FR2805742A1

FR2805742A1 - Antioxidant and UV-protective composition useful in cosmetic or dermatological skin care preparations comprises the colorless carotenoid phytoene

Info

Publication number: FR2805742A1
Application number: FR0002786A
Authority: FR
Inventors: Etienne Soudant; Hedva Schickler; Judith Paltiel; Aviv Shaish
Original assignee: I B R ISARELI BIOTECHNOLOGY RE
Current assignee: I B R ISARELI BIOTECHNOLOGY RE
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2001-09-07
Anticipated expiration: 2006-03-03
Also published as: FR2805742B3

Abstract

A novel composition (A) comprising phytoene (I) (7,8,11,12,7',8',11',12'-octahydro- psi , psi '-carotene) in an amount effective to prevent damage caused by oxidation or exposure to ultraviolet (UV) light, is new. An Independent claim is included for a method for preparing a composition containing (I), comprising: (a) incubating a carotenoid-producing organism in a medium under broad-spectrum light of intensity more than 10 W/m<2> (or out of doors under direct sunlight, from 80% shade to full sun), in presence of carotenoid synthesis inhibitor(s) (II); (b) culturing the organisms until (I) is obtained at a minimal content of 0.1-50 mg/l in the culture; and (c) separating the organisms from the culture.

Description

PREPARATION INCOLORE COMPRENANT DES CAROTENOÏDES DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne des préparations incolores comprenant des caroténoïdes. Ces préparations peuvent être utilisées dans la production d'aliments, de cosmétiques, ainsi que d'un nombre varié de médicaments, etc...Cette invention concerne également une méthode de production de caroténoïde incolore. COLORLESS PREPARATION CONTAINING CAROTENOIDS FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to colorless preparations comprising carotenoids. These preparations can be used in the production of food, cosmetics, as well as a variety of drugs, etc. This invention also relates to a method of producing colorless carotenoid.

ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
Les caroténoïdes sont des pigments produits par des micro-organismes, des champignons et des plantes. Les caroténoïdes les plus communs dans la préparation d'aliments, médicaments et cosmétiques sont le p-carotène et le lycopène. Le p-carotène et le lycopène comme la majorité des caroténoïdes sont sensibles à la lumière et à l'oxydation, deux propriétés qui limitent considérablement leurs emplois et qui racourcissent la date limite de validité des produits qui la contiennent (dans: Caroténoïdes, Chimie et Biologie, Krinski, N.I., Matthews-Roth, M.M., Taylor, R. F., (Eds), Planum Press, New York, Londres, 1989). En plus, le p-carotène et le lycopène ont une couleur orange qui limite leurs utilisations dans bons nombres de produits cosmétiques et alimentaires. BACKGROUND OF THE INVENTION
Carotenoids are pigments produced by microorganisms, fungi and plants. The most common carotenoids in the preparation of foods, drugs and cosmetics are p-carotene and lycopene. P-carotene and lycopene, like the majority of carotenoids, are sensitive to light and to oxidation, two properties which considerably limit their use and which shorten the expiry date of products containing it (in: Carotenoids, Chemistry and Biology, Krinski, NI, Matthews-Roth, MM, Taylor, RF, (Eds), Planum Press, New York, London, 1989). In addition, p-carotene and lycopene have an orange color which limits their uses in many cosmetic and food products.

Le phytoène (7,8, 11, 12, 7', 8', 11', 12'-octahydro-y,y-carotène) est lui aussi un caroténoïde (chaîne isoprénoïque en C40 ) et est l'un des précurseurs de la voie biosynthétique menant à la production de p-carotène, lycopène et d'autres caroténoïdes (le phytoène est le premier précurseur spécifique de la voie de synthèse des caroténoïdes). Le brevet d'Application Japonais No. 90-40520, a révélé que l'introduction d'une séquence de ADN produisant du phytoène dans certaines cellules cancéreuses transfectées bloque leur croissance et inhibe Phytoene (7,8, 11, 12, 7 ', 8', 11 ', 12'-octahydro-y, y-carotene) is also a carotenoid (C40 isoprenoic chain) and is one of the precursors of the biosynthetic pathway leading to the production of p-carotene, lycopene and other carotenoids (phytoene is the first specific precursor of the carotenoid synthesis pathway). Japanese Application Patent No. 90-40520, has disclosed that the introduction of a DNA sequence producing phytoene into certain transfected cancer cells blocks their growth and inhibits their growth.

l'activation par le virus Epstein Barr. (EBV). activation by the Epstein Barr virus. (EBV).

RESUME DE L'INVENTION
D'après la présente invention, il a été montré que le phyotène possède des propriétés anti-oxydantes et qu'en plus, il absorbe la lumière ultra-violette (UV). En plus de ces propriétés, le phytoène est beaucoup plus stable à l'oxydation que, par exemple, le p-carotène. Ces découvertes indiquent que le phytoène peut être utile à la prévention de certains types de dégats provoqués par l'environnement. SUMMARY OF THE INVENTION
According to the present invention, it has been shown that phyotene has anti-oxidant properties and that in addition, it absorbs ultra-violet (UV) light. In addition to these properties, phytoene is much more stable to oxidation than, for example, p-carotene. These findings indicate that phytoene may be useful in preventing certain types of environmental damage.

Donc, d'après cette invention, il existe une composition comprenant du phyotène et qui intervient contre les dégâts provoqués par l'oxydation et par l'exposition à la lumière UV. Therefore, according to this invention, there is a composition comprising phyotene and which acts against damage caused by oxidation and exposure to UV light.

D'après cette invention, le terme "dégâts" doit être interprété comme des dégâts provoqués par toute une gamme d'agents oxydants, tels que l'oxygène luimême, le radical hydroxyle, le peroxide d'hydrogène, d'autres radicaux libres, l'ozone etc., ou par n'importe quelle radiation UV délétère. Les dégâts dépendent du type d'application de cette préparation. Par exemple, lorsque cette préparation est destinée à être appliquée sur la peau, les dégâts peuvent être des brulûres, des ampoules ou des lésions semblables à celles provoquées par une exposition chronique au soleil, c'est à dire, le vieillissement prématurée de la peau, etc. According to this invention, the term "damage" is to be interpreted as damage caused by a variety of oxidizing agents, such as oxygen itself, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, other free radicals, ozone etc., or by any harmful UV radiation. The damage depends on the type of application of this preparation. For example, when this preparation is intended to be applied to the skin, the damage may be burns, blisters or lesions similar to those caused by chronic exposure to the sun, i.e., premature aging of the skin. , etc.

Lorsque cette préparation est destinée à être utilisée pour préserver des aliments, les dégâts peuvent se traduire par une diminution de la stabilité du produit ou une modification chimique ayant comme conséquence, par exemple la rancidité, ou le viellissement accéléré de l'aliment, etc. When this preparation is intended for use in preserving food, the damage may result in a decrease in the stability of the product or a chemical modification resulting in, for example, rancidity, or accelerated aging of the food, etc.

L'invention concerne une composition comprenant une quantité de phytoène efficace pour prévenir les dégats provoqués par l'oxydation ou par l'exposition à la lumière UV. The invention relates to a composition comprising an amount of phytoene effective to prevent damage caused by oxidation or exposure to UV light.

Selon une disposition avantageuse de l'invention, la composition topique qui protège la peau contre les dégats de l'environnement, contient du phytoène en According to an advantageous arrangement of the invention, the topical composition which protects the skin against environmental damage, contains phytoene in

quantité agir contre l'oxydation et les effets UV sur la peau. quantity acts against oxidation and UV effects on the skin.

Le terme "dégats de l'environnemenf' est en rapport avec n'importe quel agent nuisible de l'environnement, tel que les radiations UV et les agents oxydants. The term "environmental damage" relates to any harmful agent of the environment, such as UV radiation and oxidizing agents.

Le terme "quantité efficace" doit être compris comme un dosage de phytoène adéquat aux résultats souhaités. The term "effective amount" is to be understood as a dosage of phytoene adequate for the desired results.

Dans la composition de cette invention, le phytoène peut être sous la forme trans et/ou cis. L'une des nouveautés de ces compositions concernées par l'invention est que, quoique possédant les propriétés citées ci-dessus, le phyotène est incolore. Le fait que la composition est incolore permet que le caroténoïde n'aura pas d'effet sur les propriétés esthétiques de la préparation le contenant. En plus, l'absence d'absortion de lumière dans le visible (qui se manifeste par le fait qu'il n'a pas de couleur), le rend stable à une éventuelle dégradation à la lumière du jour. In the composition of this invention, the phytoene can be in the trans and / or cis form. One of the novelties of these compositions concerned by the invention is that, although having the properties mentioned above, phyotene is colorless. The fact that the composition is colorless allows the carotenoid to have no effect on the aesthetic properties of the preparation containing it. In addition, the absence of light absorption in the visible (which is manifested by the fact that it has no color), makes it stable to possible degradation in daylight.

La préparation peut, selon une disposition avantageuse de l'invention, être utilisée comme un cosmétique pour la peau ou comme préparation pharmaceutique pour protéger la peau contre les agressions de l'environnement, telles que celles décrites ci-dessus, y-compris les radiations UV ou les dégâts qui peuvent être provoqués par toute une gamme d'agents oxydants. Une composition pour la peau selon cette invention, peut être sous forme de gel, d'émulsion , huile dans eau ou eau dans huile, de pommade, d'onguent, etc. The preparation can, according to an advantageous arrangement of the invention, be used as a cosmetic for the skin or as a pharmaceutical preparation for protecting the skin against environmental attacks, such as those described above, including radiation. UV or damage that can be caused by a variety of oxidizing agents. A composition for the skin according to this invention can be in the form of a gel, emulsion, oil in water or water in oil, ointment, ointment, etc.

D'après un autre objet de l'invention, cette composition peut être utilisée comme additif dans la préparation d'aliments, par exemple pour préserver les aliments contre l'oxydation de plusieurs ingrédients utilisés dans la production alimentaire, tel que les huiles, les graisses . Elle peut également être utilisée dispersée comme par exemple dans des yaourts ou de manière plus générale comme complément alimentaire. According to another object of the invention, this composition can be used as an additive in the preparation of food, for example to preserve food against the oxidation of several ingredients used in food production, such as oils, fats. It can also be used dispersed, for example in yoghurts or more generally as a food supplement.

Parfois, la composition de cette invention peut comprendre des élements supplémentaires qui ne changent pas substantiellement ses charactéristiques de Sometimes the composition of this invention may include additional elements which do not substantially change its characteristics.

base. L'un d'eux est, par exemple, le zetacarotène (7,8,7',8'-tetrahydro-y,ycarotene) ou le phytofluène (15Z,7,8,11,12,7',8'-hexahydro-y,y,-carotène). based. One of them is, for example, zetacarotene (7,8,7 ', 8'-tetrahydro-y, ycarotene) or phytofluene (15Z, 7,8,11,12,7', 8'- hexahydro-y, y, -carotene).

La composition de cette invention peut, évidemment selon le but recherché, comprendre d'autres ingrédients, tels que des véhicules cosmétiques ou pharmaceutiques acceptables, d'autres anti-oxydants, des agents conservateurs, plusieurs ingrédients pharmaceutiques ou cosmétiques actifs, tels que des médicaments actifs par voie topique, etc. The composition of this invention may, obviously depending on the desired purpose, comprise other ingredients, such as acceptable cosmetic or pharmaceutical vehicles, other anti-oxidants, preservatives, several active pharmaceutical or cosmetic ingredients, such as medicaments. topically active, etc.

Selon une caractéristique intéressante de l'invention, la composition peut comprendre aussi un véhicule hydrophobique, choisi parmi des huiles utilisées couramment dans les industries cosmétiques, pharmaceutiques ou alimentaires, tels que les huiles végétales, minérales ou synthétiques. According to an advantageous characteristic of the invention, the composition can also comprise a hydrophobic vehicle, chosen from oils commonly used in the cosmetic, pharmaceutical or food industries, such as vegetable, mineral or synthetic oils.

Le phytoène peut être obtenu à partir de différentes sources. Il peut être tiré d'organismes qui produisent des caroténoïdes, tels que de nombreuses plantes, plusieurs algues et particulièrement les micro-algues Dunaliella sp, qui en sont un exemple représentatif. De très faibles quantités de (ugs) phytoène ont été produites par des organismes producteurs de ss-caroténoïdes. Cette invention fournit une méthode qui permet aux organismes producteurs de caroténoïdes de produire des quantités substantielles de phytoène. Le terme "quantité substantielle" correspond à une quantité de phytoène oscillant entre environ 0.1 mg/l de culture à environ 50 mg/l de culture, typiquement de environ 1 mg/l à environ 20 mg/l de culture. Quand l'organisme qui produit les caroténoïdes est l'algue Dunaliella sp., la quantité typique de phytoène qui peut être produite varie entre 1 mg/l à 15 mg/l. D'après la méthode décrite dans cette invention, l'organisme producteur de caroténoïdes, typiquement les algues, peut être cultivé dans différentes conditions. Phytoene can be obtained from different sources. It can be derived from organisms which produce carotenoids, such as many plants, several algae and particularly the microalgae Dunaliella sp, which are a representative example. Very small amounts of phytoene (ugs) have been produced by ss-carotenoid producing organisms. This invention provides a method which allows carotenoid producing organisms to produce substantial amounts of phytoene. The term “substantial amount” corresponds to an amount of phytoene ranging between approximately 0.1 mg / l of culture to approximately 50 mg / l of culture, typically from approximately 1 mg / l to approximately 20 mg / l of culture. When the organism that produces carotenoids is the algae Dunaliella sp., The typical amount of phytoene that can be produced varies between 1 mg / l to 15 mg / l. According to the method described in this invention, the organism producing carotenoids, typically algae, can be cultivated under different conditions.

Selon une disposition avantageuse de la présente invention, les organismes producteurs de caroténoïdes sont cultivés à l'air libre, comme dans le cas, par exemple de Dunaliella sp. qui est cultivée dans des piscines extérieures, avec un According to an advantageous arrangement of the present invention, the carotenoid-producing organisms are cultivated in the open air, as in the case, for example, of Dunaliella sp. which is grown in outdoor swimming pools, with a

milieu de culture comprenant de l'eau de mer et de l'eau salée recyclée, à une température de 10 C à 40 C environ. Les organismes peuvent être cultivés à la lumière directe du jour, entre 80% d'ombre et jusqu'en plein soleil. Dans une disposition avantageuse de la présente invention, les organismes producteurs de caroténoïdes sont cultivés à la lumière du jour, entre 40% d'ombre et jusqu'en plein soleil. culture medium comprising sea water and recycled salt water, at a temperature of approximately 10 C to 40 C. Organisms can be grown in direct daylight, between 80% shade and up to full sun. In an advantageous arrangement of the present invention, the carotenoid producing organisms are cultivated in daylight, between 40% shade and up to full sun.

Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne aussi, les organismes producteurs de caroténoïdes lorsqu'ils sont cultivés dans un milieu de culture typiquement à l'intérieur d'un fermenteur et à température ambiante. Dans ce cas là, le milieu de culture comprend typiquement plusieurs associations possibles de sels et minéraux (voir l'exemple 1. 1 ci-dessous). D'après cette réalisation, les organismes se cultivent sous une lumière à large spectre (une lumière qui comporte une portion substantielle de lumière visible de type " lumière du jour') avec une énergie supérieure à 10 W/m 2 environ et qui peut varier de 10 W/m2à 200 W/m2 environ. According to a second aspect, the present invention also relates to the organisms producing carotenoids when they are cultivated in a culture medium typically inside a fermenter and at room temperature. In this case, the culture medium typically comprises several possible combinations of salts and minerals (see Example 1.1 below). According to this realization, the organisms are cultivated under a light with broad spectrum (a light which comprises a substantial portion of visible light of the "daylight" type) with an energy greater than about 10 W / m 2 and which can vary. from 10 W / m2 to 200 W / m2 approximately.

La méthode conforme à la présente invention permet de produire des quantités substantielles de phytoène après plusieurs jours de culture de ces organismes (c'est à dire, entre 4 et 10 jours). The method according to the present invention makes it possible to produce substantial amounts of phytoene after several days of culturing these organisms (ie, between 4 and 10 days).

Le phytoène est extrait dans des conditions qui favorisent son accumulation, dans les cellules des organismes, typiquement, en faisant croître un organisme producteur de p-carotène en présence d'inhibiteurs de biosynthèse des caroténoïdes, qui sont des inhibiteurs des stades de réaction subséquents de la voie biochimique de la production de caroténoïdes. Un exemple d'inhibiteur de caroténoïdes qui peut être utilisé d'après cette invention est le 4-chloro- 5(methylamino)-2-(3- (trifluorométhyl) phényl)-3(2H)-pyridazinone (dorénavant: "l'inhibiteur chloro-4"). Quand la source de phytoène est la micro algue Dunaliella, l'inhibiteur chloro-4 est typiquement inclus dans ce milieu de croissance en concentration d'environ 0.4 M (Ben-Amotz et al., Plant Physiol. 86 :1286, 1988). Phytoene is extracted under conditions which promote its accumulation, in the cells of organisms, typically by growing a p-carotene-producing organism in the presence of inhibitors of carotenoid biosynthesis, which are inhibitors of the subsequent reaction stages of the biochemical pathway of carotenoid production. An example of a carotenoid inhibitor which can be used according to this invention is 4-chloro- 5 (methylamino) -2- (3- (trifluoromethyl) phenyl) -3 (2H) -pyridazinone (henceforth: "l ' chloro-4 inhibitor "). When the source of phytoene is the microalga Dunaliella, the inhibitor chloro-4 is typically included in this growth medium at a concentration of about 0.4 M (Ben-Amotz et al., Plant Physiol. 86: 1286, 1988).

D'autres inhibiteurs peuvent être utilisés, par exemple le J334, (Ben-Amotz et al. Supra) Sandoz H 6706 (Kümmel, H. W. et al., Z. Naturforsch 30c, 333,1975), diphenyl-amine (DPA) (Foppen F. H., Ann. Ist. Super. Sanita, 439,1969) et la nicotine (Shaish et al, Plant Cell Physiolo 31 :689, (1990)). Other inhibitors can be used, for example J334, (Ben-Amotz et al. Supra) Sandoz H 6706 (Kümmel, HW et al., Z. Naturforsch 30c, 333,1975), diphenyl-amine (DPA) ( Foppen FH, Ann. Ist. Super. Sanita, 439,1969) and nicotine (Shaish et al, Plant Cell Physiolo 31: 689, (1990)).

Selon une disposition avantageuse de l'invention, une méthode pour la préparation d'une composition contenant du phytoène comprend les stades suivants : (a) incubation d'un organisme producteur de caroténoïdes avec un milieu de culture et sous lumière artificielle à large spectre (du type "lumière du jour'), d'une intensité supérieure à 10 W/m2 avec un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes. According to an advantageous arrangement of the invention, a method for the preparation of a composition containing phytoene comprises the following stages: (a) incubation of an organism producing carotenoids with a culture medium and under broad spectrum artificial light ( of the "daylight" type), with an intensity greater than 10 W / m2 with one or more carotenoid synthesis inhibitors.

(b) croissance des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à ce que le niveau de phytoène atteigne environ 0,1 mg/l de culture à 50 mg/l de culture environ, et (c) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. (b) growth of said carotenoid-producing organisms until the level of phytoene reaches approximately 0.1 mg / l of culture to approximately 50 mg / l of culture, and (c) separation of said organisms from the culture of which they are from.

Selon une autre disposition avantageuse de l'invention une méthode est fournie pour la préparation d'une composition contenant du phytoène comprenant les stades de: (i) incubation en extérieur d'un organisme producteur de caroténoïdes, à l'intérieur d'un milieu de culture à la lumière directe du soleil allant de 80% d'ombre jusqu'en plein soleil avec un ou plusieurs inhibiteurs de synthèse de caroténoïdes; (ii) croissance des dits organismes producteurs de caroténoïdes jusqu'à un niveau de phytoène d'environ 0,1 mg/l de culture et jusqu'à environ 50 mg/l de culture avantageusement entre 1 mg/l et 50 mg/l; et (iii) séparation des dits organismes de la culture dont ils sont issus. According to another advantageous arrangement of the invention a method is provided for the preparation of a composition containing phytoene comprising the stages of: (i) outside incubation of an organism producing carotenoids, inside a medium growing in direct sunlight from 80% shade to full sun with one or more carotenoid synthesis inhibitors; (ii) growth of said carotenoid-producing organisms up to a phytoene level of around 0.1 mg / l of culture and up to around 50 mg / l of culture, advantageously between 1 mg / l and 50 mg / l ; and (iii) separation of said organisms from the culture from which they originate.

Selon une caractéristique intéressante avantageuse de l'invention, le phytoène provenant des organismes, peut être employé directement sans être séparé de la matière sèche de ces organismes . Cependant, d'après une disposition avantageuse de l'invention, après la séparation de l'organisme According to an advantageous advantageous characteristic of the invention, the phytoene originating from the organisms can be used directly without being separated from the dry matter of these organisms. However, according to an advantageous arrangement of the invention, after the separation of the organism

producteur de caroténoïdes de la culture, une autre préparation peut être réalisée à partir des organismes contenant du phyotène. Typiquement, cette préparation est un extrait qui peut être réalisé à partir d'organismes producteurs de caroténoïdes par n'importe quelle méthode d'extraction courante dans ce domaine, comme, par exemple, par extraction, par exemple à l'aide d'un mélange éthanolhexane. culture carotenoid producer, another preparation can be made from organisms containing phyotene. Typically, this preparation is an extract which can be made from carotenoid producing organisms by any extraction method common in this field, such as, for example, by extraction, for example using a ethanolhexane mixture.

Selon une caractéristique intéressante de l'invention, les auteurs ont découvert que l'extraction ou la séparation de phyotène d'autres substances éventuellement présentes dans la culture se réalise avantageusement en ajoutant du charbon actif à la culture ou en l'ajoutant pendant l'extraction du caroténoïde. According to an interesting characteristic of the invention, the authors have discovered that the extraction or separation of phyotene from other substances possibly present in the culture is advantageously carried out by adding activated carbon to the culture or by adding it during the carotenoid extraction.

Le charbon est utilisable lorsqu'on se sert d'un inhibiteur, aussi bien que lorsqu'il n'est pas utilisé. Le charbon est ensuite séparé du milieu de culture par centrifugation ou filtration. Charcoal is usable when an inhibitor is used, as well as when it is not. The charcoal is then separated from the culture medium by centrifugation or filtration.

En plus de l'exposé ci-dessus, et selon une disposition avantageuse de l'invention, le phytoène de la composition peut être synthétisé par n'importe quelle des méthodes chimiques et biochimiques connues ou par des méthodes de recombinaison génétique. Chimiquement, le phytoène peut être synthétisé à partir de deux pyrophosphates de géranylgéranyl (C-20) par une réaction qui peut être catalysée par la phytoène synthase . Le géranylgéranyl pyrophosphate peut être obtenu directement par la conversion d'acide mévalonique ou par la condensation de pyruvate et de glycéraldéhyde-3-phosphate. Les méthodes de recombinaison comprennent, par exemple, la mutagénese des enzymes situées en aval du phytoène. Les phytoènes ainsi synthétisés ont une activité équivalente aux activités du phytoène obtenus d'organismes qui produisent des caroténoïdes comme décrit ci-dessus. In addition to the description above, and according to an advantageous arrangement of the invention, the phytoene of the composition can be synthesized by any of the known chemical and biochemical methods or by genetic recombination methods. Chemically, phytoene can be synthesized from two geranylgeranyl (C-20) pyrophosphates by a reaction which can be catalyzed by phytoene synthase. Geranylgeranyl pyrophosphate can be obtained directly by the conversion of mevalonic acid or by the condensation of pyruvate and glyceraldehyde-3-phosphate. Recombinant methods include, for example, mutagenesis of enzymes located downstream of the phytoene. The phytoenes thus synthesized have an activity equivalent to the activities of phytoene obtained from organisms which produce carotenoids as described above.

La stabilité des phytoènes dans la composition de cette invention est testée en exposant la composition de caroténoïde àla lumière et/ou à des agents oxydants. L'effet de ces traitements sur les caroténoïdes dans les compositions de cette invention, est moindre que l'effet de ces traitements sur d'autres The stability of the phytoenes in the composition of this invention is tested by exposing the carotenoid composition to light and / or oxidizing agents. The effect of these treatments on the carotenoids in the compositions of this invention is less than the effect of these treatments on other

caroténoïdes de référence, comme par exemple, le (3-carotène. reference carotenoids, such as, for example, (3-carotene.

L'art antérieur montre qu'un nombre important de caroténoïdes, soumis à ces traitements se dégradent rapidement, ce qui se manifeste, par exemple, par une modification de l'absorption de la lumière dans le visible, c'est à dire, en un changement de leur couleur. L'effet anti-oxydant de la composition de cette invention peut-être déterminé, par exemple, en mesurant l'effet de protection de l'ADN face àune agression par des oxydants (Salles et al., Anal. Biochem., 232:37, 1995). The prior art shows that a large number of carotenoids, subjected to these treatments degrade rapidly, which manifests itself, for example, by a modification of the absorption of light in the visible, that is to say, in a change in their color. The antioxidant effect of the composition of this invention can be determined, for example, by measuring the protective effect of DNA against aggression by oxidants (Salles et al., Anal. Biochem., 232: 37, 1995).

L' invention est illustrée ci-dessous par des exemples donnés à titre non limitatif et conformément à l'invention. The invention is illustrated below by examples given without limitation and in accordance with the invention.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Afin de comprendre l'invention et comment elle est mise en oeuvre concrètement, une réalisation est donnée ci-dessous, sous la forme d'exemple non limitatif, avec le shéma suivant dans lequel: Fig. 1 montre l'absorption du spectre de UV d'une composition comprenant du phytoène extrait de Dunaliella sp. cultivé avec l'inhibiteur chloro-4. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
In order to understand the invention and how it is implemented in practice, one embodiment is given below, in the form of a non-limiting example, with the following diagram in which: FIG. 1 shows the absorption of the UV spectrum of a composition comprising phytoene extracted from Dunaliella sp. cultivated with the inhibitor chloro-4.

MATERIELS ET METHODES 1.Milieu de Croissance Les milieux de croissance suivants ont été utilisés: 1. 1 Un milieu de croissance contenant: MgS04, 5 mM; CaCl2, 0. 2 mM ; KH2P04, 0. 2 mM ; FeCI3 + Na2EDTA, 2uM+5 M; MnCI2, 7 M; CuCI2, 1 (M; ZnCl2, 1 (M; CoCI2, 1 M; (NH4)6MO7O24, 1 M; NaCI, 1 M; NaHC03, 50 mM; KCI, 5 mM. MATERIALS AND METHODS 1. Growth Medium The following growth media were used: 1. 1 Growth medium containing: MgSO4, 5 mM; CaCl2, 0.2 mM; KH2PO4, 0.2mM; FeCl3 + Na2EDTA, 2uM + 5M; MnCl2, 7M; CuCl2, 1 (M; ZnCl2, 1 (M; CoCl2, 1 M; (NH4) 6MO7O24, 1 M; NaCl, 1 M; NaHCO3, 50 mM; KCl, 5 mM.

Ce milieu de croissance est utilisé typiquement pour la culture d'organismes producteurs de caroténoïde en intérieur, sous conditions artificielles. This growth medium is typically used for the cultivation of carotenoid producing organisms indoors under artificial conditions.

1. 2 Un milieu de croissance contenant un mélange d'eau de mer et de l'eau salée 1.2 A growth medium containing a mixture of sea water and salt water

recyclée ayant un degré de salinité de 2M environ. Ce moyen est utilisé typiquement dans la culture de caroténoïdes à l'extérieur, au soleil. recycled having a degree of salinity of about 2M. This medium is typically used in the cultivation of carotenoids outdoors, in the sun.

Le pH final des milieux de croissance est compris entre 7. 0 et 8.0. The final pH of the growth media is between 7. 0 and 8.0.

2. Produits
L'inhibiteur de la biosynthèse p-carotène peut être le 4-chloro- 5(methylamino)-2- (3-(trifluoro-methyl)phenyl)-3(2H)-pyridazinone. L'inhibiteur chloro-4 est employé pour la production de phytoène. La concentration de l'inhibiteur chloro-4 varie entre 0.07 M et 1 M environ. 2. Products
The inhibitor of p-carotene biosynthesis can be 4-chloro- 5 (methylamino) -2- (3- (trifluoro-methyl) phenyl) -3 (2H) -pyridazinone. The chloro-4 inhibitor is used for the production of phytoene. The concentration of the 4-chloro inhibitor varies between approximately 0.07 M and 1 M.

Du charbon actif non-traité est utilisé pour séparer le phyotène d'autres caroténoïdes. Le charbon est séparé de l'extrait par filtration pendant les derniers stades de la préparation de l'extrait. Untreated activated carbon is used to separate phyotene from other carotenoids. The charcoal is separated from the extract by filtration during the later stages of the preparation of the extract.

Plusieurs huiles commerciales naturelles, minérales ou synthétiques sont utilisées pour dissoudre le phytoène. Several commercial natural, mineral or synthetic oils are used to dissolve phytoene.

3. Croissance de Dunaliella sp. 3. Growth of Dunaliella sp.

Les algues Dunaliella sp sont cultivés dans les conditions suivantes:
3. 1 Dans le milieu de croissance décrit dans 1. 1 ci dessus, à l'intérieur d'un fermenteur, à température ambiante, sous une lumière artificielle variant d'une intensité faible (de 1 W/m2) à une intensité vive (au dessus de 10 W/m2), typiquement sous une lumière de plus de 10 W/m2, variant entre 10 W/m2 et 200 W/m2. Dunaliella sp algae are grown under the following conditions:
3.1 In the growth medium described in 1. 1 above, inside a fermenter, at room temperature, under artificial light varying from low intensity (from 1 W / m2) to high intensity (above 10 W / m2), typically under a light of more than 10 W / m2, varying between 10 W / m2 and 200 W / m2.

3. 2 Dans des piscines en extérieure à une température variant de 10 C à 40 C environ, sous des conditions d'éclairage variant entre 80% d'ombre et jusqu'en plein soleil, typiquement entre 40% d'ombre et le plein soleil. 3. 2 In outdoor swimming pools at a temperature varying from 10 C to 40 C approximately, under lighting conditions varying between 80% shade and up to full sun, typically between 40% shade and full Sun.

4. Méthode d'extraction des Caroténoïdes Le phyotène est produit par inhibition de la synthèse de p-carotène dans les algues Dunaliella sp. , par l'inhibiteur chloro-4 à une concentration de 0.07 M à 1.0 M. Les algues sont collectées après quatre à dix jours de croissance, soit à l'intérieur ou à l'extérieur, comme décrit ci-dessus et extraites avec un mélange l' éthanol:hexane (1:2) v/v. L'éthanol est d'abord utilisé dans une proportion algues-éthanol de 1 :10. ce stade une hydrolyse basique des liaisons esters est réalisée en rajoutant 0.5MNaOH, en agitant pendant 30 minutes, minimum. La phase de séparation éthanol:hexane est réalisée en rajoutant du NaC1 en quantité adéquate. La fraction hexane est analysée spectrophotométriquement. 4. Method of Extraction of Carotenoids Phyotene is produced by inhibiting the synthesis of β-carotene in the algae Dunaliella sp. , by the inhibitor chloro-4 at a concentration of 0.07 M to 1.0 M. The algae are collected after four to ten days of growth, either indoors or outdoors, as described above and extracted with a mixes ethanol: hexane (1: 2) v / v. Ethanol is first used in an algae-ethanol ratio of 1: 10. this stage a basic hydrolysis of the ester bonds is carried out by adding 0.5MNaOH, while stirring for 30 minutes, minimum. The ethanol: hexane separation phase is carried out by adding NaCl in an adequate amount. The hexane fraction is analyzed spectrophotometrically.

5. Séparation du Phytoène Afin d'assurer qu'il ne reste pas de résidu d'autres caroténoïdes après l'extraction, les stades suivants de séparation sont avantagesement ajoutés à la méthode d'extraction : (1 ) La concentration de beta-carotène est mesurée dans l'extrait d' hexane. 5. Separation of Phytoene In order to ensure that no residue of other carotenoids remains after extraction, the following separation stages are advantageously added to the extraction method: (1) The concentration of beta-carotene is measured in the hexane extract.

(2) Le charbon actif est ajouté dans une proportion comprise entre 0,01 mg et 0,07 mg (idéalement 0,02mg) de charbon actif par g beta-carotène. Le mélange est agité pendant 30 minutes. (2) The activated charcoal is added in a proportion of between 0.01 mg and 0.07 mg (ideally 0.02 mg) of activated charcoal per g beta-carotene. The mixture is stirred for 30 minutes.

(3) La concentration de beta-carotène est de nouveau mesurée. (3) The concentration of beta-carotene is measured again.

(4) Le charbon actif est ajouté dans une proportion comprise entre 0.1mg et 0,3mg (idéalement 0,2mg) de charbon actif par g de beta-carotène. Le mélange est remué pendant 10 minutes. (4) The activated charcoal is added in a proportion of between 0.1 mg and 0.3 mg (ideally 0.2 mg) of activated charcoal per g of beta-carotene. The mixture is stirred for 10 minutes.

(5) Les stades 3 et 4 sont répétés. (5) Steps 3 and 4 are repeated.

(6) Le charbon actif est séparé de l'extrait d'hexane par filtration, au travers de filtre 1.0u, suivis de filtre 0.2u. (6) The activated carbon is separated from the hexane extract by filtration, through a 1.0u filter, followed by a 0.2u filter.

(7) L'hexane est partiellement évaporé sous vide et le phytoène est maintenu alors concentré à l'intérieur de l' hexane, ou bien l' hexane est totalement évaporé et le (7) The hexane is partially evaporated in vacuo and the phytoene is then kept concentrated within the hexane, or the hexane is completely evaporated and the

phytoène est re-dissous de l'huile. phytoene is re-dissolved from the oil.

6. Analyse Spectrophotométrique Le spectre d'absorption de l'extrait de phytoène est déterminé en utilisant un spectrophotomètre Hewlett Packard 8452A . 6. Spectrophotometric Analysis The absorption spectrum of the phytoene extract is determined using a Hewlett Packard 8452A spectrophotometer.

7. Stabilité du phytoène dans des conditions aérobiques sous lumière UV et à plusieurs températures d'incubation. 7. Stability of phytoene under aerobic conditions under UV light and at various incubation temperatures.

# La stabilité du phytoène à différentes températures est déterminée par exposition à différents temps dans plusieurs types d'huile et de solvants, à 4 C, 23 C, 30 C et 60 C. La quantité de phytoène restante est déterminée spectrophotométriquement. Le pourcentage de phytoène restant (% PH restant) est calculé de la manière suivante:
Phytoène après traitement (mg/ml) X 100
Phytoène avant traitement (mg/ml) # Détermination de stabilité sous lumière UV (254 nm, 365 nm, 254 + 365 nm), pendant 30 minutes. à 300/310 w/cm2. # The stability of phytoene at different temperatures is determined by exposure to different times in several types of oil and solvents, at 4 C, 23 C, 30 C and 60 C. The amount of phytoene remaining is determined spectrophotometrically. The percentage of phytoene remaining (% PH remaining) is calculated as follows:
Phytoene after treatment (mg / ml) X 100
Phytoene before treatment (mg / ml) # Determination of stability under UV light (254 nm, 365 nm, 254 + 365 nm), for 30 minutes. at 300/310 w / cm2.

8. Stabilité du phytoène dans des conditions aérobies et à la lumière du jour: La stabilité du phytoène à la lumière est mesurée en pleine lumière (à midi, en plein été à Rehovot, Israel), filtrée à travers un filtre de type "hot miror' (Andover Corporation, Salem, NH, filtre de transmitance 400-650nm). Les spécimens sont dissous à l'éthanol, exposés à la lumière pendant 30-150 minutes et ensuite extraits dans l'hexane après l'hydrolyse basique (d'après la méthode d'extraction ci-dessus). Les quantités de phytoène et de beta-carotène ont été mesurés 8. Stability of the phytoene under aerobic conditions and to daylight: The stability of the phytoene to light is measured in full light (at noon, in midsummer in Rehovot, Israel), filtered through a "hot" type filter. miror '(Andover Corporation, Salem, NH, 400-650nm transmittance filter). Specimens are dissolved in ethanol, exposed to light for 30-150 minutes and then extracted into hexane after basic hydrolysis (d 'after the extraction method above). The amounts of phytoene and beta-carotene were measured

spectrophotométriquement et le pourcentage des caroténoïdes restants a été calculé d'après la section 7 ci-dessus. spectrophotometrically and the percentage of carotenoids remaining was calculated from section 7 above.

9. Activité antiradicalaire 9. a Décomposition du radical hydroxyle: La capacité de l'extrait à décomposer les radicaux hydroxyles ( OH) a été mesurée par la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE), en comparant l'intensité du signal avec ou sans le composé. Les radicaux hydroxyles sont générés par décomposition du peroxide d'hydrogène par le fer [(FeS04). Réaction de Fenton], le OH est piégé par le DMPO afin de fournir un adduit DMPO-OH , qui présente un signal caractéristique en RPE. Le composé, comprenant du phytoène a été rajouté au système en trois dilutions 1/20, 1/50 and 1/200 (pré-addition). 9. Anti-free radical activity 9. a Decomposition of the hydroxyl radical: The capacity of the extract to decompose the hydroxyl radicals (OH) was measured by Electronic Paramagnetic Resonance (EPR), by comparing the intensity of the signal with or without the compound. . Hydroxyl radicals are generated by decomposition of hydrogen peroxide by iron [(FeSO4). Fenton reaction], OH is trapped by DMPO in order to provide a DMPO-OH adduct, which exhibits a characteristic signal in RPE. The compound, comprising phytoene, was added to the system in three dilutions 1/20, 1/50 and 1/200 (pre-addition).

Vu que plusieurs substances peuvent réduire le signal, non pas en piégant le OH, mais en ajoutant un adduit DMPO-OH, il est nécessaire d'évaluer le signal lorsqu'on ajoute le produit, après la réaction de Fenton (post-addition). Since several substances can reduce the signal, not by trapping the OH, but by adding a DMPO-OH adduct, it is necessary to evaluate the signal when adding the product, after the Fenton reaction (post-addition) .

La capacité de piéger le radical hydroxyl est évaluée théoriquement par la différence entre la valeur du signal, RPE est enregistrée lors de la pré-addition du produit et la valeur du signal enregistrée au moment de la post-addition du produit. The capacity to scavenge the hydroxyl radical is theoretically evaluated by the difference between the value of the signal, RPE is recorded during the pre-addition of the product and the value of the signal recorded at the time of the post-addition of the product.

9. b Protection de l'ADN par effet anti-oxydant : La protection de l'ADN par effet anti-oxydant est examinée, sur la base de la méthode de Salles et al. (Supra). L'effet protecteur du composé contre les ROS (Reactive Oxygen Species), générant des dégâts oxydatifs sur l'ADN est mesuré par une quantification de l'inhibition de formation de lésions du ADN. L'ADN utilisé est de nature plasmidique. 9.b Protection of DNA by anti-oxidant effect: The protection of DNA by anti-oxidant effect is examined, on the basis of the method of Salles et al. (Supra). The protective effect of the compound against ROS (Reactive Oxygen Species), generating oxidative damage to DNA, is measured by quantifying the inhibition of DNA lesion formation. The DNA used is plasmid in nature.

II. RESULTATS Exemple 1 Production de phytoène Les phytoènes sont produits à partir des algues Dunaliella sp. en les cultivant en présence d'un inhibiteur chloro-4 (0. 1-0.5 g) de la biosynthèse de p-carotène, selon la description ci-dessus. Les cultures ont été extraites et l'extrait a été séché II. RESULTS Example 1 Production of phytoene The phytoenes are produced from the algae Dunaliella sp. by culturing them in the presence of a 4-chloro inhibitor (0.1-0.5 g) of p-carotene biosynthesis, as described above. The cultures were extracted and the extract was dried.

par évaporation et re-dissous dans l'hexane ou dans l'huile. Des éventuels résidus de l'inhibiteur chloro-4 n'ont pas été détectés dans les caroténoïdes extraits. by evaporation and re-dissolved in hexane or in oil. Any residues of the 4-chloro inhibitor were not detected in the extracted carotenoids.

Selon la Fig. 1, le principal pic d'absorption du phytoène a été identifiée à 286 nm (UVB). Comme prévu, le principal pic d'absorption du p-carotène est à 450 nm. La quantité de (3-carotène a été réduite en raison de l'inhibition de la synthèse, alors que la quantité de phytoène a été augmentée. According to FIG. 1, the main absorption peak of phytoene was identified at 286 nm (UVB). As expected, the main absorption peak for p-carotene is at 450 nm. The amount of (3-carotene was reduced due to inhibition of synthesis, while the amount of phytoene was increased.

Exemple 2 Exemple de la stabilité des extraits de phytoène sous lumière UV La stabilité des extraits de phytoène obtenus, comme démontré dans l'exemple 1 ci-dessus, est déterminée par analyse spectrophométrique. Le phytoène est dissous dans l'huile ou dans de l'hexane. L'absorption de la préparation est mesurée entre 220nm et 600nm et la quantité de phytoène dans chaque spécimen est calculée afin de déterminer le pourcentage de phytoène restant après l'irradiation de l'extrait (voir Matériels et Méthodes) La stabilité du phytoène est mesurée lorsque l'extrait est exposé à la lumière UVA (365 nm) ainsi qu'à la lumière UVB (254 nm) , ainsi qu'à un mélange d'irradiation UVA et UVB. Example 2 Example of the stability of the phytoene extracts under UV light The stability of the phytoene extracts obtained, as demonstrated in Example 1 above, is determined by spectrophometric analysis. Phytoene is dissolved in oil or in hexane. The absorption of the preparation is measured between 220nm and 600nm and the amount of phytoene in each specimen is calculated in order to determine the percentage of phytoene remaining after irradiation of the extract (see Materials and Methods) The stability of the phytoene is measured when the extract is exposed to UVA light (365 nm) as well as to UVB light (254 nm), as well as to a mixture of UVA and UVB irradiation.

Comme l'on observe sur la Table 1 ci-dessous, le phytoène dissous dans l'huile ou l'hexane est très stable après avoir été exposé des irradiations UVA, UVB ou UVA+B. As observed in Table 1 below, phytoene dissolved in oil or hexane is very stable after being exposed to UVA, UVB or UVA + B irradiations.

Table 1
Stabilité PH sous irradiation UV (exposition: 30 minutes )

Table 1
PH stability under UV irradiation (exposure: 30 minutes)

<tb>
<tb> Obscurité <SEP> 254 <SEP> nm <SEP> 365 <SEP> nm <SEP> 254nm+
<tb> 365nm
<tb> PH <SEP> restant' <SEP> 100 <SEP> 92. <SEP> 2 <SEP> 98. <SEP> 7 <SEP> 92.4
<tb> (hexane)
<tb> PH <SEP> restant <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 101
<tb> (huile)
<tb> <tb>
<tb> Darkness <SEP> 254 <SEP> nm <SEP> 365 <SEP> nm <SEP> 254nm +
<tb> 365nm
<tb> PH <SEP> remaining '<SEP> 100 <SEP> 92. <SEP> 2 <SEP> 98. <SEP> 7 <SEP> 92.4
<tb> (hexane)
<tb> PH <SEP> remaining <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 101
<tb> (oil)
<tb>

Le pourcentage de pH restant équivaut à la quantité de matériel (mg/ml) mesuré après l'irradiation, divisé par la quantité de matériel mesurée avant le traitement et multiplié par 100. The percentage of pH remaining is equivalent to the amount of material (mg / ml) measured after irradiation, divided by the amount of material measured before treatment and multiplied by 100.

La stabilité du phytoène est mesurée sous différentes conditions de température (4 C, 23 C, 30 C et 60 C) dans l'hexane ou autres huiles commerciales. The stability of phytoene is measured under different temperature conditions (4 C, 23 C, 30 C and 60 C) in hexane or other commercial oils.

Les mesures ont été effectuées sur une période de quatre mois. The measurements were taken over a period of four months.

Le phytoène a été stable à toutes les températures testées, sans effet notable du type d'huile dans lequel les caroténoïdes ont été dissous. The phytoene was stable at all temperatures tested, with no noticeable effect of the type of oil in which the carotenoids were dissolved.

Exemple 3 Stabilité à la lumière du jour du phytoène extrait
La stabilité du phyotène est comparée à la stabilité du beta-carotène (comme expliqué dans Matériel et Méthode 8 ci-dessus) après exposition à la lumière du jour. Example 3 Daylight stability of the extracted phytoene
The stability of phyotene is compared to the stability of beta-carotene (as explained in Material and Method 8 above) after exposure to daylight.

L'absorption de cette préparation est déterminée à des longueurs d'onde comprises entre 220 nm et 600 nm. La quantité de chacun des caroténoïdes de chaque spécimen est calculée afin de déterminer le pourcentage des caroténoïdes restant après l'irraditation de l'extrait. (voir exemple 2 au-dessus). The absorption of this preparation is determined at wavelengths between 220 nm and 600 nm. The amount of each of the carotenoids in each specimen is calculated to determine the percentage of carotenoids remaining after irradiation of the extract. (see example 2 above).

Comme montré sur la Table 2, une exposition à la lumière du jour provoque une plus grande dégradation du beta-carotène comparé au phytoène. As shown in Table 2, exposure to daylight causes greater degradation of beta-carotene compared to phytoene.

Table 2 Stabilité PH sous lumière visible (exposition 15-150 min)

Table 2 PH stability under visible light (exposure 15-150 min)

<tb>
<tb> Temps <SEP> d'exposition <SEP> Phytoène <SEP> Beta-carotène <SEP> (%
<tb> (min) <SEP> left)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> 54.46 <SEP> 25.00 <SEP>
<tb> 90 <SEP> 20.33 <SEP> 11.36 <SEP>
<tb> 120 <SEP> 15.70 <SEP> 9.47 <SEP>
<tb> 150 <SEP> 13. <SEP> 64 <SEP> 5.68
<tb>
Exemple 4 Acivité antiradicalaire 4. a Décomposition des radicaux hydroxyles La décomposition des radicaux hydroxyles est mesurée par RPE, comme expliqué dans Matériel et Méthode 9 ci-dessus1. Les résultats obtenus (Table 3) montrent un effet dose dépendant du produit comprenant du phytoène sur les radicaux hydroxyles. <tb>
<tb> Exposure <SEP> time <SEP> Phytoene <SEP> Beta-carotene <SEP> (%
<tb> (min) <SEP> left)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 30 <SEP> 54.46 <SEP> 25.00 <SEP>
<tb> 90 <SEP> 20.33 <SEP> 11.36 <SEP>
<tb> 120 <SEP> 15.70 <SEP> 9.47 <SEP>
<tb> 150 <SEP> 13. <SEP> 64 <SEP> 5.68
<tb>
Example 4 Antiradical activity 4. a Decomposition of hydroxyl radicals The decomposition of hydroxyl radicals is measured by RPE, as explained in Material and Method 9 above1. The results obtained (Table 3) show a dose-dependent effect of the product comprising phytoene on the hydroxyl radicals.

Table 3

Table 3

<tb>
<tb> Concentration <SEP> Intensité <SEP> du <SEP> signal <SEP> Intensité <SEP> du <SEP> signal <SEP> % <SEP> de <SEP> piège <SEP> de
<tb> finale <SEP> du <SEP> produit <SEP> RPE <SEP> (pré-addition) <SEP> RPE <SEP> (post- <SEP> radicaux <SEP> d'hydroxyl
<tb> (mg/ml) <SEP> addition)
<tb> 0 <SEP> 2.82x106~0.07
<tb> 0. <SEP> 001 <SEP> 0.34x106~0.04 <SEP> 2.19x1060.13 <SEP> 66
<tb> 0. <SEP> 0004 <SEP> 0.58x106~0.02 <SEP> 1.94~106~0.05 <SEP> 48
<tb> 0. <SEP> 0001 <SEP> 1.26x106~0.10 <SEP> 2.19x106~0.13 <SEP> 24
<tb>
Le produit est composé d'une concentration initiale de phytoène de 0.02 mg/ml. La <tb>
<tb> Concentration <SEP> Intensity <SEP> of <SEP> signal <SEP> Intensity <SEP> of <SEP> signal <SEP>% <SEP> of <SEP> trap <SEP> of
<tb> final <SEP> of <SEP> product <SEP> RPE <SEP> (pre-addition) <SEP> RPE <SEP> (post- <SEP> hydroxyl <SEP> radicals
<tb> (mg / ml) <SEP> addition)
<tb> 0 <SEP> 2.82x106 ~ 0.07
<tb> 0. <SEP> 001 <SEP> 0.34x106 ~ 0.04 <SEP> 2.19x1060.13 <SEP> 66
<tb> 0. <SEP> 0004 <SEP> 0.58x106 ~ 0.02 <SEP> 1.94 ~ 106 ~ 0.05 <SEP> 48
<tb> 0. <SEP> 0001 <SEP> 1.26x106 ~ 0.10 <SEP> 2.19x106 ~ 0.13 <SEP> 24
<tb>
The product is composed of an initial phytoene concentration of 0.02 mg / ml. The

valeur moyenne de chaque résultat correspond à trois mesures. average value of each result corresponds to three measurements.

4. b Effet anti-oxydant
La protection de l'ADN par l'effet d'anti-oxydation du phyotène est déterminée en s'appuyant sur la méthode de Salles (Supra), comme expliqué dans Matériel et Méthode, 9. b ci-dessus. 4.b Antioxidant effect
The protection of DNA by the anti-oxidation effect of phyotene is determined using the Salles method (Supra), as explained in Material and Method, 9.b above.

Comme observé sur la Table 4 ci-dessous, le phytoène obtenu selon la description ci-dessus est capable de combattre les effets des radicaux hydroxyles. As observed in Table 4 below, the phytoene obtained according to the description above is capable of combating the effects of hydroxyl radicals.

Table 4
Activité anti oxydante du phytoène

Table 4
Antioxidant activity of phytoene

<tb>
<tb> Composé <SEP> Concen- <SEP> % <SEP> % <SEP> % <SEP> Concentration <SEP> d'inhibition <SEP> d'inhibition <SEP> d'inhibition <SEP> tration <SEP> sur
<tb> g/ml <SEP> en <SEP> présence <SEP> non <SEP> spécifique <SEP> 50% <SEP> de
<tb> de <SEP> ROS <SEP> spécifique <SEP> l'activité
<tb> Phytoène <SEP> 100 <SEP> 89 <SEP> 16 <SEP> 76
<tb> 10 <SEP> 63 <SEP> 8 <SEP> 55 <SEP> 7. <SEP> 14 <SEP> g/ml
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 1 <SEP> 20
<tb> 0. <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 9
<tb> Contrôle <SEP> 1000 <SEP> 88 <SEP> 9 <SEP> 79
<tb> positif <SEP> 100 <SEP> 69 <SEP> 11 <SEP> 58 <SEP> 80 <SEP> pg/ml
<tb> 10 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5
<tb> 1 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 4
<tb>
Exemple 5 Effets protecteurs de l'ADN par le phytoène Effet génotoxique
La génotoxicité est mesurée comme une induction de l'activité de réparation de synthèse de l'ADN et est exprimée par le ratio (R). <tb>
<tb> Compound <SEP> Concen- <SEP>% <SEP>% <SEP>% <SEP> Concentration <SEP> of inhibition <SEP> of inhibition <SEP> of inhibition <SEP> tration <SEP> sure
<tb> g / ml <SEP> in <SEP> presence <SEP> not specific <SEP><SEP> 50% <SEP> of
<tb> of <SEP> ROS <SEP> specific <SEP> activity
<tb> Phytoene <SEP> 100 <SEP> 89 <SEP> 16 <SEP> 76
<tb> 10 <SEP> 63 <SEP> 8 <SEP> 55 <SEP> 7. <SEP> 14 <SEP> g / ml
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 1 <SEP> 20
<tb> 0. <SEP> 10 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 9
<tb> Control <SEP> 1000 <SEP> 88 <SEP> 9 <SEP> 79
<tb> positive <SEP> 100 <SEP> 69 <SEP> 11 <SEP> 58 <SEP> 80 <SEP> pg / ml
<tb> 10 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5
<tb> 1 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 4
<tb>
Example 5 Protective effects of DNA by phytoene Genotoxic effect
Genotoxicity is measured as an induction of synthetic DNA repair activity and is expressed as the ratio (R).

Lorsque R< 2 , il n'y a pas d'effets toxiques avec: When R <2, there are no toxic effects with:

Relative émission lumineuse du spécimen R=
Relative émission lumineuse du solvant seul
Comme indiqué Table 5 , ci- dessous, le phytoène n'est pas génotoxique. Relative light emission of the specimen R =
Relative light emission of the solvent alone
As shown in Table 5, below, phytoene is not genotoxic.

Le paramètre R est significativement inférieur à 2 (effet protecteur) et beaucoup plus petit que le contrôle positif, qui est un composé génotoxique de référence. The R parameter is significantly less than 2 (protective effect) and much smaller than the positive control, which is a reference genotoxic compound.

Table 5
Effet Génotoxicité du phytoène

Table 5
Genotoxicity effect of phytoene

<tb>
<tb> Composé <SEP> Concentration <SEP> (pg/ml) <SEP> Génotoxicité <SEP> (R)
<tb> Phytoène <SEP> 100 <SEP> 0.88
<tb> 10 <SEP> 1.17
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 1.20
<tb> 0.10 <SEP> 1.05
<tb> MMS- <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 6.26
<tb> (contrôle <SEP> Positif) <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> 2.44
<tb>
Exemple 6
Les composition suivantes fournissent des exemples pouvant être réalisées en accord avec cette invention: A- Emulsion gel H/E ( voie topique): - Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) ............ 0.6 g - Alcool éthylique ........................................................ 15 g - Huile de silicone volatile ...................................... 3 g - Huile de purcellin 7 g - Conservateur 0. 3 g
Parfum...................................................................... 0. 4 g - Triéthanolamine ...................................................... 0. 2 g <tb>
<tb> Compound <SEP> Concentration <SEP> (pg / ml) <SEP> Genotoxicity <SEP> (R)
<tb> Phytoene <SEP> 100 <SEP> 0.88
<tb> 10 <SEP> 1.17
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 1.20
<tb> 0.10 <SEP> 1.05
<tb> MMS- <SEP> 10 <SEP> mM <SEP> 6.26
<tb> (positive <SEP> control) <SEP> 2 <SEP> mM <SEP> 2.44
<tb>
Example 6
The following compositions provide examples which can be produced in accordance with this invention: A- O / W gel emulsion (topical route): - Carbopol 981 (marketed by Goodrich) ............ 0.6 g - Ethyl alcohol ................................................ ........ 15 g - Volatile silicone oil ................................... ... 3 g - Purcellin oil 7 g - Preservative 0. 3 g
Perfume................................................. ..................... 0. 4 g - Triethanolamine ....................... ............................... 0. 2 g

- Phytoène .................................................................. 0. 01 g - Eau déminéralisée qsp 100 g B - Gel anhydre ( voie topique): - Propylène glycol ....................................................... 25 g - Cellulose hydroxy-éthylée ........................................ 0. 8 g
Polyéthylène glycol................................................... 12 g - Phytoène .................................................................. 1 g - Alcool absolu qsp..................................................... 100 g C- Emulsion H/E (voie topique): Paraffine liquide .......................................................... 6 g Lanoline liquide............................................................3 g Arlacel 165 (commercialisé par Atlas) ........................ 6 g Tween 60 (commercialisé par Atlas)...........................2 g

Alcool cétylique...........................................................1.2 g Acide stéarique...........................................................2.5 g Huile de silicone volatile .........................................10 g Triéthanolamine .........................................................0.1 g Conservateur.............................................................. 0.3 g Antioxydants ............................................................... 0. 3 g Phytoène ....................................................................0.3 g Eau déminéralisée qsp ............................................... 100 g D - Crème aux liposomes ( voie topique): Huile de tournesol.......................................................35 g Alcool cétylique...........................................................4 g

B-sitostérol..................................................................4 g - Phytoene ................................................ .................. 0.01 g - Demineralized water qs 100 g B - Anhydrous gel (topical route): - Propylene glycol .......... ............................................. 25 g - Hydroxy cellulose -ethylated ........................................ 0. 8 g
Polyethylene glycol ................................................ ... 12 g - Phytoene ........................................... ....................... 1 g - Absolute alcohol qsp ..................... ................................ 100 g C- O / W emulsion (topical route): Liquid paraffin ... .................................................. ..... 6 g Liquid Lanolin ......................................... ................... 3 g Arlacel 165 (marketed by Atlas) ...................... .. 6 g Tween 60 (marketed by Atlas) ........................... 2 g

Cetyl alcohol ................................................ ........... 1.2 g Stearic acid ................................... ........................ 2.5 g Volatile silicone oil .................... ..................... 10 g Triethanolamine .......................... ............................... 0.1 g Preservative ................ .............................................. 0.3 g Antioxidants. .................................................. ............ 0. 3 g Phytoene ................................. ................................... 0.3 g Demineralised water qs .......... ..................................... 100 g D - Liposome cream (topical route): Oil sunflower ................................................ ....... 35 g Cetyl alcohol ....................................... .................... 4 g

B-sitosterol ............................................... ................... 4 g

Dicétyl phosphate ....................................................... 0.5 g Conservateur..............................................................0.3 g Parfum ........................................................................0.6 g Carbopol 981 (commercialisé par Goodrich) ..............0.2 g

Triéthanolamine..........................................................0.2 g Sphingosine................................................................ 0.05 g Phytoéne .................................................................... 0.00001 g Eau déminéralisée qsp ............................................. 100 g E - Comprimé(voie orale): Talc............................................................................. 5 g

Aérosil 200..................................................................5 g Stéarate de Zn............................................................5 g Phytoène ...................................................................0.0000015 g Lactose qsp ...............................................................400 g F - Emulsion E/O ( voie topique): Protégin (commercialisé par Goldschmidt) ...............19 g Glycérine ....................................................................3 g Huile de vaseline ........................................................8 g Phytoène ....................................................................0.5 g Sulfate de Mg ............................................................0.5 g

Parfum .......................................................................0.8 g Conservateur.............................................................. 0.2 g Eau déminéralisée qsp ...............................................100 gDicetyl phosphate ................................................ ....... 0.5 g Preservative ........................................ ...................... 0.3 g Perfume ......................... ............................................... 0.6 g Carbopol 981 (marketed by Goodrich) .............. 0.2 g

Triethanolamine ................................................. ......... 0.2 g Sphingosine ...................................... .......................... 0.05 g Phytoene ..................... ............................................... 0.00001 g Water demineralized qs ............................................. 100 g E - Tablet (oral route): Talc .......................................... ................................... 5 g

Aerosil 200 ................................................ .................. 5 g Zn stearate ........................... ................................. 5 g Phytoene .............. .................................................. ... 0.0000015 g Lactose qsp ........................................... .................... 400 g F - E / O emulsion (topical route): Protégin (marketed by Goldschmidt) ........... .... 19 g Glycerin ........................................... ......................... 3 g Vaseline oil .................... .................................... 8 g Phytoene ........... .................................................. ....... 0.5 g Mg sulfate ...................................... ...................... 0.5 g

Perfume ................................................. ...................... 0.8 g Preservative ......................... ..................................... 0.2 g Demineralised water qs ........ ....................................... 100 g

Claims

CLAIMS: 1. A composition comprising an amount of phytoene effective to prevent damage caused by oxidation or by exposure to UV light.

2. A composition according to claim 1, characterized as being a topical preparation which protects the skin against environmental hazards and comprising phytoene in an amount sufficient to protect the skin against oxidation and the effects of UV.

3. A composition according to claim 2, characterized as being a cosmetic or pharmaceutical composition.

4. A composition according to claim 1, characterized as being an additive or a food supplement.

5. A composition according to any one of the preceding claims characterized as being colorless.

6. A composition according to any one of the preceding claims characterized as containing a hydrophobic vehicle.

7. A composition according to any one of the preceding claims characterized as containing zetacarotene and / or phytofluene.

8. A method for the preparation of a composition comprising phytoene, and characterized by the following steps: (a) incubation of an organism producing carotenoids in a culture medium under broad spectrum light, of intensity greater than 10. W / m2 and with one or more carotenoid synthesis inhibitors, (b) culture of said carotenoid-producing organisms until phytoene is obtained at a minimum content of between 0.1 mg / l culture and 50 mg / l culture, and ( c) separation of said organisms from the culture from which they originate.

9. A method according to claim 8, characterized in that the light

cited has an intensity which varies between approximately 10 W / m2 and approximately 200 W / m2.

10. A method for the preparation of a composition, comprising phytoene and characterized by the following steps: (i) incubation of an organism producing carotenoids outdoors in a culture medium and under direct sunlight, varying between 80% shade and full sun, in the presence of one or more carotenoid synthesis inhibitors; (ii) culture of said carotenoid-producing organisms until phytoene is obtained at a minimum content of between 1 mg / l culture and 50 mg / l culture and; (iii) separation of said organisms from the culture from which they originate.

11. A method according to claim 10, characterized in that the light varies between 40% shade and full sun.

12. A method according to claim 10, characterized in that said organisms are cultivated in full sun.

13. A method according to claims 8-12, characterized by the following additional step: (iv) producing a preparation comprising phytoene originating from said organisms thus separated from their culture medium.

14. A method according to claim 13, characterized in that this preparation is an extract.

15. A method according to claim 14, characterized in that the extract was produced using an ethanol: hexane solvent.

16. A method according to any one of claims 8-15, characterized in that the carotenoid-producing organisms are microalgae.

17. A method according to claim 16, characterized in that the mentioned microalgae are of the Dunaliella sp.

18. A method according to claims 8-17, characterized in that the carotenoid synthesis inhibitor is chloro-4--5 (methylamino) -2- (3-

(trifluoromethyl) phenyl) - 3 (2H) -pyridazinone.

19. A method according to claims 8-18, characterized in that said extract contains no trace of said inhibitor.

20. A method according to claims 8-15, characterized in that charcoal is added to said culture during the preparation of said carotenoids.

21. A composition according to any one of claims 1-7, characterized in that the phytoene is prepared by chemical synthesis.

22. A composition according to each of claims 1-7, characterized in that said phytoene is prepared by genetic recombination methods.