FR2824001A1 - Procede de depot d'un spot d'un produit d'interet, et application pour l'isolement et/ou la determination d'un analyte - Google Patents

Abstract

1. Procédé de dépôt sur un subjectile (1) d'un produit d'intérêt (2), selon une aire élémentaire (3) de faible valeur, dite spot, procédé selon lequel : (a) on prépare ou on dispose d'un milieu liquide (4), comprenant un véhicule et le produit d'intérêt (2) (b) à partir du milieu liquide, on forme une goutte (5), et on pose ladite goutte sur la surface (1a) du subjectile, en contact avec le milieu liquide (c) on élimine le véhicule de la goutte (5), par exemple par séchage, en sorte de laisser subsister ledit spot (3) caractérisé en ce que, en combinaison : (1) on prépare ou on dispose d'un support magnétique (6), distribué dans le véhicule, (2) on lie le produit d'intérêt (2) au support magnétique (6), moyennant quoi le milieu liquide, à partir duquel on forme la goutte (5), comprend des particules (7) de transport, (3) au moins pendant l'élimination du véhicule de la goutte (5), on génère un champ magnétique (8) traversant la surface (1a) du subjectile (1), moyennant quoi le spot (3) obtenu comprend les particules (7) de transport, et donc le produit d'intérêt (2).

Description

La présente invention concerne de manière générale le dépôt, par exemple à

l'état sec. sur un subjectile, d'au moins une quantité prédéterminée, ou dose, d'au moins un produit d'intérêt, réparti à la surface du subjectile et circonscrit selon une aire élémentaire, de faible valeur, notamment au plus égale à 35 mm2, et préférentiellement comprise entre

0,001 et 3 mm2, dite spot ou tâche.

Différentes techniques requièrent un tel dépôt, à l'état sec. au rang desquelles on peut citer: - I' impression d'un subjectile de type papier, par jet d'encre, auquel cas le produit d'intérêt est un pigment ou un colorant, et la juxtaposition des spots de couleur et/ou d'intensités différentes reproduit toute image ou caractères d'un alphabet, I'isolement et/ou la détermination (qualitative et/ou quantitative) d'un analyte, en particulier d'une bio-molécule, notamment bio-macro-molécule telle que acide nucléique ou protéine, par mise en _uvre de puits réactionnels, par exemple sur une micro-plaque, auquel cas le produit d'intérêt est un réactif de capture de l'analyte, par exemple un ligand se liant spécifiquement à l'analyte; dans ce dernier cas, le ou les spots obtenus sont disposés par exemple sur le fond d'un ou plusieurs puits de micro-titration, Classiquement, quelle que soit la technique concernée, un tel spot est obtenu selon le procédé général suivant: a) on prépare ou on dispose d'un milieu liquide (ou fluide) comprenant un véhicule, un solvant par exemple, et le produit d'intérêt distribué (dispersé et/ou dissout) de manière homogène dans ledit véhicule, b) à partir du milieu liquide, selon toute technique appropriée, on forme une goutte dont le volume est déterminé en correspondance avec la quantité prédéterminée du produit d'intérêt à déposer dans le spot; et on pose ou dépose la goutte, avec ou sans accélération (par exemple par gravité), sur la surface du subjectile, alors en contact selon une aire très limitée avec le milieu liquide de la goutte, c) on élimine au moins partiellement, voire totalement, le véhicule de la goulte, par tous les moyens appropriés, par exemple par séchage, alors qu'elle demeure sur la surface du subjectile, en sorte de laisser subsister sur ce dernier le spot désiré, constitué par ou comprenant

le produit d'intérêt, recouvrant la surface du subjectile.

Un tel procédé comporte une difficulté substantielle, qui en particulier a été identifiée et analysée dans le domaine de l'impression par jet d'encre; cf. US-A-5 695 820 Du fait de l'évaporation et/ou condensation du véhicule, en cours d'élimination, ou pour d'autres raisons, la tension superficielle entre le milieu liquide et l'extérieur varie selon l'interface de la goutte, ce qui génère une micro-circulation interne du milieu liquide, ayant pour effet de

concentrer le produit d'intérêt sur la périphérie de la goutte.

Da ns le do maine de l ' imp ress ion par jet d ' encre, ce p h éno mèn e, connu sous le nom d'effet MARANGONI, a pour effet de conférer à chaque

spot une forme de halo.

Dans le domaine de la détermination (qualitative et/ou quantitative) d'une bio-molécule, ce phénomène a pour effet de générer un dépôt du ligand, ayant la forme d'une couronne, dans laquelle la distribution et la concentration en ligand ne peuvent être ma^'trisées, ni reproductibles, ce qui va a l'encontre de la fiabilité recherchée dans toute méthode d'analyse, en particulier dans le domaine de la biologie moléculaire. Préalablement à la présente invention, la Demanderesse a procédé à différents essais pour supprimer ou limiter l'effet MARANGONI, dans le processus de formation d'un spot d'un ligand sur le fond d'un puits d'une micro-plaque d'analyse: 1) en refroidissan1 le subjectHe, on [me certes l'effet ARANCONI, ms 1a gouite ne sAche pas ou requie un temps de sAchage non compabble avec un processus automat6, ou industheL 2} [oppos6, en chauffant le subiectHe, pour que le prodult dntArAt n'ah pas le temps de migrer vers le bord de la gouite, on observe ndanmolns la formaton d'un spot en forme de halo, 3) en sAchant la gouite en atmosphAre humide, on retrouve les lnconvAnients selon 1), 4) en augmentant la vlscositd du mlIleu liquide, avec un addillf

approprld, goutte ne sAche pas ou mal.

La prdsente invention a donc pour obiet de remAdier Leffet ARANOCNE en contrecarrant ce dernien Selon la prAsente lnvention, on a dAccuvert que Leffet ARANGONI cessah praquemen1, dans tout processus de formatlon d'un spot parDr d' une goutte, ds lors q u 'en com binalson on met en uvre les condlons opAratolres sulvantes: 1) on prApare ou on dpose d'un support magndque dtAbud so us forme de pa rtlcul es, de maniAre ho mog Ane, dans le vhicule, 2) on [e le produ] d'lntArAt au support magnAque, moyennant quo' le mlLeu [quide, pair duquel on forme la gouite, comprend des parcules de transport disthbudes dans le vhicule, chacune comprenant et le support magnAtlque et le produit d'lntArAt, 3) au moins da l'Iminn du hule de go, on gAnAre un champ magnAque baversant la surface du subiecle selon une section comprenan1 I'ake de contact entre la gouite et le subiecide, moyennant quol le spot obtenu comprend les parcules de transporE et

donc le prodult d'lntArAt, par exemple I'Atat sec.

Grâce à l'invention, et comme montré par le protocole expérimental décrit ci-après dans le domaine de la détermination d'un analyte, du type biomolécule, on obtient un spot homogène dans lequel la quasi-totalité du produit d'intérêt est bien distribuée en surface, par I'intermédiaire des particules de transport, ayant exactement la même

distribution à la surface du spot.

Grâce à l'action du champ magnétique, on constate également une meilleure retenue du spot à la surface du subjectile, sans doute en raison d'une pénétration ou d'un ancrage des particules de transport dans

la couche superficielle du subjectile.

Un tel avantage est important pour la détermination d'un analyte du type bio-molécule, en sachant que le spot est souvent lavé, parfois à plusieurs reprises, avant que l'analyte lié au ligand soit déterminé

par toute méthode appropriée, par exemple avec un réactif marqué.

Dans toute la présente description, le vocabulaire suivant est

explicité. Par "isoler" ou "isolement", on entend de manière générique toute technique permettant de séparer un analyte, mais aussi d'enrichir ou concentrer en ledit analyte dans toute fraction ou partie liquide le conten ant. Mais on entend aussi, éventuellement co njoi ntement avec la définition précédente, toute technique permettant de déterminer l'analyte, au sens d'une détection et/ou quantification de celui-ci, à partir du milieu

liquide le contenant.

Par "analyte", on entend toute entité, notamment entité biologique, à isoler. Au rang des analytes considérés ci-après par la présente invention, on citera les cellules, organelles, virus et bactéries, les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les haptènes, les lectines, les sucres, les acides ribo-, déoxyribonucléiques, les protéines, notamment A ou G. les hormones, les récepteurs d'hormones, et d'une manière générale toutes molécules ou macromolécules, naturelles ou s synthétiques, ou anaiogues, à déterminer, c'est-à-dire détecter et/ou quantifier. On entend par "ligand", un élément capable de former par un S lien chimique ou physique, un complexe avec un analyte. A titre d'exemple de ligand, on peut citer les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les haptènes, les lectines, les sucres, les acides ribo- et désoxyribonucléiques, les protéines notamment A ou G. les hormones, les récepteurs d'hormones, la biotine, I'avidine ou la streptavidine et, d'une manière générale, les ligands naturels ou synthétiques, et les analogues de

ligands modifiés, pouvant entrer en compétition avec les ligands.

On entend par "support", tout type de support, polymère, inorganique ou métallique. A titre d'exemple de supports polymères, on peut citer les supports plastiques à base de polystyrène, poly(méth)acrylates, polybutadiène, polypropylène, ou d'autres, seuis ou sous forme de copolymères. A titre d'exemple de supports inorganiques, on peut citer l'oxyde de silice, le silicium, le mica, le verre, le quartz,... A titre d'exemple de supports métalliques, on peut citer l'or, I'argent, I'oxyde de

titane, I'oxyde de vanadium,...

L'immobilisation des ligands sur le support peut s'effectuer, soit par simple adsorption sur le support, natif ou modifié, soit par l'intermédiaire d'une résction chimique (fonctionnalisation), ou physique, permettant de modifier la surface du support, et ainsi de permettre la fixation du ligand par des liens de covalence, ou d'autres moyens

traditionnels bien connus de l'homme de l'art.

On entend par "particule", toute particule d'un support polymère, inorganique ou métallique, sur laquelle il est possible de greffer un ligand. En particulier, sont considérces comme tombant dans le champ de la présente invention, les particules pouvant être séparées par voie magnétique. Ressortent de la définition précédente, les particules de faible tail le. notamment superparamagnétiques, dont la vitesse de sédimentation sous l'effet de la gravité est inférieure à l'agitation thermique, mais pouvant constituer des agrégats par tout procédé permettant de les réunir entre elles, ou de les assembler sur des particules de plus grosses tailles,

séparables par voie magnétique.

A titre d'exemple de particules polymères, on peut citer les particules obtenues par polymérisation en émulsion telles que les latex, ou

des particules de plus grosse taille, mais magnétiques.

A titre d'exemple de particules métalliques, on peut citer les particules ferro-, ferri-, para- ou superparamagnétiques, recouvertes ou non de polymères naturels ou synthétiques, dont la composition comprend le fer ou d'autres métaux comme le cobalt, le nickel ou d'autres, seuis ou

sous forme d'alliages, mais magnétiques.

A titre d'exemple de particules inorganiques, on peut citer les

particules à base de silice ou de silicium, magnétiques ou non.

Les particules magnétiques mises en _uvre par la présente invention peuvent être rangées en deux catégories, à savoir les particules de diamètre relativement important, par exemple de l'ordre du ou de quelques microns, et celles de diamètre relativement faible, par exemple de

l'ordre de quelques dizaines de nanomètres, et à l'état collodal.

Les particules magnétiques de diamètre relativement important lorsqu'elles sont placces dans un champ magnétique, se déplacent en direction de l'endroit o le champ est le plus élevé et à une vitesse

suffisante pour être séparées de leur milieu par ce moyen.

A titre d'exemple, on peut citer les particules décrites dans le document EP-A-O 125 995. Elles sont obtenues par précipitation de sels ferreux et ferriques en milieu basique, suivie d'une réaction de silanisation dans le méthanol. Leur diamètre final est compris entre 0,1 et 1,5,um et leur densité de 2,5 glcm3. De même, les particules décrites dans les documents EP-A-O 106 873, EP-A-O 585 868 et US-C-5,356,713, sont obtenues par différent procédés de polymérisation, ou encore celles décrites dans le document US-C-4,297,337 utilisent une matrice de verre poreuse dans laquelle sont dispersés des pigments magnétiques. D'autres brevets décrivent aussi l'utilisation de particules de faibles tailles, mais volontairement agrégées afin d'augmenter la masse magnétiques comme dans le document US-C-5,169,754. L'article de P.A. Risen et al, Protein Expression and Purification, 6 (1995), 272-277 décrit aussi des gels magnétiques. Placées dans un champ magnétique, toutes ces particules relativement grosses engendrent un mouvement en direction de l'endroit o le champ est le plus intense. Un simple aimant permanent ou des montages équivalent tels que décrits par exemple dans le document EP-A-O 317 286 peuvent être utilisés. Ces particules sont couramment employées pour la séparation de cellules ou de molécules, ainsi que dans des immunoessais

tels que décrit dans le document EP-A-O 528 708.

Les particules magnétiques de diamètre relativement faible ne sont pratiquement pas attirées par un simple aimant permanent dans des délais raisonnables. Ces particules sont en particulier largement utilisées pour la séparation magnétique de cellules. Par exemple, celles décrites dans le document US-C-4,230,685, sont obtenues 'ar émuision d'un mélange d'albumine, de protéine A et de particules de Fe3O4 de diamètre 15-20 nm, et peuvent immobiliser des anticorps par l'intermédiaire de la protéine A. Le document US-C-4,452,773 décrit un autre type de particules, obtenu par précipitation de sels ferreux et ferrique en milieu basique, et en présence d'un polysaccharide. Ces particules peuvent immobiliser des anticorps, des oligonucléotides, des lectines ou d'autres biomolécules, par couplage sur le polysaccharide, grâce à des méthodes de greffage connues. Leur utilisation a souvent été reprise, comme dans les documents US-C-5,543,289 ou WO-A-88/00060, ou elles sont utilisoes dans des applications particulières comme celles décrites dans les documents FR-A2 710 410 et FR-A 2 732 116. Le document US-C-4,795,698 décrit une modification de la procédure de Molday, en remplaçant, par exemple, le polysaccharide par un autre polymère de nature protéique. Les protéines présentes à la surface des particules peuvent ainsi servir a l'immobilisation ultérieure d'anticorps

par des méthodes de couplage connues de l'homme de l'art.

Ces particules de diamètre relativement faible nécessitent l'utilisation de montages particuliers, permettant d'augmenter localement le gradient de champ magnétique. Cette technique est connue par l'homme de l'art sous l'appellation de HGMS (pour High Gradient Magnetic Separation) et utilise un dispositif consistant, par exemple, en un récipient ouvert, rempli d'une matrice de fibres ou de grains métalliques. Placé dans un champ magnétique externe, ce dispositif permet d'obtenir un gradient de champ très important à la surface même des fibres. Même des particules superparamagnétiques de dimensions restreintes peuvent être retenues sur un tel dispositif, pour peu que le réseau de fibres soit suffisamment resserré et que le trajet d'une particule l'amène au voisinage de la matrice. A titre d'exemple, de tels dispositifs sont décrits dans les docaments US-C-4,375,407, US-C-5,543,289, WO-A-96/26782, WO-A

96/26011 ou US-C-5,186,827, et des publications comme celle de B.L.

Hirschboin et al. (CHEMTECH, March 1982, pp 172-179). Des montages peuvent également être trouvés dans le commerce, par exemple, sous l'appellation MACS column chez Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Conformément à la présente invention, à titre d'exemple, le produit d'intérêt est un ligand, qui peut être un oligo-nocléotide de capture

d'un acide nucléique cible.

Préférentiellement, le produit d'intérêt est lié au support magnétique, sous forme de particules, par fonctionnalisation du support, puis liaison, par exemple liaison covalente, entre le support fonctionnalisé

et le produit d'intérêt.

A titre d'exemple, et comme décrit ci-après dans le protocole expérimental, le subjectile est une paroi d'un puits de micro-titration ou micro-analyse. Préférentiellement, et à titre d'exemple, le procédé selon l'invention s'inscrit dans une méthode d'isolement, par exemple de détermination d'un analyte, et en pareil cas le produit d'intérêt est un ligand spécifique de l'analyte, et le subjectile est par exemple la paroi d'un puits de micro-titration, tel qu'obtenu à l'issue d'un procédé selon

I' invention.

En pareil cas, on met donc en _uvre un dispositif d'isolement, S par exemple de détermination d'un analyte, comprenant ou incorporant au moins un puits dont au moins une partie de la paroi, par exemple son fond, constitue un subjectile pour lequel est déposé au moins un spot obtenu par

un procédé selon l'invention.

La présente invention est maintenant décrite par référence au dessin annexé, à caractère schématique et explicatif, dans lequel: - les Figures 1 et 2 représentent deux étapes d'un procédé de dépôt selon l'art antérieur, I'indice a étant réservé à une vue de dessus, et I'indice b étant réservé à une vue en coupe; la Figure 2c représente à échelle agrandie un détail A de la Figure 2a, - les Figures 3, 4 et 5 représentent trois étapes d'un procédé de dépôt selon la présente invention; comme précédemrnent, I'indice a est réservé à une vue de dessus, et l'indice b à une vue en coupe; la Figure 3c représente un détail B. à échelle agrandie de ia Figure 3b, - à titre d'exemple, les Figures 6a à 6c représentent le mode de formation et de pose d'une goutte, telle que requise par un procédé de

dépôt selon l'invention.

Conformément à l'art antérieur et aux Figures 1 et 2, il s'agit de déposer à l'état sec sur un subjectile (1) au moins une quantité prédéterminée d'au moins un produit d'intérêt, réparti à la surface (1a) du subjectile et circonscrit selon une aire élémentaire (3), de faible valeur, par

exemple ayant un diamètre de l'ordre de 0,3 mm.

Conformément à ce procédé antérieur: a) on prépare ou on dispose d'un milieu liquide (4), comprenant un véhicule, par exemple un solvant, et le produit d'intérêt (2) distribué S (dissout et/ou suspendu) de manière homogène dans le véhicule, b) à partir du milieu liquide, on forme par tous moyens appropriés, par exemple avec ceux décrits ci-après par référence à la Figure 6, une goutte (5) dont le volume est déterminé en correspondance avec la quantité prédéterminée du produit d'intérêt à déposer, et on pose cette goutte sur la surface (1a) du subjectile, en contact avec le milieu liquide (cf. Figure 1) c) on éiimine au moins partiellement, voire en totalité le véhicule de la goutte (5), alors qu'elle demeure sur la surface (1a) du subjectile (1), par exemple par séchage, en sorte de laisser subsister le spot (3), par exemple à l'état sec; comme montré à la Figure 2, en pratique ce spot a la forme d'un halo ou couronne, constitué par un amas du produit d'intérêt

À (2).

Comme montré par les Figures 6a à 6c, pour former la goutte (5) à partir du milieu liquide (4), on procède par exemple de la manière suivante: - on charge le milieu liquide (4) dans un réservoir (10), pourvu à son extrémité inférieure d'un orifice (12), de dimensions adaptées pour que le milieu (4) ne s'écoule pas par gravité, lorsque le réservoir (10) est au repos, - on provoque le déplacement du réservoir (10), à partir de sa position de départ (cf. Figure 6a), vers une position d'arrivée (cf. Figure 6b), déterminée par le contact entre la butée (11) (du côté du réservoir (10)) et le subjectile (1) - au moment o le déplacement du réservoir (10) est stoppé, le choc mécanique ainsi créé sur ce dernier permet d'extraire par l'orifice (12) une goutte du milieu iiquide (4), laquelle va se déplacer dans l'air avant de

se déposer sur le subjectile (1) (cf. Figure 6c).

La formation et le dépôt de la goutte peuvent être effectués selon tout procédé différent de celui précédemment décrit, par exemple par dépôt à partir d'un capillaire, par simple contact entre ce dernier contenant

le milieu liquide et le subjectile.

Selon l'invention, conformément aux Figures 3 à 5, et par différence au procédé selon l'art antérieur: 1 - on prépare ou on dispose d'un support magnétique (6), distribué sous forme de particules, de manière homogène, dans le véhicule (cf. Figure 3), 2 - on lie, par tous moyens appropriés, le produit d'intérêt (2) au support magnétique (6), moyennant quoi le milieu liquide (4), à partir duquel on forme la goutte (5), comprend des particules (7) de transport, distribuces dans le véhicule, chacune comprenant et le support magnétique

(6) et le produit d'intérêt (2) (cf. Figures 3a à 3c).

3 - au moins pendant l'élimination au moins partielle du véhicule de la goutte (5), on génère un champ magnétique (8), avec un aimant, choisi et positionné en sorte que le champ magnétique (8) traverse la surface (1a) du subjectile (1) selon une section (1c) comprenant, et donc plus large que l'aire de contact (1d) entre la goulte (5) et le subjectile (1) (cf. Figure 4a et 4b); après séchage, si nécessaire total, le spot (3) obtenu comprend les particules (7) de transport, à l'état sec. ces particules de transport étant uniformément réparties à l'intérieur du spot (3), comme

montré par les Figures 5a et 5b.

La présente invention et ses avantages sont mis en évidence par le protocole expérimental ci-après, avec la correspondance suivante entre le

vocabulaire des revendications et celui dudit protocole:

- les latex magnétiques sont un exemple, parmi d'autres, de support magnétique divisé sous formes de particules, - I'aimant utilisé génère le champ magnétique pour la mise en _uvre de l'invention, Ie fond de chaque puits de micro-titration constitue le subjectile, - I'analyte est une cible nacléique, par exemple un amplicon post RT-PCR, - le produit d'intérêt est un ligand, à savoir oligonucléotide de capture, immobilisable sur tout support par un couple réactif, à savoir streptavidine, biotine; cet oligonucléotide est spécifique, c'est-à-dire complémentaire à la cible nucléique, ou non spécifique de l'analyte précédemment exemplifié, - les particules de transport correspondent au produit de

conjugaison, ou conjugué, entre les particules magnétiques et l'oligo-

nucléotide de capture précité, - I'analyte lié à l'oligo-nucléotide de capture est détecté par tout moyen approprié, par exemple avec un réactif marqué se liant à l'analyte immobilisé Exemple 1: Dépôts de latex magnétiques. Influence de la

présence d'un aimant sous la surface de dépôt sur la morphologie du spot.

Préparation des latex magnétiques Une solution de latex magnétiques (diamètre = 300 nm, taux de solide = 0.1 %) est préparée dans un tampon borate 0.2M, pH 9.2, est disponible commercialement auprès de la Société française Ademtech, à

Pessac (France), sous la référence AD F11 2/E21 2E/P212.

Cette solution est introduite dans un dispositif tel que décrit par référence aux Figures 6a à 6c, adaptable sur une plaque de microtitration (Nunc Maxisorb, support en polystyrène, 96 puits). Ce système permet d'éjecter des gouttes vers le fond d'un puits, au travers d'une buse de 50 ,um de diamètre, après un trajet dans l'air d'environ 500,um. Dépôt sous champ magnétique Sous le fond du puits de cette plaque est déposé un aimant cylindrique, développant un champ magnétique, dont la tête cylindrique a une surface excèdant la section du puits (diamètre= 12 mm). Les latex sont déposés sous forme de spots au fond de la surface de ce puits, et laissés à

sécher pendant 10 minutes environ.

Dépôt sans champ mannétique Le même type de dépôt est réalisé en l'absence d'aimant sous le puits. Analvse Les dépôts sont analysés sous microscope optique au grossissement 5X, et en fond clair. Une image de chaque spot est acquise grâce à une caméra CCD branchée sur le tube du microscope. A chaque pixel de cette image est associé un niveau de gris, de O (noir) à 256 (blanc), d'autant plus faible que la densité de matière est importante Une coupe de section des spots permet ainsi de déterminer la répartition des

particules selon le mode de dépôt.

Résultats En l'absence d'aimant, les latex se repartissent préférentiellement à la périphérie du spot, sous forme de halo (à la manière de la Figure 2c), lors du séchage. On observe une très forte hétérogénaité de distribution des particules. En revanche, la présence d'un aimant sous la surface du dépôt, lors du séchage, et induisant une force d'attraction magnAtue perpendiculakement la surface, Ave le mouvement de convexlon des palcules vers le bord du spot. Une rAparDtlon unorme des

palcules est observe [sue du sAchage.

3 Des lavages intenss montrent que les spots ne sont pas affectAs et que les parcules sont adsorbes trAs fortement sur la surface Fsue du sAchage. Ceci permet de rdsoudre un point lmportant observA lors des dApOts de parcules non almantes: la couronne (ha10} qu'eNes forment en sAchant, peut Atre aache au cours des lavages, au polnt que cet anneau n'est plus que parteL Exe m ple 2: DAtecon de cibles nucldlques sur spots de parEcules magnAtiques. IntArAt du dApt de parcules magnAtlques par ppo un dApOt dicL D6n61 dErec1 Une solution de streptavidlne 1 mg/ml est prAparde en tampon bo[ate 0.2 pH9.2. CeHe-ci est dApose sous forme de spots dans plusleurs pults de plaque de mlcrotltration I'alde du dlsposlilf de dApt dAcrk prAcAdemment, et qulpA d'une tAte comprenant quatre caplakes permettant de dAposer simultanAment quatre spots dont le diamAtre avoIne 1 mm. Comme dlt plus haut, de te spots peuvent Atre obtenus par dpOt de gouttes, A parDr d'un slmple contact entre des tubes 23 capUlakes et le fond du pults. Les spots sont lass sAcher pendant 15

mutes, pu sont rincAs par une sotn de PBS-twean 0.05.

Immobisation des oUgonuclotdes de capture blotinylAs: 30 gl d'une soluton 5.10'5 coples/ml en tampon PBS d'oUgonuclAides spciflques {A} ou non spAclfiques {8} d'une clbles nuclA!que, et tous deux blotlnylAs en 5 sont lntrodults dans les pults fonctlonnallss. La rdacilon d'Immobilisation a lleu pendant 30 mlnutes 37 C sous agltation. Les

puRs sont ensuLe UncAs en tampon PBS-tween.

L'oUgonuc-de A a pour suence:

S'BIOTINE-TTG GAT TGG CCA TCC AGT

L'oligonucléotide B a pour séquence:

'BIOTINE-CAT GTG CTA CTT CAC CAA CGG

Dépôt nar l'intermédiaire de narticuies maqnétiques On part d'une émuision magnétique (Ademtech, Pessac, France

référence AD F11 2/E21 2E/P212).

Les particules de cette émuision sont ensuite fonctionnalisées en surface, par greffage covalent de sptréptavidine à l'aide d'un agent de

couplage hétérobifonctionnel, à savoir de carbodiimide.

Elles sont ensuite lavées par aimantation et reprises en tampon

PBS à un taux de solide de 0.2%.

Fixation des oligonucléotides biotinylés: 5.1 0'4 copies d'une solution d'oligonucléotides blotinylés spécifiques (A) ou non spécifiques (B) sont ajoutés à 100 pI de particules magnétiques-streptavidine. La résction d'immobilisation a lieu pendant 30 minutes à 37 C sous agitation. Les latex sont ensuite lavés par aimantation et repris en tampon borate, avant d'être déposés sous forme de spots dans les puits d'une microplaque avec le dispositif de dépôt capillaire décrit précédemment. Des aimants sont

placés sous certains des puits lors du dépôt et du séchage des spots.

Capture et détection sur spot de cibles nucléiques fluorescentes Un oligonucléotide cible ayant la séquence suivante:

'FITC-ACT GGA TGG ATC CAA

est donc marqué à son extrémité 5' par la fluorescéine, avec une concentration de 7.10'4 copies/ml. Cet oligonucléotide fluorescent est complémentaire ou non, respectivement des oligonocléotides A ou B. 30 l de cette solution sont déposés dans chacun des puits activés. La réaction d'hybridation a lieu pendant 30 minutes à 37 C sous agitation. Les puits sont ensuite rincés en tampon PBS-tween, puis en tampon PBS. Ils sont

À 2824001

analvss sous mroscope Duorescence en prdsence de 50 pI de P8S

dans chaque puks.

Rdsu11ats Cas du dApt direc1 Aucun signal de Duorescence n'a pu Atre dAtectd dans le cas du dApat dlct dans s condRions uNsdes 11 est pbableque qua6 de strptavldlne adsorbe sur la su[face de la mlcro-plaque est insufEsante

pour permettre ensulte une capture efcace des clbles marqudes.

Cas du dApt par lntermAdlake de paicuTes magnAtlques 13 Dans les deux cas, une image des spots fluorescents est obtenue en prdsence de FoNgonuclode spAcique. Cependant morphologie de l'image est trAs diffArente selon que le dApt alt eu lieu en

prdsence ou en absence de l'almant sous la mlcroplaque.

En Labsence d'aimant, on observe la mme rApalon h tArogAne du gnal que ceDe dAchie dans l'exemple 1 en l'absence d'aimant, c'est dire une concentratlon des parcules magndtlques et donc des ollgonuclolldes de caplure, lmportante Ia pAMphAhe de la goutte. En prAsence d'aimant, le slgnal Duorescent est repart unoAment Elntheur du spot gce la paion homogAne des

ses de capture.

Le signal gAndrA par le spot est analysA ralde d'un trakement dmage simple, qul consiste calculer le niveau de gr moyen [intArieur d'une fenAtre dflnle par l'utHateur. A chaque nlveau de gr n, est associA un nombre de pixel. Le nlveau de gAs moyen d'une fenAtre est difinl par:

N= É,P;

ÉPi Les niveaux de fluorescence générés sur les spots de particules

magnétiques ont ainsi été analysés.

s L'intérêt du dépôt de particules magnétiques sous champ magnétique apparat clairement. Il est possible dans ce cas de différentier nettement les spots " spécifiques >> des spots << non spécifiques >>, alors que ce n'est pas possible dans le cas des spots de particules non

aimantées.

Exemple 3: Détection d'amplicons post-RTPCR sur des spots de

latex magnétique.

Amplification des cibles nucléiques L'amplification d'ARN du poliovirus Sabin3 (7 kB), décrit par sa séquence dans GENBANK N X00596, est réalisée par RT-PCR (kit Access de Promega), en présence d'amorces biotinylées permettant l'obtention d'amplicons ADN marqués à leur extrémité 5' par la biotine. Les amplicons (200 bases), décrites selon la séquence ci-après, sont contrôlés (quantité et taille) sur gel d'agarose: cc tccggcccct gaatgcggct aattctaacc atggagcagg cagctgcaac ccagcagoca gcotgtcgta acgcgeaagt ccgtggcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttectt ttattctga atggctgat;t atggtgacaa teatagattg ttatcataaa gcgagttgga ktggccatcc agt Svnthèse des narticules mannétiques coniucuées à un oliconucléotide de capture 5.10'4 copies d'une solution d'oligonucléotide de caplure, complémentaire des produits PCR à détecter, sont ajoutés à 100 1li de particules magnétiques-streptavidine obtenues comme cela est décrit dans I'exemple 2. La réaction de capture a iieu pendant 30 minutes à 37 C sous agitation. Les latex sont ensuite lavés par aimantation et repris en tampon borate, avant d'être déposés sous forme de spots dans les puits d'une plaque de micro-titration avec le dispositif de dépôt capillaire précédemment décrit. Des aimants sont placés sous les puits avant le dépôt. Captu re d es am pl icons sur les spots de latex ma gnétiques Les amplicons sont dénaturés durant 5 minutes à 94 C, puis ajoutés dans les puits comprenant les spots de latex. La réaction d'hybridation a lieu pendant 30 minutes à 37 C sous agitation. Les puits

sont ensuite rincés en tampon PBS-tween.

Détection des produits PCR biotinylés Une solution de streptavidinefluoresccine à 0.1 mg/ml en PBS/tween/BSA 0.2% est préparée. 30 pI de cette solution sont ajoutés dans chaque puits. Des témoins non spécifiques sont obtenus sur des puits n'ayant pas subi l 'hybridation des produits PCR. L' incubation a lieu pendant minutes à 37 C sous agitation. Les puits sont ensuite rincés en tampon PBS-tween, puis en tampon carbonate d'ammonium avant d'être séchés

par jet d'air et analysés sous microscope à fluorescence.

Résultats Deux images montrent des spots obtenus respectivement en présence et en l'absence des amplicons. La première image montre un spot d'intensité homogène et relativement forte, qui prouve bien la présence i) d'une capture spécifique des amplicons sur les particules magnétiques de support et ii) d'une détection efficace de ces amplicons biotinylés par la streptavidine. Il est ici confirmé que l'utilisation de latex magnétiques aimantés permet d'obtenir une répartition uniforme des particules et donc du signal de détection à l'intérieur du spot, sans effet de couronne, ce qui simplifie considérablement l'analyse d'image nécessaire pour une

quantification de la fluorescence émise.

I9 Avec le procAd salon la prAsente inventlon, 11 est possible de dAposer plusieurs spots, juxtaposs mais sAparAs les uns des autres sur un mme support plan, comme est possible de superposer plusieurs spots les

3 uns sur les autres.

A tre lndlcat, s'agissant de la dAterminatlon molAculake d'un mat6del nuclAique, par exemple de tVpe bactAben, conformment au brevet hanga FR 2797 6gO (dont le contenu est incorporA prAsente descAption en tant que de besoinC chaque parUcule de transport assocle sous forme de comexe: - une parcule magn6Lque comprenant le support magnAque, un premier [gand (oUgo-nuclotide spAcique d'une cible nuclA!que), et un marqueur fluorophore - une parcule non magndque comprenant un support non magndque, et un autre marqueur Buorophore, constuant ensemble le produit d'intArAt, HA la cible nuclA!que par un second ligand (autre oligo nuclotide spcique, dans une autre rAgion, de la clble nuclAique) Le procAdA selon lnvenDon peut Atre m en uvre pour [impression ou le dApOt d'une peinture sur toute surface poskonnde dans

un champ magnue.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. ProcAdA de dAp61 sur un subjectHe {1) d'au molns une quant6 prAdAterminde d'au moins un produit dqntArAt (2), rApa[t 18 su[face (la) du subjectHe et cl[consc[h selon une ai[e AlAmentai[e (3) de falble valeu[, die spot, p[ocAd selon lequel: cn p[Apa[e ou on dpose d'un miLeu 1lqulde (4[ comp[enanl un vhicule et le produit d'IntArAt (2) d1ribuA de maniAre homogAne dans ledit vhloule, pair du miReu [qulUe, on rme une goe (5[ dont le volume est dAtermind en co [[espondance avec la q uanthA p[Ad Ate[min de d u p rod uit dntArAt dAposer, et on pose ladite goutte sur la surface (l a) du subiectile, en contact avec le milieu iiquide on Alimlne au moins en parDe le vhicuie de la goutte (5), alors qu'eHe demeure sur la surface (la) du subjecEle {1[ par exemple par sAchage, en sorte de laisser subsister ledlt spot (3) caracthsA en ce que, en comblnaison: on prApare ou on dispose d'un support magnACque (6[ distAbuA sous forme de particules, de manlAre homogAne, dans le vhicule, (D on De le produit d'intArAt (2) au suppo[t magnAque (aL moyennant quoi le mibeu "quide, pa[ duquel on forme la goe (5L compnd des pa[tcules (7) de t[anspo[t distbudes dans le vhicule, chacune comprenant et le support magnAtique (6) et le prodult d'lntrAt (2}, au moins pendant l'6[minaDon du vhicule de goulte (5[ on gAnAre un champ magnAtue (8) aversant su[face (la) du subiecle (1) selon une section (lc) comp[enant l'ake de contact (ld) ent[e la goutte (5) et le subjectUe (1L 6noyennant quo' le spot (3) obtenu comp[end les pa[tcules

33 (7) de transpo[t, et donc le p[oduit dntA[At (2).

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit d'intérêt (2) est un ligand, par exemple un oligonucléotide de capture d'un acide nucléique cible S

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le produit d'intérêt (2) est lié au support magnétique (6), sous formes de particules, par fonctionnalisation dudit support, puis liaison, par exemple liaison covalente, entre le support fonctionnalisé et le produit d'intérêt

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le subjectile (1) est une paroi d'un puits de micro-titration ou micro-analyse

5. Méthode d'isolement, par exemple de détermination d'un analyte, caractérisoe en ce que le produit d'intérêt (2) est un ligand spécifique d'un analyte, et on met en _uvre un subjectile susceptible d'être obtenu par un

procédé selon une quelconque des revendications 1 à 4.

6. Dispositif d'isolement, par exemple de détermination d'un analyte, caractérisé en ce qu'il comprend ou incorpore un puits dont au moins une partie de la paroi, par exemple son fond, constitue un subjectile sur lequel est déposé au moins un spot susceptible d'être obtenu par un procédé

selon l'une quelconque des revendications 1 à 4