FR2794460A1

FR2794460A1 - Procede de preparation de nouvelles fractions d'igg humaines possedant une activite immunomodulatrice

Info

Publication number: FR2794460A1
Application number: FR9907153A
Authority: FR
Inventors: Dominique Bourel; Rosset Martine Bruley; Frederic Dhainaut; Jacky Lirochon
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2000-12-08

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de fractions d'IgG à partir d'IgIV polyvalentes humaines qui seraient plus particulièrement responsables de l'effet immunomodulateur observé au cours des traitements de certaines maladies autoimmunes et après greffes de cellules et/ ou d'organes. L'invention porte sur des fractions qui possèdent une réactivité vis-à-vis des IgM ou des F (ab') 2 d'IgG et pas ou peu de réactivité vis-à-vis des antigènes du non-soi, c'est à dire des fractions d'Ig qui présentent des interactions de type idiotypique entre elles (fraction connectée). Ces fractions montrent une polyréactivité vis-à-vis d'autoantigènes donnés.

Description

La présente invention concerne un procédé de préparation de fractions d'Ig à partir d'immunoglobulines intraveineuses polyvalentes humaines (IglV) qui seraient plus particulièrement responsables de l'effet immunomodulateur observé au cours des traitements de certaines maladies autoimmunes. L'invention porte sur des fractions d'IgG qui possèdent une réactivité vis-à-vis des IgM ou des F(ab')2 d'IgG et pas ou peu de réactivité vis-à-vis des antigènes du non-soi, c'est à dire des fractions d'Ig qui présentent des interactions de type idiotypique entre elles (fraction connectée). Ces fractions montrent une polyréactivité vis-à-vis d'autoantigènes donnés.

Les préparations d'IgIV sont utilisées depuis de nombreuses années pour le traitement de multiples états pathologiques Les indications majeures peuvent être regroupées en trois cibles thérapeutiques : - Les déficits immunitaires primitifs ou secondaires, - Le traitement de certaines maladies autoimmunes, - Les complications infectieuses et la maladie du greffon contre l'hôte après greffes de cellules hématopoïétiques allogéniques.

Dans le cas des déficits immunitaires, les IgIV constituent un traitement substitutif qui permet d'apporter des IgG dont la concentration plasmatique chez les malades n'est pas suffisante pour neutraliser le développement d'infections virales ou bactériennes Pour les maladies autoimmunes, l'efficacité des IgIV est liée à des effets

irnmunomodulateurs complexes. Prescrites dans le cadre des greffes de moelle osseuse, les IgIV correspondent à un traitement substitutif en attendant la reconstitution immunologique des sujets greffes et exercent un effet

immunomodulateur pour la maladie du greffon contre l'hôte.

Les IgIV sont préparées à partir d'un pool de plasmas provenant de plusieurs milliers de donneurs, elles présentent une répartition en sous-classes et des spécificités anticorps reflétant celle de la population générale. Ainsi, les IgIV peuvent être considérées comme un produit contenant la totalité du répertoire des anticorps dirigés contre les antigènes extérieurs, les autoantigènes et contre les anticorps naturels euxmêmes.

Le concept d'immunorégulation par les IgIV s'est largement développé depuis la démonstration de leur efficacité dans le purpura thrombopénique auto-immun (PTAI) en 1981 (1). Les IgIV ont été par la suite utilisées dans de nombreuses pathologies autoimmunes ou inflammatoires. Certaines indications, pour lesquelles l'efficacité des IglV a été clairement établie, sont officiellement reconnues par les instances réglementaires. Il s'agit du PTAI, de la maladie de Kawasaki où elles préviennent très efficacement les complications anévrismales (2,3), de la greffe de cellules hématopoïétiques allogéniques où elles modulent la réaction du greffon contre l'hôte (4) et plus récemment, de la rétinochoroïdite de Birdshot, où elles améliorent l'acuité visuelle et où elles permettent parfois de réduire la corticothérapie (5).

D'autres indications sont considérées par les experts comme étant justifiées. Certaines cytopénies par exemple où les IgIV entraînent une amélioration rapide, mais souvent transitoire (6) et les hémophilies avec inhibiteurs (autoanticorps anti-facteur VIII) où en revanche l'amélioration peut être durable (7,8). Des résultats contradictoires ont été obtenus dans les avortements à répétition avec des taux de succès encourageants dans certaines séries (9,10).

Depuis une dizaine d'années, les IgIV ont connu un essor très important en neurologie grâce à des études multicentriques contrôlées avec des critères d'efficacité à la fois quantitatifs (scores neurologiques) et qualitatifs (nombre de patients améliorés). Ainsi, dans la maladie de Guillain-Barré de l'adulte, les IgIV sont aussi efficaces que les échanges plasmatiques et sont mieux tolérées (11,12). Elles sont conseillées en première intention dans les formes de l'enfant (13). Elles sont plus efficaces vcrsus

placebo dans les polyncuropathies inflammatoires chroniques démyelinisantes, (14) et dans les dermatomyosites (15). Elles sont aussi efficaces et mieux tolérées que les

échanges plasmatiques au cours des crises aiguës de myasthénie (16). Enfin, une étude versus placebo a démontré l'efficacité des IgIV dans les formes alternant rémissions et poussées de la sclérose en plaques (17).

Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la diversité d'action des IgIV (18) : - Le blocage des récepteurs Fc à la surface des macrophages, monocytes, neutrophiles et eosinophiles.

La neutralisation des autoanticorps circulants par des anticorps anti-idiotype,
L'inhibition des effets néfastes dus à l'activation du complément,
La modulation du réseau des cytokines, et/ou la sélection des répertoires immunitaires par interaction avec les lymphocytes T et B.

Ces mécanismes pourraient rendre compte des effets à la fois précoces et prolongés des IgIV Une fraction (dite connectée) d'IgG peut être purifiée sur une colonne d'affinité dont les F (ab')2 d'IgIV ou des IgG entières ont été couplées à des billes de Sepharose (19 et 20). Les IgM contenus dans le sérum d'individus normaux se lient aux fragments F (ab')2 des IgG autologues et inhibent l'association de ces IgG aux autoantigènes (21). Les IgM contribuent à réguler l'autoréactivité naturelle des IgG à travers des interactions de type idiotypique (21). Ces IgG ou leur F (ab')2 peuvent inhiber la liaison de certains autoanticorps à leurs antigènes comme cela a été démontré par des tests réalisés in vitro (22). La fraction connectée d'IgG obtenue à partir d'IgIV, est constituée principalement d'autoanticorps naturels et renfermerait en particulier des anticorps reconnaissant des déterminants anti-idiotypiques présents sur les autoanticorps IgG ou IgM capables de se neutraliser entre eux et d'altérer la fonction et la dynamique du réseau idiotypique (23 et 24).

D'autres documents décrivent le principe général pour l'obtention de fractions connectées. Parmi ces documents, on peut citer la demande de brevet WO 98 /26086

qui porte sur un procédé pour préparer une composition purifiée d'anticorps comprenant des anticorps anti-idiotypes, ledit procédé consistant en l'adsorption d'un pool d'IgG sur un substrat solide contenant un déterminant idiotypique d'un autoanticorps, et en une élution.

EP 293 606 décrit une méthode générale pour la purification d'un anticorps X par interaction idiotypique/ anti-idiotypique comprenant les étapes suivantes : a) attachement d'un anticorps Y à un support solide, ledit anticorps reconnaissant l'idiotype de X, b) mise en contact d'un échantillon contenant un anticorps X avec le support solide dans un tampon approprié, c) élution et d) récupération de l'anticorps X purifié.

WO 97/19113 a trait à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-idiotypes de type IgG comme immunorégulateur de la réponse immunitaire, en particulier pour le traitement des maladies autoimmunes.

Actuellement, la tolérance et l'efficacité des IgG polyvalentes mises dans le commerce, notamment TEGELINE (LFB, France) sont reconnues en particulier dans le traitement du PTI, de la maladie de Kawasaki et de la rétinochoroïdite de type
Birdshot , pathologies pour lesquelles des AMM ont été obtenues. Cependant, les posologies actuelles dans ces indications sont importantes, et le mode d'administration reste lourd et complexe (perfusions de plusieurs heures en milieu hospitalier). Le problème consiste donc à préparer une fraction active dans les pathologies autoimmunes, de façon à rendre la préparation plus efficace et d'une utilisation plus commode.

L'objectif à la base de la présente invention est donc d'obtenir des IgG spécifiques permettant une diminution des posologies, ayant une efficacité maintenue voire accrue, une meilleure tolérance, et dont le mode d'administration est plus simple. On a montré qu'il est possible de préparer des fractions répondant aux problèmes mentionnés précédemment en les préparant à partir de pools d'IgG de manière à ce qu'elles aient une réactivité anti IgM ou anti F (ab')2 d'IgG, peu ou pas de réactivité vis-à-vis des

antigènes du non-soi, et/ou qui montrent une polyréactivité vis-à-vis de certains autoantigèncs.

Description Ainsi, la présente invention concerne la purification des IgG contenues dans les IgIV polyvalentes qui seraient plus particulièrement responsables de t'effet immunomodulateur observé au cours du traitement de certaines maladies autoimmunes. L'invention repose sur les caractéristiques de ces fractions d'IgG qui possèdent une réactivité vis-à-vis des IgM ou F (ab')2 et pas ou peu vis-à-vis de l'anatoxine tétanique et de l'antigène HBs (antigènes du non-soi), c'est à dire des fractions comportant des IgG présentant des interactions de type idiotypique entre elles (fraction connectée). Ces fractions montrent une polyréactivité vis-à-vis de certains autoantigènes.

La préparation des fractions d'IgG est faite par chromatographie d'affinité en utilisant la propriété de ces IgG de se reconnaître entre elles ou de reconnaître les IgM. La matière première utilisée pour obtenir ces fractions provient d'IgG polyvalentes, notamment celles qui sont préparées et commercialisées par le LFB (France), ou de toute autre fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IgIV polyvalentes à usage thérapeutique. Le procédé général de préparation d'IgIV polyvalentes comporte essentiellement les étapes suivantes : - Fractionnement du plasma provenant d'un pool de donneurs par adsorption et/ou filtration puis ultrafiltration (obtention d'une première fraction PSO I ), - Soit traitement par la pepsine à pH acide, formulation, répartition, et lyophilisation (obtention du produit TEGELINE), - Soit chromatographie sur colonne échangeuse d'anions, ultrafiltration, obtention d'une fraction intermédiaire appelée PSO 2 ; et chauffage, ultrafiltration, formulation et répartition (obtention d'une fraction IglV liquide).

On entend par IgG polyvalentes dans le cadre de l'invention, des IgG polyvalentes entières, des fragments d'IgG polyvalentes tels que F (ab')2 F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IgIV polyvalentes

Un aspect de l'invention concerne une fraction d'IgG réagissant avec des IgM ou des F (ab')2 d'IgG avec un taux d'enrichissement supérieur à 20 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales, et ne réagissant peu ou pas avec l'anatoxine tétanique et l'antigène HBs avec un taux d'enrichissement inférieur à 2 et 5 respectivement par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales Cette fraction peut réagir avec l'un au moins des autoantigènes sélectionnés parmi la myosine, l'actine, la tubuline, et la protéine basique de la myéline (MBP) avec un taux d'enrichissement supérieur à 10 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales Avantageusement, la fraction réagit avec l'ensemble des autoantigènes évoqués précédemment.

Une fraction préférée selon l'invention peut se définir en ce qu'elle réagit avec des IgM ou les F (ab')2 d'IgG avec un taux d'enrichissement supérieur à 50 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales, et avec la myosine, l'actine, la tubuline, et la MBP avec un taux d'enrichissement moyen compris entre 20 et 100 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales.

Un deuxième aspect de l'invention porte sur un procédé de préparation de fractions d'IgG caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Préparation d'un support insoluble sur lequel sont greffés des IgG ou des IgM polyvalentes, b) adsorption d'IgG polyvalentes sur le support obtenu à l'étape a), c) élution des IgG retenues sur les IgG ou les IgM liées au support de façon à recueillir une fraction connectée par interactions idiotypiques IgG-IgG ou IgG-IgM, d) sélection des fractions présentant une réactivité vis-à-vis des F(ab')2 d'IgG ou des IgM, pas ou peu de réactivité vis-à-vis d'antigènes du non-soi, et une polyréactivité vis-à-vis d'autoantigèncs donnés.

Les fractions d'IgG obtenues sont préparées à partir d'IgG polyvalentes ou tout autre fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IglV à usage thérapeutique. Dans les IgG polyvalentes, il existe des anticorps qui interagissent avec

les autoanticorps de type IgG ou IgM ainsi qu'avec les idiotypes exprimés par ces autoanticorps (fraction connectée) et qui possèdent une certaine autoréactivité. On entend par fraction connectée dans le cadre de l'invention une fraction qui présente un pourcentage élevé d'IgG interagissant entre elles ou avec des IgM par liaison idiotype - anti-idiotype.

La stratégie utilisée pour déterminer, parmi les différentes fractions, la ou les fraction (s) possédant les propriétés recherchées, c'est à dire, les fractions contenant le plus fort titre en autoréactivité et réagissant avec le plus grand nombre d'autoantigènes, consiste à les soumettre à un criblage pouvant comporter plusieurs étapes successives.

Les différents tests in vitro et/ou in vivo utilisés permettent de sélectionner à chaque étape les fractions les plus actives sur des critères de plus en plus spécifiques.

Le procédé selon l'invention peut donc comporter des étapes permettant la sélection de fractions d'IgG présentant des caractéristiques données.

En ce sens, l'étape d) peut comprendre une mesure du taux d'enrichissement en anticorps réactifs contre les IgM ou les F (ab')2 des IgG utilisées pour la purification.

L'étape d) peut également comporter une mesure de la réactivité pour l'anatoxine tétanique et l'antigène HBs en prenant le taux d'enrichissement comme valeur contrôle.

De préférence, l'étape d) comprend un test ELISA effectué sur un panel d'autoantigènes sélectionnés notamment parmi l'actine, la myosine, la MBP, et la tubuline.

L'étape d) du procédé selon l'invention peut comprendre en outre un test de compétition pour contrôler l'activité neutralisante des fractions vis-à-vis d'autoanticorps provenant de sérum de patients atteints de maladies autoimmunes, et/ou un test d'inhibition de la réaction lymphocytaire mixte avec des cellules humaines pour contrôler la réactivité des IgG purifiées.

L'étape a) consiste en un greffage d'IgG ou d'IgM polyvalentes sur un support

insoluble, notamment sur un gel de Sepharose, de Trisacryl, d'Affiprepm ou sur un gel activé avec les groupements CNBr, NHS ou C5H8O2 (glutaraldéhyde). Les IgG déposées sur le support solide obtenu à l'étape a) sont adsorbées soit sous forme d'IgG polyvalentes lyophilisées et remises en solution ou sous forme liquide, soit sous forme de fractions intermédiaires obtenues au cours d'un procédé de fabrication des IgG polyvalentes.

L'élution des IgG retenues à l'étape b) sont éluées à l'étape c) avec un tampon d'ions solubilisants sélectionnés notamment parmi les chaotropes tels que la glycine-HCI dans des conditions faisant varier le pH, de préférence entre 2. 8 à 4.0.

Avantageusement, l'absorption est effectuée dans des conditions de température allant de 4 à 40 C.

Dans un mode particulier de réalisation, ce procédé comprend les étapes suivantes : a) Greffage d'IgG ou d'IgM polyvalentes sur un support solide ou support d'affinité (immunoadsorbant) habituellement utilisé en chromatographie d'affinité. De tels supports sont bien connus de l'homme du métier. On peut citer par exemple un gel de Sepharose, de Trisacryl ou des gels activés avec les groupements CNBr, NHS ou C5H8O2 (glutaraldéhyde). b) Adsorption d'IgIV en PBS sur le support solide obtenu à l'étape a), déposées soit sous forme d'IgG polyvalentes lyophilisées et remises en solution ou sous forme liquide, soit sous forme de fractions intermédiaires obtenues au cours du procédé de fabrication des IgG polyvalentes. c) Elution des IgG retenues à l'étape b) avec un tampon d'ions dissociant la liaison
Ag-Ac, sélectionnés notamment parmi les chaotropes tels que la glycine-HCI dans des conditions faisant varier le pH, de préférence entre 2. 8 à 4. 0, et/ou la force ionique et/ou par toute autre méthode équivalente permettant la rupture des liaisons
IgG-IgG. ou IgG-IgM de façon à obtenir des fractions d'IgG ayant un profil de réactivité différent de celui des IgG polyvalentes de départ. d) Mesure en ELISA du taux d'enrichissement en anticorps réactifs contre des IgM ou
F(ab')2 d'IgG utilisées pour la purification, mesure de la réactivité pour l'anatoxine tétanique et l'antigène HBs en prenant le taux d'enrichissement comme

valeur contrôle, et mesure du taux d'enrichissement en réactivité vis-à-vis d'un panel d'autoantigènes sélectionnés notamment parmi l'actine, la myosine, la MBP, et la tubuline.

Dans chaque cas, la fraction non retenue sur les différentes colonnes peut également servir de contrôle en plus de la préparation initiale d'IgG.

Bien entendu, certains paramètres du procédé peuvent être modifiés à la convenance de l'homme du métier par de simples expériences de routine.

Les propriétés immunomodulatrices des quelques fractions sélectionnées par les tests in vitro peuvent être également déterminées in vivo dans plusieurs modèles animaux de maladies autoimmunes et de la maladie du greffon contre l'hôte (GVH) après allogreffes.

Plusieurs types de modèles ont été choisis en fonction du mécanisme d'action mis en jeu : - Modèle dans lequel la fonction effectrice est assurée par l'intermédiaire de cellules T ou par des anticorps, - Modèle dans lequel les mécanismes dépendent de l'interaction avec les F (ab)'2 ou le Fc.

Deux maladies autoimmunes expérimentales chez le rat, où la fonction effectrice est assurée par l'intermédiaire de cellules T, sont plus particulièrement choisies car elles ont été décrites comme étant sensibles à l'administration d'IgIV et présentent l'avantage de pouvoir apporter une réponse rapide quant à l'efficacité des fractions (les effets protecteurs sont évaluables en 4 semaines environ). Il s'agit des modèles suivants : 1) L'uvéite autoimmunc expérimentale ou UAE induite par l'injection de l'antigène rétinal de b#uf ou de son peptide immunodominant à des rats Lewis.

2) La polyarthrite rhumatoide (PR) induite chez des rats Brown-Norway par injection de collagène bovin de type 11.

Dans chaque cas, la sévérité de la maladie est évaluée de manière clinique et/ou histopathologique et plusieurs paramètres biologiques tels que la perte de poids, la production d'anticorps contre l'autoantigène injecté sont mesurés au cours du temps Un modèle de GVH aiguë chez le rat a été ajouté car cette maladie a été décrite comme sensible à l'administration d'IgIV. La GVH est induite chez le rat hybride (Lewisx Brown-Norway) par injection de cellules lymphoïdes provenant de rats Lewis. La maladie est évaluée par la perte de poids, la présence d'erythème et le taux de mortalité.

Le modèle animal d'anémie hémolytique autoimmune (AHA) qui met principalement en jeu l'action des anticorps, est proche des pathologies hémolytiques observées chez l'homme. Elle est induite par l'injection de globules rouges (GR) de rat à des souris C3H préalablement splénectomisées. Ce test est utile en raison de l'efficacité des IgIV observée dans l'anémie hémolytique chez l'homme. Le développement de l'anémie est suivi par la diminution du nombre de GR et l'apparition dans le sérum des animaux d'autoanticorps dirigés contre leurs propres GR.

L'effet protecteur du produit TEGELINE est préalablement testé dans ces modèles et les conditions optimales d'administration (dose, nombre, délais et voie d'injection) sont déterminées. Les fractions sélectionnées sont injectées à des doses de cinq à vingt fois inférieures à celles de TEGELINE et l'efficacité de ces traitements est mesurée dans les différents modèles de maladie autoimmunes.

De surcroît, on peut mettre en #uvre des modèles expérimentaux utilisant des cellules humaines.

La souris SCID/NOD humanisée apparaît comme le meilleur modèle pour évaluer l'efficacité in vivo des fractions présélectionnées par les tests sur les modèles animaux. sur des cellules humaines pathologiques. Le choix du type de pathologie et de cellules à greffer chez la souris SCID/NOD doit répondre à plusieurs critères :

- Une pathologie autoimmune où l'efficacité des IgIV a été démontrée chez l'homme, - Une pathologie humaine assez fréquente pour avoir accès facilement à plusieurs malades,
L'existence d'un paramètre biologique permettant de suivre l'effet des IgIV ou des fractions comme l'évolution du titre d'un autoanticorps contre un autoantigène connu.

Les modèles de la cirrhose biliaire primitive, de la myasténie et de la thyroïdite d'Hashimoto ont été sélectionnés car les cellules provenant de ces pathologies ont déjà été greffées avec succès à des souris SCID. D'autres pathologies pourront être choisies par la suite.

Dans une phase ultérieure et dans le but d'augmenter les connaissances sur le mécanisme d'action d'une fraction donnée, démontrée comme efficace, on peut mettre en #uvre d'autres modèles complémentaires afin d'étendre les indications de

l'utilisation des fractions dérivées des IGIV, telles que TEGELINEO.

L'étape d) peut donc comprendre en outre un ou plusieurs test(s) in vivo, notamment les tests décrits ci-dessus.

Ainsi, le procédé selon l'invention permet notamment la préparation et la sélection des fractions dont les caractéristiques sont définies ci-dessus.

Une fois que les fractions d'intérêts ont été identifiées, les paramètres des étapes a), b) et c) peuvent être employés dans le cadre d'un procédé industriel de fabrication desdites fractions. Un tel procédé avec les paramètres adéquats selon les fractions d'intérêts préalablement sélectionnées est un objet supplémentaire de l'invention Un aspect complémentaire de l'invention porte sur les fractions susceptibles d'être obtenues à partir du procédé défini ci-dessus.

Il est nécessaire de noter que la description de la présente invention n'est pas limitative, que des procédés équivalents et des fractions équivalentes forment également l'invention.

Les fractions selon l'invention présentent plusieurs avantages dont les principaux sont les suivants : - Une diminution des posologies. Etant donné que le nouveau produit proposé correspond à une fraction contenue dans les IgG polyvalentes la quantité injectée d'IgG présentant des propriétés immunomodulatrices est inférieure à celle des IgIV habituellement prescrites. Les doses efficaces peuvent être réduites d'un facteur de
5 à 20 voire plus. Cet avantage est considérable car les posologies actuellement utilisées pour les IgG polyvalentes disponibles sont très élevées : de l'ordre de 1à
2 g/kg.

Une efficacité maintenue voire accrue car le produit est enrichi en fraction immunomodulatrice, - Une meilleure tolérance. Avec des concentrations plus faibles, la tolérance du nouveau produit est améliorée. En effet, actuellement il est nécessaire de prendre certaines précautions au cours de l'administration des IgIV avec, en particulier, une perfusion lente du produit pendant plusieurs heures pour éviter les réactions allergiques.

- Une prescription simplifiée. L'administration de faibles doses permet d'instaurer des traitements ambulatoires venant se substituer aux perfusions actuelles réalisées en milieu hospitalier.

Un aspect supplémentaire porte sur l'utilisation des fractions d'IgG selon l'invention pour la préparation d'un médicament. Ce médicament est plus particulièrement adapté au traitement des maladies autoimmunes, de la GVH, et/ou du rejet de greffe après transplantation.

Les fractions selon l'invention sont utiles pour la préparation d'un médicament destiné

au traitement de la maladie de Kawasaki, de la rétinochorodite de Birdshot, éventuellement en association avec une corticothérapie, des cytopénies, des

hémophilies avec inhibiteurs (autoanticorps anti-facteur VIII), et/ou pour prévenir ou empêcher le rejet immunitaire de greffes de cellules et/ou d'organes et le développement de la GVH après greffe de cellules allogéniques.

Les fractions selon l'invention sont également utiles pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies neurologiques, notamment la maladie de Guillain-Barré de l'adulte, les polyneuropathies inflammatoires chroniques démyelinisantes, les dermatomyosites, la myasthénie, et/ou la sclérose en plaques.

On se référera aux légendes des figures présentées ci-après pour la suite de la description.

Légendes Figure 1A-1D : Evaluation des propriétés d'une fraction obtenue à partir de TEGELINE (support solide à base de Trisacryl-Glutaraldéhyde greffé avec TEGELINE) Les paramètres du procédé de préparation de cette fraction sont explicités plus en détail à l'exemple 1 ci-après.

FNA signifie fraction non absorbée.

Les figures 1A et 1C illustrent la réactivité spécifique vis-à-vis des F(ab')2 d'IgG et les figures 1B et 1 D représentent la réactivité vis-à-vis des autoantigènes.

Figure 2A-2D : Evaluation des propriétés d'une fraction obtenue à partir de TEGELINE (support solide à base de NHS-Sepharose).

Les paramètres du procédé de préparation de cette fraction sont explicités plus en détail à l'exemple 2 ci-après.

Les figures 2A et 2C illustrent la réactivité spécifique vis-à-vis des F(ab')2 d'IgG et les figures 2B et 2D représentent la réactivité vis-à-vis des autoantigènes.

Figure 3A-3D : Evaluation des propriétés d'une fraction obtenue à partir de TEGELINE (support solide à base de NHS-AffiPrep avec TEGELINE#)

Les paramètres du procédé de préparation de cette fraction sont explicités plus en détail à l'exemple 3 ci-après.

Les figures 3A et 3C illustrent la réactivité spécifique vis-à-vis des F(ab')2 d'IgG et les figures 3B et 3D représentent la réactivité vis-à-vis des autoantigènes.

Figure 4A-4D : Evaluation des propriétés d'une fraction obtenue à partir de TEGELINE (support solide à base de NHS-Sepharose greffé avec des IgM).

Les paramètres du procédé de préparation de cette fraction sont explicités plus en détail à l'exemple 4 ci-après.

Les figures 4A et 4C illustrent la réactivité spécifique vis-à-vis des FIgM et les figures 4B et 4D représentent la réactivité vis-à-vis des autoantigènes.

Les procédés de préparation et d'évaluation de l'activité de fractions enrichies en IgG présentant la propriété de s'associer à d'autres IgG dans des interactions de type idiotypique sont présentés plus en détail dans les exemples ci-après.

Exemple 1 : Procédé selon l'invention avec TEGELINE et un support solide

Trisacryl-GIutnraldéhyde. Des IgG polyvalentes ont été couplées à un gel de Trisacryl préactivé au glutaraldéhyde à raison de 7,6 mg de protéine par ml de gel. Une dose de 50 mg d'IgG polyvalentes à la concentration de 1 mg/ml a été mise en contact par recirculation en colonne avec 20ml d'immunoabsorbant pendant 4h à 22 C en PBS. La fraction non absorbée ou FNA a été recueillie et conservée à -80 C. L'élution a ensuite été effectuée en tampon glycine HCI 0.1M pH 3. 5 et l'éluat concentré par centrifugation sur membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 30kD.

La concentration en IgG a été mesurée par néphélémétrie. Le taux de récupération s'élève à 0. 43 % dans l'éluat et à 90,8 % dans la FNA.

Le taux d'enrichissement en réactivité vis-à-vis des F(ab')2 de cet éluat par rapport aux IgG polyvalentes de départ, s'élève à 65.

Cette fraction possède une réactivité enrichie par rapport à celle des IgG polyvalentes vis-à-vis de plusieurs autoantigènes et une absence de réactivité vis-à-vis de l'anatoxine tétanique et de l'antigène HBs (voir figure 1 et tableau 1).

Tableau <SEP> 1
<tb> Antigènes <SEP> Taux <SEP> % <SEP> de <SEP> récupération
<tb> d'enrichissement
<tb> testés <SEP> Eluat <SEP> FNA <SEP> Eluat <SEP> FNA
<tb> F <SEP> (ab')2 <SEP> 65 <SEP> 0,3 <SEP> 25 <SEP> 26
<tb> Anatoxine <SEP> 1,7 <SEP> 1 <SEP> 0,7 <SEP> 83
<tb> HBs <SEP> < <SEP> seuil <SEP> 0,98 <SEP> < <SEP> seuil <SEP> 58,7
<tb> Actine <SEP> 60 <SEP> 0,6 <SEP> 23 <SEP> 48
<tb> Myosine <SEP> 21 <SEP> 0,6 <SEP> 8 <SEP> 50
<tb> MBP <SEP> 26 <SEP> 1,2 <SEP> 10 <SEP> 94
<tb> Tubuline <SEP> 72 <SEP> 0,9 <SEP> 28 <SEP> 74
<tb>
Exemple 2 : Procédé selon l'invention avec TEGELINEet un support solide MHS-Sepharose.

Des IgG polyvalentes ont été couplées à un gel de NHS-Sépharose à raison de 10 mg de protéine par ml de gel. Une dose de 50 mg d'IgG polyvalentes à la concentration de 1 mg/ml a été mise en contact par recirculation en colonne avec 20ml d'immunoabsorbant pendant 4h à 22 C en PBS. La fraction non absorbée ou FNA a été recueillie et conservée à -80 C. L'élution a ensuite été effectuée en tampon glycine HCl 0.1M pH 3. 5 et l'éluat concentré par centrifugation sur membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 30 kD
La concentration en IgG a été mesurée par néphélémétrie. Le taux de récupération s'élève à 0. 77% dans l'éluat et à 94,7% dans la FNA.

Le taux d'enrichissement en réactivité vis-à-vis des F(ab')2 de cet éluat par rapport aux IgG polyvalentes de départ, s'élève à 76.

Cette fraction possède une réactivité enrichie par rapport à celle des IgG polyvalentes vis-à-vis de plusieurs autoantigènes et une absence de réactivité vis-à-vis de l'anatoxine tétanique et de l'antigène HBs (figure 2 et tableau 2).

Tableau <SEP> 2
<tb> Antigènes <SEP> Taux <SEP> d'enrichissement <SEP> % <SEP> de <SEP> récupération
<tb> Testés <SEP> Eluat <SEP> FNA <SEP> Eluat <SEP> FNA
<tb> F <SEP> (ab')2 <SEP> 76 <SEP> 0,2 <SEP> 51 <SEP> 22
<tb> Anatoxine <SEP> 1,3 <SEP> 1 <SEP> 0,9 <SEP> 86
<tb> HBs <SEP> 4,87 <SEP> 1,1 <SEP> 3,3 <SEP> 96,4
<tb> Actine <SEP> 29,5 <SEP> 0,6 <SEP> 20 <SEP> 47
<tb> Myosine <SEP> 35 <SEP> 0,6 <SEP> 24 <SEP> 55
<tb> MBP <SEP> 29 <SEP> 0,7 <SEP> 20 <SEP> 58
<tb> Tubuline <SEP> 22,4 <SEP> 0,6 <SEP> 15 <SEP> 54
<tb>
Exemple 3 : Procédé selon l'invention avec TEGELINE et un support solide NHS-AffiPrep.

Des IgG polyvalentes ont été couplées à un gel de NHS-Affiprep à raison de 4,6mg de protéine par ml de gel. Une dose de 50 mg d'IgG polyvalentes à la concentration de 1mg/ml a été mise en contact par recirculation en colonne avec 20ml d'immunoabsorbant pendant 4h à 22 C en PBS. La fraction non absorbée ou FNA a été recueillie et conservée à -80 C. L'élution a ensuite été effectuée en tampon glycine HCI 0.1M pH 3. 5 et l'éluat concentré par centrifugation sur membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 30kD La concentration en IgG a été mesurée par néphélémétrie. Le taux de récupération s'élève à 0.21 % dans l'éluat et à 87% dans la FNA.

Le taux d'enrichissement en réactivité vis-à-vis des F (ab')2 cet éluat par rapport aux IgG polyvalentes de départ, s'élève à 77.

Cette fraction possède une réactivité enrichie par rapport à celle des IgG polyvalentes vis-à-vis de plusieurs autoantigènes et une absence de réactivité vis-à-vis de l'anatoxine tétanique et de l'antigène HBs (figure 3 et Tableau 3).

~~~ <SEP> Tableau <SEP> 3
<tb> Antigènes <SEP> Taux <SEP> % <SEP> de <SEP> récupération
<tb> d'enrichissement
<tb> testés <SEP> Eluat <SEP> FNA <SEP> Eluat <SEP> FNA
<tb> F <SEP> (ab')2 <SEP> 77 <SEP> 0,7 <SEP> 14 <SEP> 55
<tb> Anatoxine <SEP> 1,5 <SEP> 0,7 <SEP> 0,3 <SEP> 56
<tb> HBs <SEP> 4,6 <SEP> 0,5 <SEP> 1,6 <SEP> 38,7
<tb> Actine <SEP> 60,5 <SEP> 0,6 <SEP> 11 <SEP> 46
<tb> Myosine <SEP> 49,5 <SEP> 0,8 <SEP> 9 <SEP> 63
<tb> MBP <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 80
<tb> Tubuline <SEP> 75 <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> 79
<tb>
Exemple 4 : Procédé selon l'invention avec des IgM polyclonales et un support solide NHS-Sepharose.

Des IgM polyclonales humaines (pureté 90%) ont été couplées à un gel de NHSSepharose à raison de 10 mg de protéines par ml de gel. Une dose de 50 mg d'IgG polyvalentes à la concentration de 1 mg/ml a été mise en contact avec 20 ml d'immunoadsorbant pendant 4h à 22 C en PBS La fraction non adsorbée ou FNA a été recueillie et conservée à -80 C. L'élution a ensuite été effectuée en tampon glycine HCL O,1M pH 3,5 et l'éluat concentré par centrifugation sur membrane d'ultrafiltration ayant un seuil de coupure de 30 kDa.

La concentration en IgG a été mesurée par néphélémétrie. Le taux de récupération s'élève à 0,20 % dans l'éluat et à 98,7% dans la FNA.

Le taux d'enrichissement en réactivité vis-à-vis des IgM de cet éluat par rapport aux IgG polyvalentes de départ, s'élève à 64.

Cette fraction possède une réactivité enrichie par rapport à celle des IgG polyvalentes vis-à-vis de plusieurs autoantigènes et une absence de réactivité vis-à-vis de l'anatoxine tétanique et de l'antigène HBs (figure 4 et tableau 4).

Tableau <SEP> 4
<tb> Antigènes <SEP> Taux <SEP> % <SEP> de <SEP> récupération
<tb> d'enrichissement
<tb> testés <SEP> Eluat <SEP> FNA <SEP> Eluat <SEP> FNA
<tb> IgM <SEP> 64 <SEP> 1,2 <SEP> 11,4 <SEP> 106
<tb> F <SEP> (ab')2 <SEP> 24,5 <SEP> 0,7 <SEP> 4,5 <SEP> 67
<tb> Anatoxine <SEP> 1,8 <SEP> 0,8 <SEP> 0,3 <SEP> 76
<tb> HBs <SEP> < <SEP> seuil <SEP> 0,8 <SEP> < <SEP> seuil <SEP> 76
<tb> Actine <SEP> 52 <SEP> 0,3 <SEP> 9 <SEP> 33
<tb> Myosine <SEP> 54 <SEP> 0,6 <SEP> 10 <SEP> 54
<tb> MBP <SEP> 39,5 <SEP> 0,5 <SEP> 7 <SEP> 50
<tb> Tubuline <SEP> 58 <SEP> 0,7 <SEP> 10 <SEP> 62
<tb>
Exemple 5 : Applications cliniques.

Les fractions enrichies en autoréactivité et se montrant efficaces dans les modèles expérimentaux de maladies autoimmunes sont destinées à être utilisées dans le traitement de nombreuses pathologies où les IgIV ont été montrées comme ayant une action thérapeutique, et en particulier les maladies autoimmunes, la GVH et le rejet de greffe après transplantation. Ces indications ne sont pas exclusives et pourront être étendues. Lesdites fractions sont formulées avec un véhicule pharmaceutique adapté à une administration intraveineuse, avec un conditionnement soit sous forme lyophilisée, soit sous forme liquide ou une autre voie (IP, ID, IM) selon les indications recherchées.

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1510.

Claims

REVENDICATIONS 1 Fraction d'IgG caractérisée en ce qu'elle réagit avec les IgM ou les F (ab')2 d'IgG avec un taux d'enrichissement supérieur à 20 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales, et en ce qu'elle ne réagit pas avec l'anatoxine tétanique et l'antigène HBs avec un taux d'enrichissement inférieur à 2 et 5 respectivement par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales.
2. Fraction selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle réagit avec au moins l'un des autoantigènes sélectionnés parmi la myosine, l'actine, la tubuline, et la protéine basique de la myéline (MBP) avec un taux d'enrichissement supérieur à

10 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales.
3. Fraction selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle réagit avec la myosine, l'actine, la tubuline, et la protéine basique de la myéline (MBP).
4. Fraction selon l'une des revendications 1à 3 caractérisée en ce qu'elle réagit avec les IgM ou les F (ab')2 d'IgG avec un taux d'enrichissement supérieur à 50 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales, avec la myosine, l'actine, la tubuline, et la protéine basique de la myéline (MBP) avec un taux d'enrichissement moyen compris entre 20 et 100 par rapport à l'activité des IgG polyvalentes initiales.
5. Procédé de préparation de fractions d'IgG caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Préparation d'un support insoluble sur lequel sont greffées des IgG ou des IgM polyvalentes, b) adsorption d'IgG polyvalentes sur le support obtenu à l'étape a),

<Desc/Clms Page number 23>

c) élution des IgG retenues sur la partie des immunoglobulines liées au support de façon à recueillir la fraction connectée par interactions idiotypiques IgG-IgG ou IgMIgG, d) sélection des fractions présentant une réactivité vis-à-vis des IgM ou des F(ab')2 d'IgG, pas ou peu de réactivité vis-à-vis d'antigènes du non-soi et/ou une polyréactivité vis-à-vis d'autoantigènes donnés.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce que les fractions d'IgG sont préparées à partir d'IgG polyvalentes ou toute autre fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des IgIV à usage thérapeutique.
7. Procédé selon l'une des revendications 5 et 6 caractérisé en ce que l'étape d) comprend une mesure du taux d'enrichissement en anticorps réactifs contre les

IgM ou les F (ab')2 d'IgG utilisées pour la purification.
8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce que l'étape d) comprend une mesure de la réactivité pour l'anatoxine tétanique et l'antigène HBs en prenant le taux d'enrichissement comme valeur contrôle.
9. Procédé selon l'une des revendications 5 à 8 caractérisé en ce que l'étape d) comprend un test ELISA effectué sur un panel d'autoantigènes sélectionnés notamment parmi l'actine, la myosine, la MBP, et la tubuline.
10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9 caractérisé en ce que l'étape d) comprend un test de compétition pour contrôler l'activité neutralisante des fractions vis-à-vis d'autoanticorps provenant de sérum de patients atteints de maladies autoimmunes.
11. Procédé selon l'une des revendications 5 à 10 caractérisé en ce que l'étape d) comprend un test d'inhibition de la réaction lymphocytaire mixte avec des cellules humaines pour contrôler la réactivité des Ig purifiées.

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12. Procédé selon l'une des revendications 5 à 11 caractérisé en ce que l'étape a) consiste en un greffage d'IgG ou d'IgM polyvalentes sur un support solide, notamment sur un gel de Sepharose, de Trisacryl, d'Affiprep# ou sur un gel activé avec CNBr, NHS ou C5H8O2 (glutaraldéhyde).
13. Procédé selon l'une des revendications 5 à 12 caractérisé en ce que les IgG déposées sur le support solide obtenu à l'étape a) sont adsorbées soit sous forme d'IgG polyvalentes lyophilisées et remises en solution ou sous forme liquide, soit sous forme de fractions intermédiaires obtenues au cours d'un procédé de fabrication d'IgG polyvalentes.
14. Procédé selon l'une des revendications 5 à 13 caractérisé en ce que l'élution des

IgG retenues à l'étape b) est effectuée avec un tampon d'ions dissociant la liaison

Ag-Ac, sélectionnés notamment parmi les chaotropes tels que la glycine-HCI, dans des conditions faisant varier le pH, de préférence entre 2. 8 à 4. 0 et/ou la molarité du tampon.
15. Procédé selon l'une des revendications 5 à 14 caractérisé en ce que l'absorption est effectuée dans des conditions de température allant de 4 à 40 C et en PBS.
16. Procédé selon l'une des revendications 5 à 15 caractérisé en ce qu'on sélectionne à l'étape d) des fractions selon l'unes des revendications 1 à 4.
17. Procédé de fabrication industrielle de fractions présentant une réactivité vis-à-vis des IgM ou des F (ab')2 pas ou peu de réactivité vis-à-vis d'antigènes du non-soi et une polyréactivité vis-à-vis de certains autoantigènes caractérisé en ce qu'on met en #uvre les étapes a) b) c) de la revendication 5 en respectant ou en adaptant les paramètres utilisés lors de la préparation des fractions d'intérêts préalablement sélectionnées.
18. Fractions susceptibles d'être obtenues à partir d'un procédé selon l'une des revendications 5 à 17.

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19. Utilisation d'une fraction d'IgG selon l'une des revendications 1 à 4 et 18 pour la préparation d'un médicament.
20. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies autoimmunes, de la GVH, et/ou du rejet de greffe après transplantation.
21. Utilisation selon la revendication 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de la maladie de Kawasaki, au traitement de la rétinochoroïdite de

Birdshot, éventuellement en association avec une corticothérapie, au traitement des cytopénies, des hémophilies avec inhibiteurs (autoanticorps anti-facteur VIII), et/ou pour prévenir et/ou empêcher le rejet immunitaire de greffes de cellules et/ou d'organes et le développement de la GVH après la greffe de cellules hématopoïétiques allogéniques.
22. Utilisation selon la revendication 20 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies neurologiques, notamment la maladie de Guillain-Barré de l'adulte, les polyneuropathies inflammatoires chroniques démyelinisantes, les dermatomyosites, la myasthénie, et/ou la sclérose en plaques.