FR2791685A1 - Nouveau polypeptide a activite de type serine-protease produit par p. falciparum - Google Patents
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Abstract
Cette invention concerne un polypeptide isolé, dénommé Pf-SUB2 produit par Plasmodium falciparum, ayant une activité de type sérine-protéase comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ndegre 3 ou la séquence SEQ ID ndegre 4 ou toute séquence d'acides aminés homologue.
Description
La présente invention concerne un nouveau polypeptide à activité de type
sérine-protéase produit par Plasmodium falciparum, et son utilisation comme outil thérapeutique pour la prévention et le traitement d'une infection
par Plasmodium falciparum.
Le paludisme reste l'une des principales maladies parasitaires de l'Homme, en particulier dans les régions tropicales. La plupart des cas mortels sont dus à Plasmodium falciparum, I'une des quatre espèces de Plasmodia infectant l'Homme. La propagation de parasites résistant à l'action combinée de plusieurs médicaments et de moustiques résistant aux insecticides conduit à I( des difficultés majeures dans le contrôle et le traitement du paludisme. Pour cette raison, I'identification de nouvelles cibles thérapeutiques essentielles au développement du parasite est une première étape importante pour le
développement de nouvelles thérapies anti-paludiques ou malariques.
L'invasion des érythrocytes est la phase initiale du cycle asexué In intra-érythrocytaire qui est responsable de tous les symptômes connus du paludisme. Les études de microscopie électronique et de microvideo montrent que l'invasion des globules rouges par les mérozoïtes est un procédé rapide à plusieurs étapes, débutant par l'adhérence du mérozoïte à la surface cellulaire suivie par sa réorientation et son entrée dans la cellule hôte. Cette dernière étape est concomitante avec la libération du contenu de trois organelles du mérozoïte (les rhoptries, les micronèmes et les granules denses) et peut être bloquée par des anticorps dirigés contre des protéines du mérozoïte ou des
inhibiteurs de sérine-protéase.
L'une des étapes les mieux décrites affectées par des inhibiteurs de sérine-protéase est la dernière étape de maturation de la protéine majeure de surface du mérozoïte (MSP1), un candidat vaccinal prometteur. MSP1 est synthétisée sous forme d'un précurseur de 200 kDa qui est protéolysé en deux étapes successives. La seconde affecte le polypeptide C-terminal à ancre GPI
(glycosylphosphatidylinositol) (MSP1-42) dont le clivage produit les polypeptides MSP1-33 et MSP1-19. Cette étape est réalisée par une sérine-
protéase calcium-dépendante liée à la membrane du parasite et son inhibition par des inhibiteurs de sérine-protéase ou par des anticorps interrompt l'entrée
des mérozoïtes dans les globules rouges.
Dans les cellules eucaryotes, la maturation de précurseurs polypeptidiques est un processus conservé habituellement réalisé par des
sérine-protéases calcium-dépendantes de la famille des subtilases, les pro-
protéines-convertases (PC).
Parmi d'autres fonctions, les PC sont impliquées dans la maturation de toxines bactériennes et de glyco-protéines de surface rétrovirales. Partant du fait que la seconde étape de maturation de MSP1 est réalisée par une serine- protéase calcium-dépendante, les inventeurs ont formulé l'hypothèse que P. falciparum synthétisait une protéase de type subtilisine impliquée dans la protéolyse de MSP1-42. Leurs travaux ont abouti à l'identification d'un gène de P. falciparum (dénommé Pf-sub2 (pour P. falciparum-Subtilisin Like Protease 2)) qui spécifie une sérineprotéase
similaire à Pf-SUB1 récemment décrite (Blackman et ai, 1998).
De manière intéressante, bien que P. falciparum soit un organisme eucaryote, le site actif de Pf-SUB2 est hautement similaire à celui des subtilisines procaryotes. En effet, des analyses phylogénétiques du site actif de Pf-SUB2 comparé aux protéases du type subtilisine d'eubactéries, plantes, levures ou organismes eucaryotes supérieurs suggèrent que PfSUB2
définit une nouvelle sous-classe de subtilases comprenant Pf-SUB1, la sérine-
protease tagB de Dictyostelium discoideum et la maturase de mammifère récemment décrite S1P/SKI-1 (Sakai et ai, 1998; Shaulsky et ai, 1995). Le gène Pf-sub2 est transcrit pendant la phase de différenciation du mérozoiïte et
produit une protéine précurseur intégrale de membrane, la forme mature de Pf-
SUB2 étant sécrétée dans les granules denses. La caractérisation de PfSUB2
suggère que cette enzyme est impliquée dans l'étape de maturation de MSP1-
42 et est ainsi une enzyme cruciale pour l'entrée du parasite dans les érythrocytes. La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé de Plasmodium falciparum ayant une activité protéasique de type subtilisine comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 (correspondant à la protéine totale) ou SEQ ID n 4 (correspondant à la protéine sécrétée) ou toute
séquence d'acide aminés homologue de celle-ci.
Par "séquence d'acides aminés homologue", on entend une séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence d'acides aminés représentée à la séquence SEQ ID n 3 ou n 4 ou codée par une molécule d'ADN selon l'invention, uniquement par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité
biologique du polypeptide ou à ses propriétés immunologiques.
Par "activité biologique du polypeptide", on entend son activité protéasique de type sérine-protéase, en particulier son aptitude à reconnaître
In et cliver le polypeptide parasitaire MSP1-42.
L'activité biologique finale peut être celle obtenue après maturation du polypeptide par auto-clivage de la pro-protéine pour aboutir à la
forme enzymatique active (par auto-activation).
Par "propritétés immunologiques" du polypeptide, on entend son
In aptitude à être reconnu par des anticorps spécifiques du polypeptide Pf-SUB2.
Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, tels que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique); d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, I'alanine, la valine, la leucine, I'isoleucine, la
proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est identique à au moins 85 % des séquences SEQ ID n 3 ou n 4, de
préférence au moins 95 %.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). L'alignement des séquences étudiées permet de déterminer leur pourcentage d'identité et de similarité, qui est défini par l'enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions. A cette fin, il est nécessaire d'introduire de manière
artificielle des espaces("gaps") dans les séquences.
Les polypeptides de la présente invention peuvent être synthétisés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides de l'invention peuvent également être synthétisés par les techniques de la chimie de synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits
io secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
La présente invention a également pour objet un acide nucléique isolé ayant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide à activité
sérine-protéase de type subtilisine de Plasmodium falciparum, tel que défini ci-
dessus. Lesdits acides nucléiques de l'invention comprennent de préférence une séquence nucléotidique SEQ ID n 1 (ADNc) ou une séquence nucleotidique SEQ ID n 2 (ADN génomique) ou toutes séquences
nucléotidiques homologues de celles-ci.
Par "séquence nucléotidique homologue", on entend une séquence qui diffère de la séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ ID n 2() 2 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que cette séquence nucléotidique
homologue spécifie un polypeptide homologue tel que défini précédemment.
De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 75 % de la séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ
ID n 2, de préférence encore au moins 85%.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires de la séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ ID n 2, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent
3o de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie
par la relation: Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) -
0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et ai, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989,
pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est
définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force
ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou d'ARN, obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ ID n 2. De telles banques peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'homme de l'art. Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences
obtenues par criblage des banques.
Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes nucléotidiques, hybridant spécifiquement avec la séquence SEQ ID n 1 ou la séquence SEQ ID n 2 selon l'invention. Les conditions d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans des conditions stringentes telles que définies précédemment. De telles sondes font également partie de l'invention. Elles peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection, par des expériences d'hybridation,
notamment d'hybridation "in situ", d'une infection par P. falciparum.
Les sondes de l'invention comportent au minimum 10 nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et au maximum comportent la totalité de la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou
de la séquence SEQ ID n 2 ou de ses brins complémentaires.
Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif,
chimioluminescent ou enzymatique.
Les séquences nucléotidiques de l'invention sont également utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre
variante de celle-ci.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs des utilisations dans le domaine thérapeutique, pour la réalisation de séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager. L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de polypeptides à activité de sérineprotéase de type subtilisine, tels que définis précédemment. De telles séquences sont avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture codant pour les polypeptides à activité de sérineprotéase de type subtilisine au niveau du
transcrit.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants ayant une activité de sérine-protéase de type subtilisine tels que précédemment
définis.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de
produits recombinants connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple
l'éelectroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits ci-
dessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention font également partie de la présente invention. Des exemples de vecteurs d'expression sont pRSET T7 (dans Ecolh), pYES 2 (dans la levure) et DES
(dans les baculovirus).
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de ) manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique
transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de mammifères, telles que les cellules COS-7 et CHO, des cellules du système nerveux telles que les cellules MSC80 et C6, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9 infectées par des baculovirus recombinants, des bactéries
telles que E. coli et des souches de levures telles que L40.
Les cellules hôtes selon l'invention sont utilisables dans un procédé de production d'un polypeptide à activité de sérine-protéase de type subtilisine, procédé dans lequel on cultive des cellules transfectées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide purifiable ayant une activité de sérine-protéase de type subtilisine comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 ou n 4, ou toute séquence d'acides aminés homologue de celle-ci et que l'on récupère ledit polypeptide que l'on purifie. Les polypeptides peuvent également être produits en utilisant des
systèmes d'expression in vitro comme le tysat de réticulocytes (GIBCO).
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les
méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anti-
corps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. 1 L'invention a également pour objet des anticorps poly- ou
monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués.
Ces anticorps ou fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide tel que défini précédemment, administré à un animal, et sont
capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide à activité de sérine-
protéase de type subtilisine selon l'invention.
Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre un polypeptide à activité de sérine-protéase de
type subtilisine selon l'invention selon les modes opératoires usuels.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide, portant un épitope T-dépendant. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de lmg de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al, PNAS USA, 79, 917-921 (1982). A des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième injection, I'anti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode à la chloramine-T et est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de l'homme de l'art,
par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.
Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant des polypeptides immunisants en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin
de former un complexe immunologique en phase solide.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein
(Nature, (1975), vol 256, pp 495-497).
Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être
associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, tout particulièrement les anticorps dirigés contre le site actif de Pf-SUB2 peuvent être utilisés comme outils diagnostiques pour détecter une infection à P. falciparum ou thérapeutiques pour bloquer l'activité de Pf-SUB2
et enrayer l'invasion par Plasmodium falciparum des globules rouges de l'hôte.
2i5 L'invention a également pour objet une composition diagnostique comprenant un acide nucléique, un polypeptide ou un anticorps tel que défini ci-dessus. La composition peut comprendre un acide nucléique, utile comme sonde ou amorce spécifique pour détecter après amplification, un acide
nucléique de P. falciparum appartenant au gène Pf-sub2.
La composition peut également comprendre un polypeptide utile pour la détection par un test classique notamment de type ELISA d'un anticorps spécifique de Pf-SUB2 présent dans un échantillon biologique d'un
hôte infesté par P. falciparum.
La composition peut également comprendre un anticorps utile
pour la détection d'une séquence peptididique antigénique de Pf-SUB2 présent dans un échantillon biologique d'un hôte infesté par P. falciparum.
L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic in vitro d'une infection par P. falciparum comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps/peptide tels que définis précédemment, contenus dans un I") prélèvement biologique d'un hôte infesté par P. falciparum dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre une séquence peptidique de Pf- SUB2/anticorps tels que définis précédemment et le ou lesdits anticorps/peptides et la détection des complexes
immunologiques spécifiques éventuellement formés.
L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par P. falciparum dans un prélèvement biologique comprenant:
- au moins un anticorps/séquence peptidique spécifique de Pf-
SUB2, éventuellement fixé sur un support; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre ladite séquence peptidique et ledit
anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes.
Les tests de liaison utilisés dans le cadre de la présente invention
peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
On peut notamment marquer préalablement les composés susceptibles de se lier au polypeptide récepteur, qui peuvent être utilisés seuls ou en compétition
avec d'autres composés non marqués.
Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de
liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA.
Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des moyens de marquage pour détecter le polypeptide récepteur selon l'invention, les anticorps
dirigés contre ce récepteur et/ou les ligands de ce récepteur.
ll Les moyens de marquage utilisés peuvent être notamment un agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement à des anticorps ou à des antigènes sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de marquage. L'invention a aussi pour objet un procédé de criblage de l'activité I( protéase recombinante ou purifiée à partir d'une culture de Pf-SUB2, dans lequel on met en contact un milieu de culture susceptible de contenir Pf-SUB2 avec le substrat de Pf-SUB2, et on détermine l'activité enzymatique résultante par fluorescence ou par immuno-empreinte, la mesure de l'activité étant
évaluée par le taux de dégradation du substrat.
L'invention a également pour objet un procédé de criblage de composés ayant une affinité biologique pour le polypeptide Pf-SUB2 ou un polypeptide homologue dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide et on évalue le taux d'affinité entre lesdits composés et ledit
polypeptide.
Le procédé de criblage est particulièrement utile pour le criblage d'inhibiteurs de Pf-SUB2, et peut consister à mettre en contact le polypeptide Pf-SUB2 ou un fragment actif de celui-ci avec des composés potentiellement inhibiteurs en présence d'un substrat du polypeptide, et à évaluer le taux d'inhibition du polypeptide Pf-SUB2 par les composés potentiellement inhibiteurs. Comme substrat, on utilise avantageusement un peptide
fluorogénique dont la séquence correspond au substrat MSP1-42.
L'invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant une molécule inhibant l'activité du polypeptide Pf-
SUB2 obtenue par un procédé de criblage tel que défini précédemment, la
molécule étant avantageusement un inhibiteur enzymatique de Pf-SUB2.
La maturation de MSP1-42 à la surface du mérozoite ayant lieu dans la circulation sanguine, c'est-à-dire dans un environnement riche en inhibiteurs de protéases impliqués entre autres dans la régulation de la coagulation et de la cascade d'activation du complément, I'enzyme parasitaire responsable de cette maturation (Pf-SUB2) n'est a priori pas sensible aux molécules de l'hôte à activité d'inhibiteurs de protéase. Les inhibiteurs obtenus par un procédé de criblage tels que définis cidessus n'ayant aucun effet sur les enzymes de l'hôte sont donc particulièrement intéressants comme agents thérapeutiques ayant une activité spécifique sur la prolifération de P. falciparum. Les molécules criblées par un procédé tel que décrit précédemment sont utiles en particulier pour la fabrication d'un médicament
destiné à prévenir et/ou traiter une infection à Plasmodium falciparum, et constituent un autre objet de l'invention.
L'invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant un anticorps spécifiquement dirigé contre Pf-
SUB2. L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention ou capable de s'hybrider avec un acide
nucléique ADN ou ARN codant pour tout ou partie du polypeptide Pf-SUB2.
Un tel fragment d'acide nucléique peut comme évoqué précédemment être un oligonucléotide antisens capable d'inhiber la
transcription ou la traduction de Pf-SUB2.
Un tel acide nucléique peut également être un acide nucléique
spécifiant un polypeptide selon l'invention utile comme agent vaccinal.
L'invention a donc également pour objet une composition vaccinale contre une infection à Plasmodium falciparum comprenant à titre d'antigène tout ou partie du polypeptide Pf-SUB2 ou tout ou partie de l'acide nucléique codant pour le polypeptide Pf-SUB2 sous sa forme mature ou sa
forme exprimée, susceptible de fournir des anticorps neutralisants.
Selon le cas, le polypeptide, I'acide nucléique ou l'anticorps est
associé à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être déterminés de manière usuelle par l'homme du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc. 1) Les exemples et figures dont les légendes suivent illustrent l'invention sans la limiter:
LEGENDE DES FIGURES
- La figure 1la) représente la séquence nucléotidique et protéique de la protéase 2 de type subtilisine de Plasmodium falciparum. Les 4611 nucléotides (n accès AJ 132006) correspondant à la séquence d'ADNc du gène de Pf-sub2 est représentée. La séquence de l'intron (143 pb) est 2< représentée en italiques et les extrémités conservées GT/AG sont en gras. Les codons d'initiation et de fin de traduction prédits sont en caractères gras et soulignés. La séquence de la protéine Pf-SUB2 commence par unpeptide signal représenté en caractères gras. Les quatre résidus proposés pour le site actif subtilase, à savoir Asp75?, His793, Asn878 et Ser956 sont encadrés et le segment transmembranaire de l'extrémité C-terminale est souligné par un double trait. Entre parenthèses, sont définis les 259 résidus du domaine catalytique utilisés pour réaliser l'alignement en arbre phylogénétique, tandis que la séquence correspondant à la protéine de fusion avec GST (Gluthanione
S-transferase) est représentée en italiques et soulignée par un trait en pointillés. Les deux sites d'activation (LN) sont soulignés.
- La figure 1 b représente une séquence protéique prédite pour Pf-
SUB2 et l'identification au domaine conservé du site actif de Pf-SUB2 par analogie avec celui de la subtilisine BPN (Bacilus Protéase NOVO (Acc. x )) exprimé par B-amyloquefaciens. Les identités entre les deux sites actifs sont indiqués par - et la similarité des groupes est montrée par:. La
flèche t indique l'interruption de la phase ouverte de lecture de l'intron.
- La figure 2 représente la localisation chromosomique du gène Pf- sub2. Des blocs de chromosomes obtenus à partir du clone 3D7 et de la souche Palo Alto de P. falciparum ont été préparés comme décrits par
Hinterberg et al, (1994).
La sonde d'ADNc (1027 pb) correspondant au domaine catalytique de Pf- SUB2 s'hybride principalement aux chromosomes 1 et 11
I( dans des conditions de lavage à faible stringence (2X SSC/0,1 % SDS).
Cependant, après lavage à 0,5X SSC/0,1 % SDS, la même sonde s'hybride au
chromosome 11 uniquement.
- La figure 3 représente l'analyse en arbre phylogénétique basée sur l'alignement des séquences des domaines catalytiques de 32 subtilases provenant d'organismes variés. L'alignement original a été réalisé en utilisant le programme Clustal W 1,7 (Thompson et ai, 1994) et la matrice de distance a
été déterminée en utilisant le programme PROTDIST (Felsenstein et ai, 1993).
Un dendogramme sans racine a ensuite été construit en utilisant la méthode "neighbor-joining" du programme NEIGHBOR, et le logiciel DRAWTREE a produit l'arbre représenté à la figure 3 (Felsenstein et al, 1993). La plupart des sous-familles de subtilases connues sont représentées à partir de plantes, de
bactéries et d'organismes eucaryotes inférieurs et supérieurs Pf-SUB2 et Pf-
SUB1 se différencient des subtilases eucaryotes connues et apparaissent avoir une similarité plus grande avec les enzymes bactériennes. Les subtilases eucaryotes les plus proches sont tagB de D. discoideum et SI P/SKI-1 humain, et définissent avec Pf-SUB2 et Pf-SUB1 une nouvelle sous-classe de
subtilases eucaryotes.
- Les figures 4A et 4B représentent les résultats de l'analyse de l'expression de l'ARNm de Pf-sub2 au cours du cycle asexué de P. 3( falciparum. La RT-PCR a été réalisée sur de l'ARN total isolé entre 6 et 46 heures après l'invasion des érythrocytes par les mérozoïtes de P. falciparum
(souche Palo Alto) cultivées in vitro.
Sur la figure 4 A, les oligonucléotides de Pf-sub2 ont été choisis de manière à encadrer l'intron de Pf-sub2. Les tailles attendues des fragments amplifiés sont de 880 pb et 737 pb sur l'ADN génomique et l'ADNc respectivement. Sur la figure 4B, la RT-PCR a été réalisée en utilisant deux oligonucléotides spécifiques de Pf-rab6, dans lequel un oligonucléotide chevauchait sur la jonction entre les deux premiers exons de Pf-rab6, de
manière à ce que seul l'ADNc soit amplifié. Comme témoins négatifs, une RT-
PCR a été réalisée sur l'eau.
- La figure 5 représente les résultats d'analyse en Western Blot d'extraits protéiques préparés à partir de schizontes et mérozoïtes segmentés de P. falciparum. Les couloirs 1 et 2 correspondent aux extraits protéiques solubles et insolubles dans Na2CO3 respectivement, préparés à partir des schizontes segmentés. Les couloirs 1' et 2' contiennent la même proportion Ji d'extraits protéiques solubles et insolubles dans Na2CO3 préparés à partir de globules rouges non infectés. Les couloirs 3-3' et 4-4' représentent les résultats d'analyse en Western Blot réalisés sur des protéines solubles et insolubles
dans Na2CO3 extraites à partir de mérozoïtes libres. Les couloirs 1-2, 1'-2' et 3-
4 ont été mis à incuber avec un antisérum dirigé contre la protéine de fusion GST Pf-SUB2 tandis que les couloirs 3'-4' ont été mis à incuber avec un antisérum dirigé contre la protéine GST. Les couloirs 5 et 6 correspondent à l'immunoprécipitation de protéines marquées au S35 de schizontes segmentés réalisées avec des anticorps de souris anti-GSTPf-SUB2 (protéine de fusion)
et anti-GST.
- Les figures 6A, 6B et 6C représentent les résultats d'analyse de localisation de la protéine (Pf-SUB2) par immunofluorescence sur des schizontes segmentés et par immuno-microscopie électronique sur des
mérozoïtes fixés.
Les clichés 6A et 6B montrent un schizonte segmenté fixé et séché à l'air, respectivement incubé avec 25 pg/ml d'iodure de propidium qui marque le noyau du parasite (6A) et avec un antisérum de souris dirigé contre la protéine de fusion GST-Pf-SUB2 (6B). Les anticorps liés ont été détectés ultérieurement avec des anticorps anti-souris couplés à la FITC (isothiocyanate
de fluorescéine) (x 1500). Le cliché 6C représente l'analyse en immuno-
microscopie électronique de coupes fines de mérozoites incluses dans de la résine et mises en présence d'un antisérum de souris dirigé contre la protéine de fusion GST-Pf-SUB2 puis révélées avec des anticorps IgG antisouris
marqués à l'or, M représentant les mitochondries.
- La figure 7 représente l'alignement de 22 résidus entourant le site de maturation LeuZAsn MSP1-42 avec les 38 résidus correspondant à la région du site d'auto-activation prédit de Pf-SUB2. Les identités sont représentées par des traits verticaux et les résidus du même groupe sont
1<) représentées par des pointillés doubles.
- Les figures 8A à 8F représentent la modélisation du site catalytique de Pf-SUB2 associé avec son substrat proposé MSP1-42 défini par
huit résidus (K-F-Q-D-M-L-N-I).
La modélisation est réalisée avec les programmes QUANTA et CHARM (QUANTA est un programme commercialisé par Molecular
Simulations Inc).
Le programme CHARM a fait l'objet d'une publication de Brooks et ai, 1983, en utilisant comme modèle la structure établie pour le complexe de la subtilisine BPN et de son inhibiteur eglin (figures 8A et 8C), ainsi que le complexe formé par la subtilisine Calsberg (B licheniformis) elle-même associée avec l'inhibiteur eglin C. Les aa différents pour Pf- SUB2 par rapport à BPN ont été substitués et les insertions ont été modélisées à partir de la
banque de boucles peptidiques disponibles dans le programme QUANTA.
- La figure 8B représente la visualisation de la modélisation du
domaine cat. de Pf. SUB2 + MSPI-42.
- Les figures 8D, 8E et 8F représentent un agrandissement de la figure 8B permettant de mieux visualiser le site actif de Pf. SUB2 interagissant
avec MSPI-42.
- Les figures 8D et 8E représentent les insertions qui apparaissent comme des boucles de surface distantes de la région liant le substrat avec la possible exception du segment précédent l'aa HIS 793
(incluant Arginine 789) qui pourrait influencer la structure des poches S1' et S2'.
Cette modélisation a été manuellement corrigée pour exclure tout lieu improbable. Cette modélisation a ainsi été modifiée dans le but de minimiser les niveaux d'énergie afin de stabiliser le modèle. Cette correction
est réalisée à l'aide du programme CHARM.
EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
Les inventeurs sont partis d'un clone consistant en un ADNc de 2043 pb d'une EST (séquence partielle exprimée) de P. falciparum obtenu à partir de la collection de l'Université de Floride (code accès n 97791 Chakrabarti et ai, 1994) et l'ont séquence sur un séquenceur "ABI DNA I( sequencer" . Le cadre de lecture ouverte complet (ORF) a été obtenu en initiant des réactions de polymérase en chaîne (PCR) à l'aide de l'oligonucléotide K50 de séquence 5'AACGTCAAAATGACTAGAGC3' combiné avec l'amorce universelle M13 sur la banque d'ADNc d'origine (Chakrabarti et al, 1994). Le fragment amplifié correspondant aux nucléotides 1554 à 2645 a 1I été clone en utilisant le kit de clonage TopoTA (Invitrogen) et séquencé en utilisant le kit de réaction Sequenase (USB-Amersham). Ensuite, I'oligonucléotide K51 5'CGAATGAAGATCTAATTCTCC3' a été utilisé comme amorce pour une réaction de PCR asymétrique sur la banque vectorette d'ADN génomique Dral de Palo Alto (Barale et ai, 1997). Ceci a conduit aux nucléotides 648 à 1655. Enfin, une PCR réalisée sur la banque d'ADNc d'origine en utilisant l'oligonucléotide K53 5' TTTTGTTACTAGCCAAATTC3' et l'amorce universelle M13 a permis d'amplifier un fragment de 750 pb correspondant à l'extrémité 5' de la séquence d'ADNc de Pf-sub2. Chaque fragment amplifié a été séquence en triple exemplaire pour éliminer les erreurs
potentielles introduites par la PCR.
Electrophorèse sur gel en champs pulsés du blot
chromosomique de Palo alto et de 3D7.
L'électrophorèse sur gel en champs pulsés a été réalisée comme décrit par Hinterberg et ai (1994). La sonde d'ADNc Pf-SUB2 a été obtenue par
RT-PCR en utilisant les oligonucléotides suivants Khis 5'-
TCCTACAGATGCTTAGGTC-3' et SUB1 B, 5'-
ATCGAATTCATACAAATTATATMAAGGC-3'. Le fragment d'ADNc de 1027 pb a été marqué par du c-32P par amorçage aléatoire (Megaprime, Amersham) et hybridé pendant 24 heures dans 6X SSC, 0,1 % SDS et 2,5 % de lait écrémé à 0C, lavé à la même température pendant 30 minutes dans 2X SSC (1X SSC : 16,5 mM NaCI, 15 mM citrate de sodium, pH 7,0), 0,1 % SDS ou 0,5X SSC,
0,1 %SDS.
Analyse par ordinateur de Pf-SUB2 et construction de l'arbre phylogénétique Io La prédiction du peptide signal de Pf-SUB2 et de son site de clivage a été réalisée en suivant la technique de Nielsen et ai, (1997), tandis que le domaine de Pf-SUB2 est identifié en utilisant le programme de Rost et ai, (1996). L'analyse phylogénétique des sites actifs de 32 protéases de type subtilisine a été réalisé comme décrit par Siezen et ai, 1997, sauf que l'alignement multiple des séquences de 32 protéases de type subtilisine a été réalisé en utilisant le programme Clustal W 1,7 paramétré pour une faible pénalité d'insertion d'intervalles (Thompson et ai, 1994). Les 259 résidus correspondants à la région totale du site actif de Pf-SUB2 ont été alignés contre les régions correspondantes des 31 autres séquences décrites par Siezen et ai, (1997) ainsi qu'avec Pf-SUB1. L'alignement multiple a été utilisé pour déterminer la matrice de distance à l'aide du programme PRODIST (Felsenstein et ai (1993). Un dendogramme sans racine a été construit en
utilisant la méthode d'association par proximité de séquences ("Neighbor-
joining") de NEIGHBOR et le logiciel DRAWTREE.
RT-PCR (PCR par transcriptase reverse) et identification de I'intron. o30 L'ARN total a été préparé en utilisant du trizol (GIBCO-BRL) et en
suivant les instructions du fabricant. Dans le cas de l'analyse du transcrit Pf-
sub2, les inventeurs ont utilisé les oligonucléotides KB 'GCATCCGGAAATAAAAGTAAC3' et SUB1 décrit précédemment pour amplifier le fragment défini par les nucléotides 2713 et 3593. L'ARN correspondant à environ 106 parasites de chacun des différents compartiments sanguins a d'abord été incubé avec une DNAse1 exempte de RNAse (Mannheim, Boehringer). La synthèse du premier brin d'ADNc a été initiée par
l'oligonucléotide SUBlB en présence de la transcriptase reverse Superscript-
MMLV (GIBCO-BRL). Pour l'analyse par RT-PCR de Pf-rab6, les oligonucléotides Rab6.7 5' GAATTTCAAAACTCGGGAC3' et Rab6.3 'CCTGACCTGCAGTGTCC3' ont été utilisés pour amplifier un fragment d'ADNc de 203 pb (Alves de Castro et ai, 1996). L'oligonucléotide Rab6.7 chevauche la jonction des exons 1 et 2 de Pfrab6. Un témoin négatif pour la RT-PCR a également été réalisé en utilisant en tant que matrice soit une quantité équivalente d'ARN non transcrit de façon inverse ou de l'eau. Les matrices pour les témoins positifs étaient l'ADN génomique de la souche Palo Alto pour Pf-sub2 et un clone d'ADNc pour Pf-rab6 (Alves de Castro et al, 1996). Pour cartographier précisément la jonction intron-exon, un fragment
d'ADN génomique spécifique de Pf-sub2 a été clone et séquencé.
Analyse par Western Blot et immunoprécipitation de Pf-SUB2 Une protéine de fusion Gluthatione-S-Transferase-Pf-SUB2 (GST-Pf-SUB2) correspondant aux résidus 3661 à 4005 (figure 1) a été produite de la manière suivante: les oligonucleotides SUB2A-BamH1 5' TATATGGATCCGCGTAAACATAGTGATMAAG3' et SUB2B-EcoR1 5'GTAGAATTCTTTGGTCTCTTTCTTTC3' ont été utilisés pour amplifier un fragment de 351 pb à partir du clone d'ADNc original et après digestion par BamHil et EcoR1, il a été ligaturé dans le plasmide pGEX-A (Pharmacia). La protéine de fusion GST-Pf-SUB2 a été préparée comme décrit par Frangioni et ai (1993) sauf que la protéine purifiée a été éluée des billes d'agarose gluthanione (Sigma) à l'aide d'un tampon salin phosphate 0,2 % SDS (PBS: 10 mM phosphate de potassium, 145 mM de NaCI, pH 7,4). Des souris CD1 ont d'abord été immunisées par voie sous- cutanée avec 20 pg de la protéine de fusion GST-Pf-SUB2 en présence d'adjuvant de Freund complet cinq injections complémentaires ont été réalisées ultérieurement à l'aide de la même quantité d'antigènes en présence d'adjuvant de Freund incomplet. La même procédure a été suivie pour produire un sérum anti-GST. Des extraits protéiques ont été produits à partir de globules rouges synchrones infestés par la souche knob+ Uganda Palo Alto cultivée in vitro comme décrit par Trager et al, (1976). Des schizontes segmentés ont été enrichis par centrifugation sur un gradient Percoll-sorbitol et les mérozoïtes ont été préparés à partir de schizontes segmentés enrichis par flotation sur gélatine et laissés à maturation jusqu'à libération des mérozoïtes. Les globules rouges infestés et la quantité équivalente d'érythrocytes non infestés ont été rassemblés sous forme de
culots et lysés dans un volume d'eau par traitement de congélation-
décongélation. Les protéines sous forme de culot insoluble ont été ensuite extraites par un traitement avec Na2CO3 en milieu alcalin (100 mM), 30 minutes à 4 C, connu pour discriminer entre les protéines membranaires l périphériques qui sont solubilisées (surnageant) et les protéines intégrales de membranes qui sont insolubles, et sédimentées par une centrifugation à 100 000 g pendant 30 minutes à 4 C. Les extraits protéiques correspondant à approximativement 5.106 globules rouges infestés ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 7,5 % SDS. Après transfert sur nitrocellulose, les analyses de Western Blot ont été réalisées comme décrit
sauf que l'antisérum a été utilisé à une dilution de 1/100 (Barale et ai, 1997).
Les études d'immunoprécipitation ont été réalisées comme décrit par Mattei et ai (1992) à l'aide de protéines de parasites extraites dans 1 % SDS, sauf que des parasites hautement synchrones ont été cultivés en présence de méthionine/cystéine (ICN) marquée au 35S 175 mCi/ml pendant les sept
dernières heures de la schizogonie.
Immunolocalisation de Pf-SUB2 par analyse par fluorescence indirecte (IFA) et microscopie électronique (IEM) Des anticorps de souris anti-GSTPf-SUB2 ou des anticorps de souris anti-GST, (tous deux dilués à 1:50) ont été incubés pendant 30 minutes à 37 C avec des globules rouges infestés, probablement séchés à l'air, et enrichis par flotation sur gel. Des lamelles de microscopie ont alors été lavées à trois reprises pendant 10 minutes dans du PBS et mises à incuber avec des IgG et IgM de chèvre anti-souris conjugués à la fluorescéine (dilution 1:100), (Immunotech) en présence d'iodure de propidium (25 pg/ml). Les lamelles ont ensuite été lavées dans du PBS, scellées en présence de p- phénylènediamine 0,1 % glycérol 0,5 % en tant qu'agent stabilisant la fluorescence et ultérieurement analysées avec un microscope Leica avec un agrandissement
de 1 500 fois sous lumière UV.
Pour la microscopie électronique, des parasites de P. falciparum (Palo Alto) ont été fixés pendant 30 minutes à 4 C avec du formaldéhyde 1 %, glutaraldéhyde 0,1 % dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4. Les échantillons fixés ont été lavés, déshydratés et inclus dans une résine LR White (Polysciences, Inc. Warrington, PA) comme décrit par Aikawa et al, I' (1990). Des coupes fines ont été bloquées dans du PBS contenant 5 % (v/v) de lait écrémé déshydraté et 0,01 % (v/v) de Tween 20. Les grilles ont été incubées avec des anticorps primaires (anticorps anti- GST-Pf-SUB2 de souris ou anti-GST de souris) diluées de 1/50 à 1/200 dans du PBS contenant 1 % de sérum albumine bovine (p/v) et 0,01 % (v/v) de Tween 20 (PBT), pendant 2 2(0 heures à température ambiante. Des témoins négatifs comprenaient du sérum normal de souris et du PBT appliqué en tant qu'anticorps primaire. Après lavage, les grilles ont été incubées pendant une heure avec 15 nm d'lgG de chèvre anti-souris conjugués à l'or (Amersham) dilués au 1:20 dans du PBT, rincé avec du PBT et fixés avec du glutaldéhyde pour stabiliser les particules d'or. Des échantillons ont été colorés avec de l'acétate d'uranyle et du citrate
de plomb, et examinés à l'aide d'un microscope électronique Zeiss CEM902.
Exemple 1: Isolement et caractérisation du qgène Pf-sub2 et caractérisation de la protéine correspondante Les inventeurs ont identifié un fragment de séquence exprimée (EST) de P falciparum dans la collection de l'Université de Floride possedant un cadre de lecture ouverte (ORF), présentant de fortes similarités avec le site actif de subtilisines bactériennes. Ce clone débute au nucléotide 2669 de la séquence Pf-SUB2 complète et comprend une extrémité 3' non traduite (figure 1). En combinant les différentes techniques de PCR assymétriques décrites précédemment, ils ont obtenu le cadre de lecture ouverte complet de 4,3 kb de P. falciparum, dont la taille a été confirmée par digestion avec la nucléase de
Mung Bean (Mc Cutchan et al, 1984).
La séquence d'acides aminés de 1337 résidus de Pf-SUB2 déduite correspond à un polypeptide théorique de 140 kDa (figure 1). Elle commence avec un signal peptidique de 21 résidus et possède un domaine transmembranaire hydrophobe putatif de 19 acides aminés, proche de
l'extrémité C-terminale. Aucun motif GPI suggérant une addition post-
traductionnelle n'a été détecté. Ces observations suggèrent que Pf-SUB2 est une protéine sécrétée et intégrale de membrane de type 1. Il est important de noter que Pf-SUB2 contient les quatre séquences consensus connues pour former le site actif des sérine-protéases de type subtilisine de la super-famille S8 (Rawlings et ai, 1993; Siezen et ai, 1997). La triade catalytique universellement conservée est composée de Asp750, His793 et Ser956, tandis
que la cavité de l'oxyanion impliqué dans la stabilisation du couple enzyme-
substrat met en oeuvre le résidu Asn878 (figure 1). De manière intéressante, les résidus Asn878 et Ser956 du site actif de Pf-SUB2 sont codés par des exons différents séparés par un intron de 143 pb (figure 1). Cet intron est défini par des extrémités conservées GT/AG, à une teneur A/T de 86,7 % tandis que le
reste de la séquence codante est riche en résidus A/T (74,2 %).
Une sonde de 1027 pb correspondant au site actif de Pf-SUB2 s'hybride principalement aux chromosomes 1 et 11 (figure 2). En conditions
plus stringentes, seul le chromosome 11 est identifié, ce qui implique que Pf-
* sub2 est porté par ce chromosome. En accord avec la présence de gènes de la famille des "subtilisines-like" sur d'autres chromosomes, la région du site actif de 259 résidus de Pf-SUB2 présente une identité de 37 % et une similarité de 48 % par rapport à la région équivalente de la protéine Pf-SUB1 récemment décrite (Blackman et al, 1998). Il est intéressant de noter qu'à l'extérieur des régions du site actif, les deux subtilisines parasitaires ne présentent pas de
similarité significative.
L'analyse phylogénétique de la région du site actif de 259 résidus de Pf-SUB2 comparée à 31 sites actifs de type subtilisine exprimés par des organismes variés comprenant des eubactéries, plantes, levures et animaux
eucaryotes supérieurs est représentée à la figure 3. De façon évidente, Pf-
SUB2 s'apparente plutôt aux subtilases bactériennes qu'eucaryotes (figure 3).
Elle présente 44 % de similarité avec le site actif de la subtiline de Bacillus 1o subtilis et seulement 29 % de similarité avec celui de kex2 de Saccharomyces cerevisiae, 34 % avec celui d'ATSERP de Arabidopsis thaliana et 36 % avec celui de PC7 humain, la pro-protéine- convertase de mammifère la plus proche des protéases d'eucaryotes inférieures de type subtilisine (Seidah et al, 1996; Siezen et al, 1997). Parmi les subtilases eucaryotes, seul TAGB (36 %) de Dictyostelium discoideum et SI P/SKI-1 (35 %) de mammifère récemment décrite (Nagase et ai, 1995; Sakai et ai, 1998), présentent une proche parenté avec Pf- SUB2. L'analyse phylogénétique suggère que Pf-SUB2 et Pf-SUB1 appartiennent à la sous-famille des pyrolysine-subtilases, comme montré
précédemment pour Dd-TAGB et SI P/SKI-1 (Siezen et ai, 1997).
Le site actif de Pf-SUB2 présente les deux principales caractéristiques suivantes: - 1) le site consensus de la sérine (GTS956MA) contient une méthionine qui est conservée dans toutes les subtilisines bactériennes, fongiques et de plantes, mais est absente dans les PC eucaryotes. Ce résidu méthionine est présent dans le site actif de Dd-TAGB tandis que SIP/SKI-1
possède une valine.
- 2) le site actif de Pf-SUB2 (D750SG) est identique aux subtilisines bactériennes, tandis que les PC ont un motif (DDG). Dans le cas du site actif
de Dd-TAGB et S1 P/SKI-1, le motif (DDG) apparenté aux plantes est retrouvé.
- Ces observations prises ensemble suggèrent fortement que Pf-
SUB2 avec Pf-SUB1, Dd-TAGB et SiP/SKI-1 définissent une nouvelle sous-
classe de subtilases de type pyrolysine eucaryotes similaires aux enzymes
bactériennes et différentes des PC.
Exemple 2: Transcription du gène Pf-sub2 de P. falciparum
et traduction de la protéine Pf-SUB2.
Une RT-PCR a été réalisée sur de l'ARN total préparé à partir d'anneaux, de trophozoïtes et de schizontes de P. falciparum. Des oligonucléotides spécifiques de Pf-sub2 ont permis d'amplifier le fragment d'ADNc épissé de 737 pb attendues, principalement à partir d'ARN préparé 42
et 46 heures après l'invasion (figure 4A).
La transcription de Pf-sub2 est régulée d'une manière spécifique de la phase du cycle de P. falciparum pour intervenir durant les étapes tardives de la schizogonie de P. falciparum, différant par là de l'expression constitutive
de Pf-rab6 (figure 4B).
Pour identifier le produit du gène Pf-sub2, des analyses de Western Blot et d'immunoprécipitation ont été réalisées en utilisant des extraits
protéiques de mérozoïtes et de schizontes segmentés de P. falciparum.
Comme représenté à la figure 5, les anticorps de souris dirigés contre la protéine de fusion GST-Pf-SUB2 ont permis d'identifier un polypeptide de masse moléculaire apparente de 160 kDa, une masse attendue à partir de la séquence d'acides aminés déduite de Pf-sub2 (figure 1, couloir 2). Ce polypeptide est uniquement détecté dans des extraits protéiques insolubles dans Na2CO3, ce qui est compatible avec le fait que Pf-SUB2 est une protéine membranaire intégrale. Différents polypeptides plus petits sont également identifiés par analyse par Western Blot, ce qui correspond probablement à des produits de maturation et de dégradation, dans la mesure o seul le plus petit polypeptide membranaire intégral de 65 kDa est détecté par immunoprécipitation d'extraits protéiques de schizontes segmentés et marqués au 35S sur les résidus méthionine/cystéine (figure 5, couloir 5). En outre, l'analyse par Western Blot montre que ce polypeptide de 65 kDa est la seule forme de Pf-SUB2 qui persiste dans les merozoïtes (figure 5, couloir 4). Ainsi, il est probable que le polypeptide de 65 kDa ait la forme finale obtenue à l'issue du procédé de maturation à partir du polypeptide précurseur de 140 kDa spécifiques des schizontes (figure 5, couloir 2). Par analogie avec les
subtilisines bactériennes, le polypeptide de 160 kDa correspondrait à la pro-
enzyme inactive et la forme de 65 kDa à la forme active.
Dans le but de localiser la protéine Pf-SUB2, les anticorps dirigés contre la protéine de fusion GST-Pf-SUB2 ont été utilisés par IFA (analyse par immunofluorescence) sur des schizontes segmentés séchés à l'air et produisant un motif ponctiforme (figure 6B) distant du noyau (figure 6A). Des études par immuno-microscopie électronique ont établi que Pf-SUB2 est transportée vers des granules denses à la fois des mérozoïtes en cours de différenciation (schizontes segmentés) et de mérozoïtes libres et des schizontes intraérythrocytaires (figure 6). Dans la mesure o seule la forme de kDa de Pf-SUB2 correspondant vraisemblablement à la forme active de l'enzyme peut être détectée dans les extraits protéiques des mérozoites (figure , couloir 4), et puisque le contenu des granules denses est sécrété pendant les étapes tardives de l'invasion des érythrocytes par les mérozoïtes, Pf-SUB2 joue vraisemblablement un rôle au cours de l'étape d'invasion biologique
essentielle qui initie le cycle asexué intraérythrocytaires de P. falciparum.
Exemple 3: Caractérisation du site d'auto-activation prédit de Pf-SUB2 La subtilisine de B. subtilis et la protéine kex2 de S. cerevisiae, ou de fait la plupart des subtilases connues, éliminent leurs pro-régions par un procédé auto-catalytique. De plus, la séquence du site d'autoactivation mime le site de clivage de leurs substrats spécifiques (Shinde et ai, 1995 Thomas et ai, 1995). En outre, les séquences d'autoactivation sont fréquemment dupliquées dans la même région. Dans la mesure o le site actif de Pf-SUB2 est similaire aux subtilases calcium-dépendantes et du fait de sa localisation à lI'intérieur des organelles sécrétoires des mérozoïtes, Pf-SUB2 est un bon
candidat pour être la maturase de MSP1-42. Le site d'autoactivation de Pf-
SUB2 est vraisemblablement localisé entre les résidus 680 et 720 pour produire le polypeptide de 65 kDa observé dans les extraits de mérozoïtes (figure 5, couloir 4). Ceci placerait le site d'autoactivation environ 50 résidus avant le résidu Asp750 (figure 1), une distance typique pour les subtilases (Siezen et ai, 1997). Les inventeurs ont pour cela aligné les 22 résidus entourant le site de maturation de MSP1-42 conservé avec la région du site d'autoactivation prédit pour Pf-SUB2, à savoir les résidus 680 à 720 (figure 1) et montré que MSP1-42 est clivé au niveau de la liaison dipeptidique LeutAsn qui peut être trouvée en deux exemplaires dans la région du site d'autoactivation de Pf-SUB2 (figures 1 et7). En outre, ces dipeptides sont localisés dans des régions de charges conservées ou dans des résidusgroupés à la fois dans les séquences deMSP1-42 et Pf-SUB2 (figure 7), suggérant que non seulement la séquence du site de clivage est conservée mais également son environnement qui est important en terme de reconnaissance du substrat. La somme des différentes caractéristiques de Pf- SUB2 (stade auquel elle est synthétisée, localisation de la séquence proposée5 de son site d'autoactivation) conduit les inventeurs à proposer que Pf-SUB2 est responsable de la maturation essentielle de MSP1-42, essentielle pour l'invasion.
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Claims (21)
1. Polypeptide isolé, dénommé Pf-SUB2, ayant une activité de type sérineprotéase calcium-dépendante comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 3 ou la séquence SEQ ID n 4 ou toute séquence d'acides
aminés homologue.
2. Acide nucléique isolé codant pour un polypeptide ayant une
activité de type sérine-protéase selon la revendication 1.
3. Acide nucléique selon la revendication 2 comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID n 1 ou la séquence SEQ ID n 2 ou toute
séquence homologue.
4. Vecteur de clonage et/ou d'expression contenant une
séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3.
5. Cellule hôte transformée par un vecteur selon la revendication
JI 4.
6. Anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à partir d'un polypeptide selon la revendication 1, administré à un animal, et sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon la revendication
1.
7. Procédé de production d'un polypeptide recombinant tel que défini dans la revendication 1, dans lequel on cultive des cellules transformées selon la revendication 5 dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi la séquence SEQ ID n 3 ou n0 4, ou toute séquence homologue et on récupère
ledit polypeptide.
8. Oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides, avantageusement d'au moins 14 nucléotides, de préférence d'au moins 20 nucléotides et préférentiellement d'au moins 50 nucléotides consécutifs de la 3 séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ ID n 2, utile comme sonde
spécifique du gène Pf-sub2 de P. falciparum.
9. Couple d'oligonucléotides d'au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID n 1 ou de la séquence SEQ ID n 2 utile comme amorce spécifique pour l'amplification du gène Pf-sub2 de P. falciparum.
10. Composition de diagnostic comprenant un oligonucléoitde et/ou selon la revendication 8 et/ou un couple d'oligonucléotides selon la revendication 9, un polypeptide selon la revendication 1 ou un anticorps selon
la revendication 6.
11. Méthode pour le diagnostic in vitro d'une infection par P. falciparum comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps/peptide tels que definis précédemment, contenus dans un prélèvement biologique d'un hôte infesté par P. falciparum dans des conditions permettant la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre une séquence peptidique de Pf-SUB2/anticorps tels que définis précédemment et le ou lesdits anticorps/peptides et la détection des complexes immunologiques spécifiques
éventuellement formés.
12. Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par P. falciparurn dans un prélèvement biologique comprenant:
- au moins un anticorps/séquence peptidique spécifique de Pf-
SUB2, éventuellement fixé sur un support; - des moyens de révélation de la formation de complexes antigènes/anticorps spécifiques entre ladite séquence peptidique et ledit anticorps et/ou des moyens de quantification de ces complexes
13. Procédé de criblage de l'activité protéase recombinante ou purifiée à partir d'une culture de Pf-SUB2, dans lequel on met en contact un milieu de culture susceptible de contenir Pf-SUB2 avec le substrat de Pf-SUB2,
et on détermine l'activité enzymatique résultante.
14. Procédé de criblage selon la revendication 13 de composés ayant une affinité pour le polypeptide selon la revendication 1, dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit polypeptide et on évalue le taux
d'affinité entre lesdits composés et ledit polypeptide.
15. Procédé de criblage de composés inhibiteurs dudit polypeptide selon la revendication 1, dans lequel on met en contact ledit polypeptide avec lesdits composés potentiellement inhibiteurs en présence d'un substrat dudit polypeptide et on évalue le taux d'inhibition dudit
polypeptide par lesdits composés potentiellement inhibiteurs.
16. Utilisation d'un polypeptide à activité de type sérine-protéase selon la revendication 1 pour le criblage de molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à prévenir et/ou traiter une infection à Plasmodium falciparum. Mb
17. Composés obtenus par le procédé de criblage selon la revendication 14, plus particulièrement composés obtenus selon le procédé de
criblage selon la revendication 15.
18. Composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon la revendication 2 ou la revendication 3 ou un oligonucléotide antisens capable de s'hybrider avec la séquence nucléotidique selon la revendication 2 ou la revendication 3 et d'inhiber la transcription ou la traduction du polypeptide
Pf-S U B2.
19. Composition pharmaceutique comprenant un composé
obtenu par un procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15.
20. Composition pharmaceutique comportant un anticorps selon
la revendication 6.
21. Composition vaccinale contre une infection à Plasmodium falciparum comprenant à titre d'antigène tout ou partie du polypeptide selon la revendication 1 ou tout ou partie de l'acide nucléique selon la revendication 2
ou la revendication 3, susceptible de produire des anticorps neutralisants.
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|---|---|---|---|
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