FR2805540A1

FR2805540A1 - ULIP6 protein showing homology to Ulip family proteins, useful for diagnosing and treating paraneoplastic neurological syndromes and cancer

Info

Publication number: FR2805540A1
Application number: FR0002566A
Authority: FR
Inventors: Michele Aguera; Jean Christophe Antoine; Marie Francoise Belin; Jerome Honnorat; Veronique Rogemond
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2001-08-31
Anticipated expiration: 2020-02-29
Also published as: FR2805540B1

Abstract

A purified protein designated ULIP 6, comprising the 564 amino acid sequence fully defined in the specification, or its epitope, is new. A purified protein designated ULIP 6, comprising the 564 amino acid sequence fully defined in the specification, or its epitope, is new. The epitope has the following sequence: KEMGTPLADTPTRPVTRHGGC. Independent claims are also included for the following: (1) an isolated nucleic acid comprising a sequence encoding ULIP6 or its epitope; (2) an isolated nucleic acid comprising the 1218 nucleotide (nt) sequence fully defined in the specification or nucleotides 1-162 of the 3074 nt sequence fully defined in the specification; (3) a cloning or expression vector comprising the nucleic acid of (1) or (2); (4) a host cell transformed with the vector of (3); (5) antibodies, their chimeras, fragments or immuno-conjugants obtained using ULIP6 or its epitope; (6) detecting or purifying ULIP6 protein or its epitope using the above antibody; (7) detecting anti-CV2 antibodies using the above ULIP6 protein or its epitope in a biological sample; (8) diagnosing paraneoplastic neurological syndromes or cancerous tumor formation comprising contacting a biological sample with ULIP6 protein or its epitope and detecting formed complexes. ACTIVITY : Nootropic; cytostatic. No biological data given. MECHANISM OF ACTION : None given.

Description

L'invention concerne une nouvelle protéine ULIP humaine et son utilisation dans le diagnostic et la thérapie des cancers et des syndromes neurologiques paranéoplasiques. The invention relates to a novel human ULIP protein and its use in the diagnosis and therapy of cancers and paraneoplastic neurological syndromes.

Les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP) surviennent à l'occasion d'un cancer, souvent avant sa découverte et ne sont liés ni à la prolifération tumorale elle-même (envahissement direct, métastases) ni à la thérapie. Leur fréquence est globalement estimée à environ 1 % des cancers. Plusieurs tableaux cliniques ont été depuis longtemps individualisés (encéphalomyélite, neuropathie sensitive de Denny Brown, atrophie cérébelleuse, encéphalite limbique, opsoclonus, ...) correspondant en fait à l'atteinte soit élective soit préférentielle de certains groupes de neurones. La fréquence des cellules inflammatoires au voisinage des lésions avait fait évoquer depuis de nombreuses années la possibilité d'un processus auto-immun ou viral. La mise en évidence, plus récente, d'autoanticorps dans le sérum et le liquide céphalo-rachidien (LCR) de patients souffrant de SNP, spécifiques du type de tumeur et du type de neurones qui dégénèrent, a relancé l'hypothèse d'une participation de l'auto-immunité dans la genèse de cette pathologie (Graus et al., 1985 ; Greenlee et al., 1983). Paraneoplastic neurological syndromes (SNP) occur during cancer, often before its discovery and are not linked either to the tumor proliferation itself (direct invasion, metastases) or to therapy. Their frequency is globally estimated at around 1% of cancers. Several clinical pictures have long been individualized (encephalomyelitis, Denny Brown's sensory neuropathy, cerebellar atrophy, limbic encephalitis, opsoclonus, ...) corresponding in fact to either elective or preferential involvement of certain groups of neurons. The frequency of inflammatory cells near the lesions had raised the possibility of an autoimmune or viral process for many years. The more recent discovery of autoantibodies in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of patients suffering from PNS, specific to the type of tumor and the type of neurons which degenerate, has revived the hypothesis of a participation of autoimmunity in the genesis of this pathology (Graus et al., 1985; Greenlee et al., 1983).

Outre la présence d'un titre élevé de ces anticorps dans le sang et le LCR des patients, il existe plusieurs arguments suggérant que les SNP relèvent de mécanismes auto-immuns. Ainsi, les antigènes reconnus dans le système nerveux central sont aussi présents dans les tumeurs des patients (Anderson et al., 1987). Au sein du tissu tumoral, on retrouve des anticorps spécifiquement dirigés contre ces antigènes ainsi que des lymphocytes B et T (Hetzel et al., 1990). -
Ces données suggèrent que le processus auto-immun serait déclenché par l'expression d'antigènes tumoraux. Un processus d'immunité croisée provoquerait les lésions du système nerveux central. D'autres arguments indiquent en outre que les lésions cérébrales résultent de la réponse auto-immune. Ainsi, dans le cerveau des patients, le titre des anticorps spécifiques est supérieur à celui du sérum et du LCR (Dalmau et al., 1991). De plus, dans le cas des encéphalomyélites associées aux anticorps anti-Hu, il existe une réaction lymphocytaire intense, composée de cellules B et In addition to the presence of a high titer of these antibodies in the blood and CSF of patients, there are several arguments suggesting that SNPs are due to autoimmune mechanisms. Thus, antigens recognized in the central nervous system are also present in the tumors of patients (Anderson et al., 1987). Within the tumor tissue, there are antibodies specifically directed against these antigens as well as B and T lymphocytes (Hetzel et al., 1990). -
These data suggest that the autoimmune process is triggered by the expression of tumor antigens. A process of cross immunity would cause damage to the central nervous system. Other arguments further indicate that brain damage results from the autoimmune response. Thus, in the brains of patients, the titer of specific antibodies is higher than that of serum and CSF (Dalmau et al., 1991). In addition, in the case of encephalomyelitis associated with anti-Hu antibodies, there is an intense lymphocyte reaction, composed of B cells and

T, située à proximité de neurones en voie de destruction (Dalmau et al., 1991 ; Graus et al., 1990). T, located near neurons in the process of destruction (Dalmau et al., 1991; Graus et al., 1990).

Plusieurs types d'auto-anticorps permettant des regroupements syndromiques précis en fonction de critères immunologiques, neurologiques et carcinologiques ont été décrits. Several types of autoantibodies allowing precise syndromic groupings according to immunological, neurological and carcinological criteria have been described.

Ainsi, les anticorps anti-Yo sont retrouvés dans le sérum et le LCR de femmes présentant une atrophie cérébelleuse paranéoplasique et un cancer gynécologique (ovaire, sein ou utérus) (Greenlee et al., 1983 ; Jaeckle et al., 1985). Thus, anti-Yo antibodies are found in the serum and CSF of women presenting with a paraneoplastic cerebellar atrophy and gynecological cancer (ovary, breast or uterus) (Greenlee et al., 1983; Jaeckle et al., 1985).

Ces anticorps reconnaissent deux protéines cytoplasmiques de 34 et 62 kDa spécifiques des cellules de Purkinje du cervelet. These antibodies recognize two cytoplasmic proteins of 34 and 62 kDa specific for Purkinje cells in the cerebellum.

Les anticorps anti-Ri sont retrouvés dans le sérum et le LCR de patients (principalement des femmes) présentant un opso-myoclonus, un syndrome cérébelleux et un cancer du sein. Ces anticorps reconnaissent deux protéines de 50 et 80 kDa spécifiques des neurones du système nerveux central (Luque et al., 1991). Anti-Ri antibodies are found in the serum and CSF of patients (mainly women) with opso-myoclonus, cerebellar syndrome and breast cancer. These antibodies recognize two proteins of 50 and 80 kDa specific for neurons of the central nervous system (Luque et al., 1991).

Les anticorps anti-Hu sont les plus fréquemment rencontrés au cours des SNP. Ils sont retrouvés dans le sérum et le LCR de patients présentant un syndrome de Denny-Brown ou une encéphalomyélonévrite et un cancer du poumon à petites cellules (Graus et al., 1985 ; Dalmau et al., 1992). Anti-Hu antibodies are the most frequently encountered during SNPs. They are found in the serum and CSF of patients with Denny-Brown syndrome or encephalomyeloneuritis and small cell lung cancer (Graus et al., 1985; Dalmau et al., 1992).

Ces auto-anticorps reconnaissent plusieurs protéines de 37 à 45 kDa exprimées spécifiquement par l'ensemble des neurones du système nerveux. These autoantibodies recognize several proteins of 37 to 45 kDa expressed specifically by all of the neurons of the nervous system.

Un autre type d'auto-anticorps a été identifié chez des patients présentant un SNP : les anticorps anti-CV2 (Antoine et al., 1993 ; Honnorat et al., 1996). Ces derniers sont atypiques, eh ce sens que la cible antigénique reconnue à l'âge adulte est essentiellement non neuronale, alors que l'analyse du cerveau post-mortem de quatre patients permet d'objectiver une perte neuronale, une gliose et un processus inflammatoire caractéristique des SNP. Another type of autoantibody has been identified in patients with SNP: anti-CV2 antibodies (Antoine et al., 1993; Honnorat et al., 1996). The latter are atypical, in the sense that the antigenic target recognized in adulthood is essentially non-neuronal, while the analysis of the post-mortem brain of four patients makes it possible to object to neuronal loss, gliosis and an inflammatory process. characteristic of SNPs.

L'originalité de la découverte de ces auto-anticorps réside, d'une part, dans leur mise en évidence. Ces derniers avaient échappé à l'ensemble des investigations habituelles qui consistaient à révéler les antigènes reconnus par immunohistochimie sur du cerveau post-mortem. L'antigène reconnu est en effet soluble et disparaît du cerveau post-mortem dans la plupart des The originality of the discovery of these autoantibodies lies, on the one hand, in their demonstration. The latter had escaped all the usual investigations which consisted in revealing the antigens recognized by immunohistochemistry on the post-mortem brain. The recognized antigen is indeed soluble and disappears from the post-mortem brain in most

conditions de fixation. Seule une fixation du tissu post-mortem humain par immersion dans le paraformaldéhyde ou in situ par perfusion de paraformaldéhyde chez l'animal, a permis de révéler la présence de ces anticorps dans le LCR ou le sérum des patients atteints de SNP (Antoine et al., 1993 ; Honnorat et al., 1996). fixing conditions. Only fixation of human post-mortem tissue by immersion in paraformaldehyde or in situ by infusion of paraformaldehyde in animals has revealed the presence of these antibodies in the CSF or the serum of patients with PNS (Antoine et al ., 1993; Honnorat et al., 1996).

Les auto-anticorps anti-CV2 présents dans les sérums de patients atteints de syndrome neurologique paranéoplasique (SNP) ont été définis par leur capacité à reconnaître, par immunohistochimie indirecte, un antigène cytoplasmique exprimé spécifiquement, dans le cerveau de rat adulte, par une sous-population d'oligodendrocytes du tronc cérébral, de la moelle et du cervelet. The anti-CV2 autoantibodies present in the sera of patients suffering from paraneoplastic neurological syndrome (SNP) have been defined by their ability to recognize, by indirect immunohistochemistry, a cytoplasmic antigen expressed specifically, in the adult rat brain, by a sub -population of oligodendrocytes from the brainstem, marrow and cerebellum.

L'originalité de ces auto-anticorps réside, d'autre part, dans leur intérêt diagnostique. Leur présence dans le sérum ou le LCR de patients a valeur diagnostique puisqu'elle permet de préciser l'origine paranéoplasique d'un syndrome neurologique. La découverte de ces anticorps lorsqu'elle précède celle du cancer, oriente la recherche de celui-ci et permet sa découverte. Tel a été le cas pour six patients sur 19 présentant des anticorps anti-CV2. Les troubles cliniques étaient différents suivant les patients, certains présentaient un tableau d'encéphalite limbique, d'autres une encéphalomyélonévrite et d'autres un syndrome de Lambert-Eaton. The originality of these autoantibodies, on the other hand, lies in their diagnostic interest. Their presence in the serum or the CSF of patients has diagnostic value since it makes it possible to specify the paraneoplastic origin of a neurological syndrome. The discovery of these antibodies when it precedes that of cancer, guides research and allows its discovery. This was the case for six out of 19 patients with anti-CV2 antibodies. The clinical disorders were different according to the patients, some presented a picture of limbic encephalitis, others an encephalomyeloneuritis and others a Lambert-Eaton syndrome.

Néanmoins, dans plus de 60 % des cas, le syndrome cérébelleux était prédominant. La tumeur la plus fréquemment associée était le cancer du poumon à petites cellules (60 % des cas). However, in more than 60% of cases, the cerebellar syndrome was predominant. The most frequently associated tumor was small cell lung cancer (60% of cases).

Des expériences sur des cerveaux de rats nouveaux-nés ont montré que ces anticorps anti-CV2 réagissaient avec une protéine de 66 kDa (Honnorat et al., 1996). Experiments on brains of newborn rats have shown that these anti-CV2 antibodies react with a 66 kDa protein (Honnorat et al., 1996).

Cet antigène se situe dans le cerveau adulte dans une souspopulation d'oligodendrocytes ou dans des cellules qui gardent des capacités de différenciation dans le cerveau adulte (bulbe olfactif, gyrus denté). This antigen is located in the adult brain in an underpopulation of oligodendrocytes or in cells which keep differentiation capacities in the adult brain (olfactory bulb, dentate gyrus).

L'antigène reconnu jouerait un rôle dans la survie neuronale, via des interactions Neurone/Oligodendrocyte, comme le suggère la perte des neurones observée dans le cerveau post-mortem de patients atteints de SNP. The recognized antigen plays a role in neuronal survival, via Neuron / Oligodendrocyte interactions, as suggested by the loss of neurons observed in the post-mortem brain of patients with PNS.

Son expression très restreinte à l'âge adulte contraste avec une expression très forte et transitoire dans le système nerveux central et périphérique en développement, suggérant le rôle probable de cet antigène dans le développement du système nerveux. Its very restricted expression in adulthood contrasts with a very strong and transient expression in the developing central and peripheral nervous system, suggesting the probable role of this antigen in the development of the nervous system.

Dans la demande WO 98/37192 et l'article de Honnorat et al de 1999, l'antigène cible des auto-anticorps anti-CV2, correspondant à une protéine désignée par POP-66 pour paraneoplastic oligodendrocyte protein 66 kDa , a été identifiée comme étant la forme humaine de la protéine ULIP-4. Les protéines ULIP (pour "Unc-33 like phosphoprotein") sont impliquées dans le contrôle du développement neuronal et le transport axonal (Byk et al, 1996). Quatre membres de cette famille avaient été identifiés par trois équipes différentes (Byk et al, 1998, Wang et Strittmatter, 1996; et Hamajima et al, 1996). La recherche extensive d'éventuels autres membres de cette famille n'avait pas abouti. In application WO 98/37192 and the article by Honnorat et al of 1999, the target antigen of anti-CV2 autoantibodies, corresponding to a protein designated by POP-66 for paraneoplastic oligodendrocyte protein 66 kDa, was identified as being the human form of the ULIP-4 protein. ULIP proteins (for "Unc-33 like phosphoprotein") are involved in the control of neuronal development and axonal transport (Byk et al, 1996). Four members of this family had been identified by three different teams (Byk et al, 1998, Wang and Strittmatter, 1996; and Hamajima et al, 1996). The extensive search for possible other members of this family had been unsuccessful.

Les auteurs de la présente invention ont alors été confrontés à de nouveaux résultats, qui n'étaient pas cohérents avec l'identification établie par la demande WO 98/37192 : Alors que tous les sérums anti-CV2 testés sur des cellules Hela reconnaissaient indiscutablement la protéine recombinante ULIP 4 en immunohistochimie, seuls 20% de ces sérums reconnaissaient la protéine ULIP 4 par Western Blot sur ces mêmes extraits de cellules. Or tous les sérums anti-CV2 testés reconnaissaient par ailleurs par Western Blot la même protéine de 66 kDa après immunoprécipitation, sur des extraits de cerveaux. The authors of the present invention were then confronted with new results, which were not consistent with the identification established by application WO 98/37192: While all the anti-CV2 sera tested on Hela cells unquestionably recognized the recombinant protein ULIP 4 in immunohistochemistry, only 20% of these sera recognized the ULIP 4 protein by Western Blot on these same cell extracts. However, all the anti-CV2 sera tested also recognized by Western Blot the same 66 kDa protein after immunoprecipitation, on brain extracts.

En outre, l'ARNm d'ULIP4 n'était que très faiblement exprimé dans les oligodendrocytes en hybridation in situ. A partir de ces données, les auteurs de la présente invention ont supposé qu'il pouvait exister un nouveau membre de la famille des ULIP non identifié à ce jour, fortement exprimé par les oligodendrocytes et reconnu en Western Blot par tous les sérums anti-CV2. Furthermore, ULIP4 mRNA was only very weakly expressed in oligodendrocytes in in situ hybridization. From these data, the authors of the present invention have assumed that there could be a new member of the ULIP family not identified to date, strongly expressed by oligodendrocytes and recognized in Western Blot by all anti-CV2 sera. .

Les auteurs de la présente invention ont maintenant mis en évidence que, contrairement à ce que proposait la demande WO 96/37192, POP-66, l'antigène majeur cible des auto-anticorps anti-CV2, n'était pas la protéine ULIP 4 mais une autre protéine. Ils sont parvenus à caractériser celle- The authors of the present invention have now demonstrated that, contrary to what the application WO 96/37192 proposed, POP-66, the major target antigen of the anti-CV2 autoantibodies, was not the ULIP 4 protein. but another protein. They managed to characterize this

ci. Il s'agit d'une nouvelle protéine humaine de la famille des ULIP, désignée ULIP6. this. It is a new human protein from the ULIP family, designated ULIP6.

ULIP 6 comprend dans sa partie C-terminale un épitope majeur reconnu en Western Blot par les anticorps anti-CV2. ULIP 6 includes in its C-terminal part a major epitope recognized in Western Blot by anti-CV2 antibodies.

La présente invention a donc pour objet un polypeptide purifié ULIP 6, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2. The subject of the present invention is therefore a purified ULIP 6 polypeptide comprising the amino acid sequence SEQ ID n 2.

Est en outre compris dans la présente invention un fragment épitopique du polypeptide mentionné ci-dessus, comprenant la séquence SEQ ID n 4. Plus particulièrement l'invention a pour objet le peptide purifié de séquence SEQ ID n 4. Also included in the present invention is an epitopic fragment of the above-mentioned polypeptide, comprising the sequence SEQ ID No. 4. More particularly, the subject of the invention is the purified peptide of sequence SEQ ID No. 4.

La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé codant pour le polypeptide ULIP6 tel que défini ci-dessus, de préférence comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID n 1. The present invention also relates to an isolated nucleic acid coding for the ULIP6 polypeptide as defined above, preferably comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.

La présente invention a en outre pour objet un acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID n 3, qui correspond à la région non codante en 3' de la séquence codante humaine SEQ ID n 1. Cette séquence non codante peut notamment servir à la préparation de sondes spécifiques. The present invention further relates to an isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the human coding sequence SEQ ID No. 1. This non-coding sequence can in particular be used for the preparation of specific probes.

Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. The polypeptide of the present invention can be synthesized by any method well known to those skilled in the art. The polypeptide of the invention can for example be synthesized by the techniques of synthetic chemistry, such as Merrifield-type synthesis which is advantageous for reasons of purity, antigenic specificity, absence of unwanted side products and for its ease of production.

Une protéine ULIP6 recombinante peut également être produite par un procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n 1 est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant. A recombinant ULIP6 protein can also be produced by a method, in which a vector containing a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID n 1 is transferred into a host cell which is cultured under conditions allowing the expression of the corresponding polypeptide.

La protéine produite peut ensuite être récupérée et purifiée. The protein produced can then be recovered and purified.

Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. The purification methods used are known to those skilled in the art. The recombinant polypeptide obtained can be purified from lysates and cell extracts, from the supernatant of the culture medium, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.

La séquence d'acide nucléique d'intérêt, codant pour le polypeptide ULIP6, peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. The nucleic acid sequence of interest, coding for the ULIP6 polypeptide, can be inserted into an expression vector, in which it is operably linked to elements allowing the regulation of its expression, such as in particular promoters, transcription activators and / or terminators.

Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium. The signals controlling the expression of the nucleotide sequences (promoters, activators, termination sequences, etc.) are chosen according to the cell host used. To this end, the nucleotide sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host. Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example electroporation or precipitation with calcium phosphate.

Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits cidessus, contenant une séquence nucléotidique définie selon l'invention font également partie de la présente invention. The cloning and / or expression vectors as described above, containing a nucleotide sequence defined according to the invention also form part of the present invention.

L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. The invention further relates to host cells transfected, transiently or stable, with these expression vectors. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules The cell host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotic systems, such as yeasts, cells

d'insectes, CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par la bactérie E. coli. insects, CHO (Chinese hamster ovary cells) or any other system advantageously available. A preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of the bacterium E. coli.

Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1 ou 3. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. The nucleotide sequences of the invention can be of artificial origin or not. They can be DNA or RNA sequences, obtained by screening of sequence banks using probes prepared on the basis of the sequence SEQ ID No. 1 or 3. Such libraries can be prepared by conventional techniques molecular biology, known to those skilled in the art.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage des banques. The nucleotide sequences according to the invention can also be prepared by chemical synthesis, or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening libraries.

Cet acide nucléique permet la réalisation de sondes nucléotidiques, capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager, codant pour un polypeptide selon l'invention ou un fragment biologiquement actif de celui-ci. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et al., 1989), de préférence à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 30 C) et de préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm moins 5 C) et (Tm moins 10 C) (forte stringence), Tm étant la température théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. De telles sondes font égalemenf partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation, de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des échantillons biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage. This nucleic acid allows the production of nucleotide probes, capable of strongly and specifically hybridizing with a nucleic acid sequence, of a genomic DNA or of a messenger RNA, coding for a polypeptide according to the invention or a biologically fragment active of it. The appropriate hybridization conditions correspond to the temperature and ionic strength conditions usually used by a person skilled in the art (Sambrook et al., 1989), preferably at temperature conditions between (Tm minus 5 C) and (Tm minus 30 C) and more preferably, at temperature conditions between (Tm minus 5 C) and (Tm minus 10 C) (high stringency), Tm being the theoretical melting temperature, defined as the temperature at which 50 % of the paired strands separate. Such probes are also part of the invention. They can be used as an in vitro diagnostic tool for the detection, by hybridization experiments, of specific transcripts of the polypeptides of the invention in biological samples or for the detection of aberrant syntheses or genetic anomalies resulting from 'polymorphism, mutations or poor splicing.

Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et au maximum comportent la totalité d'une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou 3. ou de son brin complémentaire. The probes of the invention comprise at least 10 nucleotides, and at most comprise the entire nucleotide sequence SEQ ID No. 1 or 3. or its complementary strand.

L'acide nucléique de l'invention peut également être utilisé pour réaliser des amorces oligonucléotidiques , qui hybrident dans des conditions de forte stringence à la séquence SEQ ID n 1 ou 3. The nucleic acid of the invention can also be used to produce oligonucleotide primers, which hybridize under conditions of high stringency to the sequence SEQ ID No. 1 or 3.

Ces amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens peuvent être utiles pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci. These sense and / or antisense oligonucleotide primers can be useful for specific sequencing or amplification reactions according to the so-called PCR technique (polymerase chain reaction) or any other variant thereof.

Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique. Preferably, the probes or primers of the invention are marked, prior to their use. For this, several techniques are within the reach of those skilled in the art such as, for example, fluorescent, radioactive, chemiluminescent or enzymatic labeling.

Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et le réarrangement génétique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un polypeptide ULIP6 selon l'invention sont incluses dans la présente invention. Un tel type de méthode comprend : - la mise en contact d'une sonde nucléotidique de l'invention avec un échantillon biologique dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et la susdite séquence nucléotidique, éventuellement après une étape préalable d'amplification de la susdite séquence nucléotidique ; - la détection du complexe d'hybridation éventuellement formé; - éventuellement le séquençage de la séquence nucléotidique formant le complexe d'hybridation avec la sonde de l'invention. The in vitro diagnostic methods in which these nucleotide probes are used for the detection of aberrant syntheses or of genetic anomalies, such as loss of heterozygosity and genetic rearrangement, at the level of the nucleic sequences coding for a ULIP6 polypeptide according to the invention are included in the present invention. Such a type of method comprises: - bringing a nucleotide probe of the invention into contact with a biological sample under conditions allowing the formation of a hybridization complex between said probe and the above-mentioned nucleotide sequence, possibly after a prior step of amplification of the above nucleotide sequence; - detection of the hybridization complex possibly formed; - optionally the sequencing of the nucleotide sequence forming the hybridization complex with the probe of the invention.

Les sondes de l'invention sont en outre avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques. The probes of the invention are also advantageously usable for the detection of chromosomal anomalies.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en thérapie génique. The nucleotide sequences according to the invention also have uses in the therapeutic field, for the production of antisense sequences, capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence, including a messenger RNA, which can be used in gene therapy.

L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production d'un polypeptide selon l'invention, tel que The subject of the invention is therefore antisense sequences capable of inhibiting, at least partially, the production of a polypeptide according to the invention, such as

défini précédemment. previously defined.

Elles sont plus particulièrement utiles dans le traitement des désordres du système nerveux central et périphérique et de la vision, notamment dans le traitement des syndromes neurologiques paranéoplasiques, ainsi que dans le traitement anticancéreux, notamment des tumeurs associées à des syndromes neurologiques paranéoplasiques. They are more particularly useful in the treatment of disorders of the central and peripheral nervous system and of vision, in particular in the treatment of neurological paraneoplastic syndromes, as well as in the anticancer treatment, in particular of tumors associated with neurological paraneoplastic syndromes.

L'exploitation des protéines ULIP, et en particulier ULIP6, ainsi que des anticorps dirigés contre ces protéines, est prometteuse dans divers domaines. The exploitation of ULIP proteins, and in particular ULIP6, as well as antibodies directed against these proteins, is promising in various fields.

Ainsi, la détection de l'auto-anticorps anti-CV2 par immunofluorescence sur cerveau animal fixé est utilisée actuellement comme test diagnostic. Thus, the detection of the anti-CV2 autoantibody by immunofluorescence on fixed animal brain is currently used as a diagnostic test.

La production de protéine recombinante ULIP6 selon l'invention permet la fabrication d'un test (de type Elisa ou Western Blot) rapide et fiable, pour détecter les anticorps anti-CV2. The production of recombinant ULIP6 protein according to the invention allows the manufacture of a rapid and reliable test (of the Elisa or Western Blot type) for detecting anti-CV2 antibodies.

De tels tests existent déjà pour les anticorps anti-Hu, anti-Yo et anti-Ri. Le test pour détecter les anti-CV2 dans le sérum des patients pourrait être prescrit en cas de suspicion de syndrome neurologique paranéoplasique et inclurait par conséquent les anticorps anti-CV2 au même titre que les autres anticorps identifiés dans les SNP tels que précédemment cités. Such tests already exist for anti-Hu, anti-Yo and anti-Ri antibodies. The test to detect anti-CV2 in the serum of patients could be prescribed in case of suspicion of a paraneoplastic neurological syndrome and would therefore include anti-CV2 antibodies in the same way as the other antibodies identified in the SNPs as previously mentioned.

L'invention vise donc également une méthode pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et/ou pour le diagnostic précoce de la formation de tumeurs d'origine cancéreuse, caractérisée en ce que l'on met en évidence dans un échantillon biologique (tel que sang, sérum, LCR, etc) prélevé chez un individu des auto-anticorps dirigés contre une protéine ULIP6 par - la mise en contact un échantillon biologique prélevé chez un individu avec un polypeptide purifié ULIP6 éventuellement fixé sur un support dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques spécifiques entre ledit polypeptide et les auto-anticorps éventuellement présent dans l'échantillon biologique, et The invention therefore also relates to a method for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes and / or for the early diagnosis of the formation of tumors of cancerous origin, characterized in that one highlights in a biological sample (such as blood , serum, CSF, etc.) taken from an individual with autoantibodies directed against a ULIP6 protein by - bringing a biological sample taken from an individual into contact with a purified ULIP6 polypeptide optionally fixed on a support under conditions allowing the formation of specific immunological complexes between said polypeptide and the autoantibodies possibly present in the biological sample, and

la détection des complexes immunologiques spécifiques éventuellement formés. the detection of specific immunological complexes possibly formed.

De manière avantageuse, on peut utiliser à la place du polypeptide complet la partie C-terminale comprenant l'épitope dominant (par exemple le fragment allant de l'acide aminé n 236 à l'acide aminé~325). On peut en particulier utiliser un fragment épitopique du polypeptide ULIP 6, comprenant la séquence SEQ ID n 4. Le peptide de séquence SEQ ID n 4 a ainsi permis la production d'anticorps très spécifiques d'ULIP6. Advantageously, one can use instead of the complete polypeptide the C-terminal part comprising the dominant epitope (for example the fragment going from amino acid n 236 to amino acid ~ 325). It is in particular possible to use an epitopic fragment of the ULIP 6 polypeptide, comprising the sequence SEQ ID No. 4. The peptide of sequence SEQ ID No. 4 has thus made it possible to produce antibodies very specific for ULIP6.

L'invention a donc pour objet une composition utile pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques, et/ou pour le diagnostic précoce de la formation de tumeurs, caractérisé en ce qu'elle comprend un polypeptide ULIP6 ou un fragment épitopique dudit polypeptide. The subject of the invention is therefore a composition useful for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes, and / or for the early diagnosis of tumor formation, characterized in that it comprises a ULIP6 polypeptide or an epitopic fragment of said polypeptide.

L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic des syndromes neurologiques paranéoplasiques et pour le diagnostic précoce de la formation des tumeurs à partir d'un prélèvement biologique comprenant : - au moins un polypeptide purifié ULIP6, éventuellement fixé sur un support, - des moyens de révélation de la formation de complexes antigène/anticorps spécifiques entre un auto-anticorps anti-ULIP6 et ledit polypeptide purifié ULIP6, dérivé ou fragment polypeptidique et/ou des moyens de quantification de ces complexes. The subject of the invention is also a kit for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes and for the early diagnosis of tumor formation from a biological sample comprising: - at least one purified ULIP6 polypeptide, optionally fixed on a support, - means for revealing the formation of specific antigen / antibody complexes between an anti-ULIP6 autoantibody and said purified ULIP6 polypeptide, derivative or polypeptide fragment and / or means for quantifying these complexes.

L'invention a également pour objet les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, obtenus à partir d'un peptide ou polypeptide purifié ULIP comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou n 4 et leur utilisation, pour la purification ou la détection d'une protéine ULIP dans un échantillon biologique. A subject of the invention is also the mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, obtained from a purified peptide or polypeptide ULIP comprising an amino acid sequence SEQ ID n 2 or n 4 and their use , for the purification or detection of a ULIP protein in a biological sample.

Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre la protéine, produite par exemple par recombinaison génétique suivant la méthode décrite ci-dessus, selon les modes opératoires usuels. Polyclonal antibodies can be obtained from the serum of an animal immunized against the protein, produced for example by genetic recombination according to the method described above, according to the usual procedures.

Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein. The monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein.

Les anticorps peuvent être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. The antibodies can be chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab and F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies.

L'invention porte également sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la protéine ULIP6 pour la mise en évidence d'une protéine ULIP6 dans des néoplasmes, et des syndromes neurologiques paranéoplasiques à des fins de diagnostic. The invention also relates to the use of antibodies directed against the ULIP6 protein for the detection of a ULIP6 protein in neoplasms, and paraneoplastic neurological syndromes for diagnostic purposes.

De manière préférentielle, l'invention porte sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux obtenus à partir du sérum polyclonal anti-CV2 de patients par immortalisation de lymphocytes, selon les techniques usuelles connues de l'homme du métier. Preferably, the invention relates to the use of monoclonal antibodies obtained from the anti-CV2 polyclonal serum of patients by immortalization of lymphocytes, according to the usual techniques known to those skilled in the art.

Ainsi, les anticorps dirigés contre une protéine de la famille ULIP sont utiles pour détecter une expression anormale de protéine ULIP chez des patients présentant des syndromes neurologiques, chez qui aucun cancer n'a été diagnostiqué par les méthodes classiques. Cette expression anormale de protéine ULIP6 pourra être corrélée à l'existence d'un cancer qui n'avait pas été repéré. Ainsi, les anticorps dirigés contre la protéine ULIP6, sont utiles pour le diagnostic précoce d'un cancer. Thus, antibodies directed against a protein of the ULIP family are useful for detecting an abnormal expression of ULIP protein in patients with neurological syndromes, in which no cancer has been diagnosed by conventional methods. This abnormal expression of ULIP6 protein may be correlated with the existence of cancer that had not been detected. Thus, the antibodies directed against the ULIP6 protein are useful for the early diagnosis of cancer.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un agent thérapeutique choisi parmi une protéine purifiée ULIP6, ou un acide nucléique codant pour ladite protéine, une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou n 3, ou un anticorps dirigé contre ladite protéine, associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. A subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising at least one therapeutic agent chosen from a purified protein ULIP6, or a nucleic acid coding for said protein, an antisense sequence capable of hybridizing specifically with a nucleotide sequence SEQ ID n 1 or n 3, or an antibody directed against said protein, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.

L'invention comprend de manière préférentielle des compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif un polypeptide ULIP6 purifié, préférentiellement sous forme soluble, associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. The invention preferably comprises pharmaceutical compositions comprising as active ingredient a purified ULIP6 polypeptide, preferably in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.

De telles compositions offrent une nouvelle approche pour traiter les désordres du système nerveux central et périphérique et de la vision, et notamment les syndromes neurologiques paranéoplasiques. Par ailleurs, elles sont utiles pour traiter les désordres neurologiques liés à une perte neuronale et/ou une sous-expression de la protéine ULIP6 dans le système nerveux. Such compositions offer a new approach for treating disorders of the central and peripheral nervous system and vision, and in particular paraneoplastic neurological syndromes. They are also useful for treating neurological disorders linked to neuronal loss and / or under-expression of the ULIP6 protein in the nervous system.

Ainsi, ULIP6 révèle aussi un intérêt dans des pathologies neurodégénératives telles que les atrophies multisystémiques qui sont des affections similaires à celles des SNP et pour lesquelles une anomalie d'une sous-population oligodendrocytaire a été détectée (Papp et al., 1992). Thus, ULIP6 also reveals an interest in neurodegenerative pathologies such as multisystemic atrophies which are conditions similar to those of SNPs and for which an abnormality of an oligodendrocytic subpopulation has been detected (Papp et al., 1992).

Les compositions selon l'invention sont par ailleurs utiles en thérapie anticancéreuse. The compositions according to the invention are moreover useful in anticancer therapy.

Les anticorps dirigés contre la protéine ULIP6 peuvent être associés à des agents antinéoplasiques, permettant ainsi le ciblage des médicaments vers les cellules tumorales. Antibodies to the ULIP6 protein can be combined with antineoplastic agents, allowing targeting of drugs to tumor cells.

Ils peuvent en outre être associés à un groupe chimique hydrophile choisi de manière à passer ou non la barrière hématoencéphalique, selon le type de tumeur. They can also be associated with a hydrophilic chemical group chosen so as to pass or not the blood-brain barrier, depending on the type of tumor.

La protéine ULIP6 ainsi que les séquences nucléotidiques décrites plus haut, et les séquences ou oligonucléotides anti-sens, peuvent être utiles dans la thérapie de tout type de cancer dans lequel un gène codant pour la protéine ULIP6 est impliqué. Parmi des exemples de cancers, on peut citer les tumeurs périphériques, telles que le cancer du poumon à petites cellules, le thymome, le cancer du sein et de l'ovaire, ainsi que les tumeurs cérébrales, de préférence les tumeurs cérébrales primitives d'origine gliale. The ULIP6 protein as well as the nucleotide sequences described above, and the antisense sequences or oligonucleotides, can be useful in the therapy of any type of cancer in which a gene coding for the ULIP6 protein is involved. Examples of cancers include peripheral tumors, such as small cell lung cancer, thymoma, breast and ovarian cancer, as well as brain tumors, preferably primary brain tumors. glial origin.

L'expression d'ULIP6 dans les cellules non prolifératives du cerveau normal, son absence dans des tissus normaux tels que poumon ou thymus par exemple, sa réexpression différentielle lors de la tumorigénèse de ces tissus et la modulation de son expression dans une lignée tumorale au cours de la différenciation suggèrent à cet égard que ULIP 6 pourrait être un gène suppresseur de tumeur. The expression of ULIP6 in nonproliferative cells of the normal brain, its absence in normal tissues such as lung or thymus for example, its differential reexpression during the tumorigenesis of these tissues and the modulation of its expression in a tumor line at Differentiation courses suggest in this regard that ULIP 6 could be a tumor suppressor gene.

Préférentiellement, les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par voie systémique, de préférence par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Preferably, the pharmaceutical compositions according to the invention can be administered by the systemic route, preferably by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.

Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Their optimal modes of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a therapeutic treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of general condition, tolerance to treatment and observed side effects, etc.

L'invention comprend également l'utilisation d'une protéine purifiée ULIP6, un acide nucléique codant pour ladite protéine ou appartenant aux régions non codantes du gène de l'ULIP6, une séquence anti-sens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou n 3, ou un anticorps dirigé contre ladite protéine, associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les maladies neurodégénératives et les néoplasmes. The invention also includes the use of a purified protein ULIP6, a nucleic acid coding for said protein or belonging to the non-coding regions of the gene for ULIP6, an antisense sequence capable of hybridizing specifically with a nucleotide sequence SEQ ID No. 1 or No. 3, or an antibody directed against said protein, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle, for the manufacture of a medicament intended to treat neurodegenerative diseases and neoplasms.

L'invention a enfin pour objet une méthode de traitement des maladies neurodégénératives et des néoplasmes comprenant l'administration à un sujet nécessitant un tel traitement d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique telle que définie précédemment. The invention finally relates to a method of treatment of neurodegenerative diseases and neoplasms comprising the administration to a subject requiring such treatment of a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition as defined above.

Les exemples et les figures dont les légendes sont présentées ciaprès sont donnés à titre illustratif. The examples and figures whose legends are presented below are given by way of illustration.

LEGENDE DES FIGURES - La figure 1 représente un Western Blot réalisé à partir d'extraits protéiques d'E. coli exprimant la protéine de fusion GST-ULIP6 C-term. Ces extraits ont été séparés par SDS-PAGE 12,5 %, transférés sur membrane de PVDF et incubés avec des sérums humains. Lignes 1 à 4 : anti-CV2, (1) sérum 90-002, (2) sérum 95-185, (3) -sérum 95-590, (4) sérum 97-040 ; lignes 5 et 6 : sérums contrôles. LEGEND TO THE FIGURES - FIG. 1 represents a Western Blot produced from protein extracts of E. coli expressing the GST-ULIP6 C-term fusion protein. These extracts were separated by 12.5% SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane and incubated with human sera. Lines 1 to 4: anti-CV2, (1) serum 90-002, (2) serum 95-185, (3) -serum 95-590, (4) serum 97-040; lines 5 and 6: control sera.

- La figure 2 représente un Western Blot réalisé à partir de protéines de fusion GST-ULIP6 C-term après purification sur billes d'agaroseglutathione. La protéine est reconnue par deux sérums anti-CV2, (ligne 1 : sérum 94-822, ligne 2 : sérum 95-590) mais pas par un sérum contrôle (ligne 3). - Figure 2 shows a Western Blot made from GST-ULIP6 C-term fusion proteins after purification on agaroseglutathione beads. The protein is recognized by two anti-CV2 sera (line 1: serum 94-822, line 2: serum 95-590) but not by a control serum (line 3).

Exemple 1 : Identification de la cible des anticorps anti-CV2
Après expression des protéines recombinantes de la famille Ulip dans des cellules HeLa, les auteurs de l'invention ont pu montrer que les sérums anti-CV2 alors en leur possession reconnaissaient tous Ulip4 en immunohistochimie. Ce résultat suggérait que Ulip4 pouvait être l'antigène majeur reconnu par les sérums anti-CV2 (Honnorat et al, 1999). Par contre, lorsque une cohorte plus importante de sérums a été testée en Western blot sur la protéine Ulip4 exprimée dans E. coli, ils se sont aperçus que si plusieurs sérums anti-CV2 reconnaissaient indiscutablement la protéine recombinante Ulip4, certains ne la reconnaissaient pas, alors que tous les sérums anti-CV2 reconnaissent par Western blot une même protéine de 66kDa après immunoprécipitation d'extraits protéiques de cerveaux (Honnorat et al, 1996). De plus, par hybridation in situ, les oligodendrocytes n'exprimaient pas l'ARN messager de Ulip4. Les auteurs de l'invention ont alors émis l'hypothèse de l'existence d'une autre protéine homologue aux protéines Ulip, non encore décrite et exprimée par les oligodendrocytes. EXAMPLE 1 Identification of the Target of Anti-CV2 Antibodies
After expression of the recombinant proteins of the Ulip family in HeLa cells, the authors of the invention were able to show that the anti-CV2 sera then in their possession all recognized Ulip4 in immunohistochemistry. This result suggested that Ulip4 could be the major antigen recognized by anti-CV2 sera (Honnorat et al, 1999). On the other hand, when a larger cohort of sera was tested in Western blot on the Ulip4 protein expressed in E. coli, they realized that if several anti-CV2 sera undoubtedly recognized the recombinant protein Ulip4, some did not recognize it, whereas all anti-CV2 sera recognize by a Western blot the same 66kDa protein after immunoprecipitation of protein extracts from brains (Honnorat et al, 1996). In addition, by in situ hybridization, the oligodendrocytes did not express the messenger RNA of Ulip4. The authors of the invention then hypothesized the existence of another protein homologous to the Ulip proteins, not yet described and expressed by the oligodendrocytes.

Pour rechercher cette protéine, un sérum anti-CV2, ne reconnaissant pas Ulip4 recombinante par Western blot a été utilisé pour cribler une banque d'expression. Une banque d'ADNc de moëlle épinière humaine, lieu d'expression maximale de l'antigène CV2 chez l'adulte, clonés dans le phage lambda gt11a été choisie (Clontech, Palo Alto, USA). Les phages ont été criblés à une densité de 2x104 pfu par boites de 150 mm de diamètres. Après incubation 3 heures 30 à 42 C, les boites étaient recouverte d'une membrane de nitrocellulose incubée-dans l'IPTG (10 mmolaires) et réincubées 3 heures à 37 C. Les membranes étaient ensuite saturées dans du PBS-Tween-lait écrémé, puis incubées une nuit avec le sérum dilué au 1/100. Les membranes étaient ensuite lavées en PBS-Tween puis incubées avec un anti-sérum anti-immunoglobuline humaine marqué à la peroxidase. To search for this protein, an anti-CV2 serum not recognizing recombinant Ulip4 by Western blot was used to screen an expression library. A human spinal cord cDNA library, the site of maximum expression of the CV2 antigen in adults, cloned into the phage lambda gt11 has been chosen (Clontech, Palo Alto, USA). The phages were screened at a density of 2x104 pfu per 150 mm diameter boxes. After incubation for 3 hours 30 minutes at 42 ° C., the dishes were covered with a nitrocellulose membrane incubated in IPTG (10 mmol) and reincubated for 3 hours at 37 C. The membranes were then saturated in PBS-Tween-skimmed milk , then incubated overnight with the serum diluted 1/100. The membranes were then washed in PBS-Tween and then incubated with an anti-human immunoglobulin anti-serum labeled with peroxidase.

Après lavage, les membranes étaient révélées par la méthode de diaminobenzidine. Les clones donnant un signal positif ont été purifiés par repiquages successifs jusqu'a obtenir 100% de clones positifs. Quatre ADNc de 1400 à 1700 paires de bases et codant pour la partie C-terminale d'une After washing, the membranes were revealed by the diaminobenzidine method. The clones giving a positive signal were purified by successive subcultures until 100% of positive clones were obtained. Four cDNAs from 1400 to 1700 base pairs and coding for the C-terminal part of a

même protéine ont été identifiés. Le clone présentant la plus grande séquence codante (clone 97) contenait 1491 paires de bases (nucléotides 705 à 2196 de la séquence ID n 1) avec un cadre ouvert de lecture de 270 nucléotides codant pour un polypeptide de 90 acides aminés (acides aminés 236 à 325 de la séquence ID n 2). Après recherche d'homologie dans des banques de données, il a été constaté que ce polypeptide (nommé dans la suite de l'étude Ulip6 C-Term) présentait une homologie de 35% avec la partie C-terminale de chacun des membres déjà connu de la famille Ulip et qu'il n'existait aucune homologie avec d'autres familles de protéines. same protein have been identified. The clone with the largest coding sequence (clone 97) contained 1491 base pairs (nucleotides 705 to 2196 of sequence ID No. 1) with an open reading frame of 270 nucleotides coding for a polypeptide of 90 amino acids (amino acids 236 at 325 of the sequence ID No. 2). After searching for homology in databases, it was found that this polypeptide (named hereinafter in the Ulip6 C-Term study) had 35% homology with the C-terminal part of each of the members already known. of the Ulip family and that there was no homology with other families of proteins.

Exemple 2 : production de la protéine recombinante GST- ULIP6 C-Term
Pour confirmer que ce polypeptide était bien l'antigène reconnu par les sérums anti-CV2, la phase codante du clone 97 a été clonée dans un vecteur d'expression bactérien, pGex 2T (Pharmacia Amersham Biotech, Suède). Ce vecteur permet l'expression, chez E.coli, de la protéine d'intérêt en fusion avec la glutathione-S-transferase (GST, 26kDa). Par Western-blot, 16 des 18 sérums anti-CV2 testés reconnaissaient la protéine de fusion GSTUlip6-CTerm dans un extrait protéique bactérien, soit 89 % de positifs (Figure 1). Il est à noter que le polypeptide Ulip6 C-Term a un poids moléculaire de 10 kDa ce qui représente environ 15 % d'une protéine de 66 kDa. Aucun de ces sérums ne reconnaissait la GST seule. 100 sérums contrôles ont également été testés. Aucun ne présentait de réactivité vis à vis de la protéine de fusion GST-Ulip6 C-Term. Dans le but de disposer du test le plus spécifique possible, les auteurs de l'invention ont également testé les sérums anti-CV2 sur la protéine de fusion GST-Ulip6 C-Term purifiée sur billes d'agaroseglutathione. La figure 2 montre un exemple des résultats obtenus en Western blot. Example 2: production of the recombinant protein GST-ULIP6 C-Term
To confirm that this polypeptide was indeed the antigen recognized by anti-CV2 sera, the coding phase of clone 97 was cloned into a bacterial expression vector, pGex 2T (Pharmacia Amersham Biotech, Sweden). This vector allows the expression, in E. coli, of the protein of interest in fusion with glutathione-S-transferase (GST, 26kDa). By Western blot, 16 of the 18 anti-CV2 sera tested recognized the GSTUlip6-CTerm fusion protein in a bacterial protein extract, ie 89% positive (Figure 1). It should be noted that the Ulip6 C-Term polypeptide has a molecular weight of 10 kDa which represents approximately 15% of a protein of 66 kDa. None of these sera recognized GST alone. 100 control sera were also tested. None exhibited reactivity towards the GST-Ulip6 C-Term fusion protein. In order to have the most specific test possible, the authors of the invention also tested the anti-CV2 sera on the GST-Ulip6 C-Term fusion protein purified on agaroseglutathione beads. Figure 2 shows an example of the results obtained in Western blotting.

Exemple 3 : Northern-blot sur ARN de moelle épinière humaine
Pour déterminer la taille du transcript du gène Ulip6, une analyse par Northern blot a été réalisée sur des ARN polyA+ purifiés extraits de moelle épinière humaine (Clontech, Palo Alto, USA). La sonde correspondait à la totalité du clone 97 marqué au dCTP alpha 32P. Les ARN ont été séparés sur gel d'électrophorèse agarose 1,2% formaldéhyde et transférés sur membrane de nylon. Après préhybridation avec la solution d'hybridation rapide (Clontech, Palo Alto, USA) la membrane était incubée une heure avec la sonde. Après lavage, la membrane était exposée sur un film pendant une nuit à -80 C. Une seule bande correspondant à un transcrit de 5 kb a été révélée. Example 3 Northern Blot on RNA of Human Spinal Cord
To determine the size of the transcript of the Ulip6 gene, a Northern blot analysis was carried out on purified polyA + RNAs extracted from human spinal cord (Clontech, Palo Alto, USA). The probe corresponded to the entire clone 97 labeled with dCTP alpha 32P. The RNAs were separated on 1.2% formaldehyde agarose electrophoresis gel and transferred to a nylon membrane. After prehybridization with the rapid hybridization solution (Clontech, Palo Alto, USA) the membrane was incubated for one hour with the probe. After washing, the membrane was exposed on a film overnight at -80 C. A single band corresponding to a 5 kb transcript was revealed.

Exemple 4 : Hybridation in situ sur moelle épinière
Pour vérifier la présence de l'ARN messager de Ulip6 dans les oligodendrocytes, une analyse par hybridation in situ a été réalisée sur coupe frontale de moelle. La sonde utilisée était une sonde ARN froide obtenue par transcription du clone 97 sous cloné dans pBluescript SK (Stratagène) et marquée à la digoxigénine. Une sonde sens était utilisée comme contrôle négatif. Un marquage spécifique des oligodendrocytes a pu être observé. EXAMPLE 4 In situ Hybridization on Spinal Cord
To verify the presence of the messenger RNA of Ulip6 in the oligodendrocytes, an analysis by in situ hybridization was carried out on a frontal section of marrow. The probe used was a cold RNA probe obtained by transcription of clone 97 subcloned into pBluescript SK (Stratagene) and labeled with digoxigenin. A sense probe was used as a negative control. Specific labeling of oligodendrocytes could be observed.

Exemple 5 : Production d'un anticorps de lapin anti-Ulip6
Des anticorps polyclonaux ont été produits par immunisation de lapins contre un peptide spécifique de la protéine Ulip6 (peptide Pep Ulip6="KEMGTPLADTPTRPVTRHGG" de séquence SEQ ID n 4 , correspondant au fragment d'acides aminés 265 à 284 sur SEQ ID n 2). Le peptide a été synthétisé sur un appareil de synthèse peptidique (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems), par la société COVALAB (Lyon, France). La pureté des échantillons a été contrôlée par HPLC et spectrométrie de masse. Un milligramme de peptide couplé à l'hémocyanine et à de Example 5 Production of a Rabbit Anti-Ulip6 Antibody
Polyclonal antibodies have been produced by immunization of rabbits against a peptide specific for the Ulip6 protein (peptide Pep Ulip6 = "KEMGTPLADTPTRPVTRHGG" of sequence SEQ ID no 4, corresponding to the amino acid fragment 265 to 284 on SEQ ID no 2). The peptide was synthesized on a peptide synthesis device (432A Peptide Synthesizer SYNERGY, Applied Biosystems), by the company COVALAB (Lyon, France). The purity of the samples was checked by HPLC and mass spectrometry. One milligram of peptide coupled to hemocyanin and

l'adjuvant complet de Freund a été injecté aux lapins (COVALAB, Lyon, France). Toutes les 3 semaines, une nouvelle injection de 0,5 mg a été réalisée. La production d'anticorps et leur spécificité ont été analysées par western-blots et immunohistochimie, en utilisant comme contrôle les sérums pré-immuns. Freund's complete adjuvant was injected into rabbits (COVALAB, Lyon, France). Every 3 weeks, a new injection of 0.5 mg was made. The production of antibodies and their specificity were analyzed by western blots and immunohistochemistry, using as pre-immune sera.

Les anticorps obtenus reconnaissaient la protéine GST-Ulip6 CTerm par western-blot, une protéine de 66 kDa sur extraits de cerveau et marquaient spécifiquement des oligodendrocytes par immunohistochimie sur coupes de moelle de rats. The antibodies obtained recognized the GST-Ulip6 CTerm protein by western-blot, a 66 kDa protein on brain extracts and specifically labeled oligodendrocytes by immunohistochemistry on rat marrow sections.

Exemple 6 : Recherche de la séquence complète Ulip6
Pour obtenir un ADNc complet de Ulip6, la banque d'ADNc de moëlle épinière humaine, clonés dans le phage lambda gt11 (Clontech, Palo Alto, USA) a été criblée avec une sonde radioactive. Cette sonde obtenue par PCR était marquée au dCTP alpha 32P, et correspondait aux nucléotides 706 à 975 de la séquence ID N 1. Les phages ont été criblés à une densité de 2x104 pfu par boites de 150 mm de diamètres. Après incubation 6 heures à 37 C, une réplique était obtenue sur une membrane de nylon. Cette membrane était traitée pour dénaturation des phages, puis l'ADN était fixé une nuit à 42 C. Example 6: Finding the full Ulip6 sequence
To obtain a complete cDNA from Ulip6, the human spinal cord cDNA library, cloned into phage lambda gt11 (Clontech, Palo Alto, USA) was screened with a radioactive probe. This probe obtained by PCR was labeled with dCTP alpha 32P, and corresponded to nucleotides 706 to 975 of the sequence ID N 1. The phages were screened at a density of 2x104 pfu per 150 mm diameter boxes. After incubation for 6 hours at 37 ° C., a replica was obtained on a nylon membrane. This membrane was treated for denaturation of the phages, then the DNA was fixed overnight at 42 C.

Après préhybridation avec la solution d'hybridation rapide (Clontech, Palo Alto, USA) la membrane était incubée une heure avec la sonde radioactive. Après lavage, la membrane était exposée sur un film pendant une nuit à -80 C. des clones donnant un signal positif ont été purifiés par repiquages successifs jusqu'a obtenir 100% de clones positifs. Le plus grand ADNc obtenu comprenait 2196 paires de bases et codait pour la partie C-terminale d'un polypeptide de 325 acides aminés (séquences ID N 1 et 2 respectivement) et était strictement identique au clone 97 dans sa partie 3'. After prehybridization with the rapid hybridization solution (Clontech, Palo Alto, USA) the membrane was incubated for one hour with the radioactive probe. After washing, the membrane was exposed on a film overnight at -80 ° C. clones giving a positive signal were purified by successive subcultures until 100% of positive clones were obtained. The largest cDNA obtained comprised 2196 base pairs and coded for the C-terminal part of a polypeptide of 325 amino acids (sequences ID N 1 and 2 respectively) and was strictly identical to clone 97 in its 3 'part.

Après alignement du polypeptide obtenu avec les régions Cterminales des 4 protéines Ulip connues une homologie de 45% était observée. After alignment of the polypeptide obtained with the Cterminal regions of the 4 known Ulip proteins, a 45% homology was observed.

BIBLIOGRAPHIE - Anderson et al., CRC Crit. Rev. Neurobiol., 1987, vol. 3, pp 245-99 - Antoine J.C. et al., Journal of the Neurological Sciences, 1993, vol. 117, pp 215-223 - Byk et al., Journal of Neuroscience, 1996, vol. 16(2), pp 688-701 - Byk T, Ozon S, Sobel A (1998). Eur J. Biochem, 254 :14-24 - Dalmau étal., Neurology, 1991, vol. 41, pp 1757-64 - Graus et al., Neurology, 1985, vol. 35, pp 538-543 - Greenlee et al., Ann. Neurol., 1983, vol. 14, pp 609-13 - Hamajima N, Matsuda K, Sakata S, Tamaki M, Nonaka M (1996). Gene,180 :157-163. BIBLIOGRAPHY - Anderson et al., CRC Crit. Rev. Neurobiol., 1987, vol. 3, pp 245-99 - Antoine J.C. et al., Journal of the Neurological Sciences, 1993, vol. 117, pp 215-223 - Byk et al., Journal of Neuroscience, 1996, vol. 16 (2), pp 688-701 - Byk T, Ozon S, Sobel A (1998). Eur J. Biochem, 254: 14-24 - Dalmau et al., Neurology, 1991, vol. 41, pp 1757-64 - Graus et al., Neurology, 1985, vol. 35, pp 538-543 - Greenlee et al., Ann. Neurol., 1983, vol. 14, pp 609-13 - Hamajima N, Matsuda K, Sakata S, Tamaki M, Nonaka M (1996). Gene, 180: 157-163.

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Claims

1. Purified polypeptide designated ULIP6, comprising the amino acid sequence SEQ ID No. 2 or epitopic fragment of said polypeptide, comprising the sequence SEQ ID No. 4.

2. An isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide or an epitopic fragment of said polypeptide as defined in claim 1.

3. Nucleic acid according to claim 2, comprising a nucleotide sequence chosen SEQ ID No. 1.

4. Isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence SEQ ID No. 3.

5. Cloning and / or expression vector containing a nucleic acid sequence according to one of claims 2 to 4.

6. Host cell transfected with a vector according to claim 5.

7. Mono- or polyclonal antibodies obtained from a polypeptide according to claim 1 as well as the fragments, chimeric antibodies or immunoconjugates of said mono- or polyclonal antibodies.

8. Composition useful for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes and / or for the early diagnosis of tumor formation, characterized in that it comprises a polypeptide or an epitopic fragment of said polypeptide as defined in claim 1.

9. Use of a polypeptide according to claim 1 for detecting the presence of anti-CV2 antibodies in a biological sample.

10. Use of mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies according to claim 7, for the purification or the detection of a ULIP6 protein according to claim 1, in a biological sample.

11. Method for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes and / or for the early diagnosis of the formation of cancerous tumors, in which one highlights in a biological sample

taken from an individual with autoantibodies directed against a ULIP 6 protein by - bringing a biological sample taken from an individual into contact with a polypeptide according to claim 1, optionally fixed on a support under conditions allowing the formation of complexes specific immunologicals between said polypeptide and the autoantibodies possibly present in the biological sample, and - the detection of the specific immunological complexes possibly formed.

12. Kit for the diagnosis of paraneoplastic neurological syndromes and for the early diagnosis of tumor formation from a biological sample comprising: - at least one ULIP6 polypeptide, according to claim 1, optionally fixed on a support, means for revelation of the formation of specific antigen / antibody complexes between an anti-ULIP6 autoantibody and said ULIP6 polypeptide and / or means of quantification of these complexes.

13. Pharmaceutical composition comprising at least one therapeutic agent chosen from a polypeptide according to claim 1, a nucleic acid according to claim 2 to 4 or a nucleic acid comprising an antisense sequence capable of hybridizing specifically with a nucleic acid according to claim 2 to 4, or an antibody specifically directed against the polypeptide according to claim 7, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

14. Use of a therapeutic agent as defined in claim 13 for the manufacture of a medicament intended to treat neurodegenerative diseases and neoplasms.