SEP> 70,8 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 7
<tb> 248S2 <SEP> GCATGGGCGGCATGAACC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 18 <SEP> 66,7 <SEP> 71,7 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 7
<tb> 248AS1 <SEP> GATGGTGAGGATGGGCCTCC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 20 <SEP> 65 <SEP> 70,3 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 7
<tb> 248AS2 <SEP> GATGATGGTGAGGATGGGCCTC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 21 <SEP> 57,1 <SEP> 69,9 <SEP> Humain <SEP> P53 <SEP> exon <SEP> 7
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb>

1251 C'1GAA'l'A'I'AAACI-'l'Cïl'GtI'AGTI'CiGAGCT Pyr OH 29 37,9 69 Humain 1

<tb>
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 1252 <SEP> TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 29 <SEP> 37,3 <SEP> 70,3 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 12AS1 <SEP> GGCACTCTTGCCTACGCCAC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 20 <SEP> 65 <SEP> 69,6 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 12AS2 <SEP> AGGCACTCTTGCCTACGCCA <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 20 <SEP> 60 <SEP> 69,8 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 1351 <SEP> AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 29 <SEP> 37,9 <SEP> 70,2 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 13S2 <SEP> AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 25 <SEP> 48 <SEP> 70,3 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 13AS1 <SEP> CGTCAAGGCACTCTTGCCTACGC <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 23 <SEP> 52,2 <SEP> 70,5 <SEP> Humain <SEP> 1
<tb> K-ras <SEP> exon
<tb> 13AS2 <SEP> CGTCAAGGCACTCTTGCCTACG <SEP> Pyr <SEP> OH <SEP> 22 <SEP> 59,1 <SEP> 71,3 <SEP> Humain
<tb>

L'hybridation est réalisée à 45 C pendant 1 H 30 min dans le tampon d'hybridation MICAM à partir de 15 l de la fraction aliquote d'un produit de PCR purifié (phosphatase alcaline, exonucléase 1) et fragmenté (digestion par une enzyme de restriction).

Dans les tableaux précédents, les sondes sens et anti-sens sont décrites par leurs séquences respectives, et constituent les ligands actifs au sens de la définition générale de l'invention explicitée précédemment. L'espèce cible est quant à elle un fragment génomique d'un patient comprenant les exons d'intérêts des gènes p53 ou Kras. d)
L'adressage est réalisé à partir des monomères pyrroles dont l'azote est remplacé par des séquences d'oligonucléotides dont la taille est comprise entre 15- 30 mers synthétisés préalablement. Toutes les sondes seront porteuses en leur extrémité 5' d'un linker qui suit le groupement polypyrrole assurant ainsi une accessibilité maximum. Les 96 microélectrodes sont successivement adressées

<Desc/Clms Page number 18>

selon le plan de dépôt décrit figure 3. L'électrocopolymérisation a lieu dans une solution aqueuse contenant un sel inerte : 0.2M LiClO4 comme électrolyte et un mélange de pyrrole 20mM et 1 M de ODN-pyrrol. L'électropolymérisation a lieu à un potentiel de 1 V vs/ECS . Entre chaque dépôt la puce est rincée à l'eau déionisée. A la fin de ce process la matrice est séchée, stockée sous Argon à 4 C jusqu'à son utilisation.

Le plan de dépôt des sondes sens et anti-sens est montré à la figure 3 , dans la zone centrale (4) correspondant aux rangées A à H , et aux colonnes 1 à 12. Cette disposition reproduit exactement le format des 96 positions d'une plaque de microtitration. Il conserve l'indexation qui sert de référence à l'homme du métier.

Avec un échantillon génomique d'un patient, obtenu par exemple après amplification, le mode opératoire pour la mise en #uvre de la biopuce précédemment décrite, en vue de détecter les mutations précédemment définies, comporte les étapes essentielles suivantes :
L'hybridation est réalisée à 45 C pendant 1 H 30 min dans le tampon d'hybridation MICAM à partir de 15 l de la fraction aliquote d'un produit de PCR purifié (phosphatase alcaline, exonucléase 1) et fragmenté (digestion par une enzyme de restriction).

Le lavage post-hybridation se fait avec 4 X 250/il de PBS.

Dans un volume final de 20/il, l'extension est effectuée pendant 1 H 30 min à 45 C en présence de Thermoséquenase (8U), du tampon de la thermoséquenase, de ddNTP (10 M final) dont un biotinylé.

Les lavages post-extension se font pendant 2 X 90 sec avec H20 à 80 C. la Streptavidine-Phycoérythrine (0.1 mg/ml) est utilisée pendant 10 min à l'obscurité pour la révélation.

<Desc/Clms Page number 19>

Les lavages post-révélation se font dans 4 X 250 l de tampon de lavage.

Pour ces deux exemple antérieurement, ou En même temps que le dépôt des sondes, ou postérieurement audit dépôt, différents sites élémentaires, appartenant à la zone périphérique (5), sont affectés de manière générale au contrôle de la détermination biologique effectuée par ailleurs dans la zone centrale (4).

A cette fin, dans la zone périphérique (5), dix sites élémentaires (10), correspondant à la rangée I selon figure 1 et aux positions 2 à 11, sont affectés ensemble à l'identification numérique de la biopuce. A cette fin, chaque site élémentaire (10) d'identification, comprend un marqueur fixé ou lié par l'intermédiaire du pyrrole, susceptible de générer un signal d'identification, par exemple un signal lumineux. La combinaison des signaux d'identification, obtenus lors du traitement de la biopuce, génère un code d'identification en format binaire.

Comme montré à titre d'exemple à la figure 3, les sites 7 ; et 11 comportent un marqueurs fixé ou lié par l'intermédiaire du pyrrole (1) , alors que les autres sites de la rangée I n'en comportent pas (0). D'où dans la figure 3 le code 0000011001, ce qui est un codage binaire dont le nombre est 1 x 24+ 1 x 23+ 1 x 2 = 16 + 8 + 1 = 25. Ce nombre est donc caractéristique du plan de dépôt et/ou de l'affectation de la puce à une analyse donnée.

Dans la zone périphérique (5), deux sites élémentaires (11 et 12) dits respectivement de contrôle positif et de contrôle négatif, prédéterminés en positions ( DO et CO ) comprennent respectivement un ligand susceptible de se lier avec l'espèce cible, , et un ligand non susceptible de se lier avec ladite espèce cible, dans les conditions de contact avec liaison entre l'espèce cible précitée et les autres ligands dans la zone centrale (4). les ligands fixés dans les zones 11 et 12 sont chacun différents des ligands ou sondes présents dans la zone centrale (4).

Cette disposition permet de valider les étapes de préparations de l'échantillon biologique à étudier et/ou l'étape d'hybridation
Dans la zone périphérique (5) deux sites élémentaires 13 et 14, de contrôle qualité, prédéterminé en position (BO et GO).

Il s'agit de contrôle qualité des différentes étapes de la réalisation de la biopuce.

<Desc/Clms Page number 20>

Il peut donc s'agir comme dans l'exemple 1 de sites élémentaires de contrôle qualité comprenant un électrolyte qui permet de valider le process de fabrication de la biopuce à savoir si la biopuce est bien potentiellement adressable.

Il peut s'agir de sites élémentaires de contrôle qualité du système de détection, par exemple comprenant un pyrrole - oligonucléotide -biotine sur lequel est susceptible de s'accrocher la biotine couplée à un marqueur.

Enfin, il peut s'agir de sites élémentaires de contrôle qualité de la préparation de l'échantillon et de l'hybridation. Ces ligands subissent donc le même traitement que l'échantillon à analyser.

Toujours dans la zone périphérique (5), un site élémentaire (15 ), dit non traité , prédéterminé en position ( EO), demeure exempt de tout traitement , et/ou un site élémentaire (16), dit traité, prédéterminé en position (FO), demeure libre de tout ligands , par exemple avec une couche d'un polymère conducteur électronique.

Cette disposition permet d'apprécier le "bruit de fond" susceptible d'être généré par le support lui-même ou son traitement, en particulier dans les sites élémentaires précédemment définis.

Dans la zone périphérique (5), dix sites élémentaires (17 ) d'étalonnage, prédéterminés en position (toute la rangée Z, des positions 2 à 11), sont affectés ensemble à la mesure quantitative des signaux dits de sortie générés par un des marqueurs fixés ou liés, par l'intermédiaire du pyrrole , sur le support (2).

Ces sites élémentaires d'identification comprennent des quantités respectivement différentes ( de 104 à 109 molécules) d'une ou plusieurs espèces de marqueurs. Cette disposition permet d'établir une calibration de la lecture..

Dans la zone périphérique (5), six sites élémentaires (18 ), dits de calibration, prédéterminés en position (colonne 13, des positions B à G), sont affectés ensemble à la calibration interne de la biopuce.. Ces sites élémentaires de calibration comprennent des quantités respectivement différentes (de 104 à 109 molécules) d'une espèce cible calibrateur , n'ayant aucune homologie avec les cibles d'intérêt. Cette disposition permet d'apprécier la quantité et l'efficacité de l'hybridation.

Pour terminer, le support (2) comprend un organe (19 ), dit détrompeur, déposé dans la zone périphérique (5) sur le support (2), qui peut consister en un site élémentaire supplémentaire, et qui permet de repérer en position relative la biopuce (1).

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Comme le montre la description précédente, dans la zone centrale (4) les sites élémentaires sont au nombre de cent vingt-huit et distribués selon deux axes orthogonaux, à savoir en huit rangées référencées A à H selon un axe, et douze colonnes référencées 2 à 11, selon un autre axe perpendiculaire.

La zone périphérique (5) comprend quant à elle deux lignes ou rangées référencées Z et I, et deux colonnes référencées 0 et 13, encadrant la zone centrale (4) de forme rectangulaire.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS 1) Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3) avec un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que les sites élémentaires (Xn) sont distribués entre, d'une part une zone centrale (4) affectée à une détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires dits actifs, comprenant chacun en nombre multiple des ligands dits actifs, respectivement différents, intervenant directement dans la détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant au moins en partie la zone centrale, comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comprenant le cas échéant des ligands dits de contrôle.
2. 2) Biopuce selon la revendication 1 caractérisée en ce que le contour de la surface opératoire (3) une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis
3. 3) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone centrale (4), les sites élémentaires, au nombre de X multiplié par n, sont distribués selon deux axes orthogonaux, par exemple en quatre, huit ou seize (X=4,8, 16) rangées selon un axe, et six, douze ou vingt-quatre colonnes respectivement (n = 6, 12,24) selon un autre axe
4. 4) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), y sites élémentaires (10) d'identification, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à l'identification numérique de ladite biopuce, chaque site élémentaire d'identification comprenant ou non un ligand marqué susceptible de générer un signal d'identification, la combinaison des signaux d'identification présents ou absents respectivement dans les sites élémentaires d'identification générant un code d'identification en format binaire de la biopuce
5. 5) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que la zone périphérique (5) comprend deux lignes et deux colonnes, encadrant la zone centrale de forme quadrangulaire
6. 6) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), deux sites élémentaires, (11,12) dits respectivement de contrôle positif et de contrôle négatif, prédéterminés en position,

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   comprennent respectivement deux ligands susceptible et non susceptible respectivement de se lier avec une espèce cible, dans les conditions de contact avec liaison entre ladite espèce cible et au moins un autre ligand dans la zone centrale (4)
7. 7) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), un site élémentaire (14) dit non-traité, prédéterminé en position, demeure exempt de tout traitement et/ou de toute électrode, et/ou un site élémentaire (15), dit traité, prédéterminé en position, demeure libre de tout ligand, par exemple revêtement avec un couche d'un polymère conducteur électronique
8. 8) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), z sites élémentaires (17) dits d'étalonnage, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à la mesure quantitative du ou des signaux, dits de sortie, générés par un ou des marqueurs fixés ou liés, directement ou indirectement, sur le support (2), lesdits sites élémentaires d'identification comprenant des quantités respectivement différentes d'un même ligand marqué avec le dit marqueur
9. 9) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), t sites élémentaires (18) dits de calibration, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à la calibration interne de ladite biopuce, lesdits sites élémentaires de calibration comprenant des quantités respectivement différentes d'une même espèce cible, en tant que ligand
10. 10) Biopuce selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support comprend au moins un organe (19), dit détrompeur, disposé dans la zone périphérique (5) sur le support