WO1998037234A1 - Procede de caracterisation de duplex d'acide nucleique - Google Patents

Procede de caracterisation de duplex d'acide nucleique Download PDF

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WO1998037234A1
WO1998037234A1 PCT/FR1998/000340 FR9800340W WO9837234A1 WO 1998037234 A1 WO1998037234 A1 WO 1998037234A1 FR 9800340 W FR9800340 W FR 9800340W WO 9837234 A1 WO9837234 A1 WO 9837234A1
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WO
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duplex
force
dna
spacer arm
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PCT/FR1998/000340
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François HESLOT
Baptiste Essevaz-Roulet
Ulrich Bockelmann
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method allowing the demonstration of signatures corresponding to a specific double-stranded nucleic acid sequence.
  • the present invention relates to a method which makes it possible to accelerate or bypass the sequencing process of genomic DNA, a problem which is of considerable industrial interest.
  • the method according to the present invention allows the detection of specific signatures of a sequence on a long DNA fragment.
  • This method makes it possible in particular to quickly search for the presence of particular structures in the sequence of the bases and / or the quality of the pairings which may be partial and, in particular, present mismatches.
  • This process also allows the analysis and comparison of genomic differences among different patients.
  • the invention also applies to duplexes single-stranded DNA - single-stranded DNA, perfectly matched or not perfectly matched, or else to single-stranded DNA duplexes - single-stranded RNA, perfectly matched or not perfectly matched, or again to duplex single stranded RNA - single stranded RNA, perfectly matched or not perfectly matched.
  • the duplex can consist of at least partial re-pairing of two single strands from samples of different origins.
  • the invention also applies to the secondary structures of a single-stranded single DNA or of a single-stranded single RNA.
  • a “signature” allows to "characterize” a DNA sequence.
  • the pairing of bases G and C involves three hydrogen bonds, while the pairing of bases A and T only involves two, under these conditions, if we open the double helix d mechanically
  • the signal corresponding to the forces exerted depends on the sequence.
  • the implementation of the present invention has made it possible to demonstrate that the separation of two paired strands essentially results in the obtaining of a "signature", that is to say a set of specific and local information. which is linked to the sequence and / or to the pairing state.
  • the signal in force can present in particular sawtooth structures, with a gentle rise and a more abrupt descent, where the opening occurs partly by jerks.
  • the forces measured during opening therefore have a set of particular characteristics, or signature, a complex combination of the sequence where the zones rich in GC are harder to open than the zones rich in AT, and the mechanical stiffness of the system ( molecular construction and measurement system), which intervenes to induce events where several contiguous bases open more quickly.
  • a "signature” does not constitute a basic sequencing based on an entire sequence, but makes it possible to obtain a set of specific and local information, linked to the sequence and / or to the pairing state.
  • the molecules can be specifically anchored on two solid substrates (microscope slide, micro-pipette, microparticle). One end being fixed and the other being connected, for example via a particle, to a force measuring device.
  • Patent No. WO 94/23065 describes a device for measuring the force, base to base, during the mechanical opening of DNA using an atomic force microscope.
  • the present invention includes aspects relating to surface chemistry and particular constructions so as to obtain satisfactory results.
  • the present invention relates to a method for characterizing nucleic acid duplex comprising two at least partially matched nucleic acid sequences, characterized in that at least one "signature" of said duplex is recorded, which is linked to the variation of force necessary to mismatch, respectively mismatch, said two sequences, and in that comparing the signature obtained or certain characteristics thereof with references.
  • a reference can be constituted by another measurement, a combination of several measurements, or even by a numerical calculation, for example as that which will be described later, or even a combination previous cases.
  • nucleic acid duplex is meant to denote any type of DNA / RNA duplex as mentioned previously.
  • the present invention relates to a method characterized in that the 5 'end of one of the strands of the duplex is fixed on a support 1 and the 3' end of the other strand of the duplex is fixed on a support 2, the variation in force necessary to unpair, respectively pair, said sequences being measured by distance, respectively approximation, of said supports 1 and 2, characterized in that, during fixing, the point of attachment of the end 3 'on the support 2 and the attachment point of the end 5 ′ on the support 1 are connected together by a molecular wire with a length of at least 0.03 ⁇ m, and preferably between 0.5 and 30 ⁇ m.
  • the 5 'end of one of the strands of the duplex will be called “5' end of the duplex” and the 3 'end of the other strand of the duplex will be called “3 'end of the duplex", and in this definition, the strands can be reversed, of course.
  • molecular thread is meant both the distance counted on the molecule (it can be folded), for example the spacer arm (Mode I), as well as the spatial distance (measured in particular along the strands between the two fixing points (Mode II).
  • the supports 1 and 2 can also be interchanged in the following developments.
  • the method according to the invention is characterized in that the structure of the duplex is modified locally, in particular by the creation of a triplex, of a complex or of the binding of a protein.
  • a "well” is an element intended to contain a small volume of buffer and it can, with advantage, incorporate or contain one or more detachable elements or not called “slides”.
  • the "blade” is a solid element of a flexible or rigid nature and has the following particularities: a) At least part of this blade is in contact with an essentially aqueous pad, and at least a fraction of this part in contact can be functionalized on an area of at least 0.01 ⁇ m2, and preferably between 1 ⁇ m2 and 10 cm2.
  • the blade can advantageously be thin, flat and substantially transparent.
  • the slide can be a microscope slide, a polymer slide or a particle held by a micropipette.
  • a well can be advantageously designed so that it can receive a "micropipette".
  • a "micropipette” is a solid element, of flexible or rigid nature, one end of which can be fixed to a fixed or displacement system, and at least the other end of which is intended to be immersed in a liquid. It has a substantially elongated appearance and its characteristic diameter is greater than 0.01 ⁇ m, preferably between 0.1 ⁇ m and 2 mm, and it can advantageously be hollow.
  • the supports envisaged can be either slides, particles, micropipettes or an element of a force measuring device.
  • the manipulations are preferably carried out with specific molecular constructions, advantageously attached, respectively, between a slide for example, and microparticles, or else by fixing the ends on two particles.
  • This process essentially comprises two modes of implementation. More particularly, in the first mode (mode I) of implementing the method, it is a method in which the 3 ′ end of the duplex to be characterized
  • a spacer arm having a length of at least 0.03 ⁇ m, preferably between 0.5 and 30 ⁇ m.
  • one of the characteristics is that the DNA duplexes intended to be opened are not directly fixed on a support, but are by means of at least one spacer arm placed either on the support 1, either on support 2 or on both. Indeed, the use of a spacer arm makes it possible to select the place and / or the moment when the measurement is carried out. We can, for example, adapt to this type of molecular construction the selection and measurement technique used by Smith et al. (1996). You can also make multiple anchors on one blade.
  • the particles connected to the blade via a molecular construction have a certain freedom of movement.
  • the length of the spacer arm can be adapted with advantage over the spatial resolution of the system for locating the position of the balls.
  • a particle moves but is then blocked in its movement by the presence of the spacer arm.
  • the characteristics of this movement make it possible to select the interesting systems on which to launch a measurement cycle and in particular allow (i) to eliminate imperfect attachments, in particular if the particle begins to adsorb on the slide, or if the DNA begins to adsorb, the characteristics of the displacements will be more limited, and therefore different; (ii) during the somewhat abrupt phase of bonding a measuring micro-needle, the relative freedom of movement of the particle makes it possible to avoid tearing off the attachment points.
  • the spacer arm may be made up of double stranded DNA, from 100 to 500 bases, or approximately 0.03 ⁇ m to 0.2 ⁇ m, but preferably the spacer arm will correspond to 1 kb or even comprise from 5 to 100 kb, this who will match approximately at a clearance of 1.5 to 30 ⁇ m, but it is also possible to provide spacer arms which would not be made up of double stranded DNA, but which would be made up of other components of synthetic polymer type, of type protein, or other polymers, polysaccharides for example.
  • the sample under the microscope consists of: mobile, non-attached particles; particles stationary on the blade; particles with limited movement. Of course, only the latter particles are of interest.
  • the length of the spacer arm which makes it possible to identify the particles that can be the subject of a study.
  • the techniques intended to allow grafting on the ends of molecular constructions are known, they are essentially systems using a ligand / receptor association, or else covalent bonds.
  • the ends to be grafted are biotinilated or functionalized with a ligand such as dig, while glass slides for example, or the particles are coated respectively with avidin or streptavidin or an anti-dig antibody.
  • an interaction can be used:
  • the possible fixing of the particle or of the support on the force measurement device can be carried out by any means, in particular by bonding, as previously, but also by bonding or by magnetic influence using appropriate beads. More specific constructions will be described in the examples below.
  • the spacer arm can, of course, be placed either on the first support, a blade made up of a glass surface for example, but it is possible to provide a fixing on the particle by means of a spacer arm, in this case the method is characterized in that the 5 ′ end of the duplex to be characterized, respectively the 3 ′ end, is fixed to the support 2 by means of a spacer arm having a length of at least 0 , 03 ⁇ m, but preferably between 0.5 ⁇ m and 30 ⁇ m, in this case, one of the ends of the duplex can be fixed directly to the slide.
  • the support 2 is fixed at the 3 ′ end, respectively 5 ′, while the duplex to be characterized has been at least partially denatured and the ends of the two nucleic acid sequences mismatched comprising it have been partially spatially distant by a distance of at least 0.03 ⁇ m, preferably between 0.5 and 30 ⁇ m.
  • the free ends of the duplex are connected by a hairpin sequence, which makes it possible to denature the entire duplex. More specifically, - the duplex being blocked by a hairpin, each of the free ends is functionalized, for example with biotin and dig, then a particle comprising, for example, streptavidin, is fixed on the corresponding end, this ball is then immobilized by any means, mechanical for example (micro-pipette), the complex is then denatured and the assembly is placed in a stream of fluid, - the end not fixed on the ball moves away and a ball treated anti-dig is fixed for example on this end, the ball can be approached by any means, in particular optical tweezers.
  • the spacer arm will consist of double stranded DNA, for example a double stranded DNA from phage- ⁇ .
  • the DNA duplex (DNA 1) for which it is desired to obtain a signature according to the present invention must be connected to the spacer arm.
  • the duplex is digested with at least one restriction enzyme, which makes it possible to know the nature of its ends, sliced or cohesive, and in this case the cohesive sequence. It is then easy for those skilled in the art to attach the segment to the spacer arm (lambda DNA or the like), for example by a cassette-type system.
  • FIG. 2B is a cassette system of a spacer arm
  • DNA 2 is a double stranded DNA of phage- ⁇ , supplemented by
  • oligo 1 adapter system has a Cos sequence and is fixed by hybridization and ligation on DNA 2; oligo 2 is functionalized 3 'with biotin, it has a sequence complementary to a part of oligo 1 and can therefore be fixed there by simple hybridization, the free end of the duplex oligo 1-oligo 2 is chosen so that it is cohesive with the cleavage of DNA DNA-1 with a restriction enzyme.
  • the dig end is fixed on a support 1 and the biotin on a support 2.
  • the support 1 can be, for example, a glass coverslip coated with antidig
  • the support 2 can, for example, be a microbead coated with streptavidin.
  • the opening of DNA 1 can be obtained by moving the support relative to the ball, which pulls its 3 'strand linked to the ball, and its 5' strand linked to the coverslip. by the DNA 2 spacer arm.
  • DNA 2 spacer arm it is naturally possible to interchange the positions of the dig and biotin functionalizations.
  • a cassette assembly as just described by way of example can be an element of a diagnostic kit, so as to obtain the construction which allows opening, by a simple hybridization-ligation operation.
  • the oligo 2 connector may have a free unpaired region, close to the biotin, so as to facilitate the subsequent reaction with the microparticles.
  • the entire construction is linked by ligation steps after the various hybridization steps, leaving the possibility of opening the molecule at the biotinilated end.
  • ligands and receptors can be chosen, or else multiple ligands of the same type can be used in place of a single one (Cluzel et al., 1996; Strick et al., 1996) .
  • the spacer arm can be naturally placed, either between support 1 and DNA to be opened (example given here), or between DNA to be opened and support 2, or a combination of previous cases.
  • An additional element of the process is introduced with regard to the other end of the molecule to be opened.
  • This can be styled with a cohesive hairpin oligonucleotide (hairpin-oligo), which prevents the two strands from separating when reaching the end of the opening process. This makes it possible to repeat complete opening-closing cycles. It is also possible not to use this complementary element and to proceed with a partial opening while avoiding completely mismatching the duplex, which advantageously makes it possible to repeat partial opening-closing cycles.
  • the signature depends on the total stiffness of the system, that is to say of the measurement system and also on the molecular construction, in particular that of the single strands of the open molecule. We can advantageously vary this stiffness parameter to obtain different signatures for the same sequence.
  • the position of the clamp can be adjusted automatically by feedback to oppose the movements of the ball.
  • the variation in force during opening results in a variation in the position of the trap.
  • the intensity of the clamp can be controlled by feedback so as to keep the position of the ball fixed.
  • the variation of the force during the opening results in a variation of the intensity of the laser.
  • the present invention includes several measurement modes, possibly resulting in different types of signatures. It is therefore possible, for the same sequence, to accumulate several different signatures, the information of which may overlap and complement each other. 2) Stiffness of the single strands
  • the present invention includes the modification of the stiffness of the single strands (which are in series in the measurement) by introducing into the measurement buffer specific molecules known to modify the stiffness of the single strands .
  • oligonucleotides eg a population of random sequence
  • the temperature can be varied and / or the buffer used can be modified. In particular, it can be used with advantages
  • reagent any molecule capable of establishing a specific interaction with part of the duplex, whether the latter is open, closed or both open on certain parts and closed on others. Modification of the duplex or single strands is advantageously chosen to modify, locally and substantially, the force of separation of the strands, possibly even going so far as to completely block the opening.
  • one or more proteins characterized in that they are capable of specifically binding to the duplex for example on certain sequences (such as a methylation enzyme) or also on certain structures (such as the binding on a mismatch, with the Mut protein for example); such a link can also be used to position a particular reagent (attached to a protein) making it possible to induce an inter-strand "cross-link", with a photoactivatable group for example;
  • a reinforced inter-strand link for example by formation of a triple helix (with a sequence of oligonucleotides or their analogs); such a link can also be used to position a particular reagent (attached to the oligo) making it possible to induce an inter-strand "cross-link", with a photoactivable group for example;
  • the buffer used and / or the choice of temperature can also substantially modify the force necessary to unpair, respectively re-pair, the duplex.
  • additional molecules can be made to interact on the single strands of the partially open nucleic acid molecule, characterized in that they preferably bind to at least one specific site on a single strand; upon closing and / or reopening, the signature signal is then modified.
  • One or more signatures, with or without fingerprint, corresponding to a given duplex can be compared to references, constituted either by one or more measurements on another duplex, or to numerical calculations, or a combination of the two. It is thus possible to detect and locate the absence or the presence of one or more of the following elements given by way of example:
  • This method is an aid to sequencing. It also allows the analysis and comparison of genomic differences among different patients or different DNA samples to be tested.
  • the invention relates to a diagnostic kit intended for the implementation of the claimed method and which is described below.
  • the diagnostic kit is characterized in that it comprises one or more of the following elements: at least one spacer arm, at least one cassette arm molecular construction, at least one junction oligonucleotide, at least one hairpin oligonucleotide, at least one restriction enzyme, at least one molecular construct intended to fix the strands of the duplex to be opened on elements of the force measuring device, a support fixable at the functionalized end of the spacer arm.
  • Figure 1 illustrates, on an example, the principle of force measurement.
  • Double stranded DNA (5) is force open.
  • the single strand on one side of the double helix is connected to a solid substrate (microscope slide) (3) via a spacer arm (4) and the other single strand is grafted onto a microscopic ball ( 2).
  • a force measuring device for example flexible needle (1), optical clamp, etc.
  • the force is measured as a function of the extension of the molecule.
  • Figure 2 illustrates an example of molecular construction.
  • FIG. 3 shows a section in section of the sample.
  • a ring (6) retains a small volume of buffer liquid and the anchoring of the construction takes place on the glass strip (7), (a): balls glued to the surface, (b): examples of balls correctly attached.
  • - Figure 4 is a schematic view of the experimental setup.
  • the sample is placed on an inverted microscope connected to a video camera.
  • the force detector is a flexible glass needle (8) mounted on a micro-manipulator.
  • a computer is used to control displacement and acquire deflection data.
  • Figure 7 illustrates the comparison of the forces as a function of the signal of the end to end distance of the molecular construction A and A "1 , (defined below).
  • Figure 7B the two measurements are directly superimposed.
  • Figure 8 illustrates the average GC content along the phage ⁇ molecule.
  • Averaging is carried out on 200 bases (Figure 8C), on 1000 bases (Figure 8B) and on 2000 bases ( Figure 8A).
  • Figure 9 illustrates the comparison of the force measured during opening
  • FIG. 10 shows the reproducibility of the force signal for two measurements, at different times, on the same molecule, and at the same speed of movement (160 nm / sec).
  • FIG. 11 shows the detail of a force signal at low speed of movement (40 nm / sec), where the sawtooth structure is clearly seen.
  • - Figure 13 illustrates a digital calculation of the force signal for a DNA molecule of phage ⁇ . The horizontal axis is offset from the experimental measurements because the spacer arm is not included in the theoretical description.
  • - Figure 14 illustrates a set of theoretical results on the physics of the opening. From bottom to top, the deflection force, the average number ⁇ j> of open base pairs, and the variance of j are presented as a function of the displacement of the sample (in micrometers) which controls the opening process. The average GC content corresponding to the open sequence is plotted on the right (sliding average over 100 bases).
  • Figure 15 illustrates the effect of the stiffness of the lever and the single strands.
  • the average number ⁇ j> of open pairs has been plotted as a function of displacement (displacement scale given by the horizontal bar).
  • FIG. 16 illustrates a force measurement during the opening on the construction ⁇ , carried out with a stiffness lever 2.5 pN / ⁇ m approximately. The points are obtained experimentally by analysis III, described elsewhere. The force expressed in picoNewton was plotted as a function of the end-to-end distance expressed in micrometers.
  • FIG. 17 illustrates a force measurement during opening on the construction ⁇ , carried out at the same opening speed as for FIG. 16, and by the same measuring system but with a stiffness lever approximately 19 pN / ⁇ m.
  • the force expressed in picoNewton was plotted as a function of the end-to-end distance expressed micrometers.
  • FIG. 18 illustrates a superposition between the force signal obtained during opening, and the average G or C base content along a given segment of the sequence (from 3000 to 8000); the mean is a Gaussian mean, of total characteristic width at 1 / e of 50 bases. The curve giving the average is drawn with a solid line. The experimental curve is plotted with discrete points. Example of practical realization
  • Oligo 1 is a connecting element between DNA 1 (DNA from phage ⁇ intended to be opened) and DNA 2 (DNA from phage ⁇ which serves as a spacer arm).
  • Oligo 2, connector element is biotinylated 3 ', which is used for attachment to a ball.
  • Oligo 3 is functionalized 3 'dig and is used for attachment to the surface.
  • Oligo 4 is a cohesive mini hairpin.
  • Oligo 3 (functionalized 3 'dig) 5' ggg Cgg CgA CCT dig 3 'Oligo 4 (mini cohesive hairpin) 5' ggg Cgg CgA CCT AgC gAA AgC T 3 '
  • the preparation is carried out as follows, for example from 10 ⁇ g of DNA 1 and 10 ⁇ g of DNA 2:
  • the buffer used during the fusions below is the ligation buffer without ATP (Pharmacia).
  • the reaction volumes are typically 20 to 60 ⁇ l.
  • preparation A + oligo 1 that is to say preparation-C (molarity ratio: 1/20);
  • the purification steps are carried out by Amicon-100 filtration columns.
  • a plastic ring is glued to the paraffin on the microscope slide and keeps a small volume of buffer above the glass surface. This constitutes a well in which the measurements will be made.
  • the functionalized glass surface bottom of the well
  • the well is placed on an inverted microscope and the measurement of the forces is carried out using a flexible microneedle, introduced into the liquid through the free part of the meniscus.
  • an optical trap (Svoboda et al, 1993; Finer et al, 1994; Yin et al., 1996) can be used with advantage as a force sensor, instead of a micro-needle. Finally, care must be taken to avoid positively charged surfaces so as to avoid unwanted DNA adsorptions.
  • the balls used are Dyna commercial balls, paramagnetic (diameter 2.9 ⁇ m). These beads are coated with streptavidin and further treatment with an acetylating agent (NHS acetate) has been applied to them.
  • an acetylating agent NHS acetate
  • a very small reaction volume about 10 ⁇ l is created by the use of a small circular disc of thin glass (diameter 12 mm) which is placed inside the plastic ring of the well and serves as the cover.
  • the liquid approximately 10 ⁇ l
  • the disc is first added to the well and the disc then placed on top adheres by capillarity.
  • the liquid is found confined between the bottom of the well, on the one hand, and the circular coverslip, on the other hand; the liquid is distributed over the entire surface with an approximately uniform thickness of approximately 10 ⁇ m.
  • the incubation is then carried out in the covered well.
  • This enclosure contains a tube which generates UV, consisting of a low pressure mercury lamp (Heareus brand) generating UV over a wavelength range which partially covers the absorption band of the oxygen.
  • a low pressure mercury lamp Heareus brand
  • UV ultraviolet
  • the enclosure is swept by a current oxygen gas.
  • the taps are then closed and the lamp is turned on for one to several hours.
  • Ozone is created and helps to clean glass surfaces.
  • a gas flow is introduced for 5 minutes. It is oxygen bubbled through water.
  • the strips are quickly removed from the chamber and introduced into an airtight glass enclosure in which a few drops of silane have been placed. Silanization occurs by gas transfer.
  • the strips are put in an oven (typically 150 ° C. for one hour), then rinsed under a stream of water and stored in an aluminum foil pouch for example. From the coverslips, wells are made as described above.
  • a small volume of a mixture consisting of:
  • the acrylamide / maleic acid ratio is chosen from the range 10/1 to 5/1.
  • the polymerization is carried out in the wells, protected by their cover.
  • the strongly electronegative character makes it possible to effectively combat the adsorption of DNA, polyelectrolyte of negative charge.
  • an electronegative matrix obtained by fixing dextran, followed by a step of transformation of the sugars to obtain acid groups.
  • An electronegative matrix is characterized in that it consists of polymers of generally electronegative and hydrophilic character, attached to a support, the polymers can be random and / or branched, but on average consist of the assembly of at least one type of monomer.
  • the typical size of the polymers expressed in number of incorporated monomers is at least two, preferably between 10 and 1000 and possibly even up to a million, and the final matrix has a density of groups in a statistical or regular manner
  • -COOH at least greater than 1/1000 and preferably between 1/20 and 1/1.
  • the antidig (polyclonal, Boehringer Mannheim) is coupled by NH 2 groups to part of the COOH matrix using the techniques of EDC-
  • EDC 1-Ethyl-3- (3- Dimethyl-aminopropyl) -Carbodiimide as hydrochloride
  • NHSS Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide)) ; 10 seconds of rinsing under a stream of water; - 10 minutes of coupling with the antidig in PBS;
  • Antidig surfaces with an antimicrobial agent (0.02% NaN 3 ) and protected by a coverslip are placed in a bag with a humid atmosphere and can be stored for weeks in a refrigerator. While carrying out the experiments, the wells coated with anti-digest are rinsed with PBS, incubated with a dilution of molecular construction in PBS (typically 1 ng of construction in 10 ⁇ l) for 30 minutes. Dilutions and incubation pads can naturally be adapted. Then an excess of buffer is added and the beads coated with streptavidin are introduced. They sediment and react with the molecular construction on the surface of the microscope slide.
  • an antimicrobial agent 0.02% NaN 3
  • 0 to 50 attached beads are observed in a field of view, under the microscope with a 20X objective.
  • typically a fraction varying from 1/10 to 3/4 of the beads can be bonded or adsorbed.
  • surfaces other than glass, in particular polymeric materials can be used, both for the bottom of the well and for the cover. The latter can also be produced with other materials, a metal or a ceramic by way of nonlimiting example.
  • the force lever flexible glass micro-needle
  • Micro-needles are prepared (the typical dimensions of which are: diameter: 1 mm, diameter of the end: 1 ⁇ m and length 1 cm). The stiffness varies according to the needles and is calibrated (see following).
  • the needles are chemically biotinilized as follows: - washing with a sulfochromic mixture; - silanization (with a silane terminated by a primary amine); reaction with NHS-LC-biotin (Boehringer) (which reacts with primary amines).
  • the treated lever quickly adheres to microspheres coated with streptavidin by simply touching them. Force measurements can be made immediately. After measurement, the microbeads can be separated by mechanical shock to the lever, or by using a meniscus effect by simply lifting the lever out of the well and then plunging it back into the liquid.
  • the sample is placed on an inverted microscope comprising a large magnification objective (Zeiss Achroplan, oil immersion, x 100, NA 1.25).
  • the image of the ball and the flexible end of the lever is collected by a video camera.
  • a piezo translation plate allows lateral movement accuracy of the sample relative to the fixed base of the force lever. (Kinematic inversion is of course possible).
  • This displacement is measured with a resolution better than a micron using an inductive sensor
  • a computer makes it possible to connect the information on the displacement of the sample and the deflection of the lever which is recorded by a video camera, (the video image is captured by a digital acquisition system).
  • the forces involved in the DNA opening experiments are a few tens of PicoNewtons, which typically correspond to a displacement of the end of the lever of a few tens of microns.
  • Two types of methods were used to obtain this deflection data. In the low-resolution mode (called Analysis I), the deflection is determined at a resolution of approximately 0.2 ⁇ m, which corresponds to that of the pixels (digital image acquisition). A second, more sensitive mode was used (called Analysis II).
  • the method chosen is as follows: a single video line of the image is selected and selected so as to cover a section of the ball ; the video line has a gray background structure, on which is superimposed the strong and localized black-white-black modulation which corresponds to the ball.
  • a numerical method then allows with a resolution of the sub-pixel the interpolation of the position of the center of the ball. We can thus, from the video recording of the movements of the ball glued to the lever, go back to the deflection during the experiment, with a resolution of the order of twenty nanometers (Analysis II).
  • the piezoelectric displacement stage allows arbitrary displacement sequences as a function of time. Calibration of the stiffness of the levers
  • the micro-needle to be calibrated is first biotinilized as described above.
  • a paramagnetic bead (Dyna) is attached to the end of the microneedle in a well (without DNA) filled with buffer.
  • a small magnet is approached at a few tens or hundreds of microns, and the deflection of the end of the lever as a function of the distance between the ball and the magnet is measured.
  • the magnet is then moved to a position which corresponds to a small deflection.
  • the ball is then mechanically detached from the flexible lever using a second stiffer micro-needle controlled by micro-manipulation. The ball then moves quickly towards the magnet.
  • the force increases and corresponds to the linear extension of the three components in series, the spacer arm and the two single strands connected by the hairpin.
  • the characteristics of the opening are different: a force much greater than what is expected is observed just before the opening (this probably corresponds to partial adsorption of the beads on the double strand); sometimes the molecules do not open, even for forces greater than 50-pN; the end-to-end distance curve, as a function of the force, increases, although the opening is not complete; this blocking of the opening can be repeated or transient, this can be due to nodes or inter-strand links. Finer analysis of the force / distance curve
  • FIG. 11 is an example of a measurement part carried out at an average speed of 40 nm / sec.
  • the positions and amplitudes of these sawtooth patterns depend on the sequence. As described below, the birth of an instability can be induced by a very local variation of the GC content, inducing an opening blocking point, followed by an easier opening zone. After reaching the force threshold necessary to open a hard point, the elastic energy stored in the molecular construction and in the force measuring device will allow the opening point to move along the DNA, even when the position of the displacement stage is little changed. Qualitatively, these patterns are superimposed on a baseline which depends on the GC proportion of the sequence.
  • the number of saw teeth is typically 50, for the opening of a segment of 20 kb. This corresponds to an average sawtooth interval of around 400 bases. It has been noted that the descents of the saw teeth, observed at constant displacement, correspond to times greater than the characteristic response time of the lever. On the other hand, and remarkably, the characteristic amplitude of the smallest visible saw teeth is lower than the average level of vibration of the tip of the lever (subject to external disturbances: acoustic, seismic, etc.). The signature is therefore not too sensitive to mechanical disturbances during the measurement.
  • Figure 12 presents an additional example of the relationship between force signature and GC content (sliding average over 500 bases). The data correspond to a low speed measurement (20 nm / sec) of the central region poor in GC of A. We clearly see the correspondence between the two curves but the signature is not to be confused with simple averaging.
  • the signature of a given sequence corresponds to a problem of statistical physics, involving thermal agitation, stiffness, and pairing energies.
  • the average observable values can be calculated numerically from the partition function of the system.
  • Our model although simplified, highlights the essential characteristics observed experimentally.
  • the reference signature or signatures of a sequence can therefore be obtained either digitally or experimentally.
  • FIG. 13 is presented an example of calculation on the opening of the phage ⁇ (corresponding to the previous configuration ⁇ ).
  • Analysis III A third mode of force analysis (called Analysis III) has been developed and allows the acquisition of the live signal (Essevaz-Roulet et al ., 1997; Bockelmann et al., 1997). Analysis III is based on the same principle as analysis II defined above, but does not use the intermediary of video recordings on a video recorder.
  • the real-time video image of the ball and the lever is digitized live on a Macintosh computer equipped with a video input (Mac PPC8600), and specific image analysis software extracts the position of the the sink. This makes it possible to obtain a file with the deflection of the lever over time, and therefore the force exerted on the molecule during opening.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre au moins une 'signature' desdits duplex, qui est liée à la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce que l'on compare la signature obtenue avec des références.

Description

PROCEDE DE CARACTERISATION DE DUPLEX D'ACIDE NUCLEIQUE
La présente invention concerne un procédé permettant la mise en évidence de signatures correspondant à une séquence spécifique d'acide nucléique double brin.
Dans le domaine de l'analyse de séquence de l'ADN, la présente invention concerne un procédé qui permet d'accélérer ou de contourner le processus de séquençage de l'ADN génomique, problème qui présente un intérêt industriel considérable. Le procédé selon la présente invention permet la mise en évidence de signatures spécifiques d'une séquence sur un long fragment d'ADN. Ce procédé permet notamment de rechercher rapidement la présence de structures particulières dans la séquence des bases et/ou la qualité des appariements qui peuvent être partiels et, en particulier, présenter des mésappariements. Ce procédé permet aussi l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents patients. II est entendu que l'invention s'applique aussi à des duplex ADN simple brin - ADN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés, ou encore à des duplex ADN simple brin - ARN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés, ou encore à des duplex ARN simple brin - ARN simple brin, parfaitement appariés ou non parfaitement appariés. De plus, le duplex peut être constitué du réappariement au moins partiel de deux simples brins provenant d'échantillons d'origines différentes. Enfin, l'invention s'applique aussi aux structures secondaires d'un ADN simple brin unique ou d'un ARN simple brin unique.
Pour clarifier l'exposé, on utilise dans la suite l'exemple spécifique d'un ADN double brin, étant entendu que les généralisations ci-dessus sont facilement réalisables par simple développement des méthodes décrites.
Une "signature" permet de "caractériser" une séquence d'ADN.
A titre d'exemple, l'appariement des bases G et C implique trois liaisons hydrogènes, tandis que l'appariement des bases A et T n'en implique que deux, dans ces conditions, si l'on ouvre mécaniquement la double hélice d'ADN en tirant séparément les extrémités de deux brins d'un même côté d'une molécule isolée d'ADN, on peut s'attendre à ce que le signal correspondant aux forces excercées dépende de la séquence.
Ainsi, la mise en oeuvre de la présente invention a permis de démontrer que la séparation de deux brins appariés se traduit essentiellement par l'obtention d'une "signature", c'est-à-dire un ensemble d'informations spécifiques et locales qui est relié à la séquence et/ou à l'état d'appariement.
De façon inattendue, lors de l'ouverture d'un duplex, le signal en force peut présenter notamment des structures en dents de scie, avec une montée douce et une descente plus abrupte, où l'ouverture se produit en partie par saccades. Les forces mesurées lors de l'ouverture présentent donc un ensemble de caractéristiques particulières, ou signature, combinaison complexe de la séquence où les zones riches en GC sont plus dures à ouvrir que les zones riches en AT, et de la raideur mécanique du système (construction moléculaire et système de mesure), qui intervient pour induire des événements où plusieurs bases contiguës s'ouvrent plus rapidement.
En modifiant la raideur mécanique du système, on peut accentuer (à faible raideur), ou diminuer (à forte raideur) les effets d'instabilité et obtenir un ensemble de signatures pour une même séquence.
Ainsi, une "signature" ne constitue pas un séquençage base à base de toute une séquence, mais permet d'obtenir un ensemble d'informations spécifiques et locales, reliées à la séquence et/ou à l'état d'appariement.
Les mesures de force sur des molécules isolées d'ADN constituent actuellement un domaine très actif (voir références 1 à 1 1). Pour une gamme de forces s' étendant du subpicoNewton jusqu'à des dizaines de picoNewtons, lesquelles forces sont typiquement mises en jeu dans les interactions moléculaires faibles, des dispositifs de mesure de forces sensibles tels que les pinces optiques (Svoboda et al., 1993 ; Yin et al., 1996) ou les micro-aiguilles souples sont de plus en plus utilisés.
Dans une configuration typique destinée à ouvrir l'ADN, les molécules peuvent être spécifiquement ancrées sur deux substrats solides (lame de microscope, micro-pipette, microparticule). L'une des extrémités étant fixée et l'autre étant connectée par exemple par l'intermédiaire d'une particule, à un dispositif de mesure de force.
Le brevet n° WO 94/23065 décrit un dispositif pour mesurer la force, base à base, lors de l'ouverture mécanique de l'ADN en utilisant un microscope à force atomique.
Cependant, la résolution base à base se heurte à des limitations fondamentales liées au bruit thermique (Thompson al., 1995 ; Viovy et al, 1994).
Par ailleurs, la réalisation pratique de l'ouverture présente des difficultés de mise en œuvre, notamment : - le dessin de la construction moléculaire,
- la chimie des surfaces et leur préparation,
- la façon de sélectionner l'endroit où l'on fait la mesure.
En particulier, il est crucial pour effectuer ces expérimentations de réduire: - le niveau d'adsorption de la molécule à l'étude sur les surfaces (lame de microscope ou particule) ; - les interactions adhésives entre les particules et entre les particules et les surfaces.
Finalement comme une seule mesure peut prendre quelques dizaines de minutes, il est nécessaire d'avoir un mécanisme de sélection très efficace pour identifier macroscopiquement les points les plus intéressants de façon à effectuer les mesures en dépit du fait que la chimie des surfaces est imparfaite, et bien entendu, du fait que les constructions en elles-mêmes peuvent être imparfaites.
La présente invention inclut les aspects concernant la chimie des surfaces et les constructions particulières de façon à obtenir des résultats satisfaisants.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre au moins une "signature" desdits duplex, qui est liée à la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce que l'on compare la signature obtenue ou certaines caractéristiques de celle-ci avec des références.
Il est entendu, à titre d'exemple, qu'une référence peut être constituée par une autre mesure, une combinaison de plusieurs mesures, ou encore par un calcul numérique, par exemple comme celui qui sera décrit par la suite, ou encore une combinaison des cas précédents.
Par "duplex d'acide nucléique" on entend désigner n'importe quel type de duplex ADN/ ARN comme cela a été mentionné précédemment.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé caractérisé en ce que l'extrémité 5' de l'un des brins du duplex est fixée sur un support 1 et l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex est fixée sur un support 2, la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement apparier, lesdites séquences étant mesurées par éloignement, respectivement rapprochement, desdits supports 1 et 2, caractérisé en ce que, lors de la fixation, le point de fixation de l'extrémité 3' sur le support 2 et le point de fixation de l'extrémité 5' sur le support 1 sont reliés ensemble par un fil moléculaire d'une longueur d'au moins 0,03 μm, et de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm.
Dans le cadre de la présente invention, et pour clarifier les notations, l'extrémité 5' de l'un des brins du duplex sera appelée "extrémité 5' du duplex" et l'extrémité 3' de l'autre brin du duplex sera appelée "extrémité 3' du duplex", et, dans cette définition, les brins peuvent être inversés, bien entendu.
Par "fil moléculaire", on entend désigner aussi bien la distance comptée sur la molécule (celle-ci pouvant être repliée), par exemple le bras espaceur (Mode I), que la distance spatiale (mesurée notamment le long des brins entre les deux points de fixation (Mode II).
Les supports 1 et 2 peuvent également être interchangés dans les développements qui suivent.
Avantageusement, le procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce qu'on modifie localement la structure du duplex, notamment par la création d'un triplex, d'un complexe ou de la fixation d'une protéine.
Sont définis ci-après quelques termes qui seront ensuite utilisés conformément à leur définition respective. Les expériences étant réalisées dans un tampon, un "puits" est un élément destiné à contenir un petit volume de tampon et il peut, avec avantage, incorporer ou contenir un ou plusieurs éléments détachables ou non appelés "lames". La "lame" est un élément solide de nature flexible ou rigide et présente les particularités suivantes : a) Une partie au moins de cette lame est en contact avec un tampon essentiellement aqueux, et une fraction au moins de cette partie en contact est fonctionnalisable sur une surface d'au moins 0,01 μm2, et de préférence entre 1 μm2 et l0 cm2. b) La lame étant en place dans le puits, on peut approcher, pour obtenir une image de la partie fonctionnalisable en contact avec le tampon, soit un objectif de microscope à immersion en milieux aqueux, soit un objectif de microscope à immersion dans l'huile et, en ce cas, la lame peut avec avantage être mince, plane et substantiellement transparente.
A titre d'exemple particulier, la lame peut être une lamelle de microscope, une lamelle de polymère ou une particule maintenue par une micropipette.
Un puits peut être conçu avec avantage de façon à pouvoir recevoir une "micropipette".
Une "micropipette" est un élément solide, de nature flexible ou rigide, dont on peut fixer une extrémité sur un système fixe ou de déplacement, et dont au moins l'autre extrémité est destinée à être immergée dans un liquide. Elle est d'aspect substantiellement allongé et son diarnètre caractéristique est supérieur à 0,01 μm, de préférence entre 0,1 μm et 2 mm, et elle peut avec avantage être creuse. Les supports envisagés peuvent être aussi bien des lames, des particules, des micropipettes ou un élément d'un appareil de mesure de force.
Dans le procédé selon la présente invention, les manipulations sont réalisées, de préférence, avec des constructions moléculaires spécifiques, attachées avec avantage, respectivement, entre une lame par exemple, et des microparticules, ou bien par fixation des extrémités sur deux particules.
Ce procédé comporte essentiellement deux modes de mise en oeuvre. Plus particulièrement, dans le premier mode (mode I) de mise en oeuvre du procédé, il s'agit d'un procédé dans lequel l'extrémité 3' du duplex à caractériser
(respectivement l'extrémité 5') est fixée sur l'un des supports par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm.
Dans ce procédé, l'une des caractéristiques est que les duplex d'ADN destinés à être ouverts ne sont pas directement fixés sur un support, mais le sont par l'intermédiaire d'au moins un bras espaceur placé soit sur le support 1, soit sur le support 2, soit sur les deux. En effet, l'utilisation d'un bras espaceur permet de sélectionner l'endroit et/ou le moment où on effectue la mesure. On peut, par exemple, adapter à ce type de construction moléculaire la technique de sélection et de mesure utilisée par Smith et al. (1996). On peut aussi réaliser des ancrages multiples sur une lame.
Dans ces conditions, les particules reliées à la lame par l'intermédiaire d'une construction moléculaire ont une certaine liberté de mouvement. Bien entendu, la longueur du bras espaceur peut être adaptée avec avantage par rapport à la résolution spatiale du système de repérage de la position des billes.
Lorsqu'on applique simplement une force faible sur les particules, l'ADN ne va pas s'ouvrir, et l'on va pouvoir constater le mouvement caractéristique suivant :
Une particule se déplace mais est ensuite bloquée dans son déplacement par la présence du bras espaceur. Les caractéristiques de ce mouvement permettent de sélectionner les systèmes intéressants sur lesquels lancer un cycle de mesure et permettent notamment (i) d'éliminer les attachements imparfaits, en particulier si la particule commence à s'adsorber sur la lame, ou si l'ADN commence à s'adsorber, les caractéristiques des déplacements seront plus limitées, et donc différentes ; (ii) lors de la phase un peu brutale de collage d'une micro-aiguille de mesure, la relative liberté de mouvement de la particule permet d'éviter l'arrachement des points d'attache. Le bras espaceur pourra être constitué d'ADN double brin, de 100 à 500 bases, soit environ 0,03 μm à 0,2 μm, mais de préférence le bras espaceur correspondra à 1 kb ou même comportera de 5 à 100 kb, ce qui correspondra environ à un débattement de 1,5 à 30 μm, mais il est possible également de prévoir des bras espaceurs qui ne seraient pas constitués d'un ADN double brin, mais qui seraient constitués par d'autres composants de type polymère synthétique, de type protéique, ou bien d'autres polymères, polysaccharidiques par exemple. Ainsi, juste avant la mesure, l'échantillon se trouvant sous le microscope consiste en : des particules non attachées mobiles ; des particules immobiles sur la lame ; des particules avec un mouvement limité. Bien entendu, seules ces dernières particules présentent de l'intérêt.
Afin d'améliorer la sélection de ces particules, il est possible de leur appliquer, soit un gradient de champ magnétique, en particulier un aimant, si on a choisi des particules sur lesquelles un gradient magnétique exerce une force, soit un champ de type fluidique, soit un champ électrique, soit un gradient de champ électrique. Et l'on choisit à ce moment les particules qui ont une zone de déplacement qui correspond à l'extension attendue du bras espaceur en l'absence de fixations non désirées du bras espaceur ou de la séquence d'ADN avec la surface ou avec les particules elles-mêmes.
De façon générale, on connait la longueur du bras espaceur, ce qui permet de repérer les particules pouvant faire l'objet d'une étude. Les techniques destinées à permettre le greffage sur les extrémités de constructions moléculaires sont connues, il s'agit essentiellement de systèmes utilisant une association ligand/récepteur, ou encore de liaisons covalentes. De préférence, les extrémités à greffer sont biotinilées ou fonctionnalisées avec un ligand tel que dig, tandis que les lames de verre par exemple, ou les particules sont revêtues respectivement avec de l'avidine ou de la streptavidine ou un anticorps antidig.
De façon générale, pour fixer l'extrémité de la séquence d'acide nucléique au support on peut utiliser une interaction :
- covalente - antigène / anticorps
- ligand / récepteur
- avidine ou streptavidine / biotine. La fixation éventuelle de la particule ou du support sur le dispositif de mesure de force pourra être réalisée par tout moyen, notamment par liaison, comme précédemment, mais également par collage ou par influence magnétique en utilisant des billes appropriées. Des constructions plus spécifiques seront décrites dans les exemples ci- après.
Le bras espaceur peut, bien entendu, être placé ou bien sur le premier support, une lame constituée d'une surface de verre par exemple, mais il est possible de prévoir une fixation sur la particule par l'intermédiaire d'un bras espaceur, dans ce cas le procédé est caractérisé en ce que l'extrémité 5' du duplex à caractériser, respectivement l'extrémité 3', est fixée sur le support 2 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 μm, mais de préférence comprise entre 0,5 μm et 30 μm, dans ce cas, l'une des extrémités du duplex peut être fixée directement sur la lame. Afin d'améliorer encore le procédé, il est possible de prévoir l'utilisation de deux bras espaceurs, l'un par rapport à la surface ou support 1, l'autre par rapport à la particule ou support 2.
Dans le second mode de réalisation (mode II), le support 2 est fixé à l'extrémité 3', respectivement 5', alors que le duplex à caractériser a été au moins partiellement dénaturé et que les extrémités des deux séquences d'acide nucléique désappariées le comportant ont été partiellement éloignées spatialement d'une distance d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm.
De préférence, les extrémités libres du duplex sont reliées par une séquence en épingle à cheveux, ce qui permet de dénaturer l'ensemble du duplex. De façon plus spécifique, - le duplex étant bloqué par une épingle à cheveux, on fonctionnalise chacune des extrémités libres, par exemple avec de la biotine et du dig, puis on fixe une particule comportant, par exemple, de la streptavidine, sur l'extrémité correspondante, cette bille est alors immobilisée par un moyen quelconque, mécanique par exemple (micro-pipette), on dénature alors le complexe et on place l'ensemble dans un courant de fluide, - l'extrémité non fixée sur la bille s'éloigne et on fixe par exemple une bille traitée anti-dig sur cette extrémité, la bille peut être approchée par tout moyen, notamment des pinces optiques.
Dans le mode I préféré de réalisation, le bras espaceur sera constitué d'un ADN double brin, par exemple d'un ADN double brin provenant du phage-λ. Le duplex d'ADN (DNA 1) dont on souhaite obtenir une signature selon la présente invention doit être relié au bras espaceur. De préférence, le duplex est digéré par au moins une enzyme de restriction, ce qui permet de connaître la nature de ses extrémités, tranchée ou cohésive, et en ce cas la séquence cohésive. II est ensuite aisé pour l'homme de l'art d'attacher le segment au bras espaceur (ADN lambda ou autre), par exemple par un système de type cassette.
Un exemple de réalisation est donné sur la figure 2B qui est un système cassette de bras espaceur, DNA 2 est un ADN double brin du phage-λ, complété par
(i) fonctionnalisation dig d'un côté : ceci est réalisé, par exemple, à l'aide de oligo 3, qui est une séquence Cos fonctionnalisée dig en 3' et est attachée de façon covalente par hybridation puis ligation ;
(ii) le système d'adaptateurs oligo 1 et oligo 2 : oligo 1 a une séquence Cos et est fixé par hybridation et ligation sur DNA 2 ; oligo 2 est fonctionnalisé 3' avec de la biotine, il possède une séquence complémentaire d'une partie d'oligo 1 et peut donc s'y fixer par simple hybridation, l'extrémité libre du duplex oligo 1-oligo 2 est choisie de façon à ce qu'elle soit cohésive avec la coupure de l'ADN DNA-1 avec une enzyme de restriction.
Par hybridation puis ligation, on obtient une liaison covalente des deux brins 3' et 5' d'une extrémité de DNA 1 : le brin 3' sur oligo 2 et le brin 5' sur oligo 1.
Dans la construction finale, on fixe l'extrémité dig sur un support 1 et la biotine sur un support 2. Le support 1 peut être, par exemple, une lamelle de verre recouverte d'antidig, et le support 2 peut, par exemple, être une microbille recouverte de streptavidine.
L'ouverture de DNA 1 peut être obtenue en déplaçant le support par rapport à la bille, ce qui tire son brin 3 ' lié à la bille, et son brin 5' lié à la lamelle par le bras espaceur DNA 2. Dans cet exemple, on peut naturellement interchanger les positions des fonctionnalisations dig et biotine.
Un ensemble cassette tel qu'il vient d'être décrit à titre d'exemple peut être un élément d'une trousse de diagnostic, de façon à obtenir la construction qui permet l'ouverture, par une simple opération d'hybridation-ligation.
A titre d'exemple, on décrit une telle technique, appliquée à l'ouverture de l'ADN du phage lambda (DNA 1, figure 2), avec un bras espaceur constitué par l'ADN double brin d'un phage lambda (DNA 2, figure 10).
Dans la construction finale, le connecteur oligo 2 peut avoir une région non appariée libre, près de la biotine, de façon à faciliter la réaction ultérieure avec les microparticules. L'ensemble de la construction est lié par des étapes de ligation après les différentes étapes d'hybridation, laissant la possibilité d'ouvrir la molécule à l'extrémité biotinilée. Naturellement, d'autres combinaisons de ligands et de récepteurs peuvent être choisies, ou encore de multiples ligands d'un même type peuvent être utilisés à la place d'un seul (Cluzel et al., 1996 ; Strick et al., 1996).
Enfin, le bras espaceur peut être naturellement placé, soit entre support 1 et ADN à ouvrir (exemple donné ici), soit entre ADN à ouvrir et support 2, soit une combinaison de cas précédents. Un élément complémentaire du procédé est introduit en ce qui concerne l'autre extrémité de la molécule à ouvrir. Celui-ci peut être coiffé avec un oligonucléotide en épingle à cheveux cohésive (hairpin-oligo), ce qui évite que les deux brins se séparent lorsque l'on atteint la fin du processus d'ouverture. Ceci permet de répéter des cycles complets d'ouverture-fermeture. On peut aussi ne pas utiliser cet élément complémentaire et procéder à une ouverture partielle en évitant de désapparier complètement le duplex, ce qui permet avantageusement de répéter des cycles partiels d'ouverture-fermeture.
Modification de signature
Comme on le verra dans la suite, la signature dépend de la raideur totale du système, c'est-à-dire du système de mesure et aussi de la construction moléculaire, notamment celle des simples brins de la molécule ouverte. On peut avec avantage varier ce paramètre de raideur pour obtenir des signatures différentes pour une même séquence.
1 ) Raideur du système de mesure S'agissant du levier, il est facile de changer pour des leviers de raideur différente. Dans le cas d'une mesure par pince optique, ceci peut être obtenu, par exemple, par simple modification de l'intensité ou de la position du laser de piégeage. Naturellement d'autres modes de fonctionnement, notamment avec rétroaction (par exemple Finer et al, 1994 ; Svoboda et al., 1993 ; Yin et al., 1996), peuvent être utilisés avec avantage.
On donne deux exemples :
(i) Dans un de ces cas, la position de la pince peut être ajustée automatiquement par rétroaction pour s'opposer aux déplacements de la bille. La variation de la force lors de l'ouverture se traduit par une variation de la position du piège.
(ii) Dans l'autre exemple, l'intensité de la pince peut être contrôlée par rétroaction de façon à garder fixe la position de la bille. La variation de la force lors de l'ouverture se traduit par une variation de l'intensité du laser. En conclusion, la présente invention inclut plusieurs modes de mesures, se traduisant éventuellement par différents types de signatures. On peut donc pour une même séquence accumuler plusieurs signatures différentes dont les informations peuvent se recouper et se compléter. 2) Raideur des simples brins Dans le même esprit, la présente invention inclut la modification de la raideur des simples brins (qui sont en série dans la mesure) en introduisant dans le tampon de mesure des molécules particulières connues pour modifier la raideur des simples brins.
Notamment, il existe de nombreuses protéines qui ont une affinité pour les simples brins, comme recA ou SSBP (Single Strand Binding Protein), et qui peuvent augmenter la raideur des simples brins. De même, des oligonucléotides (par exemple une population de séquence aléatoire) peuvent aussi être utilisés.
Autres conditions expérimentales envisageables
Il peut être utile de varier les conditions expérimentales pour obtenir des signatures différentes sur la même molécule. Ainsi, on peut varier la température et/ou modifier le tampon utilisé. En particulier, on peut utiliser avec avantages
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA EP certains tampons spécifiques pour avoir une action sur la stabilité des appariements entre bases (par exemple, Rees, 1993).
Modification du duplex ou des simples brins
On peut induire en certains points de la signature des marques particulières, ou empreintes. Celles-ci sont obtenues en ouvrant une molécule modifiée par adjonction de réactif. Par le terme "réactif, on entend ici toute molécule capable d'établir une interaction spécifique avec partie du duplex, que celui-ci soit ouvert, fermé ou à la fois ouvert sur certaines parties et fermé sur d'autres. La modification du duplex ou des simples brins est choisie avec avantage pour modifier, de façon locale et substantielle, la force de séparation des brins, pouvant même aller jusqu'à un blocage complet de l'ouverture.
Sans pour autant s'y limiter, on donne ci-dessous quelques exemples avec :
A) - l'introduction d'une liaison plus forte en une ou plusieurs zones particulières de la séquence ; ceci conduit dans la signature à une ou plusieurs montées caractéristiques, quand le point d'ouverture moyen atteint ces zones ;
- l'introduction d'une ou plusieurs protéines caractérisées en ce qu'elles sont capables de se fixer de façon spécifique sur le duplex, par exemple sur certaines séquences (telle une enzyme de méthylation) ou encore sur certaines structures (telles la fixation sur un mésappariement, avec la protéine Mut par exemple) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner un réactif particulier (attaché à une protéine) permettant d'induire un "cross-link" inter-brin, avec un groupement photoactivable par exemple ;
- l'introduction d'une liaison inter-brin renforcée, par exemple par formation de triple hélice (avec une séquence d'oligonucléotides ou de leurs analogues) ; une telle liaison peut également être utilisée pour positionner un réactif particulier (attaché à l'oligo) permettant d'induire un "cross-link" inter-brin, avec un groupement photoactivable par exemple ;
- le tampon utilisé et/ou le choix de la température peuvent également modifier de façon substantielle la force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, le duplex. B) on peut faire interagir sur les simples brins de la molécule d'acide nucléique partiellement ouverte des molécules additionnelles caractérisées en ce qu'elles se fixent de préférence sur au moins un site spécifique sur un simple brin ; lors de la refermeture et/ou réouverture, le signal de la signature est alors modifié. Utilisations des signatures
Une ou plusieurs signatures, avec empreinte ou non, correspondant à un duplex donné, peuvent être comparées à des références, constituées soit par une ou plusieurs mesures sur un autre duplex, soit à des calculs numériques, soit une combinaison des deux. On peut ainsi détecter et localiser l'absence ou la présence d'un ou plusieurs des éléments suivants donnés à titre d'exemple :
- homologie, translocation, délétion, - amplification, des régions de répétition homologue,
- zone d'appariement partiel, motif particulier de la séquence, différence, - mutation, contigation, une région particulière, identifiable par son contenu GC, un ilôt CpG.
Cette méthode constitue une aide au séquençage. Elle permet aussi l'analyse et la comparaison des différences génomiques parmi différents patients ou différents échantillons d'ADN à tester.
L'invention concerne, enfin, un coffret de diagnostic destiné à la mise en oeuvre du procédé revendiqué et qui est décrit ci-dessous.
Le coffret de diagnostic est caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des éléments suivants : au moins un bras espaceur, au moins une construction moléculaire cassette de bras espaceur, au moins un oligonucléotide de jonction, au moins un oligonucléotide en épingle à cheveux, au moins une enzyme de restriction, au moins une construction moléculaire destinée à fixer les brins du duplex à ouvrir sur des éléments de l'appareil de mesure de force, un support fixable à l'extrémité fonctionnalisée du bras espaceur. au moins un puits, au moins une lame, au moins un type de billes fonctionnalisées et avantageusement aimantables, destinées à être attachées à un élément fonctionnalisé du duplex à ouvrir, au moins un aimant, au moins un tampon, au moins une enzyme de ligation, - au moins un tampon de ligation, au moins une colonne de séparation par centrifugation. La figure 1 illustre, sur un exemple, le principe de la mesure de la force. Un ADN double brin (5) est ouvert en force. Le simple brin d'un côté de la double hélice est connecté à un substrat solide (lamelle de microscope) (3) par l'intermédiaire d'un bras espaceur (4) et l'autre simple brin est greffé sur une bille microscopique (2). La bille est visible sous le microscope et permet de localiser la molécule. Un dispositif de mesure de force (par exemple aiguille souple (1), pince optique, etc.) est connecté à la bille choisie. La force est mesurée en fonction de l'extension de la molécule. - La figure 2, A et B, illustre un exemple de la construction moléculaire.
- La figure 3 représente une section en coupe de l'échantillon. Un anneau (6) retient un petit volume de liquide tampon et l'ancrage de la construction a lieu sur la lamelle de verre (7), (a) : billes collées sur la surface, (b) : exemples de billes correctement attachées. - La figure 4 est une vue schématique du montage expérimental. L'échantillon est posé sur un microscope inversé relié à une caméra vidéo. Le détecteur de force est une aiguille de verre flexible (8) montée sur un micro-manipulateur. Une fois que le levier (fixé à sa base) est attaché, à son extrémité souple, à une construction moléculaire, le puits est déplacé latéralement et la déflexion correspondante de l'extrémité du levier est mesurée sur la vidéo. Un ordinateur (PC) est utilisé pour contrôler le déplacement et acquérir les données de déflexion.
- La figure 5 rend compte de ce que la force (déflexion du levier) est une fonction de la "distance extrémité à extrémité" pendant l'extension de la construction moléculaire.
- La figure 6 rend compte de données relatives à la force en fonction de la distance extrémité à extrémité pour trois mesures (A, B, C) de la même molécule utilisant des vitesses de translation variées. Une structure à l'intérieur du plateau apparaît plus clairement quand la translation est lente (figure 6A).
- La figure 7 illustre la comparaison des forces en fonction du signal de la distance extrémité à extrémité de la construction moléculaire A et A"1, (défini plus loin). La vitesse de translation utilisée dans ces mesures d'ouverture est d'environ V = 0,06 μms-1. Au niveau de la figure 7B, les deux mesures sont directement superposables.
La figure 8 illustre la teneur moyenne en GC le long de la molécule du phage λ.
Un moyennage est réalisé sur 200 bases (figure 8C), sur 1 000 bases (figure 8B) et sur 2 000 bases (figure 8A).
La figure 9 illustre la comparaison de la force mesurée pendant l'ouverture
(figure 9A) et la fermeture (figure 9B) de la même molécule à la même vitesse de translation.
La figure 10 montre la reproductibilité du signal de force pour deux mesures, à des instants différents, sur la même molécule, et à la même vitesse de déplacement (160 nm/sec).
La figure 11 montre le détail d'un signal de force à faible vitesse de déplacement (40 nm/sec), où l'on voit clairement la structure en dents de scie.
- La figure 12 permet de comparer un détail de la mesure (amplitude pic-pic de 2 pN environ ; creux GC au milieu de l'ouverture du λ) avec le contenu GC
(moyenne glissante sur 500 bases) représenté pour le morceau correspondant entre les index de base de 15 000 à 25 000. - La figure 13 illustre un calcul numérique du signal de force pour une molécule d'ADN du phage λ. L'axe horizontal est décalé par rapport aux mesures expérimentales car le bras espaceur n'est pas inclus dans la description théorique. - La figure 14 illustre un ensemble de résultats théoriques sur la physique de l'ouverture. Du bas vers le haut, la force de déflexion, le nombre moyen < j > de paires de bases ouvertes, et la variance de j sont présentés en fonction du déplacement de l'échantillon (en micromètre) qui contrôle le processus d'ouverture. La teneur moyenne en GC correspondant à la séquence ouverte est tracée sur la droite (moyenne glissante sur 100 bases).
Par le choix des axes communs, la figure permet de relier les structures dans le contenu GC, à la force de déflexion, à < j > et à la variance de j (et vice versa). La figure 15 illustre l'effet de la raideur du levier et des simples brins. On a porté le nombre moyen < j > de paires ouvertes, en fonction du déplacement (échelle de déplacement donnée par la barre horizontale).
Dans ces calculs, la raideur du levier kιev. est quatre fois plus petite (courbe A), deux foix plus grande (courbes B et C), ou dix fois plus grande (courbe D) que la raideur du levier utilisé dans les expériences. Pour les courbes C et D, on a supposé que la longueur de chacun des deux simples brins est réduite de 20 000 bases, ceci permet d'observer l'influence de l'élasticité des simples brins.
La figure 16 illustre une mesure de force pendant l'ouverture sur la construction Λ, réalisée avec un levier de raideur 2,5 pN/μm environ. Les points sont obtenus expérimentalement par l'analyse III, décrite par ailleurs. On a tracé la force exprimée en picoNewton en fonction de la distance bout-à-bout exprimée en micromètres.
La figure 17 illustre une mesure de force pendant l'ouverture sur la construction Λ, réalisée à la même vitesse d'ouverture que pour la figure 16, et par le même système de mesure mais avec un levier de raideur 19 pN/μm environ. On a tracé la force exprimée en picoNewton en fonction de la distance bout-à-bout exprimée micromètres.
- La figure 18 illustre une superposition entre le signal de force obtenu lors de l'ouverture, et le contenu moyen en base G ou C le long d'un segment donné de la séquence (de 3000 à 8000) ; la moyenne est une moyenne gaussienne, de largeur caractéristique totale à 1/e de 50 bases. La courbe donnant la moyenne est tracée avec un trait continu. La courbe expérimentale est tracée avec des points discrets. Exemple de réalisation pratique
On décrit ici à titre non limitatif, et comme exemple, le détail de la préparation et de la mesure de signature selon la présente invention sur l'ADN du phage lambda. Construction (figures 1 et 2) Oligo 1 est un élément connecteur entre DNA 1 (ADN du phage λ destiné à être ouvert) et DNA 2 (ADN du phage λ qui sert de bras espaceur). Oligo 2, élément connecteur, est biotinylé 3', ce qui sert à l'attachement sur une bille. Oligo 3 est fonctionnalisé 3' dig et sert à l'attachement sur la surface. Oligo 4 est une mini-épingle à cheveux cohésive. Les séquences choisies à titre d'exemple sont les suivantes :
Oligo 1
5' Agg TCg CCg CCC AAg ggA CTA CgA g AT Tg 3' Oligo 2 (fonctionnalisé 3' biotine)
5' Agg TCg CCg CCC CAA TCT CgT AgT CCC AAA AAA TCA gCA gTA AC Biotine 3'
Oligo 3 (fonctionnalisé 3' dig) 5' ggg Cgg CgA CCT dig 3' Oligo 4 (mini-épingle à cheveux cohésive) 5 ' ggg Cgg CgA CCT AgC gAA AgC T 3 ' La préparation est effectuée de la façon suivante, par exemple à partir de 10 μg de DNA 1 et 10 μg de DNA 2 :
Le tampon utilisé lors des fusions ci-après est le tampon de ligation sans ATP (Pharmacia). Les volumes de réaction sont typiquement de 20 à 60 μl. 1) Fusion (55°C, 1 heure) et ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 1 heure, 16°C) de :
- DNA2 + oligo 3, c'est-à-dire la préparation A (rapport de molarité : 1/10) ; - DNA1 + oligo 4, c'est-à-dire la préparation B (rapport de molarité : 1/10). Ibis) Thermo-inactivation de la ligase.
2) Fusion' (55°C, 1 heure), ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 1 heure, 16°C), thermo-inactivation de la ligase et purification de :
- préparation A + oligo 1, c'est-à-dire la préparation-C (rapport de molarité : 1/20) ;
- préparation B + oligo 2, c'est-à-dire la préparation D (rapport de molarité : 1/20). 3) Fusion (40°C, 1 heure, puis refroidissement lent), ligation (T4 ligase (Pharmacia) 0,2 unités Weiss, 2 heures, 16°C), thermo-inactivation de la ligase et purification de : préparations C et D, en ajoutant du PEG (10%) pour promouvoir la réaction, c'est-à-dire la préparation E. Typiquement, on a utilisé 2 ng de construction par expérience.
Les étapes de purification sont réalisées par des colonnes de filtration Amicon-100.
L'échantillon
Les expériences sont effectuées dans un liquide (tampon de pH contrôlé et de concentration en sel donnée, on utilise par exemple du PBS, lOmM phosphate, 150mM Na+, pH = 7.0). Un anneau en plastique est collé à la paraffine sur la lame du microscope et permet de maintenir un petit volume de tampon au-dessus de la surface de verre. Ceci constitue un puits dans lequel les mesures seront effectuées. La surface de verre fonctionnalisée (fond du puits) va ancrer la construction moléculaire. Puis les particules sont ajoutées et un certain nombre d'entre elles vont se fixer. Le puits est placé sur un microscope inversé et la mesure des forces est effectuée en utilisant une micro-aiguille souple, introduite dans le liquide par la partie libre du ménisque.
Naturellement, un piège optique (Svoboda et al, 1993 ; Finer et al, 1994 ; Yin et al., 1996) peut être utilisé avec avantage comme capteur de force, à la place d'une micro-aiguille. On doit, enfin, prendre garde d'éviter les surfaces chargées positivement de façon à éviter les adsorptions non souhaitées d'ADN.
1) Support n° 2 : les particules sont des billes
Les billes utilisées sont des billes commerciales Dyna, paramagnétiques (diamètre 2,9 μm). Ces billes sont revêtues de streptavidine et on leur a appliqué un traitement complémentaire avec un agent d'acétylation (NHS acétate).
2) Support n° 1 : Lamelles de microscope et leur préparation
Dans les étapes de préparation un très petit volume de réaction, environ 10 μl est créé par l'utilisation d'un petit disque circulaire de verre mince (diamètre 12 mm) qui est disposé à l'intérieur de l'anneau en plastique du puits et sert du couvercle. Lorsqu'il est nécessaire d'effectuer une chimie par voie liquide, le liquide, environ 10 μl, est d'abord ajouté au puits et le disque placé ensuite par dessus adhère par capillarité. Le liquide se retrouve confiné entre le fond du puits, d'une part, et la lamelle circulaire, d'autre part ; le liquide est réparti sur toute la surface avec une épaisseur approximativement uniforme d'environ 10 μm. L'incubation est alors effectuée dans le puits couvert. Pour l'étape suivante 300 à 400 μl de tampon sont ajoutés à l'intérieur de l'anneau du puits, le disque en verre flotte en dehors de la base du puits et est facilement éliminé avec des brucelles. L'excès de tampon est éliminé en inclinant le puits sur un papier absorbant. On prépare des lamelles de microscope en verre sur lesquelles sont greffés des polymères linéaires, chargés négativement (polymérisation statistique d'acide maléique et d'acrylamide sur les lamelles silanisées vinyl, ce qui crée une surface chargée négativement et très hydrophile). Ceci permet la fonctionnalisation subséquente avec l'antidig. A titre d'exemple, on peut utiliser pour la silanisation un trichlorosilane, avec une chaîne intermédiaire composée de 5 à 20 carbones, terminée par un groupe vinyle. Les surfaces de verre sont introduites dans une enceinte étanche, munie d'une trappe d'accès et de tuyaux d'entrée et de sortie, munis de robinets. Cette enceinte contient un tube qui génère de l'U.V,, constitué d'une lampe basse pression à mercure (marque Heareus) générant de l'U.V. sur une gamme de longueur d'onde qui recouvre partiellement la bande d'absorption de l'oxygène. Dans un premier temps (10 minutes), l'enceinte est balayée par un courant d'oxygène gazeux. Les robinets sont ensuite fermés et on allume la lampe pendant une à plusieurs heures. De l'ozone est créé et aide au nettoyage des surfaces de verre. Après arrêt de l'U.V., un flux gazeux est introduit pendant 5 minutes. Il s'agit d'oxygène ayant barboté dans de l'eau. Les lamelles sont extraites rapidement de la chambre et introduites dans une enceinte hermétique, en verre, dans laquelle on a disposé quelques gouttes de silane. La silanisation se produit par transfert gazeux. Après quelques heures, les lamelles sont mises dans un four (typiquement 150°C pendant une heure), puis rincées sous un filet d'eau et stockées dans un pochon de feuille d'aluminium par exemple. A partir des lamelles, on fabrique des puits comme décrit précédemment. Dans les puits on introduit un petit volume d'un mélange constitué de :
- acrylamide,
- acide maléique neutralisé pH 7 au moment de l'utilisation, - eau désoxygénée,
- persulfate (initiateur),
- TEMED (initiateur).
Le rapport acrylamide/acide maléique est choisi dans la gamme 10/1 à 5/1. La polymérisation est réalisée dans les puits, protégés par leur couvercle.
Cette procédure permet l'obtention d'une matrice électronégative et hydrophile constituée ici par les groupements acides (issus de l'acide maléique), incorporés dans les polymères longs issus de la polymérisation de l'acrylamide, eux-mêmes ancrés sur la surface.
Le caractère fortement électronégatif permet de combattre efficacement l'adsorption de l'ADN, polyélectrolyte de charge négative.
L'homme de l'art peut naturellement adapter cette conception particulière de matrice électronégative à d'autres systèmes. A titre d'exemple, on peut citer encore une matrice obtenue par fixation de dextran, suivie d'une étape de transformation des sucres pour obtenir des groupements acides. Une matrice électronégative est caractérisée en ce qu'elle est constituée de polymères de caractère globalement électronégatif et hydrophile, attachés sur un support, les polymères peuvent être statistiques et/ou branchés, mais en moyenne sont constitués de l'assemblage d'au moins un type de monomère. La taille typique des polymères exprimée en nombre de monomères incorporés est d'au moins deux, de préférence entre 10 et 1 000 et pouvant même aller jusqu'à un million, et la matrice finale présente de façon statistique ou régulière une densité de groupements
-COOH au moins supérieure à 1/1 000 et de préférence comprise entre 1/20 et 1/1.
L'antidig (polyclonal, Boehringer Mannheim) est couplé par des groupes NH2 à une partie de la matrice COOH en utilisant les techniques des EDC-
NHS ou EDC-NHSS.
Après élimination du couvercle et rinçage, un film mince de tampon demeure sur la surface hydrophile de la surface en verre traitée. On peut alors effectuer les autres opérations de couplage. Le couplage de l'antidig est effectué de la façon suivante :
- 10 minutes d'incubation EDC-NHSS (dans de l'eau) (EDC = l-Ethyl-3-(3- Diméthyl-aminopropyl)-Carbodiimide sous forme de chlorhydrate, NHSS = Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide)) ; 10 secondes de rinçage sous un filet d'eau ; - 10 minutes de couplage avec l'antidig dans du PBS ;
10 minutes de désactivation avec de la glycine 1M pH8, pour permettre la récupération des groupes COOH à partir des sites activés résiduels EDC-NHSS; rinçage.
Les surfaces antidig avec un agent antimicrobien (0,02 % NaN3) et protégées par une lamelle sont placées dans un sac avec une atmosphère humide et peuvent être stockées des semaines dans un réfrigérateur. En effectuant les expériences, les puits revêtus d'antidig sont rincés avec du PBS, incubés avec une dilution de construction moléculaire dans du PBS (typiquement 1 ng de construction dans 10 μl) pour 30 minutes. Les dilutions et tampons d'incubation peuvent naturellement être adaptés. Puis un excès de tampon est ajouté et les billes revêtues de streptavidine sont introduites. Elles sédimentent et réagissent avec la construction moléculaire à la surface de la lame de microscope. Après une heure d'incubation typiquement, une grande partie des billes non attachées sont éliminées en trempant rapidement un petit aimant dans le puits, l'aimant attire et colle les particules libres. Puis on effectue l'étape de sélection des billes décrite précédemment et qui utilise la présence de bras espaceur.
Typiquement, de 0 à 50 billes attachées sont observées dans un champ de vue, sous le microscope avec un objectif 20X. Dans le même champ, typiquement une fraction variant du 1/10 aux 3/4 des billes peuvent être collées ou adsorbées. Naturellement, d'autres surfaces que le verre, notamment des matériaux polymériques, peuvent être utilisées, à la fois pour le fond du puits et pour le couvercle. Ce dernier peut aussi être réalisé avec d'autres matériaux, un métal ou une céramique à titre d'exemple non limitatif.
Le levier de force : micro-aiguille souple en verre On utilise un appareil commercial à tirer des pipettes. On prépare des micro-aiguilles (dont les dimensions typiques sont : diamètre : 1 mm, diamètre de l'extrémité : 1 μm et longueur 1 cm). La raideur varie en fonction des aiguilles et est calibrée (voir suite). Les aiguilles sont biotinilées chimiquement comme suit : - lavage au mélange sulfochromique ; - silanisation (avec un silane terminé par une aminé primaire) ; réaction avec NHS-LC-biotine (Boehringer) (qui réagit les aminés primaires).
Le levier traité adhère rapidement aux microbilles revêtues de streptavidine simplement en les touchant. On peut immédiatement procéder aux mesures de force. Après la mesure, les microbilles peuvent être séparées par un choc mécanique sur le levier, ou en utilisant un effet de ménisque simplement en soulevant le levier hors du puits puis en le replongeant dans le liquide.
Mesure des forces
L'échantillon est placé sur un microscope inversé comportant un objectif à grande magnification (Zeiss Achroplan, immersion dans l'huile, x 100, N.A. 1,25). L'image de la bille et de l'extrémité souple du levier est recueillie par une caméra vidéo. Une platine de translation piezo permet un déplacement latéral précis de l'échantillon par rapport à la base fixe du levier de force. (L'inversion cinématique est bien sûr envisageable).
Ce déplacement est mesuré avec une résolution meilleure que le micron en utilisant un senseur inductif Un ordinateur permet de connecter les informations sur le déplacement de l'échantillon et la déflexion du levier qui est enregistrée par une caméra vidéo, (l'image vidéo est capturée par un système d'acquisition numérique). Les forces impliquées dans les expériences d'ouverture de l'ADN sont de quelques dizaines de PicoNewtons, qui correspondent typiquement à un déplacement de l'extrémité du levier de quelques dizaines de microns. On a utilisé deux types de méthodes pour obtenir ces données de déflexion. Dans le mode peu résolu (appelé Analyse I), la détermination de la déflexion est faite à une résolution de 0,2 μm environ, qui correspond à celle des pixels (acquisition numérique de l'image). Un deuxième mode plus sensible a été utilisé (appelé Analyse II). Utilisant le fait que les billes présentent une image très contrastée (blanc au centre, noir sur leur périphérie), la méthode choisie est la suivante : une unique ligne vidéo de l'image est retenue et sélectionnée de façon à recouvrir une section de la bille ; la ligne vidéo présente une structure de fond gris, sur lequel est superposée la modulation forte et localisée noir-blanc-noir qui correspond à la bille. Une méthode numérique permet alors avec une résolution du sub-pixel l'interpolation de la position du centre de la bille. On peut ainsi, à partir de l'enregistrement vidéo des déplacements de la bille collée au levier, remonter à la déflexion au cours de l'expérience, avec une résolution de l'ordre d'une vingtaine de nanomètres (Analyse II).
La platine à déplacement piézoélectrique permet des séquences arbitraires de déplacement en fonction du temps. Calibration de la raideur des leviers
La micro-aiguille à calibrer est d'abord biotinilée comme décrit précédemment. Une bille paramagnétique (Dyna) est attachée à l'extrémité de la micro-aiguille dans un puits (sans ADN) rempli de tampon. Un petit aimant est approché à quelques dizaines ou centaines de microns, et la déflexion de l'extrémité du levier en fonction de la distance entre la bille et l'aimant est mesurée. L'aimant est écarté ensuite à une position qui correspond à une petite déflexion. La bille est alors détachée mécaniquement à partir du levier souple en utilisant une seconde micro-aiguille plus raide contrôlée par micro-manipulation. La bille se déplace alors rapidement vers l'aimant.
En utilisant une illumination stroboscopique, on repère la position en fonction du temps de la bille pendant l'accélération vers l'aimant. La vitesse de la bille en fonction de la distance bille/aimant est obtenue à partir d'informations vidéo. La vitesse locale v est proportionnelle à la force sur la bille (par la formule de Stokes : F = 6π ηRv dans laquelle η est la viscosité du tampon et R est le rayon de la bille). A partir des deux jeux de mesure (déflexion du levier en fonction de la distance bille/aimant et vitesse de la bille en fonction de la distance bille/aimant) on obtient la relation entre force et deflexion, c'est-à-dire la raideur du levier. Un seul levier a été utilisé au cours des différentes expériences. Sa raideur a été estimée à 1,7 pN/micron (avec une précision de 20 %). Une confirmation indépendante de cette calibration est la suivante : parfois lorsque la molécule refuse de s'ouvrir, un plateau caractéristique dans la courbe extension en fonction de la force de la double hélice, sont alors mesurées (Cluzel et al., 1996 ; Smith et al., 1996). En utilisant la raideur de la calibration, les valeurs des forces obtenues pour ce plateau sont compatibles avec celles données dans la littérature. Mesures de l'ouverture de l'ADN par des forces mécaniques
Dans la figure 5, avec l'Analyse I, on a représenté un premier exemple de mesure de force lors de l'ouverture de l'ADN du phage λ. L'axe horizontal correspond à la distance entre les deux ancrages de la construction moléculaire (distance bout à bout, définie comme le déplacement du puits mesuré à partir de l'attachement du levier, retranché de la deflexion du levier). Au point A, à une force zéro et à une distance zéro, aucune force mécanique mesurable n'est exercée par le levier sur la molécule ; par l'action des forces entropiques, le bras espaceur double brin de l'ADN λ avant attachement du levier, se trouve compacté près du point d'ancrage (distance égale à zéro, identifée comme la position moyenne de la bille avant l'attachement au levier). Juste après l'attachement de la bille au levier, on lève le levier de quelques micromètres au-dessus de la surface pour éviter les frictions solides. En déplaçant l'échantillon latéralement dans la direction X positive ou négative, une déflexion mesurable apparaît lorsque les distances bout à bout approchent de la longeur du bras espaceur ADN λ (environ 16 μm). Le segment A-B-C (respectivement A'-B'-C) correspond à l'extension entropique du bras espaceur. On trouve ici le régime décrit par Bustamante et al., (1994) sur l'extension d'une double hélice d'ADN simple.
Au point C (respectivement C), on observe un soudain changement dans la dépendance de la force en fonction de la distance. Un quasi plateau C-D (respectivement C'-D') est observé à une force d'environ 1 1 à 13 pN. Ce plateau correspond à la séparation de deux brins de la molécule d'ADN, dont un brin est fixé au long bras espaceur d'ADN et le second brin à la bille. La distance A-D de la figure 5 excède trois fois 16 μm, ce qui est attendu puisque les longueurs suivantes sont impliquées : le bras espaceur d'environ 16 μm plus deux fois la longueur de l'ADN monobrin étendu. A ce niveau grossier de résolution, l'ouverture apparaît à une valeur de force pratiquement constante. La figure 5 a été obtenue par un cycle de déplacement rapide. En effectuant le retour de D à A, les deux brins se réapparient et un nouveau cycle de mesure peut être effectué. Durant le retour, on observe un phénomène d' hystérésis comme cela sera décrit dans la figure 9.
Lorsque la molécule λ est totalement ouverte, la force augmente et correspond à l'extension linéaire des trois composants en série, le bras espaceur et les deux monobrins reliés par l'épingle à cheveux.
Parfois, les caractéristiques de l'ouverture sont différentes : une force très supérieure à ce qui est attendu, est observée, juste avant l'ouverture (ceci correspond probablement, à une adsorption partielle des billes sur le double brin) ; parfois, les molécules ne s'ouvrent pas, même pour des forces supérieures à 50-pN ; la courbe distance bout à bout, en fonction de la force, croît, bien que l'ouverture ne soit pas complète ; ce blocage de l'ouverture peut être répété ou transitoire, ceci peut être dû à des noeuds ou des liaisons inter-brins. Analyse plus fine de la courbe force/distance
Un certain nombre de détails apparaissent lorsque la vitesse de déplacement est plus lente (figure 6). Ceci offre la possibilité d'optimiser la qualité du signal force en choisissant une séquence appropriée de déplacement en fonction du temps.
Pour montrer que la courbe force en fonction de l'extension est reliée à la séquence de base de la molécule de l'ADN λ, on a préparé une construction dans laquelle l'ADN λ destiné à être ouvert, a été inversé. Cette construction dénommée A"1, par opposition à la précédente, notée elle A, est réalisée de façon à ouvrir le même type de molécule phage λ, mais en partant de l'autre extrémité. En prenant le brin 5'-3' gauche de l'ADN λ comme référence, l'ouverture de Λ part de l'extrémité 5' et l'ouverture A'1 part de l'extrémité 3'. Sur la figure 7, la courbe force en fonction de l'extension de la structure inversée A"1 est comparée à celle de la structure directe A. Les éléments de symétrie apparaissent lors de la mesure de la force. A partir de cette symétrie approximative entre Λ et A"1, on peut mettre en évidence des détails qui apparaissent à l'origine de la même séquence explorée dans les deux sens. Le signal de force de la construction inversée est mis en sens inverse sur la figure 7. Ceci permet de comparer des détails d'information obtenus par les deux mesures qui semblent se compléter mais ne se superposent pas. Les flèches indiquent l'ouverture de direction. Signature de la force en fonction de la séquence La séquence des bases complètes de la molécule de λ est connue. Dans la figure 8 on représente les moyennes de contenu G-C le long de la molécule. Zéro sur l'axe horizontal correspond aux paires de bases qui s'ouvrent d'abord dans la construction A. La mesure des forces sur Λ correspond à la forme caractéristique du contenu local en G-C, comme cela peut être vu en comparant les figures 7 et 8. On n'espère pas un accord parfait, compte tenu de ce que l'ouverture mécanique est un processus dynamique complexe qui n'est pas le même pour Λ et A"1, et enfin que la longueur des simples brins varie lors du processus d'ouverture et donc leur élasticité varie. A partir de l'inspection du nombre de caractéristiques dans la courbe d'ouverture, on constate déjà que la résolution du processus est meilleure que 500 bases. Les zones riches en GC correspondent à des forces d'ouverture plus grandes comparativement aux zones pauvres en GC. Effets de sel En effectuant différentes mesures préliminaires avec Na+ lOmM, ou Na+ IM (PB 10 mM Phosphate, 10 mM Na+ ou PBS avec du sel ajouté : 10 mM Phosphate, IM Na+), on a constaté une très faible dépendance du niveau initial de force Fo nécessaire pour ouvrir l'ADN. Par rapport aux mesures standards effectuées dans PBS (10 mM de Phosphate, 150 mM Na+), on observe une tendance d'augmentation faible de F0 (à environ 14 pN) dans Na+ IM et une décroissance faible dans 10 mM Na+ (à environ 10 pN). Un effet plus important est évidemment envisagé à des niveaux de sel très faibles (de l'ordre du millimolaire ou sub millimolaire). Refermeture des brins
Jusqu'à maintenant, on a essentiellement étudié le signal de force apparaissant lorsque l'on ouvre une double hélice. Lorsque la distance bout à bout décroît, les brins indépendants se réapparient. Comme cela apparaît dans la figure 9, le signal de force acquis durant l'étape du retour peut différer du signal obtenu durant l'ouverture. En particulier, des chutes prononcées apparaissent parfois dans la courbe force en fonction de la distance.
Une interprétation possible de ces effets est qu'il existe un réappariement transitoire différé. Plusieurs sources peuvent être envisagées :
1) des structures secondaires, c'est-à-dire une fixation locale entre deux brins en mésappariement ;
2) des séquences particulières peuvent induire des instabilités ;
3) d'autres modifications : d'autres macromolécules (en particulier des molécules d'ADN libres en solution peuvent s'interposer dans la fourche de fermeture) ; - des solides microscopiques (des poussières par exemple).
Il est clair que l'élasticité de l'ensemble du système est impliquée. En particulier, il faut noter que sur l'instabilité durant la fermeture, la pente de la courbe force/distance augmente alors que la longueur des brins simples diminue
Reproductibiiité On a effectué des mesures à grande résolution (Analyse II définie précédemment) sur une même molécule, à deux instants différents, et à la même vitesse moyenne de 160 nm sec. La figure 10 présente le résultat de ces deux mesures. On pourra également comparer ces résultats à la figure 8. Analyse de signature à forte résolution et à basse vitesse A forte résolution (Analyse II définie précédemment) et à basse vitesse, le signal d'ouverture présente des répétitions de motifs caractéristiques en dents de scie, constitués d'une montée lente en force, en fonction du déplacement imposé, suivi d'une décroissance brutale, signe d'instabilité.
La figure 11 est un exemple d'une partie de mesure réalisée à la vitesse moyenne de 40 nm/sec. Les positions et amplitudes de ces motifs en dent de scie dépendent de la séquence. Ainsi que décrit plus loin, la naissance d'une instabilité peut être induite par une variation très locale du contenu GC, induisant un point de blocage d'ouverture, suivi d'une zone d'ouverture plus facile. Après avoir atteint le seuil de force nécessaire pour ouvrir un point dur, l'énergie élastique stockée dans la construction moléculaire et dans le dispositif de mesure de force va permettre le déplacement du point d'ouverture le long de l'ADN, même lorsque la position de la platine de déplacement est peu changée. Qualitativement, ces motifs se superposent à une ligne de base qui dépend de la proportion GC de la séquence.
Il est ainsi clair que la signature des forces résulte d'une interaction complexe entre les séquences et la raideur mécanique impliquée dans cette mesure. On pourra avec avantage réaliser des signatures avec des raideurs différentes.
Dans l'exemple donné, le nombre de dents de scie est typiquement de 50, pour l'ouverture d'un segment de 20 kb. Ceci correspond à un intervalle moyen entre dents de scie de 400 bases environ. On a remarqué que les descentes des dents de scie, observées à déplacement constant, correspondent à des temps supérieurs au temps caractéristique de réponse du levier. D'autre part, et de façon remarquable, l'amplitude caractéristique des plus petites dents de scie visibles est inférieure au niveau moyen de vibration de la pointe du levier (sujette à des perturbations extérieures : acoustiques, sismiques, etc.). La signature n'est donc pas trop sensible aux perturbations mécaniques lors de la mesure. La figure 12 présente un exemple additionnel de la relation entre la signature de force et le contenu GC (moyenne glissante sur 500 bases). Les données correspondent à une mesure basse vitesse (20 nm/sec) de la région centrale pauvre en GC du A. On voit clairement la correspondance entre les deux courbes mais la signature ne se confond pas avec un simple moyennage.
On voit encore que la résolution obtenue révèle des détails correspondant approximativement à 500 bases.
Modélisation du système et résolution numérique La signature d'une séquence donnée correspond à un problème de physique statistique, faisant intervenir l'agitation thermique, les raideurs, et les énergies d'appariement. Les valeurs moyennes observables (force d'ouverture, position de point d'ouverture, etc.) peuvent être calculées numériquement à partir de la fonction de partition du système. Comme on va le voir par la suite, on peut, à partir d'une séquence connue, calculer numériquement la signature. Notre modèle, bien que simplifié, fait ressortir les caractéristiques essentielles observées expérimentalement.
La ou les signatures de référence d'une séquence peuvent donc être obtenue(s) soit numériquement soit expérimentalement. Sur la figure 13 est présenté un exemple de calcul sur l'ouverture du phage λ (correspondant à la configuration Λ précédente).
Un accord entre simulation et expérience apparaît en comparant les figures 10 et 13.
En bas de la figure 14 est présenté un agrandissement de la zone centrale de la figure précédente. La structure en dents de scie apparaît clairement. Les montées lentes correspondent à des zones où le point d'ouverture se déplace très peu, par opposition aux descentes plus rapides, où ce point d'ouverture se déplace beaucoup. Ceci apparaît dans le milieu de la figure 14, où la grandeur < j > tracée sur l'axe vertical est la valeur qui identifie la position moyenne de la zone d'ouverture. Le contenu GC de la zone d'ouverture correspondante est tracé à droite. En haut de la figure 14 est présenté le calcul de la variance de la position du point d'ouverture, mesure de la résolution locale. On observe de fortes variations de la résolution qui dépendent de la séquence. Cette résolution est presque partout meilleure que 100 bases. Les pics de variance correspondent à des endroits où le signal en force baisse brutalement. Modifications de signature Signature et raideurs :
La signature dépend de la raideur totale du système, c'est-à-dire les raideurs totales du système de mesure et les raideurs liées à la construction moléculaire, notamment celles des simples brins de la molécule ouverte. Une faible raideur favorise des grands événements d'instabilité et une forte raideur les diminue. Ceci est démontré théoriquement dans la figure 15. Analyses supplémentaires Mode d'acquisition : Un troisième mode d'analyse de la force (appelé Analyse III) a été mis au point et permet l'acquisition du signal en direct (Essevaz-Roulet et al., 1997 ; Bockelmann et al., 1997). L'analyse III est basée sur le même principe que l'analyse II définie précédemment, mais n'utilise pas l'intermédiaire des enregistrements vidéo sur magnétoscope. L'image vidéo en temps réel de la bille et du levier est numérisée en direct sur un ordinateur Macintosh muni d'une entrée vidéo (Mac PPC8600), et un logiciel spécifique d'analyse d'image en extrait en temps réel la position du levier. Ceci permet d'obtenir un fichier avec la déflexion du levier au cours du temps, et donc la force exercée sur la molécule au cours de l'ouverture.
Modification expérimentale de la signature par changement de raideur : La signature dépend de la raideur totale du système comme précisé précédemment. Lorsque la raideur augmente, la densité d'information de la signature augmente également, c'est-à-dire que, par exemple, le nombre de pics est plus important. Ceci est démontré expérimentalement par les figures 16 et 17 (dans les deux figures, on a représenté la force en picoNewton en fonction de la distance bout-à-bout définie précédemment). Dans la figure 16, on présente une portion de la signature obtenue avec un levier de raideur 2,5 pN/μm sur une construction A. La figure 17 représente la même portion de signature sur une construction Λ , avec un levier de raideur 19 pN/μm environ.
Comparaison de la signature avec la séquence de l'ADN du phage λ. Pour comparer la signature avec la séquence du phage λ, on représente la séquence par sa densité en paires de bases G-C. On effectue une moyenne gaussienne glissante (de largeur caractéristique L donnée) le long de la séquence, exprimant le pourcentage moyen en bases G-C (de 0 à 100 %) le long de cette séquence. Pour superposer la séquence ainsi moyennée à la signature, il faut leur donner un axe commun. Ceci est fait en considérant que 1 micromètre d'ouverture (ou 1 micromètre de distance bout-à-bout) correspond à l'ouverture de 1000 paires de bases environ. La superposition de deux de ces courbes est représentée par la figure 18. Il s'agit de la signature (courbe tracée en points séparés) à 3 micromètres du début de l'ouverture jusqu'à 8 micromètres, superposée à la séquence moyennée sur L≈-50 bases (courbe tracée en ligne continue) entre l'index de base 3000 et 8000. Avec cette superposition, on observe en particulier que les pics de la signature sont liés à la présence de zones riches en G-C qui bloquent transitoirement l'ouverture. On peut en déduire que la signature est sensible à des détails de la séquence à l'échelle de 50 bases environ.
REFERENCES
1. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B. & Heslot, F. "Molecular stick-slip motion revealed by opening DNA wilh piconewton force" (1997) Phys. Rev. Lett. 79, 4489-4492
2. Bustamante C, Marko J.F., Siggia E.D. et Smith S., "Entropie elasticity of λ- phage DNA", Science 265, p. 1599 (1994).
3. Chu S., Science, 253, 861 (1991).
4. Cluzel P., Lebrun A., Heller C, Lavery R., Viovy J.L., Chatenay D. et Caron F., "A new structural transition in DNA revealed by force measurements on a single molécule", Science 271, pp. 792-794 (1996).
5. Essavaz-Roulet, B., Bockelmann, U. & Heslot, F. "Mechanical séparation ofthe complementary strands of DNA" (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11935- 1 1940
6. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A., Nature 368, 1 13 (1994).
7. Perkins T. T., Smith D.E., Chu S., "Direct observation of tube-like motion of a single polymer chain", Science, 264, 819-822 (1994).
8. Perkins T.T., Quake S.R., Smith D.E., Chu S., "Relaxation of a single DNA molécule observed by optical microscopy", Science, 264, 822-826 (1994).
9. Perkins T. T., Smith D.E., Larson R.G., Chu S., "Stretching a single tethered polymer in a uniform flow", Science, 268, 83-87 (1995).
10. Rees W.A., Yager T.D., Korte J., von Hippel H., Biochemistry 32, 137 (1993). 11. Smith S.B., Finzi L. et Bustamante C, "Direct mechanical measurement of the elasticity of single DNA molécules by using magnetic beads", Science, 258, 1122 (1992).
12. Smith S.B., Cui Y., Bustamante C, "Overstretching B-DNA", Science, 271, 795-799 (1996).
13. Strick T.R., Allemand J.F., Chiffaudel A., Bensimon D., Bensimon A. et Croquette V., "The elasticity of a single supercoiled molécule", Science 271, (1996).
14. Svoboda K., Schmidt CF., Schnapp B.J., Block S.M., Nature 365, 721 (1993).
15. Thompson R.E. et Siggia E.D., Europhys. Lett. 31, 335 (1995).
16. Viovy J.L., Heller Ch., Caron F., Cluzel Ph., Chatenay D., C.R. Acad. Sci. Paris 317, 795 (1994).
17. Yin H., Wang M.D., Svoboda K., Landick R., Block S.M., Gelles J., "Transcription against an applied force" Science, 270, pp. 1653-1656 (1996).
18. Zimmerman R.M. et Cox E.C., "DNA stretching on functionalized gold surfaces", Nucl. Acid. Res., 22, 492-497 (1994).

Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de caractérisation de duplex d'acide nucléique comportant deux séquences d'acide nucléique au moins partiellement appariées, caractérisé en ce qu'on enregistre au moins une "signature" desdits duplex, qui est liée à la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites deux séquences, et en ce que l'on compare la signature obtenue avec des références.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'extrémité 5' de l'une des deux séquences est fixée sur un support 1 et l'extrémité 3' de l'autre séquence est fixée sur un support 2, la variation de force nécessaire pour désapparier, respectivement réapparier, lesdites séquences étant mesurées par éloignement, respectivement rapprochement, desdits supports 1 et 2, caractérisé en ce que, lors de la fixation, le point de fixation de l'extrémité 3' sur le support 2 et le point de fixation de l'extrémité 5' sur le support 1 se retrouvent reliés par un fil moléculaire d'une longueur d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les extrémités libres, c'est-à-dire non fixées, des séquences d'acide nucléique sont reliées entre elles. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on modifie localement le duplex.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la modification locale est effectuée par création d'un triplex ou d'un complexe ou par la fixation d'une protéine. 6/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la modification locale est effectuée par une molécule capable de créer un pontage entre les brins du duplex.
7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on modifie localement les simples brins une fois désappariés au moins partiellement 8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre avec un tampon qui modifie les énergies d'appariement. 9/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre à une température qui modifie les énergies d'appariement.
10/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les supports sont choisis parmi les lames, les billes de verre ou de polymère ou un élément d'un appareil de mesure de force, preférentiellement les lames sont choisies parmi les lamelles de verre ou de polymère.
11/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les étapes de fonctionnalisation et/ou de fixation sont réalisées dans un volume délimité par une surface plane de fixation sur laquelle est posé un élément formant enceinte latérale susceptible d'être couvert par un couvercle.
12/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1, caractérisé en ce qu'au moins un des supports est recouvert d'une matrice électronégative sur au moins une partie de sa surface.
13/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'un des supports est déplacé par une aiguille ou une micropipette ou une platine de translation ou des pinces optiques.
14/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que le duplex d'ADN à étudier est inclus dans une construction moléculaire possédant au moins deux sites distincts de fixation et où l'éloignement de ces deux sites induit l'ouverture du duplex d'ADN.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la construction moléculaire est un système cassette.
16/ Procédé selon l'une des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'au moins un site de la construction moléculaire adhère à un capteur de force directement ou par l'intermédiaire d'un support et que ce capteur détermine la force de l'ouverture du duplex quand au moins un autre site de la construction moléculaire est éloigné et induit cette ouverture.
17/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'au moins une extrémité de la séquence d'acide nucléique ou bien un site d'une construction molécule est fixé au support par une interaction :
- covalente
- antigène / anticorps - ligand / récepteur
- avidine ou streptavidine / biotine.
18/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le capteur de force est un levier dont on mesure la déflexion. 19/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les variations de force sont mesurées par un microscope à force atomique.
20/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le capteur de force est un piège optique.
21/ Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le piège optique est à rétroaction.
22/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que la raideur des simples brins a été modifiée de façon substantielle par adjonction d'autres molécules choisies parmi :
- les protéines, - les oligonucléotides d'acide nucléique ou de leurs analogues.
23/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que l'extrémité 3' du duplex à caractériser est fixée sur le support 2 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm. 24/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 23, caractérisé en ce que l'extrémité 5' du duplex à caractériser est fixée sur le support 1 par l'intermédiaire d'un bras espaceur ayant une longueur d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm.
25/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 24, caractérisé en ce que le support 1, respectivement support 2, est une lame, une particule ou une micropipette et que le support 2, respectivement support 1, est une particule.
26/ Procédé selon l'une des revendications 23 et 24, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur est une séquence nucléotidique.
27/ Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur est un ADN double brin.
. 28/ Procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'au moins un bras espaceur, par l'une de ses extrémités, est lié à l'un des brins de l'ADN double brin par une séquence oligonucléotidique de jonction.
29/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 28, caractérisé en ce que le duplex d'ADN à étudier est inclus dans une construction moléculaire contenant au moins un bras espaceur.
30/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 29, caractérisé en ce que la construction moléculaire avec au moins un bras espaceur est un système cassette. 31/ Procédé selon l'une des revendications 23 à 30, caractérisé en ce qu'on sélectionne les particules fixées sur l'une des branches du duplex ou du bras espaceur ou de la construction moléculaire en lui appliquant un champ de force ou un gradient de champ, en particulier un aimant ou un écoulement fluide.
32/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que le support 2 est fixé à l'extrémité 3', respectivement le support 1 à l'extrémité 5', alors que le duplex à caractériser a été au moins partiellement dénaturé et que le support 1 a été fixé auparavant à l'extrémité 5', respectivement le support 2 à l'extrémité 3', et que les extrémité 3' et 5' ont été partiellement éloignées d'une distance d'au moins 0,03 μm, de préférence comprise entre 0,5 et 30 μm. 33/ Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce que les séquences d'acide nucléique sont totalement dénaturées.
34/ Procédé selon l'une des revendications 32 et 33, caractérisé en ce que les séquences sont éloignées l'une de l'autre par le flux d'un liquide.
35/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 34 à l'analyse d'un ADN inconnu ou imparfaitement connu.
36/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 34 à la mise en évidence de la présence ou de l'absence d'une séquence ou d'un ensemble de séquences d'ADN déterminées dans un échantillon à tester.
37/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 36 à la mise en évidence d'au moins un mésappariement.
38/ Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 36 à la comparaison de deux échantillons d'ADN à tester. 39/ Coffret de diagnostic destiné à la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 34, caractérisé en ce qu'il comporte un ou plusieurs des éléments suivants :
- au moins un bras espaceur, - au moins une construction moléculaire cassette de bras espaceur, au moins un oligonucléotide de jonction, au moins un oligonucléotide en épingle à cheveux, au moins une enzyme de restriction, au moins une construction moléculaire destinée à fixer les brins du duplex à ouvrir sur des éléments de l'appareil de mesure de force,
- un support fixable à l'extrémité fonctionnalisée du bras espaceur. au moins un puits, au moins une lame, au moins un type de billes fonctionnalisées et avantageusement aimantables, destinées à être attachées à un élément fonctionnalisé du duplex à ouvrir, au moins un aimant, au moins un tampon, au moins une enzyme de ligation, - au moins un tampon de ligation, au moins une colonne de séparation par centrifugation. au moins un levier de mesure.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7407748B2 (en) * 2000-03-24 2008-08-05 Eppendorf Array Technologies S.A. Method and kit for the determination of cellular activation profiles
EP1136567A1 (fr) * 2000-03-24 2001-09-26 Advanced Array Technologies S.A. Procédé et trousse pour l'identification, la détection et/ou la quantification des facteurs de transcription
WO2001087354A2 (fr) 2000-05-17 2001-11-22 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Utilisation de radioligands a petites molecules en vue de rechercher des inhibiteurs de production d'amyloide-beta et destine a l'imagerie diagnostique
DE10126798A1 (de) * 2001-06-01 2002-12-19 Nanotype Gmbh Verfahren zur Bestimmung einer Probe
WO2003066896A2 (fr) * 2002-02-09 2003-08-14 Nanotype Gmbh Procede de detection de mutations
US20110059864A1 (en) * 2009-09-07 2011-03-10 Caerus Molecular Diagnostics Incorporated Sequence Determination By Use Of Opposing Forces
EP2390351A1 (fr) * 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Procédé de séquençage de l'ADN par hybridisation
EP2390350A1 (fr) * 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Procédé de séquençage de l'ADN par polymérisation
WO2013065881A1 (fr) * 2011-10-31 2013-05-10 Lg Electronics Inc. Appareil et procédé permettant de déterminer des séquences d'acides nucléiques au moyen d'un microscope à force atomique

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994023065A1 (fr) * 1993-04-06 1994-10-13 Institut Pasteur Procede rapide de determination d'une sequence d'adn et application au sequençage et au diagnostic

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8910566D0 (en) * 1989-05-08 1989-06-21 Amersham Int Plc Imaging apparatus and method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994023065A1 (fr) * 1993-04-06 1994-10-13 Institut Pasteur Procede rapide de determination d'une sequence d'adn et application au sequençage et au diagnostic

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENSIMON A ET AL: "ALIGNMENT AND SENSITIVE DETECTION OF DNA BY A MOVING INTERFACE", SCIENCE, vol. 265, 30 September 1994 (1994-09-30), pages 2096 - 2098, XP002036061 *
DESMAZE C ET AL: "IN SITU HYBRIDIZATION OF FLUORESCENT PROBES ON CHROMOSOMES, NUCLEI OR STRETCHED DNA: APPLICATIONS IN PHYSICAL MAPPING AND CHARACTERIZATION OF GENOMIC REARRANGEMENTS", CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 41, no. 7, November 1995 (1995-11-01), pages 925 - 931, XP000197050 *
ESSEVAZ-ROULET B. T AL.,: "Mechanical separation of the complementary strands of DNA", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 94, - October 1997 (1997-10-01), pages 11935 - 11940, XP002071032 *
NOY A. ET AL.,: "Stretching and breaking duplex DNA by chemical force microscopy", CHEMISTRY AND BIOLOGY, vol. 4, no. 7, - July 1997 (1997-07-01), pages 519 - 527, XP002071033 *
SMITH S. B. ET AL.,: "Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads", NATURE, vol. 258, - 13 November 1992 (1992-11-13), pages 1122 - 11126, XP002046416 *
VIOVY J -L ET AL: "SEQUENCAGE DE L'ADN PAR OUVERTURE MECANIQUE DE LA DOUBLE HELICE: UNE EVALUATION THEORIQUE ULTRAFAST SEQUENCING OF DNA BY MECHANICAL OPENING OF THE DOUBLE HELIX: A THEORETICAL INVESTIGATION", COMPTES RENDUS DES SEANCES DE L'ACADEMIE DES SCIENCES SERIE III: SCIENCES DE LA VIE, vol. 317, no. 9, 1 September 1994 (1994-09-01), pages 795 - 800, XP000608309 *

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CA2282725A1 (fr) 1998-08-27

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