ES2228425T3 - Procedimiento de purificacion de fracciones ig conectadas que presenta una acitividad inmunomoduladora. - Google Patents
Procedimiento de purificacion de fracciones ig conectadas que presenta una acitividad inmunomoduladora.Info
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Abstract
Procedimiento de preparación de fracciones de Ig, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: a) preparación de un soporte insoluble sobre el que se injerta un compuesto seleccionado de entre las IgG, las IgM polivalentes y el DNP-Lisina, b) adsorción de Ig polivalentes sobre el soporte obtenido en la etapa a), c) elución de las Ig retenidas sobre la fracción de las inmunoglobulinas unidas al soporte, de forma que se recupere la fracción conectada por interacciones idiotípicas IgG-IgG o IgM-IgG; o elución de la fracción que interactúa con el DNP, d) selección de las fracciones que presentan: I) una reactividad respecto a las IgM, las F(ab'')2 de IgG o al hapteno DNP; y II) que no muestran reactividad o reactividad escasa respecto a los antígenos no propios, y/o III) una polireactividad respecto de por lo menos uno de los autoantígenos seleccionados de entre miosina, actina, tubulina y la proteína básica de la mielina (MBP), estando I y III) caracterizados por una reactividadenriquecida de las fracciones respecto a la de las IgG polivalentes iniciales, según una tasa de enriquecimiento superior a 20 y 10, respectivamente, y e) selección de las fracciones mediante una prueba de inhibición de la reacción linfocitaria mixta con células humanas, para controlar la reactividad de las Ig purificadas.
Description
Procedimiento de purificación de fracciones de Ig
conectadas que presenta una actividad inmunomoduladora.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de preparación de fracciones de Ig a partir de
inmunoglobulinas intravenosas polivalentes humanas (IgIV) que serían
responsables, más particularmente, del efecto inmunomodulador
observado durante los tratamientos de ciertas enfermedades
autoinmunes. La invención se refiere a las fracciones de Ig que
poseen una reactividad respecto a las IgM, las F(ab')2 de IgG
o del hapteno DNP y no la poseen o la poseen escasa respecto a los
antígenos no propios, es decir de las fracciones de Ig que presentan
interacciones de tipo idiotípico entre ellas (fracción conectada) o
que comprenden anticuerpos naturales que reaccionan con el hapteno
DNP. Estas fracciones muestran una polireactividad respecto a los
autoantígenos dados.
Las preparaciones de IgIV se utilizan desde hace
muchos años para el tratamiento de múltiples estados patológicos.
Las indicaciones más importantes pueden agruparse en tres dianas
terapéuticas:
- -
- Los déficits inmunitarios primitivos o secundarios,
- -
- El tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes,
- -
- Las complicaciones infecciosas y la enfermedad del injerto contra el huésped después de injertos de células hematopoyéticas alogénicas.
En el caso de los déficits inmunitarios, las IgIV
constituyen un tratamiento sustitutivo que permite aportar IgG cuya
concentración plasmática en los enfermos no sea suficiente para
neutralizar el desarrollo de infecciones víricas o bacterianas.
Para las enfermedades autoinmunes, la eficacia de
las IgIV está relacionada con efectos inmunomoduladores complejos.
Prescritas en el ámbito de los injertos de médula ósea, las IgIV
corresponden a un tratamiento sustitutivo que espera la
reconstitución inmunológica de los individuos que han recibido el
injerto y ejercen un efecto inmunomodulador para la enfermedad del
injerto contra el huésped.
Las IgIV se preparan a partir de un conjunto de
plasmas que provienen de varios miles de donantes, presentando una
repartición en sub-clases y de especificidades de
anticuerpos que reflejan la de la población general. De este modo,
las IgIV pueden considerarse como un producto que contiene la
totalidad del repertorio de los anticuerpos naturales y de los
anticuerpos dirigidos contra los antígenos externos y los
autoantígenos.
El concepto de inmunorregulación por las IgIV se
ha desarrollado ampliamente desde la demostración de su eficacia en
la púrpura trombopénica auto inmune (PTAI) en 1981 (1). Las IgIV se
utilizaron a continuación en numerosas patologías autoinmunes o
inflamatorias. Ciertas indicaciones, para las cuales la eficacia de
las IgIV se estableció claramente, están reconocidas oficialmente
por las instancias reglamentarias. Se trata de la PTAI, de la
enfermedad de Kawasaki, en las que previenen muy eficazmente las
complicaciones aneurísmicas (2,3), del injerto de células
hematopoyéticas alogénicas, donde modulan la reacción del injerto
contra el huésped (4) y más recientemente, de la retinocoroiditis de
Birdshot, donde mejoran la agudeza visual y en las que permiten a
veces reducir la corticoterapia (5).
Otras indicaciones se consideran por los expertos
como justificadas. Por ejemplo, ciertas citopenias en las que las
IgIV inducen una mejoría rápida pero a menudo transitoria (6), y las
hemofilias con inhibidores (autoanticuerpos
anti-factor VIII) en las que, como revancha, la
mejoría puede durar (7, 8). Se han obtenido resultados
contradictorios en los abortos de repetición, en ciertas series (9,
10) con tasas de éxitos valorables.
Después de diez años, las IgIV han conocido un
desarrollo muy importante en neurología, gracias a estudios
multicéntricos controlados con criterios de eficacia a la vez
cuantitativos (clasificaciones neurológicas) y cualitativos (número
de pacientes mejorados). Así, en la enfermedad de
Guillain-Barré del adulto, las IgIV son tan eficaces
como los intercambios plasmáticos y se toleran mejor (11, 12). Se
aconsejan al principio en las formas infantiles (13). Son más
eficaces respecto al placebo en las polineuropatías inflamatorias
crónicas desmielinizantes (14) y en las dermatomiositis (15).
También son eficaces y mejor toleradas que los intercambios
plasmáticos durante las crisis agudas de miastenia (16). En fin,
respecto al placebo, las IgIV han demostrado eficacia en las formas
que alternan remisiones y progresos de la esclerosis en placas
(17).
Se han propuesto varios mecanismos para explicar
la diversidad de acción de las IgIV (18):
- -
- El bloqueo de los receptores Fc en la superficie de macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos.
- -
- La neutralización de los autoanticuerpos circulantes por los anticuerpos anti-idiotipo,
- -
- La inhibición de los efectos nefastos debidos a la activación del complemento,
- -
- La modulación de la red de citoquinas,
- -
- y/o la selección de los repertorios inmunitarios por interacción con los linfocitos T y B.
Estos mecanismos podrían explicar los efectos a
la vez precoces y prolongados de las IgIV.
Una fracción (que se denomina conectada) de Ig
puede ser purificada en una columna de afinidad en la que las F
(ab')2 de IgIV se han unido a bolas de Sepharose (19, 20 y 25). Los
IgM contenidos en el suero de individuos normales se unen a los
fragmentos F(ab')2 de los IgG autólogos e inhiben la
asociación de estos IgG a los autoantígenos (21). Los IgM
contribuyen a regular la autoreactividad natural de los IgG mediante
interacciones de tipo idiotípico (21). Estos Ig o sus F (ab')2
pueden inhibir la unión de ciertos autoanticuerpos a sus antígenos,
tal como se ha demostrado mediante ensayos realizados in
vitro (22). La fracción conectada de Ig obtenida a partir de
IgIV contendría en particular anticuerpos que reconocen los
determinantes anti-idiotípicos presentes sobre los
autoanticuerpos IgG o IgM capaces de neutralizarse entre ellos y
alterar la función y la dinámica de la red idiotípica (23). Además,
una fracción de Ig caracterizada porque reacciona con el hapteno
DNP, es descrita como que contiene anticuerpos naturales
polireactivos y autoreactivos (24).
Otros documentos describen el principio general
para la obtención de fracciones conectadas. Entre estos documentos,
se pueden citar la solicitud de patente WO 98/26086 que se refiere a
un procedimiento para preparar una composición purificada de
anticuerpos que incluyen anticuerpos anti-idiotipos,
consistiendo dicho procedimiento en la adsorción de un conjunto de
IgG sobre un substrato sólido que contiene un determinante
idiotípico de un autoanticuerpo, y en una elución.
El documento EP 293 606 describe un procedimiento
general para la purificación de un anticuerpo X por interacción
idiotípica/anti-idiotípica que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- unión de un anticuerpo Y a un soporte sólido, reconociendo dicho anticuerpo el idiotipo de X,
- b)
- puesta en contacto de una muestra que contiene un anticuerpo X con el soporte sólido en un tampón apropiado,
- c)
- elución y
- d)
- recuperación del anticuerpo X purificado.
El documento WO 97/19113 se refiere a la
utilización de anticuerpos monoclonales
anti-idiotipos de tipo IgG como inmunorregulador de
la respuesta inmunitaria, en particular para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes.
Actualmente, la tolerancia y la eficacia de los
IgG polivalentes que se encuentran en el comercio, particularmente
TEGELINE® (LFB, Francia) son reconocidas en particular en el
tratamiento del PTI, de la enfermedad de Kawasaki y de la
retinocoroiditis de tipo "Birdshot", patologías para las cuales
se han obtenido AMM. Sin embargo, las posologías actuales en estas
indicaciones son importantes, y el modo de administración sigue
siendo pesado y complejo (perfusiones de varias horas en medio
hospitalario). El problema consiste pues, en preparar una fracción
activa en las patologías autoinmunes, de forma que se convierta la
preparación en más eficaz y se utilice más
cómodamente.
cómodamente.
El objetivo en el que se basa la presente
invención es, pues, obtener Ig específicas que permitan una
disminución de las posologías, con una eficacia mantenida e incluso
aumentada, una tolerancia mejor, y cuyo modo de administración sea
más simple. Se ha mostrado que las fracciones que responden a los
problemas mencionados anteriormente, es posible prepararlas a partir
de conjuntos de Ig, de forma que muestren una reactividad anti IgM,
anti F(ab')2 de IgG o anti DNP, y poca o nula reactividad
respecto a los antígenos no propios y/o que muestren una
polireactividad respecto a ciertos autoantígenos.
Así, la presente invención se refiere a la
purificación de las Ig contenidas en las IgIV polivalentes que
serían responsables más particularmente del efecto inmunomodulador
observado durante el tratamiento de ciertas enfermedades
autoinmunes. La invención se basa en las características de estas
fracciones de IgG que poseen una reactividad respecto a las IgM,
las F (ab') de IgG o del hapteno DNP y ninguna o escasa respecto a
la anatoxina tetánica y al antígeno HBs (antígenos no propios), es
decir de las fracciones que comportan Ig que presentan interacciones
de tipo idiotípico entre ellas (fracción conectada) o que comprenden
anticuerpos naturales. Estas fracciones muestran una polireactividad
respecto a ciertos autoantígenos.
La preparación de las fracciones de Ig se lleva a
cabo mediante cromatografía de afinidad, utilizando la propiedad de
estas Ig de reconocerse entre ellas, de reconocer las IgM o de
unirse al hapteno DNP. La materia inicial que se utiliza para
obtener estas fracciones proviene de Ig polivalentes,
particularmente de aquéllas que se preparan y comercializan por LFB
(Francia), o de cualquiera otra fracción intermediaria obtenida
durante el procedimiento de fabricación de las IgIV polivalentes de
utilización terapéutica. El procedimiento general de preparación de
las IgIV polivalentes comporta esencialmente las etapas
siguientes:
- -
- Fraccionamiento mediante precipitación, adsorción y /o filtración seguida de ultrafiltración (obtención de una fracción inicial "PSO 1"), del plasma que procede de un conjunto de donantes,
- -
- Tratamiento por la pepsina con pH ácido, formulación, repartición, y liofilización (obtención del producto TEGELINE®),
- -
- Otro tratamiento podría utilizar la cromatografía en colonia intercambiadora de aniones, ultrafiltración, obtención de una fracción intermedia (denominada "PSO 2") y calentamiento, ultrafiltración, formulación y repartición (obtención de una fracción de IgIV líquida).
Por "Ig polivalentes" se entiende, en el
ámbito de la invención, IgG o IgM polivalentes enteras, fragmentos
de IgG polivalentes tales como F(ab')2 o F(ab) y
cualquier fracción intermedia obtenida durante el procedimiento de
fabricación de las IgIV polivalentes.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
una fracción de Ig que reacciona con por lo menos un compuesto
seleccionado de entre las IgM, las F(ab')2 de IgG y el
hapteno DNP, con una tasa de enriquecimiento superior a 20, respecto
a la actividad de las Ig polivalentes iniciales, y porque no
reacciona con la anatoxina tetánica y el antígeno HBs con una tasa
de enriquecimiento inferior a 5 respecto, a la actividad de las Ig
polivalentes iniciales.
Esta fracción de Ig puede consistir en una
fracción de IgG o una fracción de IgM. Preferentemente, reacciona
con un compuesto seleccionado de entre las IgM, las F (ab')2 de IgG
y el hapteno DNP con una tasa de enriquecimiento superior a 40,
respecto a la actividad de las Ig polivalentes iniciales.
La fracción según la invención puede reaccionar
igualmente con por lo menos uno de los autoantígenos seleccionados
de entre la miosina, actina, tubulina y la proteína básica de la
mielina (MBP), con una tasa de enriquecimiento superior a 10,
preferentemente 20 respecto a la actividad de las Ig polivalentes
iniciales.
Ventajosamente, la fracción reacciona con el
conjunto de los autoantígenos a los que se ha aludido
anteriormente.
Una fracción preferida según la invención puede
definirse como que reacciona con un compuesto seleccionado de entre
las IgM, las F (ab')2 de IgG y el hapteno DNP, con una tasa de
enriquecimiento superior a 40 respecto a la actividad de las Ig
polivalentes iniciales, y con la miosina, actina, tubulina y la MBP
con una tasa de enriquecimiento media superior a 20 respecto a la
actividad de las Ig polivalentes iniciales.
Las fracciones que se han mencionado pueden
reaccionar con las IgM o las F(ab')2 de IgG. Pueden,
asimismo, reaccionar con el hapteno DNP y en este caso, no
reaccionan con las IgM y las F(ab')2 de IgG.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a
un procedimiento de preparación de fracciones de Ig, caracterizado
porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de un soporte insoluble sobre el que se injerta un compuesto seleccionado de entre las IgG, las IgM polivalentes y DNP-Lisina,
- b)
- adsorción de Ig polivalentes sobre el soporte obtenido en la etapa a),
- c)
- elución de las Ig retenidas sobre la parte de las inmunoglobulinas unidas al soporte, de forma que se recupere la fracción conectada por interacciones idiotípicas IgG-IgG o IgM-IgG, o elución de la fracción que interactua con el DNP,
- d)
- selección de las fracciones que presentan una reactividad respecto a las IgM, las F(ab')2 de IgG o al hapteno DNP, y que no muestran reactividad o es escasa respecto a los antígenos no propios y/o una polireactividad respecto a autoantígenos dados, y
- e)
- selección de las fracciones que presentan una actividad inhibidora de la proliferación de los linfocitos en cultivo mixto, preferentemente con una eficacia de 10 a 50 veces superior a TEGELINE®.
En este procedimiento, las Ig absorbidas pueden
ser IgG o IgM.
Las fracciones de Ig obtenidas se preparan a
partir de Ig polivalentes o de cualquier otra fracción intermedia
obtenida durante el procedimiento de fabricación de las IgIV con
utilización terapéutica. Estas Ig polivalentes pueden ser IgG o IgM.
En las Ig polivalentes, existen anticuerpos naturales que
interactuan con el hapteno DNP y anticuerpos que interactuan con los
idiotipos expresados por los autoanticuerpos de tipo IgG o IgM
(fracción conectada) y que poseen una cierta autoreactividad. Por
"fracción conectada" se entiende, en el ámbito de la invención,
una fracción que presenta un porcentaje elevado de Ig que
interaccionan entre ellas o con las IgG o las IgM mediante unión
idiotipo-antiidiotipo.
La estrategia utilizada para determinar, entre
las distintas fracciones, la o las fracciones que poseen las
propiedades que se buscan, es decir, las fracciones que contienen el
título más elevado en autoreactividad y que reaccionan con el número
más elevado de autoantígenos, consiste en someterlas a una criba que
puede suponer varias etapas sucesivas.
Los distintos ensayos in vitro y/o in
vivo que se utilizan permiten seleccionar en cada etapa las
fracciones más activas con criterios más y más específicos.
El procedimiento según la invención puede, pues,
comportar etapas que permiten la selección de fracciones de Ig que
presentan las características dadas.
En este sentido, la etapa d) puede comprender una
medición de la tasa de enriquecimiento en anticuerpos reactivos
contra las IgM, las F(ab')2 de las IgG o el hapteno DNP
utilizados para la purificación.
La etapa d) puede comportar igualmente una
medición de la reactividad para la anatoxina tetánica y el antígeno
HBs, tomando la tasa de enriquecimiento como valor control.
Preferentemente, la etapa d) comprende una ensayo
ELISA efectuado sobre un conjunto de autoantígenos seleccionados
particularmente entre la miosina, actina, tubulina y la MBP.
La etapa d) del procedimiento según la invención
puede comprender además un ensayo de competividad para controlar la
actividad neutralizante de las fracciones respecto a los
autoanticuerpos que proceden del suero de pacientes que presentan
enfermedades autoinmunes, y/o un ensayo de inhibición de la reacción
linfocitaria mixta, con células humanas para medir la capacidad
inhibidora.
Este ensayo de reacción linfocitaria mixta puede
incluir las etapas siguientes:
- -
- obtención de muestras sanguíneas de un donante A y de un donante B incompatible a nivel de los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH),
- -
- purificación sobre ficoll de las células mononucleadas
- -
- cultivo de 2.10^{5} células del donante B en presencia de 2.10^{5} células del donante A,
- -
- medición de la proliferación de las células en el día 4, midiendo la incorporación de timidina tritiada.
La etapa a) consiste en un injerto de las IgG o
de las IgM polivalentes o del DNP-lisina sobre un
soporte insoluble, particularmente sobre un gel de Sepharose®, de
Trisacryl®, de Affiprep®, de Affigel®, geles activados con los
agrupamientos CNBr, NHS o C_{5}H_{8}O_{2} (glutaraldehído).
Las Ig depositadas sobre el soporte sólido obtenido en la etapa a),
son adsorbidas bien bajo forma de Ig polivalentes liofilizadas y
vueltas a solubilizar o bajo forma líquida, o bajo forma de
fracciones intermedias obtenidas durante un procedimiento de
fabricación de las Ig polivalentes. Las Ig depositadas comprenden
IgG o IgM.
Ventajosamente, la absorción se realiza en
condiciones de temperatura entre 4º y 40ºC y en tampón fosfato 20 mM
o equivalente que comprende NaCl, cuya concentración puede variar de
0M a 3M.
La elución de las Ig retenidas en la etapa b) se
lleva a cabo preferentemente en la etapa c) con un tampón de iones
que disocia el enlace Ag-Ac o
DNP-Ac, que se selecciona particularmente entre
caotropos tales como glicina-HCl o yoduro de sodio
(NaI) en condiciones que hacen variar el pH, preferentemente entre
2,8 y 4,0.
En una forma de realización particular, este
procedimiento comprende las etapas siguientes:
- a)
- Injerto de IgG o de IgM polivalentes o de DNP-Lisina sobre un soporte sólido o soporte de afinidad (inmunoadsorbente) que se utiliza habitualmente en cromatografía de afinidad. Dichos soportes son bien conocidos por el experto en la materia. Se pueden citar, por ejemplo, un gel de Sepharose®, de Trisacryl®, de Affiprep®, de Affigel®, geles activados con los agrupamientos CNBr, NHS o C_{5}H_{8}O_{2} (glutaraldehído).
- b)
- Adsorción de Ig en tampón fosfato 20 mM o equivalente que comprende NaCl cuya concentración puede variar de 0 M a 3M, sobre el soporte sólido obtenido en la etapa a), que se depositan bien en forma de Ig polivalentes liofilizadas y que se vuelven a solubilizar o bajo forma líquida, bien bajo forma de fracciones intermedias obtenidas durante el procedimiento de fabricación de las Ig polivalentes. Las Ig adsorbidas comprenden IgG o IgM.
- c)
- Elución de las Ig retenidas en la etapa b) con un tampón iónico que disocia el enlace Ag-Ac, seleccionado particularmente entre tales como la glicina-HCl o el yoduro de sodio (NaI) en condiciones que hacen variar el pH, preferentemente entre 2,8 a 4,0, y/o la fuerza iónica, y/o por cualquier otro procedimiento equivalente que permite la ruptura de las uniones IgG-IgG, IgG-IgM o Ig-DNP-Lisina, de forma que se obtengan fracciones de Ig que tengan un perfil de reactividad distinto al de las Ig polivalentes de partida.
- d)
- Medición en ELISA de las tasas de enriquecimiento en anticuerpos reactivos contra las IgM, las F(ab')2 de IgG o el hapteno DNP o TNP utilizados para la purificación, medición de la reactividad para la anatoxina tetánica y el antígeno HBs, tomando la tasa de enriquecimiento como valor control, y medición de la tasa de enriquecimiento en reactividad respecto a un conjunto de autoantígenos seleccionados particularmente entre la actina, la miosina, la MBP y la tubulina.
Como se ha mencionado antes, se puede igualmente
incluir en este procedimiento una etapa suplementaria que comprende
un ensayo de reacción linfocitaria.
En cada caso, la fracción que no se retiene en
las distintas columnas, puede servir igualmente de control además de
para la preparación inicial de Ig.
Por supuesto, ciertos parámetros del
procedimiento pueden modificarse según le convenga al experto en la
materia, mediante simples experiencias rutinarias. La invención se
refiere, pues, igualmente, a un procedimiento mencionado
anteriormente en el que los parámetros se determinan en función de
las fracciones que se han seleccionado previamente en la etapa d).
Se trata de definir los parámetros óptimos para obtener una fracción
que tenga las propiedades particulares que se desean, y aplicar a
continuación estos parámetros a la escala de un procedimiento
industrial según la invención. Dichos parámetros pueden ser los que
caracterizan las fracciones descritas anteriormente. De este modo,
el procedimiento puede adaptarse a la obtención de las fracciones
descritas anteriormente. Igualmente, la invención contempla un
procedimiento de fabricación industrial de fracciones que presentan
una reactividad respecto a un compuesto seleccionado de entre las
IgM, las F(ab')2 de IgG y el hapteno DNP y no la presentan o
la presentan sólo un poco respecto a los antígenos no propios, y una
polireactividad respecto a autoantígenos dados, caracterizado porque
se ponen en marcha las etapas a), b) y c) descritas anteriormente,
respetando o adaptando los parámetros utilizados al llevar a cabo la
preparación de las fracciones de interés seleccionadas
previamente.
La invención tiene igualmente como objeto las
fracciones susceptibles de obtenerse a partir del procedimiento
mencionado anteriormente.
Las propiedades inmunomoduladoras de algunas
fracciones seleccionadas por los ensayos in vitro pueden
determinarse igualmente in vivo en varios modelos animales de
enfermedades autoinmunes y de la enfermedad del injerto contra el
huésped (GVH) después de aloinjertos.
Se han seleccionado varios tipos de modelos en
función del mecanismo de acción puesto en juego:
- -
- Modelos en los cuales la función efectora está asegurada mediante células T o por anticuerpos,
- -
- Modelos en los cuales los mecanismos dependen de la interacción con las F(ab)'2 o las Fc.
Dos enfermedades autoinmunes experimentales en la
rata, en la que la función efectora está asegurada mediante células
T, se han seleccionado más particularmente, pues se han descrito
como sensibles a la administración de IgIV y presentan la ventaja de
poder aportar una respuesta rápida en cuanto a la eficacia de las
fracciones (los efectos protectores son valuables en 4 semanas
aproximadamente). Se trata de los modelos siguientes:
- 1)
- La uveitis autoinmune experimental o UAE inducida por la inyección del antígeno retinal de buey o de su péptido inmunodominante a ratas Lewis.
- 2)
- La poliartritis reumatoide (PR) inducida en ratas Dark Agouti por inyección de colágeno bovino de tipo II.
En cada caso, la gravedad de la enfermedad se
evalúa de forma clínica y/o histopatológica y a lo largo del tiempo
se miden varios parámetros biológicos tales como la pérdida de peso
y la producción de anticuerpos contra el autoantígeno inyectado.
Se ha añadido un modelo de GVH agudo en la rata,
pues esta enfermedad se ha descrito como sensible a la
administración de IgIV. La GVH es inducida en la rata híbrida (Lewis
x Brown x Norway) por inyección de células linfoides que proceden de
ratas Lewis. La enfermedad se evalúa por la pérdida de peso, la
presencia de eritema y la tasa mortalidad.
El modelo animal de anemia hemolítica autoinmune
(AHA) que pone principalmente en juego la acción de los anticuerpos,
está cercano a las patologías hemolíticas observadas en el hombre.
Es inducida por la inyección de hematíes (GR) de rata en ratones C3H
esplentomizados previamente. Esta prueba es útil debido a la
eficacia de las IgIV observada en la anemia hemolítica en el hombre.
El desarrollo de la anemia se sigue por la disminución del número de
GR y la aparición en el suero de los animales de autoanticuerpos
dirigidos contra sus propios hematíes.
El efecto protector del producto TEGELINE®, IgG o
IgM polivalentes o cualquier otro producto intermedio, obtenidos
durante el procedimiento de fabricación de las Ig polivalentes, se
ensaya previamente en estos modelos y se determinan las condiciones
óptimas de administración (dosis, número, plazos y vía de
inyección). Las fracciones seleccionadas se inyectan a dosis de
cinco a veinte veces inferiores a las de TEGELINE^{R} y se mide la
eficacia de estos tratamientos en los distintos modelos de
enfermedades autoinmunes.
Además, se pueden utilizar modelos experimentales
que utilizan células humanas.
- -
- El ratón SCID/NOD humanizado aparece como el mejor modelo para evaluar la eficacia in vivo sobre las células humanas patológicas de las fracciones preseleccionadas por los ensayos sobre los modelos animales.
Los modelos de la cirrosis biliar primitiva, de
la miastenia y de la tiroiditis de Hashimoto se han seleccionado,
pues las células que proceden de estas patologías se han injertado
ya con éxito en ratones SCID. A continuación, se podrán seleccionar
otras patologías.
En una fase ulterior y con el objeto de aumentar
los conocimientos sobre el mecanismo de acción de una fracción dada,
que se demuestre como eficaz, se pueden utilizar otros modelos
complementarios, con el fin de ampliar las indicaciones de
utilización de las fracciones derivadas de las IgIV, tales como
TEGELINE® u otras.
La etapa d) puede pues incluir además uno o
varios ensayos in vitro, particularmente los ensayos
descritos anteriormente.
De este modo, el procedimiento según la invención
permite particularmente la preparación y la selección de las
fracciones cuyas características se han definido anteriormente.
Una vez que las fracciones de interés se han
identificado, los parámetros de las etapas a), b) y c) pueden
utilizarse en el ámbito de un procedimiento industrial de
fabricación de dichas fracciones. Dicho procedimiento con los
parámetros adecuados según las fracciones de interés previamente
seleccionadas, constituye un objeto suplementario de la
invención.
Un aspecto complementario de la invención se
refiere a las fracciones susceptibles de obtenerse a partir del
procedimiento definido anteriormente.
Es necesario tener en cuenta que la descripción
de la presente invención no es limitativa, que los procedimientos
equivalentes y las fracciones equivalentes forman igualmente la
invención.
Las fracciones según la invención presentan
varias ventajas, siendo las principales las siguientes:
- -
- Una disminución de las posologías. Teniendo en cuenta que el nuevo producto propuesto corresponde a una fracción contenida en las Ig polivalentes, la cantidad inyectada de Ig que presenta las propiedades inmunomoduladoras, es inferior a la de las IgIV que se recetan habitualmente. Las dosis eficaces pueden reducirse por un factor de 5 a 20, incluso más. Esta ventaja es considerable, pues las posologías actualmente utilizadas para las Ig polivalentes disponibles son muy elevadas: del orden de 1 a 2 g/kg.
- -
- Una eficacia que se conserva o incluso aumenta, pues el producto está enriquecido en Ig inmunomoduladoras.
- -
- Una mejor tolerancia. Con concentraciones más débiles, la tolerancia del nuevo producto está mejorada. Efectivamente, es necesario actualmente tomar ciertas precauciones durante la administración de las IgIV con, particularmente, una perfusión lenta del producto durante varias horas, para evitar ciertos efectos secundarios, como por ejemplo, reacciones alérgicas.
- -
- Una prescripción simplificada. La administración de dosis débiles permite instaurar tratamientos ambulatorios que vienen a sustituir a las perfusiones actuales realizadas en medio hospitalario.
Un aspecto complementario se refiere a la
utilización de las fracciones de Ig según la invención para la
preparación de un medicamento. Este medicamento está más
particularmente adaptado al tratamiento de las enfermedades
autoinmunes, de la GVH, y/o del rechazo del injerto después del
trasplante.
Las fracciones según la invención son útiles para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la
enfermedad de Kawasaki, de la retinocoroiditis de Birdshot,
eventualmente asociadas con una corticoterapia, para el tratamiento
de ciertas citopenias, de las hemofilias con inhibidores
(autoanticuerpo anti-factor VIII), y/o para prevenir
y evitar el rechazo inmunitario de injertos de células y/o de
órganos y el desarrollo de la GVH después del injerto de células
alogénicas.
Las fracciones según la invención son igualmente
útiles para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento de enfermedades neurológicas, especialmente la
enfermedad de Guillain-Barré del adulto, las
polineuropatías inflamatorias crónicas desmielinizantes, las
dermatomiositis, la miastenia, y/o la esclerosis en placas.
Se hará alusión a las leyendas de las figuras que
se presentan seguidamente, para continuar la descripción.
Los parámetros del procedimiento de preparación
de esta fracción se explican más en detalle en el ejemplo 1 a
continuación.
FNA significa fracción no absorbida.
Las figuras 1A y 1C ilustran la reactividad
específica respecto a las F(ab')2 de IgG y las figuras 1B y
1D representan la reactividad respecto a los autoantígenos.
Los parámetros del procedimiento de preparación
de esta fracción se explican más en detalle en el ejemplo 2 a
continuación.
Las figuras 2A y 2C ilustran la reactividad
específica respecto a las F(ab')2 de IgG y las figuras 2B y
2D representan la reactividad respecto a los autoantígenos.
Los parámetros del procedimiento de preparación
de esta fracción se explican más en detalle en el ejemplo 3 a
continuación.
Las figuras 3A y 3C ilustran la reactividad
específica respecto a las F(ab')2 de IgG y las figuras 3B y
3D representan la reactividad respecto a los autoantígenos.
Los parámetros del procedimiento de preparación
de esta fracción se explican más en detalle en el ejemplo 4 a
continuación.
Las figuras 4A y 4C ilustran la reactividad
específica respecto a las IgM y las figuras 4B y 4D representan la
reactividad respecto a los autoantígenos.
Las condiciones experimentales del ensayo de
competividad se detallan en el ejemplo 6 que se cita a
continuación:
\ding{110} 47-2 EN
(anti-DNP); \ding{109} 47-4 EN
(anti-DNP); \boxempty Tegeline; \ding{109}
46-8 EA (anti-Tegeline);
\ding{110} 46-9 EA
(anti-Tegeline).
Esta figura representa la evolución de la
clasificación artrítica con las fracciones
DNP-LISINA.
Las modalidades de inducción de la enfermedad,
así como de la administración de los productos se describen en el
ejemplo 7A a continuación.
Las modalidades de inducción de la enfermedad,
así como la administración de los productos, se describen en el
ejemplo 7B a continuación.
Los procedimientos de preparación y de evaluación
de la actividad de fracciones enriquecidas en IgG que presentan la
propiedad de asociarse a otras IgG en las interacciones de tipo
idiotípico, se presentan más detalladamente en los ejemplos que
siguen.
Las IgG polivalentes se acoplaron a un gel de
NHS-Affigel a razón de 21 mg de producto por ml de
gel. Una dosis de 20 g de IgG polivalentes a la concentración de 20
mg/ml, se puso en contacto por recirculación en columna con 21 de
inmunoabsorbente durante 4 horas a 22ºC en PBS. Se realizó
seguidamente la elución en glicina HCL 0,1 M pH 3,25 y el eluado se
concentró sobre una membrana de ultrafiltración que presentaba un
umbral de corte de 30 kD.
Se midió la concentración en nefelemetría. La
tasa de recuperación se eleva a 0,42% en el eluado y a 89% en la
FNA.
La tasa de enriquecimiento en reactividad
respecto a las F(ab')2 de este eluado respecto a las IgG
polivalentes de partida, se eleva a 65.
Esta fracción posee una reactividad enriquecida
con respecto a la de las IgG polivalentes contra varios
autoantígenos y una ausencia de reactividad respecto a la anatoxina
tetánica y al antígeno HBs (véase figura 1 y tabla 1).
Las IgG polivalentes se acoplaron a un gel de
NHS-Sépharose a razón de 10 mg de proteína por ml de
gel. Una dosis de 50 mg de IgG polivalentes a la concentración de 1
mg/ml se puso en contacto por recirculación en columna con 20 ml de
inmunoabsorbente durante 4 horas a 22ºC en PBS. La fracción no
absorbida o FNA se recuperó y se conservó a -80ºC. Se realizó
seguidamente la elución en tampón glicina HCL 0,1 M pH 3,5 y el
eluado se concentró sobre una membrana de ultrafiltración que
presentaba un umbral de corte de 30 kD. La concentración en IgG se
midió por nefelemetría. La tasa de recuperación se eleva a 0,77% en
el eluado, y a 94,7% en la FNA.
La tasa de enriquecimiento en reactividad
respecto a las F(ab')2 de este eluado con relación a las IgG
polivalentes de iniciación, se eleva a 76.
Esta fracción posee una reactividad enriquecida
con relación a la de las IgG polivalentes respecto a diversos
autoantígenos y una ausencia de reactividad respecto a la anatoxina
tetánica y al antígeno HBs (figura 2 y Tabla 2).
La DNP-Lisina se unió a un gel
NHS-Affiprep a razón de 4 mg de producto por ml de
gel. Se puso en contacto una dosis de 60 g de IgG polivalentes, a la
concentración de 50 mg/ml, por recirculación en columna con 2 l de
inmunoabsorbente durante 4 horas a 22ºC en PBS. Se llevó a cabo la
elución seguidamente en yoduro de sodio (KI) 2M a pH 7. Después de
concentración sobre una membrana de ultrafiltración con un umbral de
cortado de 30 kD, el eluado se desaló contra PBS sobre una columna
de Sephadex G 25.
La concentración se midió en nefelemetría. La
tasa de recuperación se eleva a 0,12% en el eluado y a 85% en la
FNA.
La tasa de enriquecimiento en reactividad
respecto al TNP-Ova de este eluado, con relación a
las IgG polivalentes de salida, se eleva a 239.
Esta fracción posee una reactividad enriquecida
respecto a la de las IgG polivalentes respecto a diversos
autoantígenos, y una ausencia de reactividad respecto a la anatoxina
tetánica y el antígeno HBs (figura 3 y Tabla 3).
IgM policlonales humanos (pureza del 90%) se
acoplaron a un gel de NHS-Sépharose, a razón de 10
mg de proteínas por ml de gel. Se puso en contacto una dosis de 50
mg de IgG polivalentes a la concentración de 1 mg/ml, con 20 ml de
inmunoadsorbente, durante 4 horas a 22ºC en PBS. La fracción no
adsorbida o FNA se recuperó y conservó a -80ºC. La elución se
realizó seguidamente en tampón de glicina HCL 0,1 M pH 3,5 y el
eluado se concentró por centrifugación sobre membrana de
ultrafltración que presentaba un umbral de corte de 30 kDa.
La concentración en IgG se midió por
nefelemetría. La tasa de recuperación se eleva a 0,20% en el eluado
y al 98,7% en el FNA.
La tasa de enriquecimiento en reactividad
respecto a los IgM de este eluado, con relación a las IgG
polivalentes de inicio, se eleva a 64.
Esta fracción posee una reactividad enriquecida
respecto a las de las IgG polivalentes con relación a varios
autoantígenos y una ausencia de reactividad con relación a la
anatoxina tetánica y el antígeno HBs (figura 4 y tabla 4).
Los linfocitos de un donante A y de un donante B
incompatibles a nivel de las moléculas HLA, se separaron sobre
ficoll y se cultivaron a la concentración de 2X10^{5} por pocillo
en medio PPMI 1640 al que se le añadió 10% de suero de vaca fetal.
Se añadieron al medio concentraciones decrecientes de Tégeline, de
fragmentos Fc o F(ab')2 de Tégeline o de las distintas
fracciones que se han presentado en los ejemplos 1 a 4. Después de 4
días de cultivo a 37ºC en atmósfera de CO_{2}, 1 \muCi = 37 KBq
de timidina tritiada se añadió durante las últimas 6 horas del
cultivo. La medición de las tasas de incorporación de timidina
tritiada a las células humanas que refleja la proliferación, se
llevó a cabo mediante un contador de centelleo \beta. El
porcentaje de inhibición de la proliferación de los linfocitos en
presencia de los diferentes compuestos que se habían añadido al
cultivo, se calculó respecto a la proliferación de las células
mezcladas de los donantes A y B. La tabla 5 presenta los resultados
en términos de dosis en \mug/ml de fracciones o de productos
capaces de dar lugar a una inhibición del 50% de la proliferación de
las células. Las fracciones que se han presentado en los ejemplos 1
a 4 son capaces de inhibir la proliferación de los linfocitos en
cultivo mixto con una eficacia 10 a 50 veces superior a la de
Tégeline.
| NA = no aplicable |
| NT = no ensayado |
Tégéline o las fracciones
anti-Tégéline preparadas según el ejemplo 2 o las
fracciones anti-DNP preparadas según el ejemplo 3,
se incuban, en presencia de anticuerpos biotinilados
anti-ADN que proceden de un paciente afecto de lupus
eritematoso, en una placa de microfiltración recubierta con ADN. El
porcentaje de inhibición de la unión del anticuerpo biotinilado
anti-ADN, con el ADN, se mide en función de la
concentración de Tégéline o de las fracciones que se han añadido.
Los resultados que se presentan en la figura 5 muestran que, para
una misma concentración, las fracciones anti-DNP
inhiben alrededor de diez veces más la proliferación que Tégéline.
Las fracciones anti-Tégéline, al contrario,
favorecen la unión de los anticuerpos patógenos al ADN,
estableciendo interacciones de tipo idiotípico.
Las fracciones enriquecidas en autoreactividad y
que se muestran eficaces en los modelos experimentales de
enfermedades autoinmunes, están destinadas a utilizarse en el
tratamiento de numerosas patologías en las que se ha mostrado que
las IgIV presentan una acción terapéutica, y en particular las
enfermedades autoinmunes, la GVH y el rechazo del injerto después de
realizar un trasplante.
Las fracciones enriquecidas en autoreactividad
procedentes de la elución de IgG polivalentes de un gel de
NHS-Affiprep unido al DNP-Lisina
(fig 3 y ejemplo 3) se inyectaron intraperitonealmente a
distintas dosis a ratas que habían recibido colágeno II para inducir
el desarrollo de una poliartritis reumatoidea. La eficacia de la
protección contra la poliartritis reumatoidea de las fracciones, se
comparó a la obtenida por las mismas dosis de IgG polivalente
iniciales. Los resultados acumulados de dos experimentos
independientes (figura 6) muestran que la dosis eficaz sobre el
desarrollo de la poliartritis reumatoidea de las fracciones que
proceden de la elución del gel de NHS-Affiprep unido
a DNP-Lisina, es diez veces inferior a la dosis
eficaz de Tégéline.
Los ratones NOD machos recién nacidos se
inyectaron tres veces por semanas durante 4 semanas, bien por
Tégéline a la dosis de 1 mg/ratoncillo, o por la fracción
anti-Tégéline o la fracción anti-DNP
a la dosis de 0,1 mg/ratoncillo. El desarrollo de la diabetes se
produjo a las 8 semanas por dos inyecciones de ciclofosfamida (200
mg/kg) espaciadas dos semanas. La figura 7 muestra que el porcentaje
de ratones diabéticos [tasas de azúcar en sangre superiores a 3g/l)
disminuyó significativamente en el grupo de ratones NOD que había
recibido inyecciones de Tégéline (14%) y en el grupo que había sido
inyectado por la fracción anti-DNP (21%), pero no en
el grupo que recibió inyecciones de la fracción
anti-Tégéline comparado con el grupo no tratado
(68%)].
Estas indicaciones no son exclusivas y podrán
ampliarse. Dichas fracciones se formulan con un vehículo
farmacéutico adaptado a una administración intravenosa,
acondicionada sea bajo forma liofilizada, o bien bajo forma líquida
u otra vía (IP, ID, IM) según las indicaciones que se buscan.
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Claims (16)
1. Procedimiento de preparación de fracciones de
Ig, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de un soporte insoluble sobre el que se injerta un compuesto seleccionado de entre las IgG, las IgM polivalentes y el DNP-Lisina,
- b)
- adsorción de Ig polivalentes sobre el soporte obtenido en la etapa a),
- c)
- elución de las Ig retenidas sobre la fracción de las inmunoglobulinas unidas al soporte, de forma que se recupere la fracción conectada por interacciones idiotípicas IgG-IgG o IgM-IgG; o elución de la fracción que interactúa con el DNP,
- d)
- selección de las fracciones que presentan:
- i)
- una reactividad respecto a las IgM, las F(ab')2 de IgG o al hapteno DNP; y
- ii)
- que no muestran reactividad o reactividad escasa respecto a los antígenos no propios, y/o
- iii)
- una polireactividad respecto de por lo menos uno de los autoantígenos seleccionados de entre miosina, actina, tubulina y la proteína básica de la mielina (MBP), estando i) e iii) caracterizados por una reactividad enriquecida de las fracciones respecto a la de las IgG polivalentes iniciales, según una tasa de enriquecimiento superior a 20 y 10, respectivamente, y
- e)
- selección de las fracciones mediante una prueba de inhibición de la reacción linfocitaria mixta con células humanas, para controlar la reactividad de las Ig purificadas.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las Ig absorbidas consisten en las IgG o
las IgM.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque las fracciones
de Ig se preparan a partir de Ig polivalentes o de cualquier otra
fracción intermedia obtenida durante el procedimiento de
fabricación de las IgIV con utilización terapéutica.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque las Ig polivalentes utilizadas para
preparar las fracciones consisten en las IgG o las IgM.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa d)
comprende una medición de la tasa de enriquecimiento en anticuerpos
reactivos contra las IgM, las F(ab')2 de IgG o el hapteno DNP
utilizados para la purificación.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa d)
comprende una medición de la reactividad para la anatoxina tetánica
y el antígeno HBs tomando como valor control la tasa de
enriquecimiento.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa d)
comprende un ensayo de competividad para controlar la actividad
neutralizante de las fracciones anti-DNP respecto a
anticuerpos biotinilados anti-ADN que proceden de un
paciente afecto de lupus eritematoso, midiéndose el porcentaje de
inhibición de la unión del anticuerpo biotinilado
anti-ADN al ADN, en función de la concentración en
Tégéline.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa a)
consiste en un injerto de IgG, de IgM polivalentes o de
DNP-Lisina sobre un soporte sólido, particularmente
sobre un gel de Sepharose®, de Trisacryl®, de Affiprep®, de
Affigel®, geles activados con los agrupamientos CNBr, NHS ó
C_{5}H_{8}O_{2} (glutaraldehído).
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las IgG
depositadas sobre el soporte sólido obtenido en la etapa a) son
adsorbidas bien como IgG polivalentes liofilizadas y resolubilizadas
o bajo forma líquida, o bien como fracciones intermedias obtenidas
durante un procedimiento de fabricación de IgG polivalentes en tapón
fosfato 20 mM que comprende NaCl cuya concentración puede variar
entre 0M y 3M.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la elución de
las Ig retenidas en la etapa b), se lleva a cabo con un tampón
iónico que disocia el enlace Ag-Ac, seleccionado
particularmente de entre caotropos tales como la
glicina-HCl o el yoduro de sodio (NaI) en
condiciones que hacen variar el pH, preferentemente entre 2,8 a 4,0
y/o la molaridad del tampón.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la absorción se
realiza en condiciones de temperatura que oscila entre 4ºC y 40ºC y
en PBS.
12. Fracciones susceptibles de ser obtenidas a
partir de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 11, caracterizadas porque reaccionan con por lo menos uno
de los autoantígenos seleccionados de entre la miosina, actina,
tubulina y la proteína básica de la mielina (MBP), con una tasa de
enriquecimiento superior a 10 respecto a la actividad de las Ig
polivalentes iniciales.
13. Utilización de una fracción de Ig según la
reivindicación 12 para la preparación de un medicamento.
14. Utilización según la reivindicación 13 para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las
enfermedades autoinmunes, de la GVH y/o del rechazo de injerto
después de trasplante.
15. Utilización según la reivindicación 13 para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la
enfermedad de Kawasaki, de la retinocoroiditis de Birdshot,
eventualmente asociadas con una corticoterapia, para el tratamiento
de ciertas citopenias, de las hemofilias con inhibidores
(autoanticuerpo anti-factor VIII), y/o para prevenir
y evitar el rechazo inmunitario de injertos de células y/o de
órganos y el desarrollo de la GVH después del injerto de células
hematopoyéticas alogénicas.
16. Utilización según la reivindicación 13 para
la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de
enfermedades neurológicas, especialmente de la enfermedad de
Guillain-Barré del adulto, de las polineuropatías
inflamatorias crónicas desmielinizantes, de las dermatomiositis, de
la miastenia y/o de la esclerosis en placas.
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