FR2795091A1

FR2795091A1 - Acides nucleiques et proteines du gene abc1 humain et leur application en therapie et diagnostic

Info

Publication number: FR2795091A1
Application number: FR9907684A
Authority: FR
Inventors: Patrice Denefle; Montus Marie Francoise Rosier; Reguigne Isabelle Arnould; Catherine Prades; Laurent Naudin; Cendrine Lemoine; Nicolas Duverger; Gerd Assmann; Stephan Rust
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2000-12-22
Anticipated expiration: 2019-06-17
Also published as: FR2795091B1; ZA200110545B

Abstract

La présente invention concerne des acides nucléiques correspondant aux différents exons et introns du gène ABC1, dont il est présentement démontré qu'il est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, plus particulièrement des perturbation du transport inverse du cholestérol, et plus particulièrement des déficiences familiales en HDL (FHD), comme la maladie de Tangier.

Description

La présente invention concerne des acides nucléiques correspondant aux différents exons et introns du gène ABC1, dont il est présentement démontré qu'il est un gène causal de pathologies liées à un dysfonctionnement du métabolisme du cholestérol induisant des maladies comme l'athérosclérose, plus particulièrement des perturbation du transport inverse du cholestérol, et plus particulièrement des déficiences familiales en HDL (FHD), comme la maladie de Tangier. L'invention concerne également des moyens de détection de polymorphismes en général, et de mutations en particulier, dans le gène ABC1 ou dans la protéine correspondante produite par la forme allélique du gène ABC1. L'invention fournit également des compositions pharmaceutiques comprenant un acide nucléique contenant la région codante du gène ABC1 et des compositions pharmaceutiques contenant la protéine ABC1 destinées au traitement de maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol, telle que la maladie de Tangier. L'invention forunit également des méthodes de criblages de petites molécules agissant sur la protéine ABC1 qui peuvent par elle même constituer des produit agissant sur le transport inverse du cholestérol et en tant que telles, peuvent permettre de lutter efficacement contre l'athérosclérose du point de vue thérapeutique.

Les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont l'une des quatre classes majeures de lipoprotéines qui circulent dans le plasma sanguin.

Ces lipoprotéines sont impliquées dans différentes voies métaboliques telles que le transport lipidique, la formation des acides biliaires, la stéroïdogénèse, la prolifération cellulaire et en outre interfèrent avec les systèmes de protéinase plasmatique.

Les HDL sont de parfaits accepteurs de cholestérol libre et, en combinaison avec les protéines de transfert d'ester de cholestérol (CETP), la lipoprotéine lipase (LPL), la lipase hépatique (HL) et la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT), jouent un rôle majeur dans le transport inverse du cholestérol, c'est à dire le transport du cholestérol en excès dans les cellules périphériques vers le foie pour son élimination de l'organisme sous forme d'acide biliaire.

Il a été démontré que les HDL jouent un rôle central dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie.

Diverses maladies liées à une déficience en HDL ont été décrites, comprenant la maladie de Tangier, la déficience en HDL et la déficience en LCAT.

La déficience impliquée dans la maladie de Tangier est reliée à un déficit cellulaire dans la translocation du cholestérol cellulaire qui entraînent une dégradation des HDLs. Néanmoins, pour la maladie de Tangier, la nature exacte du déficit n'a pas encore été précisément définie.

Dans la maladie de Tangier, ce déficit cellulaire conduit à une perturbation du métabolisme lipoprotéique. Les particules HDL n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDL n'assurent plus le retour du cholestérol vers le foie. Ce cholestérol s'accumule dans ces cellules périphériques et provoquent des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation d'amygdales orangées. De plus, d'autres perturbations lipoprotéiques comme une surproduction de triglycérides ainsi qu'une synthèse et un catabolisme intracellulaire accrus des phospholipides sont observées.

La maladie de Tangier, dont les symptômes ont été décrits ci-dessus, est classée parmi les affections familiales liées au métabolisme des HDL qui sont les plus couramment détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes.

De nombreuses études ont montré qu'un niveau réduit de cholestérol HDL est un excellent facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.

Dans ce contexte, des syndromes liés aux déficiences en HDL ont présenté un intérêt accru durant la décennie passée du fait qu'elles permettent d'accroître la compréhension du rôle des HDL dans l'athérogénèse.

Plusieurs mutations dans le gène apo A-I ont été caractérisées. Ces mutations sont rares et peuvent conduire à une absence de production d'apo A-I.

Des mutations dans les gènes codant pour la lipoprotéine lipase (LPL) ou son activateur apoC-11 sont associées à des hypertriglycéridémies sévères et des niveaux de HDL-c fortement réduits.,

Des mutations dans le gène codant pour l'enzyme lécithine: cholestérol, acyltransférase (LCAT) sont également associées à une déficience sévère en HDL.

De plus, des dysfonctionnements dans le transport inverse du cholestérol pourraient être induits par des déficits physiologiques affectant une ou plusieurs des étapes de transport du cholestérol stocké, des vésicules intracellulaires vers la surface membranaire au niveau de laquelle celui-ci est pris en charge par les HDL.

Il existe donc un besoin croissant dans l'état de la technique d'identifier des gènes impliqués dans l'une quelconque des étapes du métabolisme du cholestérol et/ou des lipoprotéines, et en particulier de gènes associés à des dysfonctionnements du transport inverse du cholestérol des cellules périphériques vers le foie.

Récemment, une étude de la ségrégation de différentes formes alléliques de 343 marqueurs microsatellites répartis sur l'ensemble du génome et distants entre eux en moyenne de 10,3 cM a été réalisée.

L'étude de liaison (linkage) a porté sur une famille bien caractérisée sur onze générations, dont de nombreux membres sont affectés par la maladie de Tangier, la famille comportant cinq lignées de consanguinité.

Cette étude a permis d'identifier une région localisée dans le locus 9q31 du chromosome 9 humain statistiquement associé à l'affection (Rust S. et al., Nature Genetics, vol. 20, Septembre 1998, pages 96-98).

Toutefois, l'étude de RUST et al. définit seulement une large région du génome dont des altérations sont susceptibles d'être associées à la maladie de Tangier. Il est simplement précisé que la région 9q31-34 concernée contient des ESTs mais aucun gène connu.

Il a désormais été montré selon l'invention qu'une région d'environ 1 cM située dans le locus 9q31 chez l'homme était associée, de manière générale, à des déficiences familiales en HDL.

De manière plus précise, il a été montré qu'un gène codant pour une protéine de la famille des transporteurs ABC, localisé précisément dans la région de 1 cM du locus 9q31, était impliqué dans des pathologies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol.

Plus particulièrement, il a été montré selon l'invention que le gène codant pour le transporteur ABC-1 était muté chez des patients affectés dans le transport inverse du cholestérol, et tout particulièrement chez des patients atteints de la maladie de Tangier.

Les protéines transporteurs ABC (" ATP-binding cassette ") constituent une famille de protéines qui sont extrêmement conservées au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme.

Les protéines transporteurs ABC sont impliqués dans le transport membranaire de divers substrats, par exemple des ions, des acides aminés, des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes.

La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de certains transporteurs ABC a permis de déterminer que ces protéines avaient une structure générale commune, notamment deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucleotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs de type Walker A et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de six hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF.

Plusieurs des protéines transporteurs ABC qui ont été identifiées chez l'homme, ont été associées à diverses maladies.

Par exemple, la mucoviscidose est provoquée par des mutations dans le gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator).

Par ailleurs, certains phénotypes de résistance multiple aux médicaments dans les cellules tumorales ont été associés à des mutations dans le gène codant la protéine MDR (multi-drug résistance), qui a également une structure de transporteur ABC.

D'autres transporteurs ABC ont été associés à des affections neuronales et tumorales (brevet US n 5,858,719) ou encore potentiellement impliqués dans des maladies provoquées par une altération de l'homéostasie des métaux, telle que la protéine ABC-3.

De même, un autre ABC transporteur, désigné PFIC2, semble impliquer dans une forme de cholestasie intrahépatique familiale

progressive, cette protéine étant potentiellement responsable, chez l'homme, de l'exportation des sels biliaires.

En 1994, un ADNc codant pour un nouveau transporteur ABC de souris a été identifié et désigné ABC1 (Luciani et al., 1994). Cette protéine est caractéristique des transporteurs ABC en ce qu'elle comporte une structure symétrique comprenant deux domaines transmembranaires liés à un segment hautement hydrophobe et à deux motifs NBF.

Chez l'homme, un ADNc partiel comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte du transporteur ABC1 humain a été identifié (Langmann et al., 1999).

Il a également été montré que le gène codant pour la protéine ABC1 humaine est exprimé dans divers tissus, et plus particulièrement à des niveaux élevés dans le placenta, le foie, le poumon, les glandes surrénales ainsi que les tissus f#taux.

Ces auteurs ont également montré que l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 humaine était induite pendant la différenciation des monocytes en macrophages in vitro. De plus, l'expression du gène codant pour la protéine ABC1 est augmentée lorsque les macrophages humains sont incubés en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).

Toutefois, le rôle exact de la protéine ABC1 humaine dans le système de transport des lipides est totalement inconnu. Il est simplement supposé que la protéine ABC1 possède une activité de translocase des phospholipides.

Il a désormais été montré selon l'invention que des patients atteints de la maladie de Tangier comportaient un gène ABC1 muté. Plusieurs mutations distribuées dans différents exons du gène ABC1 ont été identifiées dans le génome de différents malades, en particulier de malades affectés d'une forme sévère de la maladie associée à des désordres coronariens. Par ailleurs, divers polymorphismes ont été trouvés à la fois dans les exons et dans les introns du gène ABC1 chez des patients atteints de formes plus légères de la maladie, indiquant que ces patients portent des allèles particuliers du gène, distinct du ou des allèles " sauvages De tels allèles, en partie caractérisables par ces polymorphismes, sont par ailleurs susceptibles de contenir des substitutions, additions ou délétions de

nucléotides dans des régions non codantes localisées respectivement du côté 5' du premier exon ou encore du côté 3' du dernier exon du gène, en particulier dans des régions régulatrices, par exemple dans des séquences promotrices ou encore dans des séquences activatrices (en anglais " enhancer "), de nature à induire des défauts-augmentation ou diminutiondans la synthèse du polypeptide ABC1.

Il a ainsi été identifié une première mutation particulière chez un patient atteint de la maladie de Tangier, dans le gène ABC-1, qui est localisée dans l'exon 13, et qui consiste en une substitution d'un nucléotide provoquant l'introduction d'un codon d'arrêt de traduction précoce dans la phase ouverte de lecture, conduisant à la synthèse d'un polypeptide tronqué comprenant environ d'un quart de la séquence d'acides aminés du polypeptide synthétisé chez les patients non affectés par la maladie de Tangier.

Une seconde mutation particulière dans le gène ABC1 a été trouvée, qui consiste en une insertion d'un fragment de 100 nucléotides dans l'exon 12, conduisant à la synthèse d'un polypeptide anormal en ce qu'il contient une délétion de 6 résidus et une insertion de 38 amino-acides, ce en position 468 de la séquence de la protéine.

Il a en outre été confirmé selon l'invention que le gène ABC1 était régulé positivement par les lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDLs).

DEFINITIONS GENERALES
Le terme " isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).

Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".

Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeur

néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.

Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.

Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.

Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de duplex.

Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.

Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.

Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.

Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entendra un acide nucléique qui diffère d'une ou plusieurs bases par rapport au polynucléotide de référence. Un acide nucléique variant peut être d'origine naturel, tel qu'un variant allélique retrouvé naturellement, ou peut être aussi un variant non naturel obtenu par exemple par des techniques de mutagénèse.

En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que les séquences nucléotidiques de l'acide nucléique de référence et de l'acide nucléique variant sont très proches et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications de nucléotides présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'altèrent pas les séquences d'aminoacides codées par ledit acide nucléique variant.

Cependant, les changements de nucléotides dans un acide nucléique variant peuvent aussi résulter dans des substitutions, additions, délétions dans le polypeptide codé par l'acide nucléique variant par rapport aux peptides codés par l'acide nucléique de référence. En outre,- des modifications de nucléotides dans les régions codantes peuvent produire des substitutions, conservatives ou non conservatives dans la séquence d'aminoacides.

De préférence, les acides nucléiques variants selon l'invention codent pour des polypeptides qui conservent sensiblement la même fonction ou activité biologique que le polypeptide de l'acide nucléique de référence ou encore la capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides codés par l'acide nucléique initial.

Certains acides nucléiques variants coderont ainsi pour des formes mutées des polypeptides dont l'étude systématique permettra de déduire des relations structure activité des protéines en question. La connaissance de ces variants par rapport à la maladie étudiée est fondamentale puisqu'elle permet de comprendre la cause moléculaire de la pathologie.

On entendra par " fragment " un acide nucléique de référence selon l'invention, une séquence nucléotidique de longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence et comprenant, sur la partie commune, une séquence en nucléotides identique à l'acide nucléique de référence.

Un tel " fragment " d'acide nucléique selon l'invention peut être le cas échéant, compris dans un polynucléotide plus grand duquel il est constitutif.

De tels fragments comprennent, ou alternativement consistent en, des oligonucléotides de longueur allant de 8,10, 12,15, 18,20 à 25, 30, 40, 50,
70,80, 100,200, 500,1000 ou 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention.

Par " variant " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra principalement un polypeptide dont la séquence d'acides aminés contient une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'aminoacides peuvent être indifféremment conservatives ou non conservatives.

Par " fragment " d'un polypeptide selon l'invention, on entendra un polypeptide dont la séquence d'acides aminés est plus courte que celle du polypeptide de référence et qui comprend sur toute la partie commune avec ces polypeptides de référence, une séquence en acides aminés identique.

De tels fragments peuvent, le cas échéant, être compris au sein d'un polypeptide plus grand duquel ils font partie.

De tels fragments d'un polypeptide selon l'invention peuvent avoir une longueur de 10, 15,20, 30 à 40,50, 100,200 ou 300 acides aminés.

Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.

La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.

Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE,
GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison,
WISCONSIN.

À titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1. 4.9 de mars 1996, BLAST 2. 0.4 de février 1998 et BLAST 2. 0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol.

Biol. 1990 215 : 403-410, S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res. 1997 25 : 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.

Par " conditions d'hybridation de forte stringence " au sens de la présente invention, on entendra les conditions suivantes : 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION : - Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 l ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Oter le SSC 2X et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.

- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Compétition de la sonde marquée : - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 l ADN Cot I, selon la quantité de repeats.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3- HYBRIDATION: - Oter le mix de pré hybridation.

- Mélanger 40 l ADN sperme de saumon + 40 l ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace.

- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot1 dénaturée.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1 % à 65 C.

- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1% à 65 C.

Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.

Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.

Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.

Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et
HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999).

ACIDES NUCLEIQUES DU GENE ABC1 SEQUENCES GENOMIQUES
Le gène ABC1 humain comprendrait 48 exons et 47 introns, si l'on se réfère notamment à la structure du gène ABC1 orthologue chez la souris.

Plusieurs séquences nucléotidiques génomiques partielles du gène ABC1 ont été isolées et caractérisées selon l'invention, ces séquences génomiques comprenant à la fois des séquences exoniques et des séquences introniques nouvelles, qui peuvent être utilisées notamment pour la réalisation de différents moyens de détection du gène ABC1 ou de ses produits d'expression nucléotidiques dans un échantillon. Ces séquences génomiques partielles sont représentées dans le tableau 1 ci-après.

Tableau #
Séquences génomiques partielles du gène ABC1 humain

<tb>
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> Désignation
<tb> 1 <SEP> Intron <SEP> 10(p), <SEP> exon <SEP> 11 <SEP> (p) <SEP>
<tb> 2 <SEP> Intron <SEP> 11 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 12, <SEP> intron <SEP> 12, <SEP> exon
<tb> 13, <SEP> intron <SEP> 13, <SEP> exon <SEP> 14, <SEP> intron <SEP> 14, <SEP> exon
<tb> 15, <SEP> intron <SEP> 15, <SEP> exon <SEP> 16, <SEP> intron <SEP> 16, <SEP> exon
<tb> 17(p)
<tb> 3 <SEP> Exon <SEP> 17 <SEP> (p), <SEP> 17(p)
<tb> 4 <SEP> Intron <SEP> 18 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 19, <SEP> intron <SEP> 19(p)
<tb> 5 <SEP> Intron <SEP> 19 <SEP> (p), <SEP> 20, <SEP> intron <SEP> 20, <SEP> exon
<tb> 21, <SEP> intron <SEP> 21, <SEP> exon <SEP> 22, <SEP> intron <SEP> 22, <SEP> exon
<tb> 23, <SEP> intron <SEP> 23, <SEP> exon <SEP> 24, <SEP> intron <SEP> 24, <SEP> exon
<tb> 25, <SEP> intron <SEP> 25, <SEP> exon <SEP> 26, <SEP> intron <SEP> 26(p)
<tb> 6 <SEP> Intron <SEP> 26 <SEP> (p), <SEP> 27, <SEP> intron <SEP> 27, <SEP> exon
<tb> 28, <SEP> intron <SEP> 28, <SEP> exon <SEP> 29, <SEP> intron <SEP> 29, <SEP> exon
<tb> 30, <SEP> intron <SEP> 30(p)
<tb> 7 <SEP> Intron <SEP> 30 <SEP> (p), <SEP> 31, <SEP> intron <SEP> 31, <SEP> exon
<tb> 32, <SEP> intron <SEP> 32, <SEP> exon <SEP> 33, <SEP> intron <SEP> 33, <SEP> exon
<tb> 34, <SEP> intron <SEP> 34(p)
<tb> 8 <SEP> Intron <SEP> 34 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 35, <SEP> intron <SEP> 35(p)
<tb> 9 <SEP> Intron <SEP> 35 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 36, <SEP> intron <SEP> 36(p)
<tb>

<tb>
<tb> 10 <SEP> Intron <SEP> 36 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 37, <SEP> intron <SEP> 37, <SEP> exon
<tb> 38, <SEP> intron <SEP> 38(p)
<tb> 11 <SEP> Intron <SEP> 39 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 40, <SEP> intron <SEP> 40, <SEP> exon
<tb> 41, <SEP> intron <SEP> 41 <SEP> (p) <SEP>
<tb> 12 <SEP> Intron <SEP> 41 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 42, <SEP> intron <SEP> 42(p)
<tb> 13 <SEP> Intron <SEP> 46 <SEP> (p), <SEP> exon <SEP> 47, <SEP> intron <SEP> 47(p)
<tb> 14 <SEP> Dernier <SEP> exon <SEP> (p), <SEP> en <SEP> 3' <SEP> du
<tb> dernier <SEP> exon
<tb>

Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1-14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1-14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Trente deux exons du gène ABC1 ont été caractérisés, au moins partiellement, par leur séquence nucléotidique, comme indiqué dans le Tableau Il ci-dessous.

Tableau Il

<tb>
<tb> Exon <SEP> N <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> Localisé <SEP> dans <SEP> Position <SEP> du <SEP> Position <SEP> du
<tb> NO <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5' <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'
<tb> 11 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 15 <SEP> 1 <SEP> 3003 <SEP> 3153 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 16 <SEP> 2 <SEP> 398 <SEP> 603
<tb> 13 <SEP> 17 <SEP> 2 <SEP> 1124 <SEP> 1300
<tb> 14 <SEP> 18 <SEP> 2 <SEP> 3087 <SEP> 3309
<tb> 15 <SEP> 19 <SEP> 2 <SEP> 5055 <SEP> 5276
<tb> 16 <SEP> 20 <SEP> 2 <SEP> 6337 <SEP> 6541
<tb>

<tb>
<tb> 17 <SEP> (Ext. <SEP> 5') <SEP> 21 <SEP> 2 <SEP> 7646 <SEP> 7660
<tb> 17 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 22 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 105
<tb> 19 <SEP> 23 <SEP> 4 <SEP> 904 <SEP> 1035
<tb> 20 <SEP> 24 <SEP> 5 <SEP> 284 <SEP> 426
<tb> 21 <SEP> 25 <SEP> 5 <SEP> 630 <SEP> 767
<tb> 22 <SEP> 26 <SEP> 5 <SEP> 1470 <SEP> 1690
<tb> 23 <SEP> 27 <SEP> 5 <SEP> 2949 <SEP> 3021
<tb> 24 <SEP> 28 <SEP> 5 <SEP> 4008 <SEP> 4210
<tb> 25 <SEP> 29 <SEP> 5 <SEP> 5878 <SEP> 5926
<tb> 26 <SEP> 30 <SEP> 5 <SEP> 6122 <SEP> 6235
<tb> 27 <SEP> 31 <SEP> 6 <SEP> 561 <SEP> 709
<tb> 28 <SEP> 32 <SEP> 6 <SEP> 2359 <SEP> 2483
<tb> 29 <SEP> 33 <SEP> 6 <SEP> 3714 <SEP> 3812
<tb> 30 <SEP> 34 <SEP> 6 <SEP> 6848 <SEP> 7036
<tb> 31 <SEP> 35 <SEP> 7 <SEP> 1183 <SEP> 1277
<tb> 32 <SEP> 36 <SEP> 7 <SEP> 2587 <SEP> 2619
<tb> 33 <SEP> 37 <SEP> 7 <SEP> 3744 <SEP> 3849
<tb> 34 <SEP> 38 <SEP> 7 <SEP> 5323 <SEP> 5397
<tb> 35 <SEP> 39 <SEP> 8 <SEP> 236 <SEP> 405
<tb> 36 <SEP> 40 <SEP> 9 <SEP> 989 <SEP> 1166
<tb> 37 <SEP> 41 <SEP> 10 <SEP> 545 <SEP> 660
<tb> 38 <SEP> 42 <SEP> 10 <SEP> 772 <SEP> 916
<tb> 40 <SEP> 43 <SEP> 11 <SEP> 435 <SEP> 564
<tb> 41 <SEP> 44 <SEP> 11 <SEP> 829 <SEP> 949
<tb> 42 <SEP> 45 <SEP> 12 <SEP> 589 <SEP> 651
<tb> 47 <SEP> 46 <SEP> 13 <SEP> 377 <SEP> 620
<tb> Dernier <SEP> 47 <SEP> 14 <SEP> 1 <SEP> 1237
<tb> Exon
<tb> (Ext3')
<tb>

Ainsi, l'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15-47 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Par ailleurs, trente-cinq introns du gène ABC1 ont été isolés et caractérisés, au moins partiellement. Les séquences nucléotidiques des introns du gène ABC1, ainsi que leurs fragments et leurs variants peuvent aussi être utilisés comme sondes ou amorces nucléotidiques pour détecter la présence d'au moins une copie du gène ABC1 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène ABC1.

Les références aux séquences introniques du gène ABC1 sont indiquées dans le Tableau III ci-dessous.

Tableau III

<tb>
<tb> Intron <SEP> N <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> Localisé <SEP> dans <SEP> Position <SEP> du <SEP> Position <SEP> du
<tb> NO <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5' <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3'
<tb> 10 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 48 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 3002
<tb> 11 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 49 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 397
<tb> 12 <SEP> 50 <SEP> 2 <SEP> 604 <SEP> 1123
<tb> 13 <SEP> 51 <SEP> 2 <SEP> 1301 <SEP> 3086
<tb> 14 <SEP> 52 <SEP> 2 <SEP> 3310 <SEP> 5054
<tb> 15 <SEP> 53 <SEP> 2 <SEP> 5277 <SEP> 6336
<tb> 16 <SEP> 54 <SEP> 2 <SEP> 6542 <SEP> 7645
<tb> 17(Ext <SEP> 3') <SEP> 55 <SEP> 3 <SEP> 106 <SEP> 1285
<tb> 18 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 56 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 903
<tb> 19 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 57 <SEP> 4 <SEP> 1036 <SEP> 1521
<tb> 19 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 58 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 283
<tb> 20 <SEP> 59 <SEP> 5 <SEP> 427 <SEP> 629
<tb> 21 <SEP> 60 <SEP> 5 <SEP> 768 <SEP> 1469
<tb> 22 <SEP> 61 <SEP> 5 <SEP> 1691 <SEP> 2948
<tb> 23 <SEP> 62 <SEP> 5 <SEP> 3022 <SEP> 4007
<tb> 24 <SEP> 63 <SEP> 5 <SEP> 4211 <SEP> 5877
<tb> 25 <SEP> 64 <SEP> 5 <SEP> 5927 <SEP> 6121
<tb> 26 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 65 <SEP> 5 <SEP> 6236 <SEP> 6519
<tb> 26 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 66 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 560
<tb>

<tb>
<tb> 27 <SEP> 67 <SEP> 6 <SEP> 710 <SEP> 2358
<tb> 28 <SEP> 68 <SEP> 6 <SEP> 2484 <SEP> 3713
<tb> 29 <SEP> 69 <SEP> 6 <SEP> 3813 <SEP> 6847
<tb> 30 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 70 <SEP> 6 <SEP> 7037 <SEP> 7378
<tb> 30 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 71 <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 1182
<tb> 31 <SEP> 72 <SEP> 7 <SEP> 1278 <SEP> 2586
<tb> 32 <SEP> 73 <SEP> 7 <SEP> 2620 <SEP> 3743
<tb> 33 <SEP> 74 <SEP> 7 <SEP> 3850 <SEP> 5322
<tb> 34 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 75 <SEP> 7 <SEP> 5398 <SEP> 5689
<tb> 34 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 76 <SEP> 8 <SEP> 1 <SEP> 235
<tb> 35 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 77 <SEP> 8 <SEP> 406 <SEP> 645
<tb> 35 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 78 <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 988
<tb> 36 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 79 <SEP> 9 <SEP> 1167 <SEP> 1664
<tb> 36 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 80 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 544
<tb> 37 <SEP> 81 <SEP> 10 <SEP> 661 <SEP> 771
<tb> 38 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 82 <SEP> 10 <SEP> 917 <SEP> 1279
<tb> 39 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 83 <SEP> 11 <SEP> 1 <SEP> 434
<tb> 40 <SEP> 84 <SEP> 11 <SEP> 565 <SEP> 828
<tb> 41 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 85 <SEP> 11 <SEP> 950 <SEP> 1124
<tb> 41 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 86 <SEP> 12 <SEP> 1 <SEP> 588
<tb> 42 <SEP> (Ext5') <SEP> 87 <SEP> 12 <SEP> 652 <SEP> 729
<tb> 46 <SEP> (Ext <SEP> 3') <SEP> 88 <SEP> 13 <SEP> 1 <SEP> 376
<tb> 47 <SEP> (Ext <SEP> 5') <SEP> 89 <SEP> 13 <SEP> 621 <SEP> 731
<tb> Séquence <SEP> 90 <SEP> 14 <SEP> 1238 <SEP> 3501
<tb> distale <SEP> en <SEP> 3'
<tb> du <SEP> dernier
<tb> Exon
<tb>

L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a en outre pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe

constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-89, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

En outre, une séquence nucléotidique génomique potentiellement régulatrice localisée en aval de l'extrémité 3' du dernier exon du gène ABC1 a été isolée. Il s'agit du polynucléotide de séquence SEQ ID NO 90. La caractérisation de polymorphismes dans cette séquence potentiellement régulatrice (présence éventuelle de séquences régulatrices de type activatrice ou " enhancer "), en particulier chez des patients affectés de formes légères de déficit dans le transport inverse du cholestérol, en particulier de formes légères de la maladie de Tangier, serait de nature à permettre la réalisation de moyens de détection appropriés, sondes ou amorces, spécifiques de certains de ces polymorphismes susceptibles d'induire des défauts dans la régulation de l'expression du gène ABC1.

Afin d'identifier les fragments polynucléotidiques biologiquement actifs de la séquence SEQ ID NO 90, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) qui décrit l'utilisation d'un vecteur recombinant portant un gène marqueur (par exemple la ss galactosidase, la chloramphenicol acétyl transférase, etc. ) dont l'expression peut être détectée lorsque ce gène marqueur est placé sous le contrôle d'un promoteur adapté et d'un fragment biologiquement actif du polynucléotide de séquence SEQ ID NO 90. De tels fragments biologiquement actifs de la séquence SEQ ID NO 90 peuvent être notamment clonés dans des vecteurs de sélection de séquences régulatrices appropriés, tels que l'un des vecteurs pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, ppgal-Basic, pssgal-Enhancer, ou encore pEGFP-1, commercialisés par la Société Clontech.

L'invention a en outre pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

ADNc COMPLET
Comme déjà indiqué précédemment, une séquence partielle de l'ADNc correspondant à l'expression du gène ABC1 a été identifiée par Langman et al. (1999). Cette séquence partielle de l'ADNc d'ABC1 comprend 6880 nucléotides et contient la totalité de la phase ouverte de lecture correspondant à la protéine ABC1 produite chez les sujets non affectés de troubles liés au transport inverse du cholestérol. La séquence d'ADNc décrite par Langmann et al . (1999) contient en outre une partie de la région 5'-UTR (nucléotides 1 à 120) et une partie de la région 3'-UTR (nucléotides 6727 à 6880).

Il a désormais été isolé et caractérisé selon l'invention la totalité de l'ADNc complet correspondant au gène ABC1, qui comprend une région 3'UTR nouvelle , qui constitue une région nucléique importante, notamment du point de vue de la stabilité des ARN messagers dans la cellule.

Les analyses d'expression du transcrit de séquence SEQ ID N 91 ont été réalisées par RT-PCR, comme décrit dans l'Exemple 1. Ces analyses effectuées à partir d'ARN polyA+ de différents tissus ont permis de montrer que le gène ABC1 était exprimé dans le cerveau foetal, le cerveau, le c#ur, le placenta et l'utérus.

En conséquence, l'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 91 de l'ADNc du gène ABC1 humain, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'ADNc du gène ABC1 humain de séquence SEQ ID NO 91 comprend une phase de lecture ouverte allant du nucléotide en position 121 (base A du codon d'initiation de la traduction ATG) au nucléotide en position 6723 de la séquence SEQ ID NO 91. Un signal de polyadénylation (de séquence ATTAAA) est présent, débutant au nucléotide en position 9454 de la séquence SEQ ID NO 91.

L'ADNc de séquence SEQ ID NO 91 code pour le polypeptide ABC1 d'une longueur de 2201 acides aminés, et ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 139.

L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention a aussi pour objet un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

POLYMORPHISMES AU SEIN DU GENE ABC1 MUTATIONS
Selon l'invention, plusieurs mutations ont été identifiées dans la séquence du gène ABC1, ces mutations conduisant à des altérations structurales majeures du polypeptide ABC1 codé par les séquences mutées.

Ces mutations ont été retrouvées particulièrement dans des patients atteints de formes sévères de la maladie de Tangier, associées à de graves désordres coronariens. Deux mutations particulièrement délétères sont décrites ci-après.

1. Mutation dans l'exon 12
Cette mutation consiste à la fois en une délétion d'un segment de 14 nucléotides (" TGAGAGGAAGTTCT ") localisé du nucléotide en position 472 au nucléotide en position 485 de l'ADN génomique normal de séquence
SEQ ID NO 2 et en une insertion d'une séquence de type Alu de 110 nucléotides au sein de la séquence de l'exon12 du gène ABC1, en amont du nucléotide en position 486 de l'ADN génomique normal de séquence SEQ ID
NO 2.

L'exon 12 portant cette mutation de délétion/insertion a la séquence nucléotidique SEQ ID NO 93.

L'ADNc muté correspondant a la séquence nucléotidique SEQ ID NO 94, code pour un polypeptide ABC1 muté d'une longueur de 2233 acides aminés, de séquence SEQ ID NO 140, dont la structure est fortement altérée par rapport au polypeptide ABC1 normal de séquence SEQ iD NO 139.

Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93 et 94 ainsi que la séquence polypeptidique SEQ ID NO 140 font également partie de l'invention.

2 Mutation dans l'exon 13
Cette mutation consiste en une délétion du nucléotide (G) en position 1232 de la séquence génomique SEQ ID NO 2, qui est localisé dans l'exon 13 (nucléotide G en position 106 de la séquence de l'exon 13 SEQ ID NO 17). Cette délétion ponctuelle d'une base introduit un codon stop dans la phase de lecture normale dans l'ARNm du gène ABC1.

La séquence de l'exon 13 du gène ABC1 portant cette mutation est le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 95.

L'ADNc correspondant à cette mutation dans l'exon 13 du gène ABC1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO 96.

La protéine mutée codée par le gène ABC1 muté ayant une longueur de 574 acides aminés, c'est-à-dire environ le quart de la longueur en acides aminés de la protéine normale. Le polypeptide tronqué a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO 141.

Les caractéristiques structurales permettant de différencier les séquences normales des séquences mutées d'ABC1 (génomiques, ARN messagers, ADNc) peuvent être mises à profit afin de réaliser des moyens de détections des séquences mutées d'ABC1 dans un échantillon, en particulier des sondes hybridant spécifiquement avec les séquences mutées d'ABC1 ou encore des couples d'amorces permettant d'amplifier sélectivement les régions du gène ABC1 portant les mutations décrites cidessus, la détection de la présence de ces mutations pouvant notamment être effectuée par discrimination de la longueur des fragments d'acide nucléique amplifiés, par hybridation des fragments amplifiés à l'aide des

sondes spécifiques décrites ci-dessus, ou encore par séquençage direct de ces fragments amplifiés.

Ainsi, l'invention a encore pour objet un acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, un tel acide nucléique comprend : a) soit au moins deux nucléotides consécutifs de la séquence Alu localisée dans les séquences SEQ ID NO 93 et 94, de préférence
5,10, 15,20, 25, 30,35, 40,50 ou 100 nucléotides consécutifs de la séquence Alu localisée dans les séquences SEQ ID NO 93 et
94 ; b) soit au moins les deux nucléotides " CT " situés de par et d'autre de la base G délétée, dans les séquences SEQ ID NO 94 et 95.

Font également partie de l'invention les amorces hybridant avec une séquence nucléique localisée dans la région d'une séquence d'ABC1 (génomique, ARN messager) portant l'une ou l'autre des deux mutations décrites ci-dessus.

L'invention concerne en outre un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

AUTRES POLYMORPHISMES
D'autres polymorphismes ont été retrouvés au sein de la séquence du gène ABC1, notamment des substitutions de nucléotides localisées à la fois dans les régions codantes (exons) et dans les régions non codantes.

Concernant les polymorphismes retrouvés au sein des régions codantes, il s'agit essentiellement de substitutions d'un seul nucléotide localisé sur la troisième base des codons du cadre ouvert de lecture d'ABC1,

ces substitutions n'entraînant pas de modification quant à la nature de l'acide aminé codé, compte tenu des règles de dégénérescence génétique chez l'homme, bien connues de l'homme du métier.

Ces polymorphismes sont représentés dans la présente description sous la forme de séquences nucléotidiques d'une longueur de 41 bases, la base polymorphe étant localisée au centre du fragment polymorphe. Pour chacun des polymorphismes repérés, chaque allèle est ainsi représenté comme une séquence de 41 bases, le polymorphisme lui-même étant défini par les deux séquences nucléotidiques correspondant respectivement à chacune des formes. Les polymorphismes identifiés dans le gène ABC1 sont représentés dans le Tableau IV ci-dessous.

Tableau IV
Polymorphismes retrouvés dans le gène ABC1

<tb>
<tb> Désignation <SEP> Position <SEP> dans <SEP> Allèle <SEP> 1 <SEP> Allèle <SEP> 2 <SEP> Base
<tb> N <SEP> la <SEP> séquence <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> polymorphe
<tb> SEQ <SEP> ID <SEP> NO <SEP> 2 <SEP> Allèle1/Allèle:
<tb> 1 <SEP> 397 <SEP> 97 <SEP> 98 <SEP> G/A
<tb> 2 <SEP> 1324 <SEP> 99 <SEP> 100 <SEP> T/A
<tb> 3 <SEP> 3028 <SEP> 101 <SEP> 102 <SEP> C/T
<tb> 4 <SEP> 3234 <SEP> 103 <SEP> 104 <SEP> C/A
<tb> 5 <SEP> 3390 <SEP> 105 <SEP> 106 <SEP> A/G
<tb> 6 <SEP> 6854 <SEP> 107 <SEP> 108 <SEP> G/A
<tb>

La détection de ces polymorphismes au sein d'un échantillon d'ADN provenant d'un sujet peut par exemple être réalisée par une amplification spécifique de la région nucléotidique d'ABC1 contenant la base polymorphe, puis séquençage du fragment amplifié afin de déterminer la nature de l'allèle ou des allèles portés par ledit sujet.

La détection de ces polymorphismes au sein d'un échantillon d'ADN provenant d'un sujet peut aussi être réalisé à l'aide de sondes ou d'amorces nucléotidiques hybridant spécifiquement avec un allèle déterminé contenant

l'une des bases polymorphes d'un polymorphisme du gène ABC1 selon l'invention.

A titre illustratif, des amorces nucléotidiques appropriées sont par exemple des amorces dont la base à l'extrémité 3' hybride avec la base localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe du fragment comprenant ledit polymorphisme. Après l'étape d'hybridation de l'amorce spécifique, une étape d'élongation avec un mélange des deux didéoxynucléotides complémentaires de la base polymorphe dudit polymorphisme, par exemple marqués différentiellement par fluorescence, puis une étape détection du signal de fluorescence obtenu permet de déterminer lequel des deux didéoxynucléotides fluorescents différemment marqués a été incorporé et de déduire directement la nature de la base polymorphe présente au niveau de ce polymorphisme.

Différentes approches peuvent être utilisées pour le marquage et la détection des didéoxynucléotides. Une méthode en phase homogène basée sur le FRET ("Fluorescence résonance energy transfer") a été décrite par Chen et Kwok (1997). Selon cette méthode, des fragments amplifiés d'ADN génomique contenant des polymorphismes sont incubés avec une amorce marquée à la fluorescéine à l'extrémité 5', en présence de didéoxynucléotides triphosphate marqués et une polymérase Taq modifiée.

L'amorce marquée est allongée d'une base par incorporation du didéoxynucléotide marqué spécifique de l'allèle présent sur la séquence d'ADN génomique complémentaire. A la fin de cette réaction de génotypage, les intensités de fluorescence pour les deux composés marqueurs des didéoxynucléotides marqués sont analysées directement sans séparation ni purification. L'ensemble de ces étapes peut être réalisé dans le même tube et les modifications du signal de fluorescence suivies en temps réel. Selon un autre mode de réalisation, l'amorce allongée peut être analysée par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. La base localisée au niveau du site polymorphique est identifiée par mesure de la masse ajoutée à l'amorce de microséquençage (Haff et Smirnov, 1997).

De telles amorces nucléotidiques peuvent par exemple être immobilisées sur un support. De plus, il est possible d'immobiliser sur un support, par exemple de manière ordonnée, de multiples amorces

spécifiques telles que décrites ci-dessus, chacune des amorces étant adaptée à la détection de l'un des polymorphismes du gène ABC1 selon l'invention.

Les polymorphismes du gène ABC1 selon l'invention sont utiles notamment comme marqueurs génétiques dans des études d'association entre la présence d'un allèle donné chez un sujet et la prédisposition de ce sujet à une pathologie donnée, particulièrement à l'une des pathologies déjà associées à la région chromosomique 9q31 préférentiellement à une pathologie liée à un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

Les méthodes pour l'analyse génétique de caractères (phénotypes) complexes sont de différents types (Lander and Schork, 1994). En général, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utiles dans l'un quelconque des procédés décrits dans l'état de la technique destiné à démontrer une corrélation statistiquement significative entre un génotype et un phénotype. Les polymorphismes bialléliques peuvent être utilisés dans des analyses de liaison ("linkage analysis") et dans des procédés de partage d'allèles ("allele sharing"). De préférence, les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utilisés pour identifier des gènes associés à des caractères (phénotypes) détectables en utilisation des études d'association, une approche qui ne nécessite pas le recours à des familles affectées par le caractère, et qui permet en outre l'identification de gènes associés à des caractères complexes et sporadiques.

D'autres méthodes statistiques mettant en #uvre des polymorphismes bialléliques selon l'invention sont par exemple celles décrites par Forsell et al. (1997), Xiong et al. (1999), Horvath et al. (1998),
Sham et al. (1995) ou encore Nickerson et al. (1992).

Selon un autre aspect, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques du gène ABC1 comprenant au moins un polymorphisme biallélique tel que décrit ci-dessus.

Ainsi, l'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 97-108 et comprenant la base polymorphe, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

SONDES ET AMORCES NUCLEOTIDIQUES
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1-14,15-47, 48-89,90, 92,94-96 et 97-108 sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène ABC1 ou encore d'un fragment ou d'un variant (contenant une mutation ou un polymorphisme) de cette dernière dans un échantillon.

Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 8 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 1-14, 15-47, 48-89, 90, 92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25,35, 40, 50, 70, 80,100, 200,500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO 1-14,15-47, 48-89, 90,92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12,
15,18, 20,25, 35,40, 50,100, 200,500, 1000,1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1-14, 15-47, 48-89, 90,92, 93-96 et 97-108, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID NO 1-14,15-47, 48-89,90,
92, 93-96 et 97-108 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.

Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABC1 sont représentés dans le
Tableau V ci-dessous.

Tableau V

Amorces pour l'amplification de fragments nucléiques du gène ABC1

<tb>
<tb> Amorce <SEP> N <SEP> Localisée <SEP> Position <SEP> dans <SEP> la <SEP> Séquence <SEP> Région
<tb> dans <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> séquence <SEP> de <SEP> d'hybridation
<tb> l'amorce
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> 313-335 <SEP> 109 <SEP> I <SEP> ntron <SEP> 11 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> Comp <SEP> 640-663 <SEP> 110 <SEP> Intron <SEP> 12
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> 1005-1029 <SEP> 111 <SEP> Intron <SEP> 12
<tb> 4 <SEP> 2 <SEP> Comp <SEP> 1472- <SEP> 112 <SEP> Intron <SEP> 13 <SEP>
<tb> 1496
<tb> 5 <SEP> 2 <SEP> 2930-2954 <SEP> 113 <SEP> Intron <SEP> 13
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> Comp <SEP> 3444- <SEP> 114 <SEP> Intron <SEP> 14 <SEP>
<tb> 3468
<tb> 7 <SEP> 2 <SEP> 4988-5012 <SEP> 115 <SEP> Intron <SEP> 14
<tb> 8 <SEP> 2 <SEP> Comp <SEP> 5338- <SEP> 116 <SEP> Intron <SEP> 15
<tb> 5362
<tb> 9 <SEP> 2 <SEP> 6240-6262 <SEP> 117 <SEP> Intron <SEP> 15
<tb> 10 <SEP> 2 <SEP> Comp <SEP> 6581- <SEP> 118 <SEP> Intron <SEP> 16 <SEP>
<tb> 6603
<tb> 11 <SEP> 5 <SEP> 1369-1391 <SEP> 119 <SEP> Intron <SEP> 21 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 5 <SEP> Comp <SEP> 1748- <SEP> 120 <SEP> Intron <SEP> 22 <SEP>
<tb> 1770
<tb> 13 <SEP> 5 <SEP> 3868-3890 <SEP> 121 <SEP> Intron <SEP> 23 <SEP>
<tb> 14 <SEP> 5 <SEP> Comp <SEP> 4240- <SEP> 122 <SEP> Intron <SEP> 24 <SEP>
<tb> 4262
<tb> 15 <SEP> 6 <SEP> 3587-3610 <SEP> 123 <SEP> Intron <SEP> 28
<tb> 16 <SEP> 6 <SEP> Comp <SEP> 3881- <SEP> 124 <SEP> Intron <SEP> 29 <SEP>
<tb> 3903
<tb> 17 <SEP> 6 <SEP> 6753-6775 <SEP> 125 <SEP> Intron <SEP> 29
<tb> 18 <SEP> 6 <SEP> Comp <SEP> 7112- <SEP> 126 <SEP> Intron <SEP> 30 <SEP>
<tb> 7134
<tb> 19 <SEP> 7 <SEP> 1060-1082 <SEP> 127 <SEP> Intron <SEP> 30
<tb> 20 <SEP> 7 <SEP> Comp <SEP> 1377-<SEP> 128 <SEP> Intron <SEP> 31
<tb> 1399
<tb>

<tb>
<tb> 21 <SEP> 7 <SEP> 3574-3596 <SEP> 129 <SEP> Intron <SEP> 32
<tb> 22 <SEP> 7 <SEP> Comp <SEP> 3909- <SEP> 130 <SEP> Intron <SEP> 33 <SEP>
<tb> 3931
<tb> 23 <SEP> 7 <SEP> 5161-5183 <SEP> 131 <SEP> Intron <SEP> 33
<tb> 24 <SEP> 7 <SEP> Comp <SEP> 5463- <SEP> 132 <SEP> Intron <SEP> 34 <SEP>
<tb> 5485
<tb> 25 <SEP> 8 <SEP> 100-122 <SEP> 133 <SEP> Intron <SEP> 34
<tb> 26 <SEP> 8 <SEP> Comp <SEP> 475-497 <SEP> 134 <SEP> Intron <SEP> 35
<tb> 27 <SEP> 9 <SEP> 841-861 <SEP> 135 <SEP> I <SEP> ntron <SEP> 35
<tb> 28 <SEP> 9 <SEP> Comp <SEP> 1249- <SEP> 136 <SEP> Intron <SEP> 36 <SEP>
<tb> 1271
<tb> 29 <SEP> 10 <SEP> 455-477 <SEP> 137 <SEP> Intron <SEP> 36
<tb> 30 <SEP> 10 <SEP> Comp <SEP> 966-988 <SEP> 138 <SEP> Intron <SEP> 38
<tb>

Selon un premier mode de réalisation de sondes et d'amorces préférées selon l'invention, celles-ci comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 109- 138, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.

Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N EP 0 707 592.

Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.

Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.

Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.

Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez-pescador et al. (1988).

De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (1991) ou encore dans le brevet européen n EP-0 225 807 (CHIRON).

Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.

Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.

Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.

En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ciavant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.

Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.

Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.

Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1-14,15-47, 48-89,90, 92,93-96 et 97-108 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.

Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N 5,143,854, dans les demandes PCT N WO 90/150 70 et 92/10092.

Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N 5,412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.

Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ
ID NO 1-14,15-47, 48-89,90, 92,93-96 et 97-108, ou encore un variant de celui-ci.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-14,15-47, 48-89,90, 92,93-96 et 97- 108 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.

Pour mettre en #uvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.

L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1-14,15-47, 48-89,90, 92, 93-96 et 97-108 ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.

Selon un premier mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 109 et 110, permettant d'amplifier la région de l'exon 12 du gène ABC1 portant la première mutation (délétion/insertion) décrite ci-dessus, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.

Selon un second mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 111 et 112, permettant d'amplifier la région de l'exon 13 du gène ABC1 portant la seconde mutation (délétion d'une base G) décrite ci-dessus, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.

Selon un troisième mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent, de manière générale, tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 109- 138, ou des acides nucléiques de séquence complémentaire.

Selon un quatrième mode de réalisation préféré, l'invention a également trait à des amorces nucléotidiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 97-108 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire du nucléotide localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.

Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi des amorces nucléotidiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 97-108 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2,3, 4,5, 6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14, 15,16, 17,18, 19,20 nucléotides ou plus du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires. Pour construire des amorces dont le nucléotide à l'extrémité 3' est complémentaire d'un nucléotide localisé à plus de 20 nucléotides du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108, l'homme du métier se référera avantageusement à la séquence génomique correspondante parmi les séquences SEQ ID NO 1-14 ou encore SEQ ID NO 15-47 et 48-90, comprenant le polymorphisme dont la nature de l'allèle est recherchée.

De telles amorces sont particulièrement utiles dans le cadre de procédés de génotypage de sujets et/ou de génotypage de populations, notamment dans le cadre d'études d'association entre des formes allèles

particulières ou des formes de groupes d'allèles particulières (haplotypes) chez des sujets et l'existence d'un phénotype (caractère) particulier chez ces sujets, par exemple la prédisposition de ces sujets à développer des maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol, ou encore la prédisposition de ces sujets à développer une pathologie dont la région chromosomique candidate se situe sur le chromosome 9, plus précisément sur le bras 9q et plus précisément encore dans le locus 9q31.

VECTEURS RECOMBINANTS
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.

Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 92 ou un fragment biologiquement actif de ce dernier ; b) un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 91, 94 ou 96; c) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15-47 et 48-90 d) un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N015-47 et 48-90 ou un fragment ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 15-47 et 48-90, ou un fragment ou un variant de ce dernier.

Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.

Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.

Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention,

des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.

Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices (" enhancers ") ; (2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée, des marqueurs ou des marqueurs de sélection.

A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.

Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.

De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al.

(1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996).

Lorsque l'expression de la séquence génomique du gène ABC1 sera désirée, on aura préférentiellement recours à des vecteurs capables d'inclure de grandes séquences d'insertion. Dans ce mode de réalisation particulier, on utilisera de préférence des vecteurs de bactériophages, tels que les vecteurs de bactériophage P1 comme le vecteur p158 ou encore le vecteur p158/neo8 décrits par Sternberg (1992,1994).

Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-
3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl,
ETATS-UNIS).

On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).

Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.

Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.

Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), ou encore McLaughlin BA et al. (1996).

Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces derniers doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. On peut aussi réaliser l'introduction des polynucléotides selon l'invention in vivo ou ex vivo, pour la prévention ou le traitement de maladies liées à un déficit dans le transport inverse du cholestérol.

Pour introduire les polynucléotides ou les vecteurs dans une cellule hôte, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à différentes techniques, comme la technique de précipitation au phosphate de calcium (Graham et al., 1973 ; Chen et al., 1987), le DEAE Dextran (Gopal, 1985), l'électroporation (Tur-Kaspa, 1896 ; Potter et al., 1984), la microinjection directe (Harland et al., 1985), Les liposomes chargés en ADN (Nicolau et al.,
1982, Fraley et al., 1979).

Une fois que le polynucléotide a été introduit dans la cellule hôte, il peut être intégré de manière stable dans le génome de la cellule.
L'intégration , peut être réalisée à un endroit précis du génome, par recombinaison homologue, ou peut être intégré au hasard. Dans certains modes de réalisation, le polynucléotide peut être maintenu de manière stable

dans la cellule hôte sous la forme d'un fragment d'épisome, l'épisome comprenant des séquences permettant le maintien et la réplication de ce dernier, soit de manière indépendante, soit de manière synchronisée avec le cycle cellulaire.

Selon un mode de réalisation particulier, une méthode pour introduire un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte, en particulier une cellule hôte provenant d'un mammifère, in vivo, comprend une étape au cours de laquelle on introduit une préparation comprenant un vecteur pharmaceutiquement compatible et un polynucléotide " nu " selon l'invention, placé sous le contrôle de séquences de régulation appropriées, par injection locale au niveau du tissus choisi, par exemple un tissu musculaire lisse, le polynucléotide " nu " étant absorbé par les cellules de ce tissu.

Des compositions pour l'utilisation in vitro et in vivo comprenant des polynucléotides " nus " sont par exemples décrites dans la demande PCT N WO 95/11307 (Institut Pasteur, Inserm, Université d'Ottawa) ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) et de Huygen et al. (1996) .

Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, il est fourni une composition pour la production in vivo de la protéine ABC1. Cette composition comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide ABC1 placé sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, en solution dans un vecteur physiologiquement acceptable.

La quantité de vecteur qui est injecté à l'organisme hôte choisi varie selon le site de l'injection. A titre indicatif, il peut être injecté entre environ 0,1 et environ 100 g du polynucléotide codant la protéine ABC1 ans le corps d'un animal, de préférence d'un patient susceptible de développer une maladie liée à un déficit dans le transport inverse du cholestérol ou ayant déjà développé cette maladie, en particulier un patient ayant une prédisposition pour la maladie de Tangier ou ayant déjà développé la maladie.

En conséquence, l'invention concerne également une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un acide nucléique codant pour la protéine ABC1, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

Avantageusement, une telle composition comprendra le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 91 , placé sous le contrôle des éléments de régulation appropriés.

L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un vecteur recombinant selon l'invention, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.

L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique selon l'invention, codant pour la protéine ABC1, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, comprenant un acide nucléique codant pour la protéine ABC1, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

Vecteurs utiles dans des procédés de thérapie génique somatique et compositions contenant de tels vecteurs
La présente invention concerne aussi une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol. Elle propose une solution avantageuse aux inconvénients de l'art antérieur, en démontrant la possibilité de traiter les pathologies liées au transport du cholestérol par la thérapie génique, par le transfert et l'expression in vivo d'un gène codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. L'invention offre ainsi un moyen simple permettant un traitement spécifique et efficace des pathologies associées comme par exemple l'Athérosclérose.

La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information

génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.BioI.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.

La présente invention est donc également relative à une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des pathologies liées au transport du cholestérol, consistant à transférer et à exprimer in vivo des gènes codant pour ABC1. De manière particulièrement avantageuse, la demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de construire des virus recombinants contenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol, d'administrer ces virus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active in vivo, et sans effet cytopathologique.

La présente invention résulte également de la mise en évidence que les adénovirus constituent des vecteurs particulièrement efficaces pour le transfert et l'expression du gène ABC1. En particulier, la présente invention montre que l'utilisation d'adénovirus recombinants comme vecteurs permet d'obtenir des niveaux d'expression suffisamment élevés de ce gène pour produire l'effet thérapeutique recherché. D'autres vecteurs viraux tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV) permettant une expression stable du gène sont aussi revendiqués.

La présente invention offre ainsi une nouvelle approche pour le traitement et la prévention des pathologies cardiovasculaires et neurologiques liées aux anomalies du transport du cholestérol.

L'invention a donc aussi pour objet un virus recombinant défectif comprenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le métabolisme du cholestérol.

L'invention a également trait à l'utilisation d'un tel virus recombinant défectif pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies cardiovasculaires.

La présente invention concerne également l'utilisation de cellules modifiées génétiquement ex vivo par un virus tel que décrit ci-dessus, ou de cellules productrices de tels virus, implantées dans l'organisme, permettant une expression in vivo prolongée et efficace d'une protéine ABC1 biologiquement active.

La présente invention montre qu'il est possible d'incorporer une séquence d'ADN codant pour ABC1 dans un vecteur viral, et que ces vecteurs permettent d'exprimer efficacement une forme mature, biologiquement active. Plus particulièrement, l'invention montre que l'expression in vivo de ABC1 peut être obtenue par administration directe d'un adénovirus ou par implantation d'une cellule productrice ou génétiquement modifiée par un adénovirus ou par un rétrovirus incorporant un tel ADN.

La présente invention est particulièrement avantageuse car elle permet d'induire une expression contrôlée et sans effet nocif de ABC1 dans des organes qui ne sont pas normalement concernés par l'expression de cette protéine. En particulier, une libération significative de la protéine ABC1 est obtenue par implantation de cellules productrices de vecteurs de l'invention, ou infectées ex vivo par des vecteurs de l'invention.

L'activité de transporteur du cholestérol produit dans le cadre de la présente invention peut être du type ABC1 humaine ou animale. La séquence nucléique utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), un ARN (dans le cas des rétrovirus) ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg permet une meilleure expression dans les cellules humaines. Pour

permettre leur incorporation dans un vecteur viral selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mutagénèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes. Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 humaine. Par ailleurs, il est également possible d'utiliser une construction codant pour un dérivé de ces protéines ABC1. Un dérivé de ces protéines ABC1 comprend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'activité transporteur de cholestérol. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément déterminée, comme indiqué notamment dans les exemples la mesure de l'efflux de cholestérol à partir des cellules. Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.

Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques. Les dérivés incluent également les séquences d'ADN modifiées permettant une expression améliorée in vivo.

Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un virus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour une protéine ABC1 impliquée dans le transport et le métabolisme du cholestérol. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence d'ADN est une séquence d'ADNg.

Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus, des virus adéno-associés (AAV), des virus de l'herpès

(HSV) ou des rétrovirus. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus, pour une administration directe ou pour la modification ex vivo de cellules destinées à être implantées, ou un rétrovirus, pour l'implantation de cellules productrices.

Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence nucléique codant pour la protéine ABC1 Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.

S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.

Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte. Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et la séquence codant pour la protéine ABC1. Avantageusement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est rendue non fonctionnelle. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-
L5 sont non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou

plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode préféré de mise en #uvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4 et la séquence codant pour ABC1 est insérée au niveau de la région E1 inactivée. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérés la région E4 et la séquence codant pour ABC1 (Demande de brevet Français FR94 13355).

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour la protéine ABC1. La recombinaison homologue se produit après cotransfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n WO 94/26914 et W095/02697.

* Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables

d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.

L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Toutefois, aucun de ces documents ne décrit ni ne suggère l'utilisation d'un AAV recombinant pour le transfert et l'expression in vivo ou ex vivo d'une protéine ABC1, ni les avantages d'un tel transfert. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203 ; 453242,
EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235 ; McCormick,
BioTechnology 3 (1985) 689, etc.

En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant les cellules en division. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol

et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus" ; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.

Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABC1 selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (W089/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.

Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif.

Les résultats donnés ci-après démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de transport de cholestérol. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.

Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en #uvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant la séquence codant pour la protéine ABC1, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABC1 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotente, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises ne culture peuvent être alors transfectées par le vecteur rétroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABC1 sous le contrôle de promoteurs viraux, non viraux, non viraux et spécifiques des macrophages ou encore sous le contrôle de son propre promoteur. Ces cellules sont alors re-introduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules sanguines exprimant la protéine ABC1, notamment à l'origine des monocytes qui, transformés en macrophages, participent à l'élimination du cholestérol de la paroi artériel. Ces macrophages exprimant la protéine ABC1 auront une capacité accrue à métaboliser le cholestérol en excès et le mettront à disposition à la surface cellulaire pour son élimination par les accepteurs primaires du cholestérol membranaire.

Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABC1 est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir de signaux d'expression homologues ou hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression de la protéine ABC1. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences de gènes eucaryotes ou viraux ou de séquences dérivées, stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non et de façon inductible ou non. A titre d'exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter, ou du génome d'un virus, et notamment, les promoteurs des gènes E1A, MLP d'adénovirus, le promoteur CMV, LTR-RSV, etc. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut citer également les promoteurs ubiquitaires (HPRT, vimentine, a-actine, tubuline, etc), les promoteurs des filaments

Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfulml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souche totipotente ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.

Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP
400047, EP 456640).

Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABC1

biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro. Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.

Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères infectées par un ou plusieurs virus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus ou des cellules productrices de virus recombinants, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.

Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.

Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférentiellement, on utilise du collagène de type I.

Comme indiqué ci avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des

cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou biocompatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou un support d'origine biologique.

La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des pathologies liées au transport du cholestérol, en particulier l'obésité, l'hypertriglycéridémie, ou, dans le domaine des affections cardiovasculaires, l'infarctus du myocarde, l'angor, la mort subite, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires.

En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.

CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant l'un quelconque des acides nucléiques de l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID NO 91, 94 ou 96
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que ci-dessus décrit.

Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont par exemple les suivantes : a) cellules hôtes procaryotes : souchesd'Escherichia coli (souche
DH5-a), de Bacillus subtilis, de Salmonella typhimurium, ou encore des souches d'espèces telles que Pseudomonas, Streptomyces et
Staphylococus ; b) cellules hôtes eucaryotes: cellules HeLa (ATCC N CCL2), cellules
Cv 1 (ATCC N CCL70), cellules COS (ATCC N CRL 1650), cellules Sf-9

(ATCC N CRL 1711), cellules CHO (ATCC N CCL-61) ou encore cellules 3T3(ATCCN CRL-6361).

POLYPEPTIDES ABC1 MUTES
Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide codé par un gène ABC1 muté, et plus particulièrement un gène ABC1 muté chez des patients atteints d'un déficit dans le transport inverse du cholestérol, tout particulièrement chez des patients atteints de la maladie de Tangier.

Comme déjà indiqué précédemment, deux mutations délétères ont été identifiées chez des patients atteints de la maladie de Tangier.

La première mutation correspond à l'insertion d'un fragment -d'une centaine de paires de bases au sein de la séquence codante, au niveau de l'exon 12 du gène ABC1, conduisant à la production d'un polypeptide biologiquement inactif de 2233 acides aminés de séquence SEQ ID NO 140. Le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140 possède, par rapport au polypeptide normal de séquence SEQ iD NO 139, les différences suivantes : a) une délétion d'un fragment peptidique de séquence " DERKFW " et le remplacement de ce fragment peptidique par la séquence " EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG "codée par le fragment nucléotidique de type Alu inséré.

La seconde mutation concerne l'introduction d'un codon stop précoce dans le premier quart de la séquence codante, au niveau de l'exon 13 du gène ABC1, conduisant à la production d'un polypeptide tronqué ayant 574 acides aminés de séquence SEQ ID NO 141. En outre, la délétion de la base G induit un changement du cadre de lecture conduisant à une protéine dont l'extrémité COOH-terminale ne se retrouve pas dans la séquence d'acides aminés du polypeptide ABC1 normal. Il s'agit de la séquence
COOH-terminale " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG du polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141.

Ces deux polypeptides sont utiles notamment pour la préparation d'anticorps les reconnaissant spécifiquement. De tels anticorps constituent des moyens de détection de la production de ces polypeptides ABC1 mutés dans un échantillon provenant d'un sujet à tester, préférentiellement d'un patient présentant des symptômes caractéristiques d'un déficit dans le

transport inverse du cholestérol, et de manière tout à fait préférée chez un patient présentant les symptômes caractéristiques de la maladie de Tangier.

Selon un autre aspect, l'invention concerne donc un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés SEQ ID NO 140.

Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés SEQ ID NO 141.

L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141, ou un fragment peptrdique de ce dernier.

Un premier fragment peptidique préféré comprendra au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140.

Un second fragment peptidique préféré comprendra au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141.

Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec une séquence en acides aminés choisie dans le groupe constitué des peptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141, ou un fragment peptidique de ce dernier.

De préférence, des polypeptides selon l'invention auront une longueur de 15,18 ou 20 à 25,35, 40,50, 70,80, 100 ou 200 acides aminés consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un polypeptide de séquence en acides aminés choisie parmi les séquences
SEQ ID N 140 et 141.

Alternativement, un polypeptide selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 15,18, 20,25, 35,40, 50,100 ou 200 acides aminés consécutifs d'un polypeptide selon l'invention, plus

particulièrement d'un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO 140 et 141.

De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.

L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides de séquences SEQ ID NO 140 et 141, ou d'un fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.

Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.

Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1989).

Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.

A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par Houben Weyl (1974)

ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield (1965a; 1965b).

Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO 140 et 141, ou de leurs fragments ou variants.

De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.

On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un-acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par Koch (1977).

Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.

Font également partis de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2).

De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés.

ANTICORPS
Les polypeptides ABC1 mutés selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID NO 140-141] ou les fragments de ces derniers ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps, notamment en vue de détecter la production de formes altérés du polypeptide ABC1 chez un patient.

Un premier anticorps préféré selon l'invention est dirigé contre un fragment peptidique comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence

" EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG " comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 140.

Un second anticorps préféré selon l'invention est dirigé contre un fragment peptidique comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs du fragment peptidique de séquence " RAPRRKLVSICNRCPIPVTLMTSFCG comprise dans le polypeptide ABC1 muté de séquence SEQ ID NO 141.

Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention .

Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975).

La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).

L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N 4,946,778 ou encore par Martineau et al. (1998).

Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages Ridder et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés Reinmann et al. (1997) ; Leger et al., (1997).

Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité d'antigènes présents dans un échantillon.

Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Ainsi, la mention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.

L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic ou pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés.

COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ET METHODES DE TRAITEMENT THERAPEUTIQUES
L'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme du cholestérol telle que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'un polynucléotide capable de donner lieu à la production d'une quantité efficace du polypeptide ABC1 normal, en particulier du polypeptide de séquence SEQ iD NO 139.

L'invention a en outre pour objet des compositions pharmaceutiques destinées à la prévention ou au traitement d'un déficit dans le métabolisme du cholestérol telle que l'athérosclérose, particulièrement dans le transport du cholestérol, et plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide ABC1 normal, en particulier du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139.

De telles compositions pharmaceutiques seront avantageusement adaptées pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une quantité du polypeptide ABC1 allant de 1 ug/kg/jour à 10 mg/kg/jour, de

préférence au moins 0,01 mg/kg/jour et de manière tout à fait préférée entre 0,01 et 1 mg/kg/jour.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être indifféremment administrées par voie orale, rectale, parentérale, intraveineuse, sous-cutanée ou encore intra-dermique.

L'invention concerne aussi l'utilisation du polypeptide ABC1 de séquence SEQ ID NO 139 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

L'invention est enfin relative à une composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139
Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies provoquées par une déficience dans le métabolisme du cholestérol, plus particulièrement dans le transport du cholestérol et encore plus particulièrement dans le transport inverse du cholestérol, une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administrée à un patient un polynucléotide capable de donner lieu à l'expression du polypeptide ABC1 chez ledit patient, ledit polynucléotide étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et/ou excipients physiologiquement compatibles.

De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un polynucléotide, telle que définie ci-dessus.

Selon encore un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement thérapeutique préventive ou curative de maladies provoquées par une déficience dans le métabolisme du cholestérol, plus particulièrement dans le transport du cholestérol et encore plus particulièrement dans le transport inverse du cholestérol, une telle méthode comprenant une étape au cours de laquelle est administrée à un patient une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide ABC1 chez ledit patient,

ledit polypeptide étant, le cas échéant, associé à un ou plusieurs véhicules et/ou excipients physiologiquement compatibles.

De préférence, on administrera au patient une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide, telle que définie ci-dessus.

METHODES DE CRIBLAGE D'UN COMPOSE AGONISTE OU ANTAGONISTE DU POLYPEPTIDE ABC1.

Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi divers procédés de criblage de composés à visée thérapeutique utiles dans le traitement de maladies dues à un déficit dans le métabolisme du cholestérol, particulièrement dans le transport du cholestérol, plus particulièrement encore dans le transport inverse du cholestérol, telles que la maladie de Tangier, ou plus généralement les affections de type FHD.

L'invention est donc également relative à l'utilisation du polypeptide ABC1, ou de cellules exprimant le polypeptide ABC1, pour cribler des principes actifs pour la prévention ou le traitement de maladies résultant d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

Les sites catalytiques et fragments oligopeptidiques ou immunogéniques du polypeptide ABC1 peuvent servir pour cribler des banques de produits par tout une foule de techniques existantes. Le fragment utilisé dans ce type de criblage peut être libre en solution, fixé sur un support solide, à la surface cellulaire ouencore dans la cellule. La formation des complexes de liaisons entre les fragments d'ABC1 et l'agent testé peut alors être mesuré.

Une autre technique de criblage de produit qui peut être utilisée dans les criblages à haut flux donnant accès à des produits ayant de l'affinité pour la protéine d'intérêt est décrite dans l'application W084/03564. Dans cette méthode, appliquée à la protéine ABC1, différents produits sont synthétisés sur une surface solide. Ces produits réagissent avec la protéine ABC1 ou des fragments de celle-ci et le complexe est lavé. Les produits liant la protéine ABC1 sont ensuite détectés par des méthodologies connues de l'homme de l'art. Des anticorps non neutralisants peuvent aussi être utilisés pour capturer un peptide et l'immobiliser sur un support.

Une autre possibilité est d'utiliser un criblage de produit utilisant la compétition d'anticorps neutralisants ABC1, la protéine ABC1 et un produit potentiellement liant la protéine ABC1. De cette manière, les anticorps peuvent être utilisés pour détecter la présence de peptide ayant des motifs antigéniques commun avec ABC1.

Dans les produits à évaluer et permettant d'augmenter l'activité d'ABC1, on mentionnera notamment les homologues d'ATP spécifiques des kinases impliquées dans l'activation de la molécules ainsi que des phosphatases qui pourront éviter la déphosphorylation issue de ces dites kinases. On nommera notamment les inhibiteurs de du type phosphodiestérase (PDE) théophylline et 3-isobutyl-1-methylxanthine ou les activateurs d'adénylcyclase forskoline.

Aussi, nous revendiquons dans cette invention l'utilisation de tout procédé de criblage de produits basé sur la méthode de translocation du cholestérol (voir l'exemple 17) entre les membranes ou vésicules, et ceci dans tous les types synthétiques ou cellulaires, c'est à dire de mammifères, d'insectes, de bactéries ou de levures exprimant de manière constitutive ou bien ayant incorporés la séquence d'ABC1 humaine. A cet effet, des analogues lipidiques marqués peuvent être utilisés.

De même, il a été décrit que la protéine ABC1 permettait le transport d'anion (Becq et al. Journal of Biological Chemistry vol 272, n 5 pages 2695-2699,
1997 et Yamon et al. Blood vol 90, n 8 pages 2911-2915,1997) et ce transport était activé par des inhibiteurs de phosphatase comme l'acide okadaique et l'orthovanadate ainsi que part l'élévation de l'AMPc par des agents comme la forskoline. Nous revendiquons l'utilisation de ce système pour cribler des molécules modulant l'activité de la protéine ABC1 (voir
Exemple 18).

Yamon et al (Blood vol 90, n 8 pages 2911-2915,1997) ont démontré que la protéine ABC1 de souris était impliquée dans la sécrétion d'une cytokine pro- inflammatoire IL-1beta dans des macrophages péritoneaux de souris. On peux donc aussi proposer une méthode de criblage de produits modulant

l'activité de la protéine ABC1 par détermination du relargague de l'IL-1beta à partir de tout type cellulaire exprimant deux protéines (voir Exemple 19).

De plus, sachant que la disruption de nombreux transporteurs ont été décrits (van, den Hazel. H., H. Pichler, V. M. M. do, E. Leitner, A. Goffeau, and G. Daum. 1999. PDR16 and PDR17, two homologous genes of Saccharomyces cerevisiae, affect lipid biosynthesis and resistance to multiple drugs. J Biol Chem. 274 (4): 1934-41), on peux penser utiliser des mutants cellulaires ayant un phénotype caractéristique et complémenter la fonction de ceux-ci par ABC1 et utiliser l'ensemble à des fin de criblage.

L'invention est également relative à un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) préparer des vésicules membranaires contenant le polypeptide ABC1 et un substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; b) incuber les vésicules obtenues à l'étape a) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) mesurer qualitativement et/ou quantitativement la libération du substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; d) comparer la mesure obtenue à l'étape b) avec une mesure de la libération du substrat lipidique marqué par les vésicules n'ayant pas préalablement été incubées avec le composé candidat agoniste ou antagoniste.

Selon un premier aspect du procédé de criblage ci-dessus, les vésicules membranaires sont des vésicules lipidiques synthétiques, qui peuvent être préparées selon des techniques bien connues de l'homme du métier. Selon cet aspect particulier, la protéine ABC1 peut être une protéine ABC1 recombinante.

Selon un second aspect, les vésicules membranaires sont des vésicules de membranes plasmiques dérivées de cellules exprimant le polypeptide ABC1.

Il peut s'agir de cellules exprimant naturellement le polypeptide ABC1 ou encore de cellules transfectées avec un vecteur recombinant codant pour le polypeptide ABC1.

Selon un troisième aspect du procédé de criblage ci-dessus, le substrat lipididique est choisi parmi le cholestérol ou la phosphatidyl choline.

Selon un quatrième aspect, le substrat lipidique est marqué radioactivement, par exemple par un isotope choisi parmi le 3H OU 1251.

Selon un cinquième aspect, le substrat lipidique est marqué par un composé fluorescent, tel que le NBD ou le pyrène.

Selon un sixième aspect, les vésicules membranaires comprenant le substrat lipidique marqué et le polypeptide ABC1 sont immobilisées à la surface d'un support solide préalablement à l'étape b).

Selon un septième aspect, la mesure de la fluorescence ou de la radioactivité libérée par les vésicules est le reflet direct de l'activité de transport du substrat lipidique par le polypeptide ABC1.

L'invention est encore relative à un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir des cellules, par exemple une lignée cellulaire, exprimant naturellement ou après transfection le polypeptide ABC1 ; b) incuber les cellules de l'étape a) en présence d'anion marqué par un marqueur détectable ; c) laver les cellules de l'étape b) afin d'éliminer l'excès de l'anion marqué n'ayant pas pénétré dans ces cellules ; d) incuber les cellules obtenues à l'étape c) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 ; e) mesurer l'efflux de marqué ; f) comparer la valeur de l'efflux de l'anion marqué déterminé à l'étape e) avec la valeur de l'efflux de , @ marqué mesuré avec des cellules n'ayant pas préalablement été incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1.

Selon un premier aspect du procédé de criblage ci-dessus, les cellules mises en #uvre sont des cellules exprimant naturellement le polypeptide ABC1. Il peut s'agir de monocytes humains en culture primaire, purifiés à partir d'une population de cellules mononucléées du sang humain. Il peut s'agir aussi de lignées de cellules monocytaires humaines, telles que le lignée leucémique monocytaire THP1.

Selon un second aspect, les cellules mises en #uvre dans le procédé de criblage décrit ci-dessus peuvent être des cellules n'exprimant pas naturellement, ou alternativement exprimant à un faible niveau, le polypeptide ABC1, lesdites cellules étant transfectées avec un vecteur recombinant selon l'invention capable de diriger l'expression du polypeptide ABC1 Selon un troisième aspect, les cellules peuvent être des cellules ayant un déficit naturel dans le transport anionique, ou encore des cellules pré-traitées avec un ou plusieurs inhibiteurs des canaux anioniques, tels que le VerapamilTM ou le tetra éthylammonium.

Selon un quatrième aspect dudit procédé de criblage, l'anion est un iodure marqué radioactivement, tels que les sels K125I ou Na 1251.

Selon un cinquième aspect, la mesure de l'efflux de l'anion marqué est déterminé périodiquement au cours du temps pendant l'expérience, permettant ainsi d'établir aussi une mesure cinétique de cet efflux.

Selon un sixième aspect, la valeur de l'efflux de l'anion marqué est déterminée par la mesure de la quantité de l'anion marqué présent à un temps donné dans le surnageant de culture cellulaire.

Selon un septième aspect, la valeur de l'efflux de l'anion marqué est déterminée comme la proportion de radioactivité retrouvée dans le surnageant de culture cellulaire par rapport à la radioactivité totale correspondant à la somme de la radioactivité retrouvée dans les lysats

cellulaires et de la radioactivité retrouvée dans le surnageant de culture cellulaire.

L'invention a encore pour objet un procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) cultiver des cellules d'une lignée monocytaire humaine dans un milieu de culture approprié, en présence d'albumine humaine purifiée ; b) incuber les cellules de l'étape a) simultanément en présence d'un composé stimulant la production d'IL-1 beta et du composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape b) en présence d'une concentration appropriée d'ATP ; d) mesurer d'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture cellulaire. e) comparer la valeur de la libération de l'IL-1 beta obtenue à l'étape d) à la valeur de l'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture de cellules n'ayant pas été préalablement incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste.

Selon un premier aspect du procédé de criblage décrit ci-dessus, les cellules utilisées appartiennent à la lignée monocytaire leucémique humaine THP1.

Selon un second aspect du procédé criblage, le composé stimulant la production d'IL-1 beta est un lipopolysaccharide.

Selon un troisième aspect dudit procédé, on détermine également qualitativement et/ou quantitativement la production d'IL-1 alpha, de IL-6 et de TNF alpha par ces cellules.

Selon un quatrième aspect, le niveau d'expression de l'ARN messager codant pour l'IL-1 beta est également déterminé.

L'invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants :

La Figure 1 illustre la ségrégation de la mutation par insertion d'une séquence Alu dans l'exon 12 du gène ABC1. L'insertion-délétion dans l'exon 12 du gène ABC1 consiste en une délétion de 14 nucléotides et d'une insertion de 110 nucléotides comme représenté sur la figure 1A. La figure 1 B représente le pédigré Nu et la taille des fragments d'ADN obtenus pour chacun des patients après amplification par PCR de l'exon 12. La piste M correspond aux marqueurs de mobilité (Gibco BRL) . La piste C correspond à un ADN témoin.

La Figure 2 illustre la mutation par délétion d'un seul nucléotide dans l'exon 13 du gène ABC1. La séquence du brin complémentaire a été obtenue et est représentée de 3' vers 5'. La séquence codant pour les acides aminés 546 à 552 du polypeptide ABC1 est représentée pour différents patients de la famille étudiée, respectivement pour un individu homozygote (Figure 2-a), hétérozygote (Figure 2-b) et non affecté (Figure 2-c). La séquence de la Figure 2-a a été retrouvée chez trois individus homozygotes, la séquence de la Figure 2-b a été retrouvée chez cinq individus hétérozygotes et la séquence de la Figure 2-c a été retrouvée chez quatre individus non affectés.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : Distributiontissulaire des transcrits du gène ABC1 selon l'invention
Le profil d'expression des polynucleotides selon la présente invention est déterminé selon les protocoles d'analyse de Northern blot et de transcription inverse couplée à la PCR décrits notamment par Sambrook et al (ref. CSH
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). " Molecular Cloning : A
Laboratory Manual, " 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY.).

Par exemple, dans le cas d'une analyse par transcription inverse, un couple d'amorces synthétisées à partir de l'ADN complet du gène humain
ABC1 de séquence SEQ ID NO 91 est utilisé pour détecter l'ADNc correspondant.

La réaction de polymérase en chaîne (PCR) est réalisée sur des matrices d'ADNc correspondant à des ARNm polyA+ (Clontech) rétrotranscrits. La transcription inverse en ADNc est réalisée avec l'enzyme SUPERSCRIPT Il (GibcoBRL, Life Technologies) selon les conditions décrites par le fabricant.

La réaction de polymérase en chaîne est réalisée selon des conditions standard, dans 20 l de mélange réactionnel avec 25 ng de la préparation d'ADNc. Le mélange réactionnel est composé de 400 M de chacun des dNTP, de 2 unités de Thermus aquaticus (Taq) ADN polymérase (Ampli Taq Gold ; Perkin Elmer), de 0,5 M de chaque amorce, de 2,5 mM MgCI2, et de tampon PCR. Trente quatre cycles de PCR ( dénaturation 30 s à 94 C, hybridation de 30 s décomposé comme suit lors des 34 cycles : 64 C 2 cycles, 61 C 2 cycles, 58 C 2 cycles et 55 C 28 cycles et une élongation d'une minute par kilobase à 72 C) sont réalisés après une première étape de dénaturation à 94 C durant 10 min dans un thermocycler Perkin Elmer 9700. Les réactions de PCR sont visualisées sur gel d'agarose par électrophorèse. Les fragments d'ADNc obtenus peuvent être utilisés comme sondes pour une analyse par Northern blot et peuvent également être utilisés pour la détermination exacte de la séquence polynucléotidique.

Dans le cas d'une analyse par Northern Blot, une sonde d'ADNc produite comme décrit ci-dessus est marquée au 32P grâce au système de marquage d'ADN High Prime (Boehringer) selon les instructions indiquées par le fabricant. Après marquage, la sonde est purifiée sur une microcolonne de Sephadex G50 (Pharmacia) selon les instructions indiquées par le fabricant. La sonde marquée et purifiée est alors utilisée pour la détection de l'expression des ARNm dans différents tissus.

Le Northern blot contenant des échantillons d'ARN de différents tissus humains ((Multiple Tissue Northern , MTN, Clontech) Blot 2, référence 77759-1) est hybridé avec la sonde marquée.

. Le protocole suivi pour les hybridations et lavages peut être soit directement celui décrit par le fabricant (Manuel d'utilisation PT1200-1) soit une adaptation de ce protocole en utilisant les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1999). On

pourra ainsi faire varier par exemple les températures de préhybridation et d'hybridation en présence de formamide.

Par exemple on pourra utiliser le protocole suivant : 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION: - Mélanger : 40 l ADN sperme de saumon (10mg/ml) + 40 l ADN placentaire humain (10mg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96 C, puis plonger dans la glace le mélange.

- Ajouter le mélange des deux ADN dénaturés.

- Incubation à 42 C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.

2- Compétition de la sonde marquée: - Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 l ADN Cot I, selon la quantité de séquences répétées.

- Dénaturer 7 à 10 mn à 95 C.

- Incuber à 65 C pendant 2 à 5 heures.

3- HYBRIDATION : - Oter le mix de pré-hybridation.

- Incuber 15 à 20 heures à 42 C, avec rotation.

4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du SSC 2X, pour rincer.

- 2 fois 5 minutes à température ambiante SSC 2X et SDS 0,1% à 65 C.

- 2 fois 15 minutes à 65 C SSC 1X et SDS 0,1 % à 65 C.

Après hybridation et lavage, le blot est analysé après une nuit d'exposition au contact d'un écran au phosphore révélé à l'aide du Storm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

EXEMPLE 2 : Obtention de l'ADNc complet du gène ABC1 La séquence de la région 3'-UTR de l'ADNc du gène ABC1 humain a été identifiée par recherche dans les bases de données.

Un criblage itératif d'une base de données de séquences EST ( "Genbank mouse human subdivision EST, v. 111") a été réalisé à l'aide du logiciel BLAST.

Des amorces oligonucléotidiques ont été synthétisées à partir de la séquence consensus partielle dérivée des séquences EST, afin d'amplifier par une réaction de RT-PCR l'extrémité 3' de l'ADNc du gène ABC1 humain, puis d'en déterminer la séquence.

Les amorces oligonucléotidiques utilisées sont les suivantes :
1.5'- AAACCAGACAGTAGTGGACG-3', (SEQ ID NO 142)
2.5'-GTTACTGCCACCAGAACAGC-3', (SEQ ID NO 143)
3. 5'- TGATAAGCTGTTCTGGTGGC-3',(SEQ ID NO 144)
4. 5'-CTTGGCTTTTGCATTGTTGC-3', (SEQ ID NO 145)
5. 5'- CAATGCAAAAGCCAAGAAAG-3', (SEQ ID NO 146)
6.5'-TGCAACGATGCCATATCAC-3', (SEQ ID NO 147)
7. 5'-CAACTCCTTACTTCGGTTCCTC-3',(SEQ ID NO 148)
8.5'-GTTTTCTGAGGTGTCCCAAAG-3'( SEQ ID NO 149)
La transcription inverse de l'ARNm poly(A)+ à partir de tissus de cerveau, de cerveau foetal, de c#ur, d'utérus et de placenta (Banques

commercialisées par la société Clontech) a été réalisé par élongation à l'aide d'amorces oligodT en utilisant le kit SuperscriptTM (commercialisé par la société Life Technologies Inc.), selon les instructions du fabricant.

Dans chaque expérience, on a pu exclure la présence d'ADN contaminant du fait de l'absence de polynucléotides amplifiés par PCR dans les échantillons ne contenant pas de transcriptase inverse.

Une réaction PCR a été effectuée sur les produits ayant subi ou non une première étape de trancription inverse dans les conditions suivantes : - 400 M dNTP, 2 Unités d'ADN polymérase Taq (Thermus aquaticus, Ampli Taq Gold, commercialisée par la société Perkin Elmer), 0,5 M de chacune des amorces, 2,5 mM de Mg Cl2, l'ensemble étant présent dans un tampon pour PCR contenant également 50 ng d'ADN ou environ 25 ng d'ADNc.

- La réaction PCR a été effectuée pendant 30 cycles dans un appareil thermocycleur ("Perkin Elmer 9700 Thermal Cycler") dans des micro-plaques de 96 puits.

- Après une dénaturation initiale à 94 C pendant 10 minutes, chaque cycle a été réalisé de la manière suivante : - étape de dénaturation à 94 C pendant 30 secondes ; d'hybridation pendant 30 secondes (à 64 C pendant 2 cycles, à 61 C pendant 2 cycles, à 58 C pendant 2 cycles et à 55 C pendant 28 cycles).

- étape d'élongation pendant un temps correspondant à 1 minute par kilobase.

- La réaction PCR est arrêtée par une étape finale d'extension de 7 minutes.

Différentes autres approches peuvent être utilisées pour isoler l'ADNc correspondant à l'ADNc complet de ABC1.

Par exemple un clone complet peut être directement isolé par hybridation en criblant une banque d'ADNc au moyen d'une sonde polynucléotidique spécifique de la séquence du gène d'intérêt.

En particulier une sonde spécifique de 30-40 nucléotides est synthétisée en utilisant un synthétiseur de marque Applied Biosystem/Perkin Elmer selon la séquence choisie.

L'oligonucléotide obtenu est radiomarqué, par exemple au 32P-[gamma]- ATP en utilisant la T4 polynucléotide kinase et est purifié selon les méthodes usuelles (e.g. Maniatis et al. Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press, Cold Spring, NY 1982 ou encore F.Ausubel et al .

(Current Protocols in Molecular Biology, J.Wiley and Sons Eds, 1989).

La banque de clones contenant l'ADNc que l'on veut cribler est étalée sur milieu de culture en boîte de Pétri (1. 5% agar) contenant les antibiotiques appropriés selon les méthodes usuelles citées ci dessus (F.Ausubel et al.). Les colonies ainsi produites après incubation sont transférées sur filtres de nitrocellulose et criblées au moyen de la sonde nucléotidique radiomarquée, selon les méthodes usuelles et les colonies hybridant avec la sonde sont isolées et sous clonées.

L'ADN des clones ainsi repéré est préparé et analysé par séquençage. Les clones contenant les fragments correspondant à l'ADNc complet sont purifiés et reclonés dans le vecteur pcDNA3 selon les protocoles connus de l'homme de l'art et présentés par exemple dans F. Ausubel et al (1989) .

Différentes méthodes sont connues pour identifier les extrémités 5' et 3' du cDNA correspondant aux gènes décrits dans la présente demande. Ces méthodes incluent mais ne se limitent pas au clonage par hybridation, au clonage utilisant des protocoles similaires ou identiques à la 3' ou 5' RACEPCR (Rapid Amplification of cDNA End-PCR) qui sont bien connues de l'homme de l'art.

Par exemple, on pourra utiliser le kit commercialisé par la société Clontech (Marathon ReadyTM cDNA kit , protocole référencé PT1156-1) ou alternativement une méthode similaire à la 5'RACE est disponible pour caractériser l'extrémité 5' manquante d'un cDNA (Fromont-Racine et al.

Nucleic Acid Res.21(7):1683-1684 (1993)). En bref, un oligonucléotide d'ARN est ligaturé à l'extrémité 5' d'une population d'ARNm. Après retrotranscription en cDNA, un jeu d'amorces spécifiques respectivement de l'adaptateur ligaturé en 5' et d'une séquence située en 3' du gène d'intérêt est utilisé en PCR pour amplifier la portion 5' du cDNA recherché. Le fragment amplifié est ensuite utilisé pour reconstruire l'ADNc complet.

EXEMPLE 3 : Analyse du profil d'expression génique pour la maladie de Tangier La vérification de l'altération du niveau d'expression du gène ABC1 entraînant le phénotype cellulaire de Tangier peut-être déterminé par hydridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de fibroblastes de sujets atteints ou non de la maladie, selon les méthodes décrites ci-dessous : 1. Préparation des ARN totaux, des ARNm poly(A)+ et de sondes de cDNA Les ARN totaux sont obtenus à partir de cultures cellulaires des fibroblastes de sujets normaux ou bien atteints de la maladie de Tangier par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine(Chomczynski & Sacchi, 1987). Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., 1989) et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., 1997) avec des oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDye TM).

2. Hydridation et détection des niveaux d'expressions Les membranes de verre contenant les séquences présentées dans cette demande de brevet, correspondant au gène Tangier sont hydridées avec les sondes de cDNA, obtenues à partir des fibroblastes (lyer et al., 1999).

L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche MicroscannerTM) permet la quantification des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté.

EXEMPLE 4 : Construction du vecteur d'expression contenant l'ADNc complet de ABC1 dans des cellules de mammifères Le gène ABC1 peut être exprimé dans des cellules de mammifères. Un vecteur d'expression eucaryote typique contient un promoteur qui permet l'initiation de la transcription de l'ARNm, une séquence codant pour la protéine, et les signaux requis pour la terminaison de la transcription et pour la polyadénylation du transcrit. Il contient aussi des signaux supplémentaires

comme des enhancers, la séquence (de) Kozak et des séquences nécessaires pour l'épissage de l'ARNm. Une transcription efficace est obtenue avec les éléments early et late des promoteurs du virus SV40, les LTR rétroviraux ou le promoteur early du virus CMV. Cependant des éléments cellulaires comme le promoteur de l'actine peuvent aussi être employés. De nombreux vecteurs d'expression peuvent être employés pour mettre en oeuvre la présente invention comme le vecteur pcDNA3.

EXEMPLE 5 : des polypeptides ABC1 normaux et mutés.

Le polypeptide ABC1 normal codé par l'ADNc complet de ABC1 dont l'isolement est décrit dans l'Exemple 2 (clonage du cDNA complet), ou encore les polypeptides ABC1 mutés dont l'ADNc complet peut également être obtenu selon les techniques déctites à l'Exemple 2, peuvent être facilement produits dans un système d'expression bactérienne, de cellules d'insectes en utilisant les vecteurs baculovirus ou encore dans des cellules de mammifères avec ou sans les vecteurs du virus de la vaccine. Toutes les méthodes sont aujourd'hui largement décrites et connues de l'homme de l'art. On en trouvera par exemple une description détaillée dans F.Ausubel et al. (1989).

EXEMPLE 6 : Production d'un anticorps dirigé contre l'un des polypeptides ABC1 mutés.

Les anticorps dans la présente invention peuvent être préparés par différentes méthodes (Current Protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D.

Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl - Massachusetts General
Hospital Harvard Medical School, chapitre 11). Par exemple, les cellules exprimant un polypeptide de la présente invention sont injectées dans un animal afin d'induire la production de serum contenant les anticorps. Dans une des méthodes décrites, les protéines sont préparées et purifiées afin d'éviter des contaminations. Une telle préparation est alors introduite dans

l'animal dans le but de produire des antisera polyclonaux de plus grande activité.

Dans la méthode préférée, les anticorps de la présente invention sont des anticorps monoclonaux. De tels anticorps monoclonaux peuvent être préparés en utilisant la technique d'hybridome. (Kôhler et al, Nature 256 :495 (1975) ; Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6 :511 (1976) ; Kôhler et al, Eur. J. Immunol. 6:292 (1976) ; Hammeling et al., in : Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pp. 563-681 51981). En général, de telles méthodes impliquent d'immuniser l'animal (préférentiellement une souris) avec un polypeptide ou, mieux encore, avec une cellule exprimant le polypeptide. Ces cellules peuvent être mises en culture dans un milieu de culture tissulaire adéquat. Cependant, il est préferable de cultiver les cellules dans un milieu Eagle (Earle modifié) supplementé avec 10% de serum bovin foetal (inactivé à 56 C) et additionné d'environ 10 g /I d'acides aminés non essentiels, de 1000 U/ml de pénicilline et d'environ 100 g/ml de streptomycine.

Les splenocytes de ces souris sont extraits et fusionnés avec une lignée cellulaire de myelome adéquate. Cependant, il est préférable d'utiliser la lignée cellulaire de myelome parentale (SP20) disponible à l'ATCC. Après fusion, les cellules d'hybridomes résultantes sont sélectivement maintenues en milieu HAT puis clonées par dilution limite comme décrit par Wands et al.

(Gastroentérology 80 :225-232 (1981)). Les cellules d'hybridomes obtenues après une telle sélection sont testées afin d'identifier les clones sécrétant des anticorps capables de se fixer au polypeptide.

D'autre part, d'autres anticorps capables de se fixer au polypeptide peuvent être produits selon une procédure en 2 étapes utilisant des anticorps anti-idiotypique une telle méthode est fondée sur le fait que les anticorps sont eux-mêmes des antigènes et en conséquence il est possible d'obtenir un anticorps reconnaissant un autre anticorps. Selon cette méthode, les anticorps spécifiques de la protéine sont utilisés pour immuniser un animal, préférentiellement une souris. Les splénocytes de cet animal sont ensuite utilisés pour produire des cellules hybridomes, et ces dernières sont criblées pour identifier les clones qui produisent un anticorps dont la capacité à se fixer au complexe protéine-anticorps spécifique peut- être bloqué par le polypeptide. Ces anticorps peuvent être utilisés pour

immuniser un animal afin d'induire la formation en plus grande quantité d'anticorps spécifiques de la protéine.

Il serait apprécié que Fab et F(ab')2 et les autres fragments des anticorps de la présente invention puissent être utilisés selon les méthodes décrites ici. De tels fragments sont typiquement produits par clivage protéolytique à l'aide d'enzymes telles que la Papaïne (pour produire les fragments Fab) ou la Pepsine (pour produire les fragments F (ab')2).

Sinon,les fragments sécrètes reconnaissant la protéine peuvent être produits en appliquant la technologie de l'ADN recombinant ou de la chimie de synthèse.

Pour l'utilisation in vivo d'anticorps chez l'homme il serait préférable d'utiliser des anticorps monoclonaux chimériques " humanisés ". De tels anticorps peuvent être produits en utilisant des constructions génétiques dérivés de cellules d'hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus. Les méthodes pour produire les anticorps chimériques sont connus par l'homme de l'art. (Pour revue, voir : Morrison, Science 229 : 1202 (1985) ; Oi et al., Biotechnique 4 : 214 (1986) ; Cabilly et al., US patent n 4,816,567 ; Taniguchi et al., EP 171496 ; Morrison et al., EP
173494 ; Neuberger et al., WO 8601533 ; Robinson et al., WO 8702671 ; Boulianne et al ; Nature 312 :643 (1984) ; Neuberger et al., Nature 314 :
268(1985)).

EXEMPLE 7 : Correction du phénotype cellulaire de la maladie de Tangier
La maladie de Tangier est caractérisée par un catabolisme accéléré des particules lipoprotéiques de haute densité (HDL) et une accumulation de cholestérol dans les tissus. Notamment, les fibroblastes de peau des patients atteints de la maladie de Tangier ont une capacité réduite à éliminer leur contenu en cholestérol par le processus d'efflux de cholestérol assuré par l'apolipoprotéine A-I (apoA-I), protéine majeure des HDL (Francis et al.,
1995). Cette caractéristique correspondant à une perte de fonction est aussi retrouvée dans d'autres cellules fibroblastiques de patients atteints de déficit familial en HDL (Marcil et al., 1999).

La correction du phénotype des fibroblastes de Tangier peut être assurée par la transfection de l'ADNc complet de ABC1 selon l'invention, dans lesdites cellules. L'ADNc est inséré dans un vecteur d'expression qui est ensuite transfecté selon les méthodes décrites ci-dessous : 1. Préparation des cultures fibroblastiques de sujets normaux et de sujets atteints de la maladie de Tangier Les fibroblastes primaires de peau humaine sont obtenus par la mise en culture de biopsie de peau provenant de l'avant bras. Ces biopsies sont effectuées sur des patients atteints de la maladie de Tangier ayant les particularités cliniques et biochimiques des " homozygotes ", c'est à dire des amygdales oranges, des concentrations plasmatiques d'apoA-1 et de cholestérol-HDL inférieur au 5ème percentile. Les lignées de fibroblastes normaux sont obtenus chez l'American Type Culture Collection (Rockville, MD). Les fibroblastes sont cultivés dans un milieu EMMEM (Eagle-modified minimium essential médium ; GIBCO) complété par 10% de sérum de veau foetal, de la glutamine à 2 mM, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 g/ml de steptomycine (milieu désigné par EMMEM10). En vue de la réalisation de l'étude de l'efflux de cholestérol, ces cellules sont pré-chargées en cholestérol par incubation de 24 heures avec 50 /ml de cholestérol dans le milieu décrit ci-dessus sans sérum de veau mais contenant 2 mg/ml d'albumine bovine (BSA, fraction V).

2. Etude de l'efflux de cholestérol Les fibroblastes pré-chargés en cholestérol à confluence sur des plaques à 24 puits sont incubés dans le milieu EMMEM10 et 1 Ci/ml de 1,2-3Hcholestérol (50 Ci/mmol ; Dupont ; Wilmington, DE) durant 48 heures. Environ 100 000 coups par minute sont obtenus par puits ou 1000 coups par minute et par g de protéine cellulaire. Les cellules sont lavées trois fois avec du milieu EMMEM/BSA, et incubées avec ce milieu durant 24 heures avant de transfecter le gène d'intérêt et de démarrer l'efflux par ajout de 10 g/ml de protéoliposome contenant l'apoA-1 en milieu EMMEM/BSA. Ces protéoliposomes sont préparés par sonication de phosphatidylcholine et d'apoA-1 humaine purifiée (Jonas, 1986). La transfection cellulaire s'effectue par la technique de précipitation de phosphate de calcium (Sambrook et al.,

1989). Après la période d'efflux, en général 20 heures, le milieu est collecté, centrifugé (1000 g, 5 min), et la radioactivité déterminée par comptage en scintillation liquide. La radioactivité résiduelle dans les cellules est aussi déterminée sur la nuit après extraction des lipides dans l'isopropanol. Le pourcentage d'efflux est calculé en divisant la radioactivité mesurée dans le surnageant par la somme des radioactivités mesurées, dans le surnageant et l'extrait cellulaire.Un contrôle interne est réalisé par transfection d'un gène marqueur et l'incubation sur 24 heures avec un milieu EMMEM/BSA sans protéoliposome contenant l'apoA-1. L'efflux de cholestérol cellulaire à partir de fibroblastes normaux et transfectés par un gène témoin correspondent à 62% alors que celui obtenu à partir de fibroblastes atteints de la maladie de Tangier et transfectés par ce gène témoin est inférieur à 1 %. En revanche la transfection des fibroblastes atteints de la maladie de Tangier par un plasmide contenant l'ADNc complet ou encore l'ADN génomique de ABC1 selon l'invention permettrait de restaurer la capacité de ces cellules à éliminer leur excès de cholestérol à un niveau correspondant à celui de fibroblastes normaux.

EXEMPLE 8 :Isolement et caractérisation de fragments génomiques du gène ABC1 humain.

Un fragment d'environ 3 kb de l'ADNc de ABC1 humain a été obtenu à partir du clone d'ADNc désigné " pf10 " contenant le premier domaine de fixation de l'ATP de ABC1, ce clone d'ADNc étant décrit dans l'article de
Luciani et al. (1994).

Ce fragment d'ADNc obtenu par digestion du clone pf10 à l'aide de l'endonucléase de restriction EcoRI, a été isolé sur un gel d'agarose après électrophorèse, puis marqué avec la digoxigénine selon les instructions du constructeur (kit commercialisé par Boehringer Mannheim, référence 1 585
614)
Le fragment d'ADNc marqué a été utilisé afin de cribler la banque de cosmides LLNL (Lawrence Livermore National Labs) du chromosome 9, immobilisés sur un filtre de Nylon TM
Six clones positifs ont été identifiés. Pour ces six cosmides, la sonde a hybridé avec des colonies uniques.

Un clone représentatif a été isolé à partir de chacune de ces colonies.

Les clones LLNLC 131J087 Q2 (désignés ici cos3a) et LLNLc 13101165 Q2 (désignés ici cos6f) ont été analysés plus en détail.

Le clone cos3a a été sous-cloné sous la forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur Gen3zf (-) etséquence aux deux extrémités en utilisant la technologie Big Dye Terminator sur un séquenceur de type ABI377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer).

Les clones contenant des inserts distincts (déterminés après séquençage des extrémités des différents inserts ou encore par détermination de la taille de ceux-ci) qui étaient de longueur trop grande pour être complètement séquences à l'aide des amorces hybridant avec les séquences du vecteur, ont été analysés plus avant par la technique d'insertion de transposon puis de séquençage à l'aide d'amorces spécifiques du transposon (système " GPS " commercialisé par la Société New England Biolabs).

De cette manière, des séquences génomiques correspondant au gène ABC1 humain ont été isolées et caractérisées. Ces séquences ont été comparées avec des séquences humaines et de souris référencées dans les bases de données permettant de déterminer les jonction intron-exon..

EXEMPLE 9 : de polymorphismes/mutations dans le gène ABC1.

La détection de polymorphismes et ou de mutations dans les séquences des transcrits ou dans la séquence génomique du gène ABC1 peut être réalisée selon différents protocoles. La méthode de choix est le séquençage direct.

Pour les patients dont on peut obtenir une préparation d'ARNm la méthode de choix consiste à préparer les cDNAs et les séquencer directement, Pour les patients dont on ne dispose que de l'ADN, et dans le cas d'un transcrit où la structure du gène correspondant est inconnue ou partiellement connue il est nécessaire de déterminer précisément sa structure intron-exon ainsi que la séquence génomique du gène correspondant. Il s'agit donc dans un premier temps d'isoler le ou les clones de cosmides ou de BAC d'ADN génomique correspondant au transcrit étudié selon la méthode décrite dans l'exemple 8, de séquencer l'insert du ou des clones correspondants et de

déterminer la structure intron-exon en comparant la séquence de l'ADNc à celle de l'ADN génomique obtenu.

La technique de détection de mutations par séquençage direct consiste à comparer les séquences génomiques du gène ABC1 obtenues à partir des homozygotes pour la maladie ou d'au moins 8 individus ( 4 individus affectés par la pathologie étudiée et 4 individus non affectés). Les divergences de séquence constituent des polymorphismes. Tous ceux modifiant la séquence en acides aminés de la protéine sauvage peuvent être des mutations susceptibles d'affecter la fonction de ladite protéine qu'il est intéressant de considérer plus particulièrement pour l'étude de co-ségrégation de la mutation et de la maladie (corrélation génotype-phénotype) dans le pédigrée ou encore dans les études d'association cas/témoin pour l'analyse des cas sporadiques.

EXEMPLE 10 : Identification d'un gène causal d'une maladie liée à un déficit du transport inverse du cholestérol par la mutation causale ou une différence transcriptionnelle Parmi les mutations identifiées selon la méthode décrite dans l'Exemple 9, toutes celles associées au phénotype malade sont susceptibles d'être causales. La validation de ces résultats est faite en séquençant le gène chez tous les individus atteints et leurs apparentés (dont l'ADN est disponible).

D'autre part, la réalisation de Northern blot ou RT-PCR, selon la méthode décrite dans l'Exemple 1, à partir d'ARN spécifique d'individus atteints et non-atteints permet de détecter des variations notables du niveau d'expression du gène étudié, en particulier une absence de transcription du gène.

EXEMPLE 11 : Identification d'une délétion d'un nucléotide dans l'exon
13 du gène ABC1 chez des patients atteints de la maladie de TANGIER
L'analyse de mutations dans le gène ABC1 a été réalisée sur de l'ADN génomique de plusieurs individus appartenant à une famille dont plusieurs membres sont atteints de la maladie de Tangier avec des désordres coronariens précoces.

Une délétion d'un nucléotide a été identifiée dans l'exon 13 (DG
1764 : Leu548Leu ; 575 End). Cette délétion introduit un codon stop en

position 575 qui permet de prédire une troncation de la protéine ABC1 codée par le gène ABC1 muté, cette troncation conduisant à la stnthèse d'un polypeptide délété d'une grande partie de la séquence normale d'acides aminés, et en particulier des deux cassettes de fixation à l'ATP.

Une corrélation parfaite entre l'observation des symptomes de la maladie et la présence de cette délétion d'un nucléotide a été retrouvée dans l'ensemble de la famille (Figure 1).

EXEMPLE 12: Identification d'une insertion d'un segment de nucléotides dans l'exon 12 du gène ABC1.

Dans une autre famille dont plusieyrs membres sont atteints de la maladie de Tangier, on a observé une insertion de 110 paires de bases ayant la strcture d'une séquence nucléotidique répétée de type Alu-sq, accompagnée d'une délétion de 14 paires de bases dans l'exon 12 (Figure 2). Cette mutation par insertion/délétion permet de prédire une délétion de 65 acides aminés (DERKFW) aisni qu'une insertion en phase de 38 acides aminés (EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG).

Cette mutation ne permet pas la synthèse d'un polypeptide transporteur ABC1 normal. Il epeut donc être conclu que la maladie de Tangier, chez les individus de cette famille, est provoquée par un défaut dans le gène ABC1.

EXEMPLE 13. : Identification de polymorphismes bialléliques dans le gène ABC1
Des amorces pour l'amplification de l'ADN des patients ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1, de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de la structure secondaire durant l'étape d'épissage de l'ARN soit incluses dans les fragments amplifiés.

Les différents couples d'amorces spécifiquement mis au point sont présentés dans le tableau V.

Les résultats trouvés sur l'ADN d'une famille contenant des cas de maladie de Tangier sans complication coronariennes sont montrés dans le tableau
IV.

L'ADN génomique des patients a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci-dessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq ou encore le kit Supertaq, en utilisant les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur.

Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la Société Qiagen, puis séquences par la méthode Big Dye Terminator sur un séquençeur AB1377 (Applied Biosystems, Perkin Elmer).

EXEMPLE 14 : Identification d'une région de 1 cM sur le locus 9q31 associée à la maladie de Tangier
Une première analyse de liaison (" linkage ") a été décrite dans l'article de Rust et al (1998).

Cet article a présenté une analyse de liaison sur trois familles de patients atteints de la maladie de Tangier et défini un intervalle candidat de 8 cM en 9q31.

Le demandeur a réalisé une étude de liaison en incluant quatre familles supplémentaires ainsi que des marqueurs additionnels référencés dans des bases de données publiques afin d'affiner la région candidate à environ 1 cM, en référence à la carte génétique publiée par le Généthon (Dib et al., 1996)
Les résultats d'analyse de liaison présentés ci-après ont permis au demandeur d'exclure de la région candidate les segments génomiques respectivement proximaux (centromérique) et distaux (télomèrique) aux marqueurs D9S271 et D9S1866.

La région candidate est donc localisée entre ces deux marqueurs exclus.

Une information importante ayant permis d'affiner la région candidate a été obtenue à partir de la portion E1 du pedigree décrit dans l'article de
Rust et al. (1998). En effet il a été montré sur le chromosome maternel, à l'origine de la partie E121m, que l'événement de recombinaison (crossing- over) déjà décrit dans la figure 2 de cet article (entre les marqueurs D9S277 et D9S53), devait en fait être localisé de façon télomérique par rapport au

marqueur D9S271. La borne centromèrique de l'intervalle candidat étant située entre D9S271 et D9S277.

Dans deux des nouvelles familles, respectivement la famille " S1 " et la famille " NU ", des événements de recombinaison supplémentaires ont été observés. Ces événements de recombinaison ont permis de déplacer la borne télomérique de l'intervalle candidat, du marqueur D9S1677 (décrit dans l'artcle de Rust et al 1998) au marqueur D9S1866.

Le premier pedigree, " S1 ", a été étendu. Les individus atteints présentent un génotype homozygote pour tous les marqueurs de la région de 8cM ainsi que pour des marqueurs plus lointains, localisés de part et d'autre de cette région. L'un des cousins de l'individu S1, apparenté à S1 par les deux parents (double consanguinité) possède quatre enfants. Deux de ces enfants présentent sur leur chromosome d'origine paternel une conservation d'une grande partie de l'haplotype malade (dans la region défini de 8 cM). Ces deux enfants présentent également la caractéristique typique des parents hétérozygotes de la famille atteinte de la maladie de Tangier, à savoir un niveau de HDL qui est de moitié le niveau observé chez des patients non affectés par la maladie.

Cependant, le caractère homozygote pour les marqueurs n'est plus observé dans la région chromosomique à partir du marqueur D9S1866 (qui est hétérozygote chez ces individus), ce qui a permis de définir D9S1866 comme borne télomérique de la région candidate.

La même borne télomérique a été observée dans la famille " Nu ", dans laquelle l'un des quatre enfants issus de parents cousins au premier degré, était un patient affecté de la maladie de Tangier homozygote.

Une homozygotie pour les marqueurs sur l'ensemble de la région candidate a été observée chez ce patient.

L'un de ses frères, hétérozygote (au niveau phénotypique), présente un événement de recombinaison (crossing-over) sur l'un des deux chromosomes, de telle manière que ce frère est homozygote (au niveau génétique) pour tous les marqueurs télomériques incluant le marqueur
D9S1866, mais hétérozygote (au niveau génétique) pour les marqueurs localisés dans la région vers le centromère.

Comme ce patient ne présentait pas un phénotype de patient homozygote, la région télomérique incluant le marqueur D9S1866 a pu être exclue.

EXEMPLE 15: Isolement et caractérisation du gène ABC1 humain.

Ce fragment d'ADNc obtenu par digestion du clone pf10 à l'aide de l'endonucléase de restriction EcoRI, a été isolé sur un gel d'agarose après électrophorèse, puis marqué avec la digoxigénine selon les instructions du constructeur (kit commercialisé par Boehringer Mannheim)
Le fragment d'ADNc marqué a été utilisé afin de cribler la banque de cosmides LLNL du chromosome 9, immobilisés sur un filtre de NylonTM.

Six clones positifs ont été identifiés. Pour ces six cosmides, la sonde a hybridé avec des colonies uniques.

Un clone représentatif a été isolé à partir de chacune de ces colonies.
Les clones LLNLC 131J087 Q2 (désignés ici cos3a) et LLNLc 13101165 Q2 (désignés ici cos6f) ont été analysés plus en détail.

Le clone cos3a a été sous-cloné sous la forme d'un fragment EcoRI dans le vecteur Gen3zf (-) etséquence aux deux extrémités en utilisant la technologie Big Dye Terminator sur un séquenceur de type AB1377.

De cette manière, des séquences génomiques correspondant au gène ABC1 humain ont été isolées et caractérisées. Ces séquences ont été

comparées avec des séquences humaines et de souris référencées dans les bases de données.

Les séquences des jonctions intron-exon ont été déterminées.

Des amorces pour l'amplification de l'ADN des patients ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1, de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de la structure en lariat durant l'étape d'épissage soit incluse dans les fragments amplifiés.

Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la Société Qiagen, puis séquences par la méthode Big Dye Terminator sur un séquençeur AB1377.

EXEMPLE 16 : de vecteurs recombinants contenant un polynucléotide codant pour la protéine ABC1 1. Synthèse de du gène ABC1 humain.

De l'ARN total (500 ng) isolé de tissu de placenta humain (Clontech, Palo Alto, CA, USA) a été utilisé comme source pour la synthèse de l'ADNc du gène ABC1 humain, en mettant en oeuvre le système " Superscript one step RT-PCR (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA ) et les amorces oligonucléotidiques spécifiques de ABC1 (0,25 M) suivante : - amorce aller : 5'-CTACCCACCCTATGAACAAC-3' (nt 75-94 de l'ADNc ABC1); - amorce retour: 5'-1GCCACCCCGTATGAACAGGG-3' (nt 6731-6751 de l'ADNc de ABC1).

Ces amorces oligonucléotidiques ont été synthétisées par la méthode au phosphoramidite sur un appareil synthétiseur d'ADN de type ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Les sites reconnus par l'enzyme de restriction Notl ont été incorporés dans l'ADNc amplifié de 6676 pb par une nouvelle étape d'amplification en utilisant 50 ng de l'ADNc de ABC1 humain comme matrice, et 0,25 M des

amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus contenant, à leur extrémité 5', le site reconnu par l'enzyme de restriction Notl, en présence de 200pM de chacun desdits didéoxynucléotides dATP, dCTP, dTTP et dGTP ainsi que l'ADN polymérase de Pyrococcus furiosus (Stratagene, Inc. La Jolla, CA, USA).

La réaction PCR a été réalisée pendant 30 cycles comprenant chacun une étape de dénaturation à 95 C pendant une minute, une étape de renaturation à 50 C pendant une minute et une étape d'extension à 72 C pendant deux minutes, dans un appareil thermocycleur pour PCR (Cetus Perkin Elmer Norwalk, CT, USA).

Il. Clonage de l'ADNc du gène ABC1 humain dans un vecteur d'expression :
L'insert de 6676 pb de l'ADNc de ABC1 humain a été cloné au site de restriction Notl du vecteur d'expression pCMV contenant un promoteur précoce du cytomégalovirus et une séquence activatrice (" Enhancer ") ainsi que le signal de polyadénylation de SV40 (Beg et al., 1990 ; ApplebaumBoden, 1996), afin de réaliser le vecteur d'expression désigné pABC1.

La séquence de l'ADNc cloné a été confirmée par un séquençage sur les deux brins en utilisant la trousse de réaction " ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing ready" (commercialisée par Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans un séquenceur capillaire de type ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

III. Construction d'un vecteur adénoviral recombinant contenant l'ADNc du gène ABC1 humain.

A- Modification du vecteur d'expression pCMV-ss.

L'ADNc de la ss-galactosidase du vecteur d'expression pCMV- ss(Clontech, Palo Alto, CA, USA, Gene Bank Accession n UO2451) a été délété par digestion avec l'endonucléase de restriction Notl et remplacé par un polysite de clonage contenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', les sites suivants:
Notl, Ascl, Rsrll, Avril, Swal, et Notl (séquence du polysite de clonage: 5'-CGGCCGCGGCGCGCCCGGACCGCCTAGGATTTAAATCGCGGCCCGCG-3' ce polysite de clonage ayant été cloné au niveau du site Notl.

Le fragment d'ADN compris entre les sites EcoRI et Sanl du vecteur d'expression pCMV modifié a été isolé et cloné dans le site Xbal modifié du vecteur navette pXCXII (McKinnon et al., 1982 ; McGrory et al., 1988).

B-modification du vecteur navette pXCXII.

Un polysite de clonage comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' les sites de restriction Xbal, EcoRI, Sfil, Pmel, Nhel, Srfl, Pacl, Sali et Xbal (de séquence: 5'-GCTCTAGAATTCGGCCTCCGTGGCCGTTTAAACGCTAGCGCCCGGGCTTAATTAA GTCGACTCTAGAGC-3') a été insérée au niveau du site Xbal (nucléotide en position 3329) du vecteur pXCXII (McKinnon et al., 1982 ; McGrory et al., 1988).

Le fragment d'ADN EcoRI-Sall isolé du vecteur pCMV-p modifié contenant le promoteur/enhancer de CMV, les sites donneurs et accepteurs d'épissage de FV40 et le signal de polyadénylation de FV40 a ensuite été cloné dans le site EcoRi-Sall du vecteur navette pXCX modifié, désigné pCMV-11.

C- Préparation du vecteur navette pAD12-ABC1.

L'ADNc ABC1 humain est obtenu par une réaction de RT-PCR, comme décrit ci-dessus, et cloné au niveau du site Notl dans le vecteur pCMV-12, résultant dans l'obtention du vecteur pCMV-ABC1.

L'ADNc ABC1 contenu dans le vecteur pCMV-ABC1 est constitué d'un fragment d'ADN de 6676 pb comprenant la séquence allant du nucléotide en position 75 au nucléotide en position 6751 de l'ADNc ABC1 humain.

D. Construction de l'adénovirus recombinant ABC1.

* L'adénovirus recombinant ABC1-rldV contenant l'ADNc ABC1 humain a été construit selon la technique décrite par McGrory et al. (1988).

Brièvement, le vecteur pAD12-ABC1 a été cotransfecté avec le vecteur tGM17 selon la technique de CHEN et OKAYAMA (1987).

De même, le vecteur pAD12-Luciferase a été construit et co- transfecté avec le vecteur pJM17.

Les adénovirus recombinants ont été identifiés par amplification PCR et soumis à deux cycles de purification avant une amplification à grande échelle dans la lignée de cellules embryonnaires de rein humain HEK 293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA).

Les cellules infectées ont été collectées 48 à 72 heures après leur infection par les vecteurs adénoviraux et soumis à cinq cycles de lyse par congélation et décongélation.

Les lysats bruts ont été extraits à l'aide de Fréon (Halocarbone 113, Matheson Product, Scaucus, N.J. USA), sédimentés deux fois dans le chlorure de césium supplémenté d'albumine murine à 0,2% (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, MO, USA) et dialysés extensivement contre du tampon composé de 150 nM NaCI, 10 mM Hepes (pH 7,4), 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, et 1 mM CaCI2.

Les adénovirus recombinants ont été conservés à -70 C et titrés avant leur administration à des animaux ou leur incubation avec des cellules en culture.

L'absence d'adénovirus contaminant de type sauvage a été confirmée par criblage à l'aide d'amplification PCR en utilisant des amorces oligonucléotidiques localisées sur la partie structurale de la région délétée.

IV Validation de l'expression de l'ADNc ABC1 humain.

Des anticorps polyclonaux spécifiques du polypeptide ABC1 humain ont été préparés chez des lapins et des poussins par injection du peptide synthétique " LHKNQTWDVAVLTSFLQDEKVKESYV ", dérivé de la protéine ABC1. Ces anticorps polyclonaux sont utilisés pour détecter et/ou quantifier l'expression du gène ABC1 humain dans des cellules et des modèles animaux par immunoempreinte et/ou immunodétection.

L'activité biologique de ABC1 peut être suivie en quantifiant les flux de cholestérol induits par apoA-1 à partir de cellules transfectées par le vecteur pCMV-ABCI qui ont été chargées en cholestérol (Remaley et al., 1997).

V. Expression in vitro de l'ADNc abc1 humain dans les cellules.

Des cellules de la lignée HEK293 et de la lignée COS-7 (American Tissue Culture Collection, Betesda, MD, USA), ainsi que des fibroblastes en culture primaire dérivés de patients Tangier ou de patients atteints d'hypoalphalipoprotéinémie sont transfectés avec le vecteur d'expression pCMVABC1 (5-25ug) en utilisant de la Lipofectamine (BRL, Gaithersburg, MD, USA) ou par co-précipitation à l'aide de chlorure de calcium (Chen et al., 1987).

Ces cellules peuvent être également infectées avec le vecteur pABC1-AdV (Indice d'infection, MOI=10).

L'expression de ABC1 humain peut être suivie par immunoempreinte ainsi que par quantification de l'efflux de cholestérol induit par apoA-1 à partir de cellules transfectées et/ou infectées.

La complémentation du défaut génétique dont sont atteints les patients Tangier et les patients hypo-alphalipoprotéinémiques à partir de fibroblastes de ces patients, peut être confirmée par la détection de l'expression du gène ABC1 normal, ce qui permet d'établir l'importance fonctionnelle de ce récepteur.

VI. : Expression in vivo du gène ABC1 dans différents modèles animal.

Un volume approprié (100 à 300 l) d'un milieu contenant l'adénovirus recombinant purifié (pABC1-AdV ou pLucif-AdV) contenant de 108 à 109 unités formant des plages de lyse (PFUs) sont infusées dans la veine Saphène de souris (C57BL/6, à la fois souris témoins et modèles de souris transgéniques ou knock-out ) au jour 0 de l'expérience .

L'évaluation du rôle physiologique de la protéine ABC1 dans le métabolisme des lipoprotéines est réalisée par détermination de la quantité totale de cholestérol, de triglycérides , de phospholipides et de cholestérol libre (Sigma et Wako Chemicals, Richmond, VA, USA), de cholestérol-HDL (CIBA-Corning, Oberlin, OH, USA) et des apolipoprotéines A-I, A-II, E et B de souris (Foger et al., 1997), avant (jour zéro) et après (jours 2,4, 7,10, 14) l'administration de l'adénovirus.

Des études cinétiques à l'aide de produits marqués radioactivement tels qu'apoA-I-HDL, CE-HDL ainsi que apoB-LDL et CE-LDL sont réalisées au jour 5 après l'administration des vecteurs rLucif-AdV et rABC1-AdV afin

d'évaluer l'effet de l'expression de ABC1 sur le métabolisme des HDLs et des LDLs ainsi que sur la libération du cholestérol vers le foie.

L'effet de l'expression de ABC1 sur le développement de l'athérosclérose peut être évalué en quantifiant la surface moyenne de lésion aortique dans des souris apoE après administration du vecteur rABC1-Adv.

De plus, des souris transgéniques et des lapins surexprimant le gène ABC1 peuvent être produits, conformément à l'enseignement de Waisman (1995) et Hoeg (1996) en utilisant des constructions contenant l'ADNc de ABC1 humain sous le contrôle de promoteurs endogènes tels que ABC1, CMV ou apoE.

L'évaluation de l'effet à long terme de l'expression de ABC1 sur la cinétique des lipides, lipoprotéines, apolipoprotéines plasmatiques et sur l'athérosclérose pourra être réalisée comme décrit ci-dessus.

EXEMPLE 17 : Utilisation de vésicules pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABC1.

La base de cette essai est la reconstitution de membranes ayant incorporé la protéine ABC1 et contenant des substrats comme le cholestérol ou des phopholipides. La protéine ABC1 peut alors être activés ou sa fonction réprimée par l'ajout de molécules d'intérêt. La sortie des substrats par le canal formé par la protéine ABC1 est alors détectée. a) Reconstitution d'une membrane contenant la protéine ABC1 et un substrat lipidique marqué.

Différentes stratégies peuvent être employées pour fabriquer ces membranes, des méthodes utilisant des solvant organiques, des moyens mécaniques comme la sonication, la " French press ", ou bien par des cycles de congélation- décongélation, ou encore utilisant des détergents (les cholates, le Chaps, Chapso) (référence : Rigaud et al. Biochimica et
Biophysica Acta 1231 (1995) 223-246).

Plus particulièrement, un substrat lipidique comme des phospholipides, du cholestéol ou ester de cholestérol, radioactif du type 3H-cholestérol, 125-1- cholestérol, 3H-phospphatidylcholine ou bien fluorescent avec du NBD ou du pyrene (Molecular Probes ; http ://www.probes.com) et de la phospatidyle-

choline d'oeuf (1 mM) sont séchés sur le culot d'un flacon en verre. Dans ce flacon sont mélangés à la fois du cholate de sodium et la protéine ABC1 au ratio mole à mole de 0,3. L'ensemble est mélangé au vortex pendant 5 minutes puis incubé à 25 C durant 30 minutes puis dialysé contre un tampon salin. Le protéoliposome réalisé selon ce protocole est suivi par turbidimétrie pour vérifier sa bonne fabrication. b) Capture du protéoliposome sur une surface solide Cette étape peut être réalisée en incorporant des protéines de fixation du type intégrine. Dans ce protocole, on utilise une capture par les anticorps dirigés contre la protéine ABC1 et préalablement adsorbée sur une plaque 96 ou 384 puits.

Une solution contenant ces anticorps à la concentration de 100 g/l sont absorbés sur ces plaques multipuits par incubation sur la nuit à 4 C. Après lavage, la plaque est ensuite saturée par de l'albumine bovine à 1 mg/ml incubé durant 2 heures à 37 C. L'ensemble est encore lavé et incubé avec les protéoliposomes contenant ABC1 durant 2 heures à 37 C. c) Liaison aux molécules d'intérêt Cette étape est réalisée par incubation de produits durant 1 heure à 37 C d) Détermination de l'activation ou inhibition de la protéine ABC1 Si le substrat est fluorescent, la fluorescence du surnageant nous révèle l'activité de produit à induire un transport de lipide vers l'extérieur du protéoliposome. Ou encore, l'utilisation de système Confocal nous informe sur les quantités de substrat à l'intérieur et l'extérieur du protéoliposome. Si le substrat est radioactif, l'utilisation de plaques du type CytoStar ayant un fond avec du liquide de scintillation permet de révèler le subtrat encore séquestré dans le protéoliposome.

EXEMPLE 18: Utilisation de transport d'anion pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABC1).

Le principe de cet essai réside dans la propriété qu'a la protéine ABC1 à transporter les anions lors de son activation. a) Les cellules macrophagiques de la lignées THP-1, cellules humaines monocytic leukemia, sont un modèle de macrophages différenciés. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dans des plaques 48-multipuits à la densité de 2 105

cellules par puits. Les cellules fibroblastiques de patients atteints de la maladie de Tangier peuvent être utilisées comme témoin négatif parce que leur protéine ABC1 n'est pas fonctionnelle. Un autre témoin négatif peut être obtenu par l'ajout d 'anticorps anti-ABC1. b) L'utilisation de cellules défectives en transport anioniques ou bien des cellules traitées avec des inhibiteurs de canals anioniques (type Verapamil, un inhibiteur de P-glycoprotéine ou le tetraethylammonium, un inibiteur de canal potassique) peuvent être aussi utilisés. c) Pour l'essai proprement dit, les cellules sont ensuite lavées par un milieu Earles's modified sait solution (ESS) préchargées avec 1ml de KI à 1 mol/L (0,1 Ci/ml de Na1125) dans ce milieu ESS pour 30 minutes à 37 C. Les produits sont alors ajoutés dans le milieu extracellulaire. Les cellules sont ensuite lavées par le milieu ESS. d) La quantité d'iiodure dans le milieu est détectée toute les minutes durant 11minutes. Les deux premiers points correspondent à l'efflux basal. A la fin de l'incubation, le milieu est repris et la quantité d'iodine restant dans les cellules est compté suite à la lyse des cellules dans du NaOH 1 molaire. e) La quantité totale de radioactivité au temps zéro est égale à la somme de la radioactivité trouvée dans les surnageant et résiduelle dans les cellules.

Les courbes d'efflux sont construites en marquant le pourcentage de radioactivité libéré dans le milieu en fonction du temps.

EXEMPLE 19 : Utilisation de macrophages THP-1 exprimant l'IL-1béta pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes de la protéine ABC1).

Le principe de ce test est que toutes substances modulant l'activité de la protéine ABC1 a des répercussions sur la synthèse d'IL-1beta. a) Les cellules macrophagiques de la lignées THP-1, cellules humaines monocytic leukemia, sont un modèle de macrophages différenciés. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal dans des plaques multipuits à la densité de 2 105 cellules par puits.

b) Pour l'essai proprement dit, les cellules sont ensuite lavées et placés dans un milieu RPMI 1640 contenant 1 mg/ml d'albumine humaine purifiée fraction IV. c) Les produits sont ajoutés dans le milieu extracellulaire. Simultanément, les cellules sont alors activées par ajout de lipopolysaccharide (LPS) durant 3 heures à 1 g/ml suivit par une incubation de 30 minutes en présence de ATP à 5 mmol/L. d) Les concentrations en IL-1beta et en contrôle l'IL-1 alpha, le tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) et l'IL-6 sont déterminées par des kits ELISA selon les instructions des fabriquants (R&D Sytem ; IL-1béta humain Chemiluminescent ELISA référence QLBOO). Les variations en ARNm de l'IL-1béta qui n'est pas censé être affecté sont évaluées par la technique de Nothern blot avec la sonde correspondante.

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2160

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660

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1380 acacaatgat gaaaattaat accactacca cttaagttcc tatgtgacaa ctttcccaag
1440 aatcagagag atacaagtca aaactccaag tcaatgcctc taacttctct gatgggtttt
1500 aacctccaga gtcagaatgt tctttgcctt actaggaaag ccatctgtca tttgaaaact
1560 ctgtacattt tatcagcagc ttatccatcc attgcaaata tgtttttgtg ccagccacaa
1620 tatattgctt ctatttggac caataggggg atttgaagga attc
1664

<210> 10 <211> 1279 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 gaattctcat aattgtccta tcgtcaagtc tttatttctg cattttactg cttgatacac 60 tgtcaggaca gactttaaaa ttattctcag tgcgatgaaa caattctgac attcatgtta 120 tgagcagtta cctcataaat agattacatg tgagattgaa cttgggcaga ctataatata 180 gcattaatga cgaaacagac acagtcatct tcgggaagaa gaatagaggc ttatttgctg 240 cctgtgaaat taaaattact ctgactggga atccatcgtt cagtaagttt actgagtgtg 300 acaccttggc ttgactgttg gaaagacaga aagggcatgt agtttataaa atcagccaag 360 gggaaaatgc ttgtcaaaat gtattgtcgg gtattttgat taatagttta tgtggcttca 420 ttaattcaga gttactctcc aatatgttta tctgcccttt cttgtctgat aatggtgaaa
480 acttgtgtga tgcattgtat atttgattta ggggtgaact ggatgtcttt gttttcactt
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720 gaaggagggc agggactctc agtagacact tatctttttg tgtctcaaca ggtggtcaat
780 cacacctctc atgtacccag cctcctttgt gttcaagatc cccagcacag cctatgtggt
840

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120 ggtcgtttgc ctttttaaaa ggatttttgg catgtctcat taaaaaaaga aatactagat
180 atcttcagtg aagttacaaa tcgaatacac attggctctg aaattctgat tgatactggg
240 tcataaaaag ttttcccaaa tcagacttgg aaagtgatca ctctcttgtt actctttttt
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360

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acatactaat attgtatatc tagtcaaaac tgaggtagag agaataaatg gttgattttg 120 agtttgagtt tcatagtcca aaaagctgat atattgcctg tgttcaagag ggtctatatc 180 agccctctag atgccagcat ctccaaattt tacttttttg gaatctgtac agtatttgca 240 atatttttat tacaaatttc tactctgtgg aatttaattt ttaaaatacc tgcaatacat 300 atatatgttg aatagatgaa aaattatgta gataataatg aatgatacgg ttctaaaaag 360 acaggttaaa aagtaagttc acttttattt tgagcttcag aatcattcag aagccagtcg 420 ccacaaacgc agaccaaggc tcttggcaca tcaaatatgc ctatggctta gggttattga 480 caagtcttat gttgcagtgt atgtggttta tagtcctgcc ttccacagtt gcttgggaga 540 gctgtgagtc actgaggctt atgaatgttt acattttgtt tgttgcagat atatagaagg
600 aagcggaagc ctgctgttga caggatttgc gtgggcattc ctcctggtga ggtaaagaca
660 ctttgtctat attgcgtttg tccctattag ttcagactat ctctacccaa tcaagcaacg
720 atgctcgtt
729 <210> 13 <211> 731 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 acatgtgcca gtactggtga gagcgcaagc tttggagtca aacacaaatg ggtttgcatc 60 ctggccctac caattatgag ctctgagcca tgggcaagtg actaactccc tgggcctcag
120

tttctctgta acatctgtca gacttcatgg gtccaggtga ggattaaagg agatcatgta 180 tttacagcac atggcatggt gcttcacata aaataagtat ttagtaaatg ataactggtt 240 ccttctctca gaaacttatt tctgggcctg ccaggggccg ccctttttca tggcacaagt 300 tgggttccca gggttcagta ttcttttaaa tagttttctg gagatcctcc atttgggtat 360 tttttcctgc tttcaggttt ggagatggtt atacaatagt tgtacgaata gcagggtcca 420 acccggacct gaagcctgtc caggatttct ttggacttgc atttcctgga agtgttctaa 480 aagagaaaca ccggaacatg ctacaatacc agcttccatc ttcattatct tctctggcca 540 ggatattcag catcctctcc cagagcaaaa agcgactcca catagaagac tactctgttt 600 ctcagacaac acttgaccaa gtaagctttg agtgtcaaaa cagatttact tctcagggtg 660 tggattcctg ccccgacact cccgcccata ggtccaagag cagtttgtat cttgaattgg 720 tgcttgaatt c 731 <210> 14 <211> 3501 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 gaattcttca acagggaaaa cagctagctt gaaaacttgc tgaaaaacac aacttgtgtt 60 tatggcattt agtaccttca aataattggc tttgcagata ttggataccc cattaaatct
120 gacagtctca aatttttcat ctcttcaatc actagtcaag aaaaatataa aaacaacaaa
180

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1920 atcataaaag agaactgagg ggactacttg aaaataaaag gttgttttgt attttcatgt
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2040 taatgattat gaagçtgcac tgagatttct gaaaatgctc tgtagctgag cttatttaat
2100 aaatgttcac ttggtatagg ggaagctaca aaggcagcct tcagtgtcct tttgtttatt
2160 caaccaaaaa tataaggaca caatgtagca gttatactgg gaaggtgctg ggggtggtgg
2220

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acacctgccc tatgaggtaa aaagtaccat tttacatatg agtaaattac agctcagtgg 3300 ataagaaact cgtccaaagg tacaggttca gtcaagtggc agagggttct ttttgttgaa 3360 gttaggtatc agttaaaatt gaccttgtaa aatcacatca gcatcaatat acattaattt 3420 aacaaatatt tattgaactt tactgtatgc cagatacttc tctaggtact agggggtaca 3480 atgtagaaga aaatagaatt c 3501 <210> 15 <211> 151 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 atgctgttgg acagcaggga caatgaccac ttttgggaac agcagttgga tggcttagat 60 tggacagccc aagacatcgt ggcgtttttg gccaagcacc cagaggatgt ccagtccagt 120 aatggttctg tgtacacctg gagagaagct t 151 <210> 16 <211> 206 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 tgtgtcaacc tgaacaagct agaacccata gcaacagaag tctggctcat caacaagtcc 60 atggagctgc tggatgagag gaagttctgg gctggtattg tgttcactgg aattactcca 120

ggcagcattg agctgcccca tcatgtcaag tacaagatcc gaatggacat tgacaatgtg 180 gagaggacaa ataaaatcaa ggatgg 206 <210> 17 <211> 177 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 gtactgggac cctggtcctc gagctgaccc ctttgaggac atgcggtacg tctggggggg 60 cttcgcctac ttgcaggatg tggtggagca ggcaatcatc agggtgctga cgggcaccga 120 gaagaaaact ggtgtctata tgcaacagat gccctatccc tgttacgttg atgacat 177 <210> 18 <211> 223 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 ctttctgcgg gtgatgagcc ggtcaatgcc cctcttcatg acgctggcct ggatttactc 60 agtggctgtg atcatcaagg gcatcgtgta tgagaaggag gcacggctga aagagaccat
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223 <210> 19

<211> 222 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 19 ttaggaaacc tgctgcccta cagtgatccc agcgtggtgt ttgtcttcct gtccgtgttt 60 gctgtggtga caatcctgca gtgcttcctg attagcacac tcttctccag agccaacctg 120 gcagcagcct gtgggggcat catctacttc acgctgtacc tgccctacgt cctgtgtgtg 180 gcatggcagg actacgtggg cttcacactc aagatcttcg ct 222 <210> 20 <211> 205 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 agcctgctgt ctcctgtggc ttttgggttt ggctgtgagt actttgccct ttttgaggag 60 cagggcattg gagtgcagtg ggacaacctg tttgagagtc ctgtggagga agatggcttc
120 aatctcacca cttcggtctc catgatgctg tttgacacct tcctctatgg ggtgatgacc
180 tggtacattg aggctgtctt tccag
205 <210> 21 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21

gccagtacgg aattc 15 <210> 22 <211> 105 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 gaattcccag gccctggtat tttncttgca ccaagtccta ctggtttggc gaggaaagtg 60 atgagaagag ccaccctggt tccaaccaga agagaatatc agaaa 105 <210> 23 <211> 132 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 gtcaatcctg accgggttgt tccccccgac ctcgggcacc gcctacatcc tgggaaaaga 60 cattcgctct gagatgagca ccatccggca gaacctgggg gtctgtcccc agcataacgt 120 gctgtttgac at 132 <210> 24 <211> 143 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 gctgactgtc gaagaacaca tctggttcta tgcccgcttg aaagggctct ctgagaagca 60

cgtgaaggcg gagatggagc agatggccct ggatgttggt ttgccatcaa gcaagctgaa 120 aagcaaaaca agccagctgt cag 143 <210> 25 <211> 138 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 gtggaatgca gagaaagcta tctgtggcct tggcctttgt cgggggatct aaggttgtca 60 ttctggatga acccacagct ggtgtggacc cttactcccg caggggaata tgggagctgc 120 tgctgaaata ccgacaag 138 <210> 26 <211> 221 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 26 gccgcaccat tattctctct acacaccaca tggatgaagc ggacgtcctg ggggacagga 60 ttgccatcat ctcccatggg aagctgtgct gtgtgggctc ctccctgttt ctgaagaacc
120 agctgggaac aggctactac ctgaccttgg tcaagaaaga tgtggaatcc tccctcagtt
180 cctgcagaaa cagtagtagc actgtgtcat acctgaaaaa g
221 <210> 27

<211> 73 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 gaggacagtg tttctcagag cagttctgat gctggcctgg gcagcgacca tgagagtgac 60 acgctgacca tcg 73 <210> 28 <211> 203 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 atgtctctgc tatctccaac ctcatcagga agcatgtgtc tgaagcccgg ctggtggaag 60 acatagggca tgagctgacc tatgtgctgc catatgaagc tgctaaggag ggagcctttg 120 tggaactctt tcatgagatt gatgaccggc tctcagacct gggcatttct agttatggca
180 tctcagagac gaccctggaa gaa 203 <210> 29 <211> 49 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 atattcctca aggtggccga agagagtggg gtggatgctg agacctcag 49 <210> 30 <211> 114

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 30 atggtacctt gccagcaaga cgaaacaggc gggccttcgg ggacaagcag agctgtcttc 60 gcccgttcac tgaagatgat gctgctgatc caaatgattc tgacatagac ccag 114 <210> 31 <211> 149 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 aatccagaga gacagacttg ctcagtggga tggatggcaa agggtcctac caggtgaaag 60 gctggaaact tacacagcaa cagtttgtgg cccttttgtg gaagagactg ctaattgcca 120 gacggagtcg gaaaggattt tttgctcag 149 <210> 32 <211> 125 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc 60 tttggcaagt accccagcct ggaacttcag ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt
120 gtcag
125

<210> 33 <211> 99 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 caatgatgct cctgaggaca cgggaaccct ggaactctta aacgccctca ccaaagaccc 60 tggcttcggg acccgctgta tggaaggaaa cccaatccc 99 <210> 34 <211> 189 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 agacacgccc tgccaggcag gggaggaaga gtggacactg ccccagttcc ccagaccatc 60 atggacctct tccagaatgg gaactggaca atgcagaacc cttcacctgc atgccagtgt 120 agcagcgaca aaatcaagaa gatgctgcct gtgtgtcccc caggggcagg ggggctgcct 180 cctccacaa 189 <210> 35 <211> 95 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 agaaaacaaa acactgcaga tatccttcag gacctgacag gaagaaacat ttcggattat 60 ctggtgaaga cgtatgtgca gatcatagcc aaaag 95

<210> 36 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 cttaaagaac aagatctggg tgaatgagtt tag 33 <210> 37 <211> 107 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 gtatggcggc ttttccctgg gtgtcagtaa tactcaagca cttcctccga gtcaagaagt 60 taatgatgcc atcaaacaaa tgaagaaaca cctaaagctg gccaag 107 <210> 38 <211> 75 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 gacagttctg cagatcgatt tctcaacagc ttgggaagat ttatgacagg actggacacc 60 aaaaataatg tcaag 75 <210> 39 <211> 170 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 39

gtgtggttca ataacaaggg ctggcatgca atcagctctt tcctgaatgt catcaacaat 60 gccattctcc gggccaacct gcaaaaggga gagaacccta gccattatgg aattactgct 120 ttcaatcatc ccctgaatct caccaagcag cagctctcag aggtggctct 170 <210> 40 <211> 178 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 40 gatgaccaca tcagtggatg tccttgtgtc catctgtgtc atctttgcaa tgtccttcgt 60 cccagccagc tttgtcgtat tcctgatcca ggagcgggtc agcaaagcaa aacacctgca
120 gttcatcagt ggagtgaagc ctgtcatcta ctggctctct aattttgtct gggatatg
178 <210> 41 <211> 116 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 41 tgcaattacg ttgtccctgc cacactggtc attatcatct tcatctgctt ccagcagaag 60 tcctatgtgt cctccaccaa tctgcctgtg ctagcccttc tacttttgct gtatgg
116 <210> 42 <211> 145 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 42 gtggtcaatc acacctctca tgtacccagc ctcctttgtg ttcaagatcc ccagcacagc 60 ctatgtggtg ctcaccagcg tgaacctctt cattggcatt aatggcagcg tggccacctt 120 tgtgctggag ctgttcaccg acaat 145 <210> 43 <211> 130 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 43 gggagaatcg ctttgtgtca ccattatctt gggacttggt gggacgaaac ctcttcgcca 60 tggccgtgga aggggtggtg ttcttcctca ttactgttct gatccagtac agattcttca 120 tcaggcccag 130 <210> 44 <211> 121 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 44 acctgtaaat gcaaagctat ctcctctgaa tgatgaagat gaagatgtga ggcgggaaag 60 acagagaatt cttgatggtg gaggccagaa tgacatctta gaaatcaagg agttgacgaa
120 g
121

<210> 45 <211> 63 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 atatatagaa ggaagcggaa gcctgctgtt gacaggattt gcgtgggcat tcctcctggt 60 gag 63 <210> 46 <211> 244 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 gtttggagat ggttatacaa tagttgtacg aatagcaggg tccaacccgg acctgaagcc 60 tgtccaggat ttctttggac ttgcatttcc tggaagtgtt ctaaaagaga aacaccggaa 120 catgctacaa taccagcttc catcttcatt atcttctctg gccaggatat tcagcatcct
180 ctcccagagc aaaaagcgac tccacataga agactactct gtttctcaga caacacttga
240 ccaa
244 <210> 47 <211> 1237 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 47 gaattcttca acagggaaaa cagctagctt gaaaacttgc tgaaaaacac aacttgtgtt 60

tatggcattt agtaccttca aataattggc tttgcagata ttggataccc cattaaatct 120 gacagtctca aatttttcat ctcttcaatc actagtcaag aaaaatataa aaacaacaaa 180 tacttccata tggagcattt ttcagagttt tctaacccag tcttattttt ctagtcagta 240 aacatttgta aaaatactgt ttcactaata cttactgtta actgtcttga gagaaaagaa 300 aaatatgaga gaactattgt ttggggaagt tcaagtgatc tttcaatatc attactaact 360 tcttccactt tttccaaaat ttgaatatta acgctaaagg tgtaagactt cagatttcaa 420 attaatcttt ctatattttt taaatttaca gaatattata taacccactg ctgaaaaaga 480 aaaaaatgat tgttttagaa gttaaagtca atattgattt taaatataag taatgaaggc 540 atatttccaa taactagtga tatggcatcg ttgcatttta cagtatcttc aaaaatacag 600 aatttataga ataatttctc ctcatttaat atttttcaaa atcaaagtta tggtttcctc 660 attttactaa aatcgtattc taattcttca ttatagtaaa tctatgagca actccttact 720 tcggttcctc tgatttcaag gccatatttt aaaaaatcaa aaggcactgt gaactatttt 780 gaagaaaaca caacatttta atacagattg aaaggacctc ttctgaagct agaaacaatc 840 tatagttata catcttcatt aatactgtgt taccttttaa aatagtaatt ttttacattt
900 tcctgtgtaa acctaattgt ggtagaaatt tttaccaact ctatactcaa tcaagcaaaa
960 tttctgtata ttccctgtgg aatgtaccta tgtgagtttc agaaattctc aaaatacgtg
1020 ttcaaaaatt tctgcttttg catctttggg acacctcaga aaacttatta acaactgtga
1080

atatgagaaa tacagaagaa aataataagc cctctataca taaatgccca gcacaattca 1140 ttgttaaaaa acaaccaaac ctcacactac tgtatttcat tatctgtact gaaagcaaat 1200 gctttgtgac tattaaatgt tgcacatcat tcattca 1237 <210> 48 <211> 3002 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 48 acatggcaat ggcattcatt aggaatctag ctgggaaaat ccagtgtgta tgcttggaaa 60 tgagggatct ggggctggag agaaaggcat gggcatgcct tggagggact tgtgtgtcaa 120 gctgaggacc tttactttaa gctctagggg accaggcaag gggagatgta gatacgttac 180 tctgatgggg tggatgaatt gaagaaggat gaggcaagaa tgaaggcaga gaccagggag 240 gaggctctcc aagtggccaa ggcataaagc aagaaatgag gcctggtgac tgcttagtgg 300 cagagcagtg aaagagaggg aggcatcaaa gtgagtctcg atttctagct gggtgggtgg
360 tagcgatgtc cagtaggcca gtggctactg aggtctgcag tggaggaggg tggttgggct
420 ggagacagat gatgagggag tcatcagcct gtgggtggaa gaaaagggaa cctcttccaa
480 ctgttttctt tgcttcttcc ctctctttct cttttttttt ttttttggac agagtcttgc
540 tctgtcaccc aggctgaaat gcagtggcat gatcttggct caccacagcc tccgcctcct
600 gggttcaagc aattctcctg tctcagcctc cagagtagct gggattacag gcacatatca
660

ctgtgcccgg ctaatttttg tattttcagt ggagatggga tttcaccatg ttggtcgggc 720 tggaatgaac tcctgacctc aagtgatcca cctgcctcag cctcccaaag tgttgggatt 780 acaggcattg agccaccgcg cccggccttt cttccctctc ttaaagagtg tttatttaat 840 tccacaaaca tgagcttgtc accccctgta gcctggcatc tcctacacga ggtgatggct 900 gaggcttctg cttctgctgg ggtagctctg atctttctgc tttctctggc actgtctacc 960 catgttgcct caccccacag gtcccagggc acctctctcg ggcaagtctt ggaaccctct 1020 gacactgatt tgctctcttt tctgagctgc ttttagccac ccatcctcgg gacctgtttt 1080 ctctctgcct ccacccctgc gggcagtctt aggtctcctg cccctcacga gcaccccaga 1140 gaggccacgt gctcagtgat ctcagtgggc gcatctttct agtcttgcta ttctttttgg 1200 ccatgttgtt cagaaaccat actgggcagg gccgacttca ccctaaaggc tgcgtctctt 1260 cactctgctt ttgtttgttc caaataaagt ggcttcagaa ttgctaaccc tagcctctgt 1320 gaacttgtga ggtacaattt tgtgtctgtt atgttaacaa aaatacatac ataccttcct
1380 ggtgatggta taaattgcta ttctctattg gaaagcaatt tggaatgaaa atttaaagaa
1440 ccattttaaa atatgctatc ctgcgtacct ccattccacc cacccccagg gatgtagcct
1500 actgaaataa ttttaaagaa gtcaccatat gagagaaaat gttattgcta tattgttatt
1560 gtgagaaatt ggaaatagac taaatgttca gcactatagg aataattaat gaaattacat
1620 atactctata caatcattat gctgccattg aaataataaa tacaaaggcg caagggggga
1680

aaagcttata atgttagtga aactaagact gattttttta taaagcagca gttttcagac 1740 ccttggagac tccaattcgg tagaaccaga gcttcatctt ctctgtcgaa gctgtgacag 1800 gagttgcaaa tgcctctcct ttttgctgag tttgcagctg ctgtttttcc ggcagcacat 1860 ctgtgcaggc ctctgcctcg gcccctctgg atctgctgat tgagcagcgg attgatctgt 1920 ccttctcttt cgtgttgacc catgtgagga accaactggc aagggaacaa gaaatggaaa 1980 taggcctcct ttgcatcatg acctgtacat cctgcaattg gaaaagattg tactttagft 2040 ggtttaacca gcagcattat ttttctaaac taagcagtaa gaaggaatta ggttttatgt 2100 gggatcaaca gactgggtct caaaagagga aggtgataga acacagtggg gagggggagg 2160 tgcactagaa acagagggcc tatgctttca ttctggcttt gctacttaat agctgtgtga 2220 cccaatctta gagacttaac ctctctgaac ttccattttc tcatgtataa aatgggaaat 2280 attaaaggat actcactggg ctggtggctt gtgcctgtaa tcccagcact tggggaggtt 2340 gaggtgggag gatcacttga gcccaggtgt tcaagaccag cccaggcaac atggcaagac 2400 tctgtctcta tgaaaaaatt aaaaattagc caggtgtggt ggtgtgcacc tgtagtctta 2460 gctacttggt aggctgagat gggaggatca cttgggcttg ggaggtcaag gctgcggtga 2520 gctgtgattc catcactgca ctccagcccg ggcggcagag cgagacactg aatccaaacg 2580 acaacaacaa caaaaggcaa aaaaataaaa gtgccctctt tatggagttg tgtaaggtga
2640 agcatataca ctattcaaca tagtaactat ataaaggaag tattgttgtt gttactgtag
2700

ttaataccat taagtgagat gtttcgtata gtggaaagca catggactct gaattcagac 2760 tggtctgact ttgagtctca gctccacatc tagtaatact atgaccaagc cctggttaaa 2820 atcatgtttt tttttcttca gccttagtct tctcacatat aaaataggga cactgtcatt 2880 tacctcagtt ttctgtgagg ataaaacaac gacagtgtat atgcaagtat tttgtaaatt 2940 ttgtagtgct cctcaagatt tagttggtgt ttactacttg tactttctca ctggaatggc 3000 ag 3002 <210> 49 <211> 397 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 aattcgggtc caattaaatt tttgaaattt tatattaaaa attatattag tagggatggg 60 taagaggtgt tttggtctgg ttggttggtt agttgctatg actcagaatt gctaagaaaa
120 cagaaaagta agataagatc attgttttaa cctcttttcc tccacaaaat caataaataa
180 catatcccta aattactctt agaatttctc ttaaattgca gtgaaaaacc aaaatccttc
240 attcttggtt gaaggttgga aaactacgtt agagaggatt agagagagag gatgagcaat
300 cgtgtagtca gcccttgcct cctagtgtag gatttgtctc agccactgct tgttgtcctg
360 gctgccaacg ttctcatgaa ggctgttctt ctatcag
397

<210> 50 <211> 520 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 50 gtaagtggaa tcccatcaca ccagcctggt cttggggagg tccagagcac ctattatatt 60 aggacaagag gtactttatt ttaactaaaa atttggtaga aatttcaaca acaacaaaaa 120 aactcaactt ggtgtcatga ttttggtgaa attggtacat gacttgctgg aaggtttttc 180 ataggtcata aaataacagt atcttttgat ttagcatttc tactcaaggg aattaattcc 240 aggaattttg gtggcaggca cctgtaatcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat 300 tgcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagctaagat cgcatcattg cactcccgcc 360 tgggcaataa gagtgaaact ccatctcaaa aaaaaaaaaa gatacaaaaa tagaaaaagg 420 ggcttggtaa gggtagtagg gttttgggca attttttttt tttttttttt ttattgtatg
480 gttctaaagg aatggttgat tacctgtggt ttggttttag 520 <210> 51 <211> 1786 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 51 gtaagttacc tgcaagccac tgtttttaac cagtttatac tgtgccagat gggggtgtat 60 atatgtgtgt gcatgtgcat gcatgtgtga atgatctgga aataagatgc cagatgtaag
120

ttgtcaacag ttgcagccac atgacagaca tagatatatg tgcacacact agtaaacctc 180 tttccttctc atccatggtt gccactttta tctttttatt tttatttttt tttttgagat 240 ggagtctcgc tctgacgccc aggctggagt gcagtggctc gatctcggct cactgcaacc 300 tttgcctccc gggttcaagc tattctcctg cctcagcctc cacagtagct gggactacag 360 gctcatgctg ccacgcccgg ctgacttttt gtattttagt agagacgagg tttcaccatg 420 ttacccaggc tagacttcaa ctcctgagct caggcaatcc accctccttg gcctccca a 480 gtgctgggat tacaggtgtg agccactgca cccagcccac cactttaatt ttttacactc 540 tacccttttg gtcaaaattt gctcaatctg caagcttaaa atgtgtcatg acaaacacat 600 gcaagcacat actcacacat agatgcagaa acagcgtcta aacttataaa agcacagttt 660 atgtaaatgt gtgcacttct tctccctagg tggtaaacca catttcaaaa caacccaaat 720 aaaactgaac aaagcttctt cctcttagac tttttagaaa atctttcagt gctgagtcac 780 taagctgcca agttctcatt gtgggaacta tgcctttgga tgtaatgatt tcttctaaga 840 caatgggcgg aggtgtagtt attgcagaca tctgaaatat gtaatgtttc ttccagattc 900 tggaaattct cttattctct gtggttggtg gtggtggtgg gatgtgtgtg tgtgtgtgtg
960 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tagggatcag gatgcgggag gagctgggtt ctgcttgtat
1020 tggttctctg ttttgcattg aatagtgtgt ttccttgtat ggctatctat agcttttcaa
1080 ggtcaccaga aattatcctg tttttcacct tctaaacaat tagctggaat ttttcaaagg
1140

aagactttta caaagacccc taagctaagg tttactctag aaaggatgtc ttaagacagg 1200 gcacaggagt tcagaggcat taagagctgg tgcctgttgt catgtagtga gtatgtgcct 1260 acatggtaaa gctttgacgt gaacctcaag ttcagggtcc aaaatctgtg tgccttttta 1320 ctttgcacat ctgcattttc tattctagct tggaatctga aacattgaca agagctgcct 1380 gaaatgtatg tctgtggtgt gattagagtt acgataagca agtcaatagt gagatgacct 1440 tggagatgtt gaacttttgt gagagaatga gttgtttttt tgttttggtt tttagtactt 1500 taacataatc tacctttagt ttaagtatcg ctcacagtta cctagttact gaagcaagcc 1560 cccaaagaaa tttggtttgg caacactttg ttagcctcgt ttttctctct acattgcatt 1620 gctcgtgaag cattggatca tacgtacatt tcagagtcta gagggcctgt ccttctgtgg 1680 cccagatgtg gtgctccctc tagcatgcag gctcagaggc cttggcccat caccctggct
1740 cacgtgtgtc tttctttctc cccttgtcct tccttggggc ctccag
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120 tttcctgcaa tttcatccat ttatagttgg ggaaagtgag gcccagagag gggcagtgac
180

ttgcccaagg tcaacccagc cgggtagcag ctaagtagga tgagagtgca gggttcatgc 240 tttccagata accacatgct caactgtgcc atgctgtctc attggtagtg gttcatggca 300 gcatctgaaa gctatttatt ttcttagata tattgggtgg cgattcttcc taagtttcta 360 agaacaataa tcagaaggat atatattgtt gcaggttaga ctgtctggaa gcagaggctg 420 aaatagagtt tgatgtatgg gtatttatga gggctcaata cctatgaaga gatatggaag 480 atgcaggatt gggcagaggg aggagttgaa ctgtgatata gggccaaccc cgtggggc c 540 tctanagaat atgcagcttg ttggagttgt tnttcatcga gctgaaacat ccagcccttt 600 gtgctccccc aaggcctccc tcctgacacc acctacctca gccctctcaa tcaatcactg 660 gatgtgggct gccctgggaa ggtcgtgccc cagggcctac atggctctct gctgctgtga 720 caaacccaga gttgctgatg cctgaggccg tctactgaca gctgggcaac aaggcttccc 780 tgaatgggga ctctgggcag tgcagttttg tgtctgaacc atacattaat atatttatat 840 ccgaattttc tttctctgca agcatttcat ataaagacac atcaggtaaa aataaatgtt 900 tttgaagcaa aaggagtaca aagagataag aactaactaa tttaatacta gttaccatct 960 gttacaaata gttcctactg attgccaagg actgtttaaa cacatcacat gggcttcttc
1020 ttctatcctc actaaccctt ttaacagaca aggaaatgag gctcaggaag gtcaaggact
1080 ttattgaggt tccacagtag gatacagttc ttgctaaaag caacccctcc ctcatgctct
1140 gttatctaac tgcaagggga aggtcagtgg cagaggtagt ggtcccatgg ttggtgcata
1200

agagctgctc tgagacaact gcatgctggt gggtcctgca gacatgtacc catcagccgg 1260 agataggctc aaaatatcca caagagtttg gatgattgtg ggaatgcaga atccatggtg 1320 atcaagaggg aaagtcaagt tgcctggcca ttttccttgg cttttagaca gaaaagttac 1380 gtgggatatt atctcccaca gctcttctgt ggtgccacca gtcatagtcc ttatataagg 1440 agaaaccagt tgaaattacc tattgaagaa acaaagagca aactcgccca ctgaaatgcg 1500 tagaaagccc tggactctgt tgtattcata actctgccat tatttttctg cgtagttttg 1560 ggtaagtcac ttatcttctt taggatggta atgatcagtt gcctcatcag aaagatgaac 1620 agcattacgc ctctgcattg tctctaacat gagtaggaat aaaccctgtc ttttttctgt 1680 agatcataca agtgagtgct tgggattgtt gaggcagcac atttgatgtg tctcttcctt
1740 cccag
1745 <210> 53 <211> 1060 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 53 gtgagtacct ctggcctttc ttcagtggct gtaggcattt gaccttcctt tggagtccct 60 gaataaaagc agcaagttga gaacagaaga tgattgtctt ttccaatggg acatgaacct
120 tagctctaga ttctaagctc tttaagggta agggcaagca ttgtgtttta ttaaattgtt
180 tacctttagt cttctcagtg aatcctggtt gaattgaatt gaatggaatt tttccgagag
240

ccagactgca tcttgaactg ggctggggat aaatggcatt gaggaatggc ttcaggcaac 300 agatgccatc tctgcccttt atctcccagc tctgttggct atgttaagct catgacaaag 360 ccaaggccac aaatagaact gaaaactctt gatgtcagag atgacctctc ttgtcttcct 420 tgtgtccagt atggtgtttt gcttgagtaa tgttttctga actaagcaca actgaggagc 480 aggtgcctca tcccacaaat tcctgacttg gacacttcct tccctcgtac agagcagggg 540 gatatcttgg agagtgtgtg agcccctaca agtgcaagtt gtcagatgtc cccaggtcac 600 ttatcaggaa agctaagagt gactcatagg atgctcctgt tgcctcagtc tgggcttcat 660 aggcatcagc agccccaaac aggcacctct gatcctgagc catccttggc tgagcaggga 720 gcctcagaag actgtgggta tgcgcatgtg tgtgggggaa caggattgct gagccttggg 780 gcatctttgg aaacataaag ttttaaaagt tttatgcttc actgtatatg catttctgaa 840 atgtttgtat ataatgagtg gttacaaatg gaatcatttt atatgttact tggtagccca
900 ccactcccct aaagggactc tataggtaaa tactacttct gcaccttatg attgatccat
960 tttgcaaatt caaatttctc caggtataat ttacactaga agagatagaa aaatgagact
1020 gaccaggaaa tggataggtg actttgcctg tttctcacag
1060 <210> 54 <211> 1104 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 54 gtacactgct ttgggcatct gtttggaaaa tatgacttct agctgatgtc ctttctttgt 60 gctagaatct ctgcagtgca tgggcttccc tgggaagtgg tttgggctat agatctatag 120 taaacagata gtccaaggac aggcagctga tgctgaaagt acaattgtca ctacttgtac 180 agcacttgtt tcttgaaaac tgtgtgccag gcagcatgca aaatgtttta tacacattgc 240 ttcatttaat tctcacaagg ctactctgaa gtagttacta taataaccag caattttcaa 300 atgagagaac tgtgactcaa agacgttaag taaccagctt tggtcacaca actgttaa t 360 gttggtacgt ggaggtgaat ccacttcggt tacactgggt caataagccc aggcgaatcc 420 tcccaatgct cacccaattc tgtatttctg tgtcctcaga gggggtacaa ctaggagagg 480 ttctgtttcc tgagtacagg ttgttaataa ttaaatatac tagctctaag gcctgcctgt 540 gatttaatta gcattcaata aaaattcatg ttgaattttt ctttagtact tctttcttaa 600 tataatacat cttcttgacc aagtccaaga ggaacctgcg ttggacagtt ttcatatgag 660 atcaaattct gagagagcaa gatttaaccc tttttggttc accttctgat cctcccctaa 720 ggaggtatac atgaaatatt tattactcct gcctgaactt ctttcattga atatgcaatt 780 ttgcagcatg cagattctgg atttaaattc tgagtcttaa cttactggct gagggacctt
840 ggataggctc cttatccctc agtttcctca tctctaaaat ggggatggca cctgccccgt
900 gggttgttgg aaggacttac agaggtgcag aatgtacgtt gtacatagca ggtttcagca
960 aatgttagct ccctctttcc ccacatccat tcaaatctgt tccttctcca aaggatgtgt
1020

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360 catggtgacc tgtgtatcag cctgtgtggg ctgagaccaa gtggctacca cagagctcag
420 cctatgcttc ataatgtaat cattacccag atccctaatc ctctcttggc tcttaactgc
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540 ggcttcctaa atatttaata ggtccctttt ctgccagtct cttctgtgcc catcccctga
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660 atcttctcct acctcctctt tacacctagc tcctgtttca gtcacctaga aatgctcaca
720

gtcgctggaa tatgtcatgt tcttccacac ctccatgcct ttgtaggtac tgtttgctct 780 cacaggagaa ctttctctct aacttgccta tcttctcaac tcctcctttc tctccaagat 840 ctagttccgg atcccctccc ctgagcatcc ctccttggtt ctcaggtagt cagtcactct 900 ctgccctgaa cttccatggc acgtgaaaga aaatcttttt attttaaaac aattacagac 960 tcacaagaag taatacaaat tacatgaggg ggttccctta aacctttcat ccagtttccc 1020 caatggtagc agcatgtgta actgtagaat agtatcaaaa ccatgaaatt gacataggta 1080 caattcacaa accttcttca gatttcacta gctttatgtg cgctcatttg tgtgtgtgtg 1140 tgcgtattta gttctatgca attttatcat gtgtgaattc 1180 <210> 56 <211> 903 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 56 gatccctggg ccaagggaag gagcacatga ggagttgccg aatgtgaaca tgttatctaa 60 tcatgagtgt ctttccacgt gctagtttgc tagatgttat ttcttcagcc taaaacaagc
120 tggggcctca gatgaccttt cccatgtagt tcacagaatt ctgcagtggt cttggaacct
180 gcagccacga aaagatagat tacatatgtt ggagggagtt ggtaattccc aggaactctg
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300 tgccttccct gcgacctcaa ggaccttaca gtgggtagta tcaggagggg tcaggggctg
360

taaagcacca gcgttagcct cagtggcttc cagcacgatt cctcaaccat tctaaccatt 420 ccaaagggta tatctttggg gggtgacatt cttttcctgt tttcttttta atcttttttt 480 aaaacataga attaatatat tatgagcttt tcagaagatttttaaaaggc agtcagaaat 540 cctactacct aacacaaaaa ttgtttttat ctttgaataa tatgttcttg tttgtccatt 600 ttccatgcat gcgatgttag gcatacaaaa tacatttttt aaagaatact ttcattgcaa 660 attggaaact tcgtttaaaa aatgctcata ctaaaattgg catttctaac ccataggccc 720 acttgtagtt atttaccgaa gcaaaaggac agctttgctt tgtgtgggtc tggtagggtt 780 cattagaaag gaatgggggc ggtgggaggg ttggtgttct gttctctctg cagactgaat 840 ggagcatcta gagttaaggg taggtcaacc ctgacttctg tacttctaaa tttttgtcct 900 cag 903 <210> 57 <211> 486 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 57 gtgagtacca gcagcacgtt aagaataggc cttttctgga tgtgtgtgtg tcatgccatc 60 atgggaggag tgggacttaa gcattttact ttgctgngtt tttgtttttt ctttttttct
120 tttttatttt tttgagatgg agtctcgctc tgtagccagg ctggactgta gtggcgcgat
180 ctcggctcac tgcaaccttg gcctcccagg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcccg
240

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120 tctaccttga atcttgaaga ttatttttca gaaattgata aagttatttt aaaaagcacg
180 gggagagaaa aatatgccca ttctcatctg ttctgggcca ggggacactg tattctgggg
240 tatccagtag ggcccagagc ttgacctgcc tccctgtccc cag
283 <210> 59 <211> 203 <212> ADN' <213> Homo sapiens <400> 59

gtgcggccca gagctacctt ccctatccct ctcccctcct cctccggcta cacacatgcg 60 gaggaaaatc agcactgccc cagggtccca ggctgggtgc ggttggtaac agaaacttgt 120 ccctggctgt gcccctaggt cctctgcctt cactcactgt ctggggctgg tcctggagtt 180 tgtcttgctc tgtttttttg tag 203 <210> 60 <211> 702 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 60 gtgcctgatg tgtatttatt ctgagtaaat ggactgagag agagcggggg gcttttgaga 60 agtgtggctg tatctcatgg ctaggcttct gtgaagccat gggatactct tctgttatca
120 cagaagagat aaagggcatt gagactgaga ttcctgagag gagatgctgt gtctttattc
180 atctttttgt ccccaacatg gtgcactaaa tttatggtta gttgaaaggg tggatgctta
240 aatgaatgga agcggagagg ggcaggaaga cgattgggct ctctggttag agatctgatg
300 tggtacagta tgaggagcac aggcaggctt ggagccaact ctggctggcc ctgagacatt
360 gggaaagtca caacttgcct caccttcttt gccgataata atagtggtgc ttacctcata
420 gaggattaaa ttaaatgaga atgcacacaa accacctagc acaatgcctg gcatatagca
480 agttcccaaa taaaatgcta ctgttcttac ctctgtgagg atgtggtacc tatatataca
540 aagctttgcc attctagggg tcatagccat acagggtgaa aggtggcttc caggtctctt
600

ccagtgctta cccctgctaa tatctctcta gtccctgtca ctgtgacaaa tcagaactga 660 gaggcctcac ctgtcccaca tccttgtgtt tgtgcctggc ag 702 <210> 61 <211> 1258 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 61 gtgagctgca gtcttggtgc tgggctggtg ttgggtctgg gcagccagga cttgctggct 60 gtgaatgatt tctccatctc cacccctttt gccatgttga aaccaccatc tccctgctct 120 gttgcccctt tgaaatcata tcatacttaa ggcatggaaa gctaaggggc cctctgctcc
180 cattgtgcta gttctgttga atcccgtttt ccttttccta tgaggcacag agagtgatgg 240 agaaggtcct tagaggacat tattatgtca aagaaaagag acttgtcaag aggtaagagc
300 cttggctaca aatgacctgg tgttcctgct cattactttt caatctcatt gaccttaact
360 tttaaactat aaaacagcca atatttatta ggcactgatt tcatgccaga gacactctgg
420 gcatgaaaga aagtaatgat aatagttaat tttatatagc gttgttacca tttacaacct
480 tttttttttt tttaacctct atcatctcaa ttaaagtgca gagagaccct gggaagaagg
540 taactatatt tattatccca gatgagggaa gtgaggcttg tagggaattg gtagctgatt
600 caaggtcacc cagcaggtaa ataacagtgg tgggaccaga cccaattacc aggtatgttt
660 tcctctgtac cgcagtacat gcctgagatt tatttgtgtg ttgaagccag tggtacctaa
720

taagtaaaaa aaaaaaaaaa aaacccactt agcttcagtt ttcaagtgtt tactgtgttg 1980 tcatgcactt catttaattc tcaacacctg ccctatgagg taaaaagtac cattttacat 2040 atgagtaaat tacagctcag tggataagaa actcgtccaa aggtacaggt tcagtcaagt 2100 ggcagagggt tctttttgtt gaagttaggt atcagttaaa attgaccttg taaaatcaca 2160 tcagcatcaa tatacattaa tttaacaaat atttattgaa ctttactgta tgccagatac 2220 ttctctaggt actagggggt acaatgtaga agaaaataga attc 2264 <210> 91 <211> 9497 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 91 caaacatgtc agctgttact ggaagtggcc tggcctctat ttatcttcct gatcctgatc 60 tctgttcggc tgagctaccc accctatgaa caacatgaat gccattttcc aaataaagcc 120 atgccctctg caggaacact tccttgggtt caggggatta tctgtaatgc caacaacccc 180 tgtttccgtt acccgactcc tggggaggct cccggagttg ttggaaactt taacaaatcc 240 attgtggctc gcctgttctc agatgctcgg aggcttcttt tatacagcca gaaagacacc 300 agcatgaagg acatgcgcaa agttctgaga acattacagc agatcaagaa atccagctca 360 aacttgaagc ttcaagattt cctggtggac aatgaaacct tctctgggtt cctgtatcac 420 aacctctctc tcccaaagtc tactgtggac aagatgctga gggctgatgt cattctccac 480 aaggtatttt tgcaaggcta ccagttacat ttgacaagtc tgtgcaatgg atcaaaatca 540 gaagagatga ttcaacttgg tgaccaagaa gtttctgagc tttgtggcct accaagggag 600 aaactggctg cagcagagcg agtacttcgt tccaacatgg acatcctgaa gccaatcctg 660 agaacactaa actctacatc tcccttcccg agcaaggagc tggccgaagc cacaaaaaca 720 ttgctgcata gtcttgggac tctggcccag gagctgttca gcatgagaag ctggagtgac 780 atgcgacagg aggtgatgtt tctgaccaat gtgaacagct ccagctcctc cacccaaatc 840 taccaggctg tgtctcgtat tgtctgcggg catcccgagg gaggggggct gaagatcaag
900 tctctcaact ggtatgagga caacaactac aaagccctct ttggaggcaa tggcactgag
960 gaagatgctg aaaccttcta tgacaactct acaactcctt actgcaatga tttgatgaag
1020 aatttggagt ctagtcctct ttcccgcatt atctggaaag ctctgaagcc gctgctcgtt
1080 gggaagatcc tgtatacacc tgacactcca gccacaaggc aggtcatggc tgaggtgaac
1140 aagaccttcc aggaactggc tgtgttccat gatctggaag gcatgtggga ggaactcagc
1200

cccaagatct ggaccttcat ggagaacagc caagaaatgg accttgtccg gatgctgttg 1260 gacagcaggg acaatgacca cttttgggaa cagcagttgg atggcttaga ttggacagcc 1320 caagacatcg tggcgttttt ggccaagcac ccagaggatg tccagtccag taatggttct 1380 gtgtacacct ggagagaagc tttcaacgag actaaccagg caatccggac catatctcgc 1440 ttcatggagt gtgtcaacct gaacaagcta gaacccatag caacagaagt ctggctcatc 1500 aacaagtcca tggagctgct ggatgagagg aagttctggg ctggtattgt gttcactgga 1560 attactccag gcagcattga gctgccccat catgtcaagt acaagatccg aatggacatt 1620 gacaatgtgg agaggacaaa taaaatcaag gatgggtact gggaccctgg tcctcgagct 1680 gacccctttg aggacatgcg gtacgtctgg gggggcttcg cctacttgca ggatgtggtg 1740 gagcaggcaa tcatcagggt gctgacgggc accgagaaga aaactggtgt ctatatgcaa 1800 cagatgccct atccctgtta cgttgatgac atctttctgc gggtgatgag ccggtcaatg 1860 cccctcttca tgacgctggc ctggatttac tcagtggctg tgatcatcaa gggcatcgtg 1920 tatgagaagg aggcacggct gàaagagacc atgcggatca tgggcctgga caacagcatc 1980 ctctggttta gctggttcat tagtagcctc attcctcttc ttgtgagcgc tggcctgcta 2040 gtggtcatcc tgaagttagg aaacctgctg ccctacagtg atcccagcgt ggtgtttgtc 2100 ttcctgtccg tgtttgctgt ggtgacaatc ctgcagtgct tcctgattag cacactcttc 2160 tccagagcca acctggcagc agcctgtggg ggcatcatct acttcacgct gtacctgccc 2220 tacgtcctgt gtgtggcatg gcaggactac gtgggcttca cactcaagat cttcgctagc 2280 ctgctgtctc ctgtggcttt tgggtttggc tgtgagtact ttgccctttt tgaggagcag 2340 ggcattggag tgcagtggga caacctgttt gagagtcctg tggaggaaga tggcttcaat
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3000

ttgccatcaa gcaagctgaa aagcaaaaca agccagctgt caggtggaat gcagagaaag 3060 ctatctgtgg ccttggcctt tgtcggggga tctaaggttg tcattctgga tgaacccaca 3120 gctggtgtgg acccttactc ccgcagggga atatgggagc tgctgctgaa ataccgacaa 3180 ggccgcacca ttattctctc tacacaccac atggatgaag cggacgtcct gggggacagg 3240 attgccatca tctcccatgg gaagctgtgc tgtgtgggct cctccctgtt tctgaagaac 3300 cagctgggaa caggctacta cctgaccttg gtcaagaaag atgtggaatc ctccctcagt 3360 tcctgcagaa acagtagtag cactgtgtca tacctgaaaa aggaggacag tgtttctcag 3420 agcagttctg atgctggcct gggcagcgac catgagagtg acacgctgac catcgatgtc 3480 tctgctatct ccaacctcat caggaagcat gtgtctgaag cccggctggt ggaagacata 3540 gggcatgagc tgacctatgt gctgccatat gaagctgcta aggagggagc ctttgtggaa 3600 ctctttcatg agattgatga ccggctctca gacctgggca tttctagtta tggcatctca 3660 gagacgaccc tggaagaaat attcctcaag gtggccgaag agagtggggt ggatgctgag 3720 acctcagatg gtaccttgcc agcaagacga aacaggcggg ccttcgggga caagcagagc 3780 tgtcttcgcc cgttcactga agatgatgct gctgatccaa atgattctga catagaccca.

3840 gaatccagag agacagactt gctcagtggg atggatggca aagggtccta ccaggtgaaa 3900 ggctggaaac ttacacagca acagtttgtg gcccttttgt ggaagagact gctaattgcc 3960 agacggagtc ggaaaggatt ttttgctcag attgtcttgc cagctgtgtt tgtctgcatt 4020 gcccttgtgt tcagcctgat cgtgccaccc tttggcaagt accccagcct ggaacttcag
4080 ccctggatgt acaacgaaca gtacacattt gtcagcaatg atgctcctga ggacacggga 4140 accctggaac tcttaaacgc cctcaccaaa gaccctggct tcgggacccg ctgtatggaa
4200 ggaaacccaa tcccagacac gccctgccag gcaggggagg aagagtggac cactgcccca
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4380 gcaggggggc tgcctcctcc acaaagaaaa caaaacactg cagatatcct tcaggacctg
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4560 aatactcaag cacttcctcc gagtcaagaa gttaatgatg ccaccaaaca aatgaagaaa
4620 cacctaaagc tggccaagga cagttctgca gatcgatttc tcaacagctt gggaagattt
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4800

ggagagaacc ctagccatta tggaattact gctttcaatc atcccctgaa tctcaccaag 4860 cagcagctct cagaggtggc tccgatgacc acatcagtgg atgtccttgt gtccatctgt 4920 gtcatctttg caatgtcctt cgtcccagcc agctttgtcg tattcctgat ccaggagcgg 4980 gtcagcaaag caaaacacct gcagttcatc agtggagtga agcctgtcat ctactggctc 5040 tctaattttg tctgggatat gtgcaattac gttgtccctg ccacactggt cattatcatc 5100 ttcatctgct tccagcagaa gtcctatgtg tcctccacca atctgcctgt gctagccctt 5160 ctacttttgc tgtatgggtg gtcaatcaca cctctcatgt acccagcctc ctttgtgttc 5220 aagatcccca gcacagccta tgtggtgctc accagcgtga acctcttcat tggcattaat 5280 ggcagcgtgg ccacctttgt gctggagctg ttcaccgaca ataagctgaa taatatcaat 5340 gatatcctga agtccgtgtt cttgatcttc ccacattttt gcctgggacg agggctcatc 5400 gacatggtga aaaaccaggc aatggctgat gccctggaaa ggtttgggga gaatcgcttt 5460 gtgtcaccat tatcttggga cttggtggga cgaaacctct tcgccatggc cgtggaaggg 5520 gtggtgttct tcctcattac tgttctgatc cagtacagat tcttcatcag gcccagacct 5580 gtaaatgcaa agctatctcc tctgaatgat gaagatgaag atgtgaggcg ggaaagacag 5640 agaattcttg atggtggagg ccagaatgac atcttagaaa tcaaggagtt gacgaagata 5700 tatagaagga agcggaagcc tgctgttgac aggatttgcg tgggcattcc tcctggtgag 5760 tgctttgggc tcctgggagt taatggggct ggaaaatcat caactttcaa gatgttaaca 5820 ggagatacca ctgttaccag aggagatgct ttccttaaca gaaatagtat cttatcaaac 5880 atccatgaag tacatcagaa catgggctac tgccctcagt ttgatgccat cacagagctg 5940 ttgactggga gagaacacgt ggagttcttt gcccttttga gaggagtccc agagaaagaa 6000 gttggcaagg ttggtgagtg ggcgattcgg aaactgggcc tcgtgaagta tggagaaaaa 6060 tatgctggta actatagtgg aggcaacaaa cgcaagctct ctacagccat ggctttgatc 6120 ggcgggcctc ctgtggtgtt tctggatgaa cccaccacag gcatggatcc caaagcccgg 6180 cggttcttgt ggaattgtgc cctaagtgtt gtcaaggagg ggagatcagt agtgcttaca
6240 tctcatagta tggaagaatg tgaagctctt tgcactagga tggcaatcat ggtcaatgga
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6600

gccaaggacc aaagtgatga tgaccactta aaagacctct cattacacaa aaaccagaca 6660 gtagtggacg ttgcagttct cacatctttt ctacaggatg agaaagtgaa agaaagctat 6720 gtatgaagaa tcctgttcat acggggtggc tgaaagtaaa gaggnactag actttccttt 6780 gcaccatgtg aagtgttgtg gagaaaagag ccagaagttg atgtgggaag aagtaaactg 6840 gatactgtac tgatactatt caatgcaatg caattcaatg caatgaaaac aaaattccat 6900 tacaggggca gtgcctttgt agcctatgtc ttgtatggct ctcaagtgaa agacttgaat 6960 ttagtttttt acctatacct atgtgaaact ctattatgga acccaatgga catatgggtt 7020 tgaactcaca cttttttttt ttttttgttc ctgtgtattc tcattggggt tgcaacaata 7080 attcatcaag taatcatggc cagcgattat tgatcaaaat caaaaggtaa tgcacatcct 7140 cattcactaa gccatgccat gcccaggaga ctggtttccc ggtgacacat ccattgctgg 7200 caatgagtgt gccagagtta ttagtgccaa gtttttcaga aagtttgaag caccatggtg 7260 tgtcatgctc acttttgtga aagctgctct gctcagagtc tatcaacatt gaatatcagt 7320 tgacagaatg gtgccatgcg tggctaacat cctgctttga ttccctctga taagctgttc 7380 tggtggcagt aacatgcaac aaaaatgtgg gtgtctctag gcacgggaaa cttggttcca 7440 ttgttatatt gtcctatgct tcgagccatg ggtctacagg gtcatcctta tgagactctt 7500 aaatatactt agatcctggt aagaggcaaa gaatcaacag ccaaactgct ggggctgcaa 7560 gctgctgaag ccagggcatg ggattaaaga gattgtgcgt tcaaacctag ggaagcctgt 7620 gcccatttgt cctgactgtc tgctaacatg gtacactgca tctcaagatg tttatctgac 7680 acaagtgtat tatttctggc tttttgaatt aatctagaaa atgaaaagat ggagttgtat
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8400

agaaaaatat aaaaacaaca aatacttcca tatggagcat ttttcagagt tttctaaccc
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9497 <210> 92 <211> 2617- <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 92 -CAATGAAAA CAAAATTCCA TTACAGGGGC AGTGCCTTTG TAGCCTATGT CTTGTATGGC 60
TCTCAAGTGA AAGACTTGAA TTTAGTTTTT TACCTATACC TATGTGAAAC TCTATTATGG
120
AACCCAATGG ACATATGGGT TTGAACTCAC ACTTTTTTTT TTTTTTTGTT CCTGTGTATT
180
CTCATTGGGG TTGCAACAAT AATTCATCAA GTAATCATGG CCAGCGATTA TTGATCAAAA
240
TCAAAAGGTA ATGCACATCC TCATTCACTA AGCCATGCCA TGCCCAGGAG ACTGGTTTCC
300
CGGTGACACA TCCATTGCTG GCAATGAGTG TGCCAGAGTT ATTAGTGCCA AGTTTTTCAG
360
AAAGTTTGAA GCACCATGGT GTGTCATGCT CACTTTTGTG AAAGCTGCTC TGCTCAGAGT
420

CTATCAACAT TGAATATCAG TTGACAGAAT GGTGCCATGC GTGGCTAACA TCCTGCTTTG 480 ATTCCCTCTG ATAAGCTGTT CTGGTGGCAG TAACATGCAA CAAAAATGTG GGTGTCTCTA 540 GGCACGGGAA ACTTGGTTCC ATTGTTATAT TGTCCTATGC TTCGAGCCAT GGGTCTACAG 600 GGTCATCCTT ATGAGACTCT TAAATATACT TAGATCCTGG TAAGAGGCAA AGAATCAACA 660 GCCAAACTGC TGGGGCTGCA AGCTGCTGAA GCCAGGGCAT GGGATTAAAG AGATTGTGCG 720 TTCAAACCTA GGGAAGCCTG TGCCCATTTG TCCTGACTGT CTGCTAACAT GGTACACTGC 780 ATCTCAAGAT GTTTATCTGA CACAAGTGTA TTATTTCTGG CTTTTTGAAT TAATCTAGAA 840 AATGAAAAGA TGGAGTTGTA TTTTGACAAA AATGTTTGTA CTTTTTAATG TTATTTGGAA 900 TTTTAAGTTC TATCAGTGAC TTCTGAATCC TTAGAATGGC CTCTTTGTAG AACCCTGTGG 960 TATAGAGGAG TATGGCCACT GCCCCACTAT TTTTATTTTC TTATGTAAGT TTGCATATCA 1020 GTCATGACTA GTGCCTAGAA AGCAATGTGA TGGTCAGGAT CTCATGACAT TATATTTGAG 1080 TTTCTTTCAG ATCATTTAGG ATACTCTTAA TCTCACTTCA TCAATCAAAT ATTTTTTGAG
1140 TGTATGCTGT AGCTGAAAGA GTATGTACGT ACGTATAAGA CTAGAGAGAT ATTAAGTCTC
1200 AGTACACTTC CTGTGCCATG TTATTCAGCT CACTGGTTTA CAAATATAGG TTGTCTTGTG
1260 GTTGTAGGAG CCCACTGTAA CAATACTGGG CAGCCTTTTT TTTTTTTTTT AATTGCAACA
1320 ATGCAAAAGC CAAGAAAGTA TAAGGGTCAC AAGTCTAAAC AATGAATTCT TCAACAGGGA
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1440
TCAAATAATT GGCTTTGCAG ATATTGGATA CCCCATTAAA TCTGACAGTC TCAAATTTTT
1500 CATCTCTTCA ATCACTAGTC AAGAAAAATA TAAAAACAAC AAATACTTCC ATATGGAGCA
1560
TTTTTCAGAG TTTTCTAACC CAGTCTTATT TTTCTAGTCA GTAAACATTT GTAAAAATAC
1620
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1680
TGTTTGGGGA AGTTCAAGTG ATCTTTCAAT ATCATTACTA ACTTCTTCCA CTTTTTCCAA
1740
AATTTGAATA TTAACGCTAA AGGTGTAAGA CTTCAGATTT CAAATTAATC TTTCTATATT
1800
TTTTAAATTT ACAGAATATT ATATAACCCA CTGCTGAAAA AGAAAAAAAT GATTGTTTTA
1860
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1920
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1980
CTCCTCATTT AATATTTTTC AAAATCAAAG TTATGGTTTC CTCATTTTAC TAAAATCGTA
2040
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2160
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2220

ATTAATACTG TGTTACCTTT TAAAATAGTA ATTTTTTACA TTTTCCTGTG TAAACCTAAT 2280 TGTGGTAGAA ATTTTTACCA ACTCTATACT CAATCAAGCA AAATTTCTGT ATATTCCCTG 2340 TGGAATGTAC CTATGTGAGT TTCAGAAATT CTCAAAATAC GTGTTCAAAA ATTTCTGCTT 2400 TTGCATCTTT GGGACACCTC AGAAAACTTA TTAACAACTG TGAATATGAG AAATACAGAA 2460 GAAAATAATA AGCCCTCTAT ACATAAATGC CCAGCACAAT TCATTGTTAA AAAACAACCA 2520 AACCTCACAC TACTGTATTT CATTATCTGT ACTGAAAGCA AATGCTTTGT GACTATTAAA 2580 TGTTGCACAT CATTCATTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2618 2618 <210> 93 <211> 302 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 93 tgtgtcaacc tgaacaagct agaacccata gcaacagaag tctggctcat caacaagtcc 60 atggagctgc tggagtacag tggcgtgacc tcagctcact gcaacctctg cctcctgagt
120 tcaagtgatt ctcgtgcctc agcctcccaa gtagctggga ttacagctcc tgccaccacg
180 cccggggctg gtattgtgtt cactggaatt actccaggca gcattgagct gccccatcat
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aatcagctct ttcctgaatg tcatcaacaa tgccattctc cgggccaacc tgcaaaaggg 4800 agagaaccct agccattatg gaattactgc tttcaatcat cccctgaatc tcaccaagca 4860 gcagctctca gaggtggctc cgatgaccac atcagtggat gtccttgtgt ccatctgtgt 4920 catctttgca atgtccttcg tcccagccag ctttgtcgta ttcctgatcc aggagcgggt 4980 cagcaaagca aaacacctgc agttcatcag tggagtgaag cctgtcatct actggctctc 5040 taattttgtc tgggatatgt gcaattacgt tgtccctgcc acactggtca ttatcatctt 5100 catctgcttc cagcagaagt cctatgtgtc ctccaccaat ctgcctgtgc tagcccttct 5160 acttttgctg tatgggtggt caatcacacc tctcatgtac ccagcctcct ttgtgttcaa 5220 gatccccagc acagcctatg tggtgctcac cagcgtgaac ctcttcattg gcattaatgg 5280 cagcgtggcc acctttgtgc tggagctgtt caccgacaat aagctgaata atatcaatga 5340 tatcctgaag tccgtgttct tgatcttccc acatttttgc ctgggacgag ggctcatcga 5400 catggtgaaa aaccaggcaa tggctgatgc cctggaaagg tttggggaga atcgctttgt 5460 gtcaccatta tcttgggact tggtgggacg aaacctcttc gccatggccg tggaaggggt 5520 ggtgttcttc ctcattactg ttctgatcca gtacagattc ttcatcaggc ccagacctgt 5580 aaatgcaaag ctatctcctc tgaatgatga agatgaagat gtgaggcggg aaagacagag 5640 aattcttgat ggtggaggcc agaatgacat cttagaaatc aaggagttga cgaagatata 5700 tagaaggaag cggaagcctg ctgttgacag gatttgcgtg ggcattcctc ctggtgagtg 5760 ctttgggctc ctgggagtta atggggctgg aaaatcatca actttcaaga tgttaacagg 5820 agataccact gttaccagag gagatgcttt ccttaacaga aatagtatct tatcaaacat 5880 ccatgaagta catcagaaca tgggctactg ccctcagttt gatgccatca cagagctgtt 5940 gactgggaga gaacacgtgg agttctttgc ccttttgaga ggagtcccag agaaagaagt
6000 tggcaaggtt ggtgagtggg cgattcggaa actgggcctc gtgaagtatg gagaaaaata
6060 tgctggtaac tatagtggag gcaacaaacg caagctctct acagccatgg ctttgatcgg
6120 cgggcctcct gtggtgtttc tggatgaacc caccacaggc atggatccca aagcccggcg
6180 gttcttgtgg aattgtgccc taagtgttgt caaggagggg agatcagtag tgcttacatc
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6300 gttcaggtgc cttggcagtg tccagcatct aaaaaatagg tttggagatg gttatacaat
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6540

ccacatagaa gactactctg tttctcagac aacacttgac caagtatttg tgaactttgc 6600 caaggaccaa agtgatgatg accacttaaa agacctctca ttacacaaaa accagacagt 6660 agtggacgtt gcagttctca catcttttct acaggatgag aaagtgaaag aaagctatgt 6720 atgaagaatc ctgttcatac ggggtggctg aaagtaaaga ggnactagac tttcctttgc 6780 accatgtgaa gtgttgtgga gaaaagagcc agaagttgat gtgggaagaa gtaaactgga 6840 tactgtactg atactattca atgcaatgca attcaatgca atgaaaacaa aattccatta 6900 caggggcagt gcctttgtag cctatgtctt gtatggctct caagtgaaag acttgaattt 6960 agttttttac ctatacctat gtgaaactct attatggaac ccaatggaca tatgggtttg 7020 aactcacact tttttttttt ttttgttcct gtgtattctc attggggttg caacaataat 7080 tcatcaagta atcatggcca gcgattattg atcaaaatca aaaggtaatg cacatcctca 7140 ttcactaagc catgccatgc ccaggagact ggtttcccgg tgacacatcc attgctggca 7200 atgagtgtgc cagagttatt agtgccaagt ttttcagaaa gtttgaagca ccatggtgtg 7260 tcatgctcac ttttgtgaaa gctgctctgc tcagagtcta tcaacattga atatcagttg 7320 acagaatggt gccatgcgtg gctaacatcc tgctttgatt ccctctgata agctgttctg 7380 gtggcagtaa catgcaacaa aaatgtgggt gtctctaggc acgggaaact tggttccatt 7440 gttatattgt cctatgcttc gagccatggg tctacagggt catccttatg agactcttaa 7500 atatacttag atcctggtaa gaggcaaaga atcaacagcc aaactgctgg ggctgcaagc 7560 tgctgaagcc agggcatggg attaaagaga ttgtgcgttc aaacctaggg aagcctgtgc 7620 ccatttgtcc tgactgtctg ctaacatggt acactgcatc tcaagatgtt tatctgacac
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7740 tgacaaaaat gtttgtactt tttaatgtta tttggaattt taagttctat cagtgacttc
7800 tgaatcctta gaatggcctc tttgtagaac cctgtggtat agaggagtat ggccactgcc
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8340

ttggataccc cattaaatct gacagtctca aatttttcat ctcttcaatc actagtcaag 8400 aaaaatataa aaacaacaaa tacttccata tggagcattt ttcagagttt tctaacccag 8460 tcttattttt ctagtcagta aacatttgta aaaatactgt ttcactaata cttactgtta 8520 actgtcttga gagaaaagaa aaatatgaga gaactattgt ttggggaagt tcaagtgatc 8580 tttcaatatc attactaact tcttccactt tttccaaaat ttgaatatta acgctaaagg 8640 tgtaagactt cagatttcaa attaatcttt ctatattttt taaatttaca gaatattata 8700 taacccactg ctgaaaaaga aaaaaatgat tgttttagaa gttaaagtca atattgattt 8760 taaatataag taatgaaggc atatttccaa taactagtga tatggcatcg ttgcatttta 8820 cagtatcttc aaaaatacag aatttataga ataatttctc ctcatttaat atttttcaaa 8880 atcaaagtta tggtttcctc attttactaa aatcgtattc taattcttca ttatagtaaa 8940 tctatgagca actccttact tcggttcctc tgatttcaag gccatatttt aaaaaatcaa 9000 aaggcactgt gaactatttt gaagaaaaca caacatttta atacagattg aaaggacctc 9060 ttctgaagct agaaacaatc tatagttata catcttcatt aatactgtgt taccttttaa 9120 aatagtaatt ttttacattt tcctgtgtaa acctaattgt ggtagaaatt tttaccaact
9180 ctatactcaa tcaagcaaaa tttctgtata ttccctgtgg aatgtaccta tgtgagtttc
9240 agaaattctc aaaatacgtg ttcaaaaatt tctgcttttg catctttggg acacctcaga
9300 aaacttatta acaactgtga atatgagaaa tacagaagaa aataataagc cctctataca
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9480 aaaaaaaaaa aaaaa
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<210> 99 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 99 agttacctgc aagccactgt ttttaaccag tttatactgt g 41 <210> 100 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 100 agttacctgc aagccactgt atttaaccag tttatactgt g 41 <210> 101 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 101 caggctcaga ggccttggcc c tcaccctg gctcacgtgt g 41 <210> 102 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 102 caggctcaga ggccttggcc tatcaccctg gctcacgtgt g 41 <210> 103 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 103 atgggcctgg acaacagcat cctctggttt agctggttca t 41 <210> 104 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 104 atgggcctgg acaacagcat actctggttt agctggttca t 41 <210> 105 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 105

aagggaggag aagaagaaaa aaaatccaag cctctggtag a 41 <210> 106 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 106 aagggaggag aagaagaaaa gaaatccaag cctctggtag a 41 <210> 107 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 107 tcttcccttt gcagagacac gccctgccag gcaggggagg a 41 <210> 108 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 108 tcttcccttt gcagagacac accctgccag gcaggggagg a 41 <210> 109 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 109 ccttgcctcc tagtgtagga ttt 23 <210> 110 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 110 aatataatag gtgctctgga cctc 24 <210> 111 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 111 atacaaaaat agaaaaaggg gcttg 25 <210> 112 <211> 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 112 atggatgaga aggaaagagg tttac 25 <210> 113 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 113 cattggatca tacgtacatt tcaga 25 <210> 114 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 114 tcactttccc caactataaa tggat 25 <210> 115 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 115 gtagatcata caagtgagtg cttgg 25 <210> 116 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 116 ctgttctcaa cttgctgctt ttatt 25 <210> 117 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 117 gcaaattcaa atttctccag gta 23 <210> 118 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 118 gcacaaagaa aggacatcag cta 23

<210> 119 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 119 cagtgcttac ccctgctaat atc 23 <210> 120 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 120 gagatggaga aatcattcac agc 23 <210> 121 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 121 acatgtggaa tgacctaaac acc 23 <210> 122 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 122 cttaggacat ttggccttgc tat 23 <210> 123 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 123 catttctgtt ttaagagcct gtca 24 <210> 124 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 124 AATGTGGCAT GCAGTTGATA AAT 24 <210> 125 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 125

gtttgtggtt gttacggaat gat 23 <210> 126 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 126 CCTCCCAACA TGATATCTCA CTC- 24 <210> 127 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 127 gtctgggacc tgtagtcagg ttt 23 <210> 128 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 128 ccaatagaca gaatcaggcc ata 23 <210> 129 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 129 tgccaacatt tattagagga agc 23 <210> 130 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 130 atccgtttaa cctgccaact act 23 <210> 131 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 131 tctcaggagc cgtttattta atg 23 <210> 132 <211> 23 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 132 gccaacttta ccatgagttg aaa 23 <210> 133 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 133 tctgatcata gtgttttgcc ttg 23 <210> 134 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 134 TGTTCCCCTA CAATGAGATT CAC~ 24 <210> 135 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 135 gggtgaacag atgtttttcc tt 22 <210> 136 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 136 tagctggaac atttcctgat gat 23 <210> 137 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 137 ccctttcttg tctgataatg gtg 23 <210> 138 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 138 CACAATTAAA CACTGTCCTC TGG 24

<210> 139 <211> 2201 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Met Pro Ser Ala Gly Thr Leu Pro Trp Val Gln Gly Ile Ile Cys Asn 1 5 10 15 Ala Asn Asn Pro Cys Phe Arg Tyr Pro Thr Pro Gly Glu Ala Pro Gly
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260 265 270
Leu Phe Gly Gly Asn Gly Thr Glu Glu Asp Ala Glu Thr Phe Tyr Asp
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Ala Val Ile Ile Lys Gly Ile Val Tyr Glu Lys Glu Ala Arg Leu Lys
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2195 2200

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245 250 255
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35 40 45 Ala Arg Arg Leu Leu Leu Tyr Ser Gln Lys Asp Thr Ser Met Lys Asp
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325 330 335 Ala Glu Val Asn Lys Thr Phe Gln Glu Leu Ala Val Phe His Asp Leu
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355 360 365 Asn Ser Gln Glu Met Asp Leu Val Arg Met Leu Leu Asp Ser Arg Asp
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565 570

Claims

REVENDICATIONS 1. Acide nucléique comprenant au moins 245 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 1-14, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 15-47 , ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 48-90, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
6. Acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO 91, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
7. Acide nucléique comprenant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques

<Desc/Clms Page number 213>

SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
8. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
9. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 92, un fragment biologiquement actif de celui-ci ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
11. Acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
12. Acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 93-96, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
13. Acide nucléique ayant au moins huit nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 97-108 et comprenant la base polymorphe, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

<Desc/Clms Page number 214>
14. Sonde ou amorce nucléotidique spécifique du gène ABC1, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides choisie parmi les acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
15. Sonde ou amorce selon la revendication 14, comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 109-138, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
16. Sonde ou amorce nucléotidique utile pour la détection d'une mutation dans le gène ABC1, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides, choisie parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 11 et 12.
17. Sonde ou amorce nucléotidique selon la revendication 16, comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 109 - 112, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
18. Sonde ou amorce nucléotidique utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABC1, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides, choisie parmi les acides nucléiques selon la revendication 13.
19. Sonde ou amorce selon la revendication 18, comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 142-

149, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
20. Amorce nucléotidique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire du nucléotide localisée immédiatement du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.

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21. Amorce nucléotidique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires, la base de l'extrémité 3' de ces amorces étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 5' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID NO 97-108 ou de leurs séquences complémentaires.
22. Procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'une quelcônque des revendications 1 à 13 contenu dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; b) détection des acides nucléiques amplifiés.
23. Procédé d'amplification selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les amorces selon l'une quelconque des revendications 14 à 19.
24. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

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25. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies dans le groupe constitué des amorces selon l'une des revendications 14 à 19.
26. Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 14 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé marqueur dont la présence est détectable.
27. Procédé de détection de la présence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléiques selon l'une des revendications 14 à 19 avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
28. Procédé de détection selon la revendication 27, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
29. Nécessaire pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 14 à 19; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
30. Nécessaire de détection selon la revendication 29, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

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31. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.

32 Vecteur selon la revendication 31 caractérisé en ce qu'il est un adénovirus.

33 Vecteur selon l'une des revendications 32 et 33 caractérisé en ce qu'il est l'ABC1-rldV 34 Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 31 à 33.
35. Polypeptide ABC1 muté, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 140.
36. Polypeptide ABC1 muté, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID NO 141.
37. Anticorps dirigé contre un polypeptide ABC1 muté selon l'une quelconque des revendications 35 et 36, ou un fragment peptidique de ce dernier..
38. Anticorps selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend un composé détectable.
39. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, comprenant les étapes de: a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 37 ou 38; b) détection du complexe antigène/anticorps formé .
40. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 35 ou 36 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant :

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a) un anticorps selon l'une des revendications 37 ou 38; b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.
41. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
42. Composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol, comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 31, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
43. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 6 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
44. Utilisation d'un vecteur recombinant selon la revendication 31 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.

45 Utilisation selon la revendication 44 caractérisé en ce que le vecteur est l'ABC1-rldV.
46. Utilisation du polypeptide ABC1 de séquence SEQ ID NO 139 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention de l'Athérosclérose sous diverses formes ou plus particulièrement au traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol.
47. Composition pharmaceutique pour la prévention ou le traitement de sujets affectés d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol,

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comprenant une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide de séquence SEQ ID NO 139.

48 Utillisation du polypeptide ABC1, ou de cellules exprimant le polypeptide ABC1, pour cribler des principes actifs pour la prévention ou le traitement de maladies résultant d'un dysfonctionnement du transport inverse du cholestérol., 49. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) préparer des vésicules membranaires contenant le polypeptide ABC1 et un substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; b) incuber les vésicules obtenues à l'étape a) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) mesurer qualitativement et/ou quantitativement la libération du substrat lipidique comprenant un marqueur détectable ; d) comparer la mesure obtenue à l'étape b) avec une mesure de la libération du substrat lipidique marqué par les vésicules n'ayant pas préalablement été incubées avec le composé candidat agoniste ou antagoniste.
50. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir des cellules, par exemple une lignée cellulaire, exprimant naturellement ou après transfection le polypeptide ABC1 ; b) incuber les cellules de l'étape a) en présence d'anion marqué par un marqueur détectable ; c) laver les cellules de l'étape b) afin d'éliminer l'excès de l'anion marqué n'ayant pas pénétré dans ces cellules ; d) incuber les cellules obtenues à l'étape c) avec un composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1 ; e) mesurer l'efflux de l'anion marqué ;

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f) comparer la valeur de l'efflux de l'anion marqué déterminé à l'étape e) avec la valeur de l'efflux de l'anion marqué mesuré avec des cellules n'ayant pas préalablement été incubées en présence du composé candidat agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1.
51. Procédé de criblage d'un composé actif sur le métabolisme du cholestérol, agoniste ou antagoniste du polypeptide ABC1, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) cultiver des cellules d'une lignée monocytaire humaine dans un milieu de culture approprié, en présence d'albumine humaine purifiée ; b) incuber les cellules de l'étape a) simultanément en présence d'un composé stimulant la production d'IL-1 beta et du composé candidat agoniste ou antagoniste ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape b) en présence d'une concentration appropiée d'ATP ; d) mesurer d'IL-1 beta libérée dans le surnageant de culture cellulaire. e) comparer la valeur de la libération de l'IL-1 beta obtenue à l'étape d) à la valeur de l'IL-1 beta libérée dans le surangeant de culture de cellules n'ayant pas été préalablement incubées en présence du composé candidat agonsite ou antagoniste.