FR2788698A1

FR2788698A1 - Peptides et proteines aptes a desensibiliser les sujets allergiques au venin d'abeille et compositions les contenant

Info

Publication number: FR2788698A1
Application number: FR9900879A
Authority: FR
Inventors: Bernard Maillere; Sandra Pouvelle; Catherine Texier; Andre Menez
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2000-07-28
Anticipated expiration: 2019-01-27
Also published as: WO2000044887A1; FR2788698B1; CA2360082A1; US6649166B1; EP1144602A1

Abstract

Peptides et protéines aptes à désensibiliser, de manière spécifique, la grande majorité des sujets allergiques au venin d'abeille, compositions contenant lesdits peptides ou protéines ainsi que procédé de sélection desdits peptides en fonction du sujet à désensibiliser.Les peptides sont sélectionnés dans le groupe constitué par : le fragment (1) correspondant aux positions P85-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (2) correspondant aux positions P 81-93 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (3) correspondant aux positions P 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (4) correspondant aux positions P76-88 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (5) correspondant aux positions P77-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille, et le fragment (6) correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille, les fragments (1) et (2) formant le groupe I; le fragment (3) formant le groupe II; les fragments (4) et (5) formant le groupe III et le fragment (6) formant le groupe IV.Compositions contenant lesdits peptides ou protéines.

Description

La présente invention est relative à des peptides et à des protéines aptes à désensibiliser, de manière spécifique, la grande majorité des sujets allergiques au venin d'abeille, à des compositions contenant lesdits peptides ou protéines ainsi qu'à un procédé de sélection desdits peptides en fonction du sujet à désensibiliser.

L'allergie immédiate aux hyménoptères (abeille, guêpe, frelon) touche 15 à 20 % de la population, si l'on tient compte des tests cutanés à lecture immédiate (prick tests), mais seulement 0,1à 0,5 % de la population est exposé à un accident de type anaphylactique (1,2). Cette allergie se caractérise par des manifestations variables allant du gonflement local aux réactions systémiques comme l'urticaire, l'angiodème ou le choc anaphylactique. Compte tenu de la soudaineté des piqûres, la désensibilisation (immunothérapie spécifique ou ITS) par les venins constitue le traitement de choix de cette allergie mais n'est pas sans danger. En effet, 13 % des patients désensibilisés par le venin d'abeille et 5 % dans le cas du venin de guêpe sont victimes d'effets secondaires (3). La recherche d'une ITS mieux tolérée et aussi efficace est donc nécessaire, en particulier pour le venin d'abeille.

La rapidité des réactions observées chez les patients allergiques au venin d'abeille est caractéristique d'une allergie de type immédiate, qui est médiée par des IgE spécifiques des constituants du venin. Le mécanisme complexe de ces réactions est résumé ci-après.

Les IgE apparaissent progressivement sous l'action répétée des piqûres et avant que le moindre symptôme ne soit apparent. Bien que le venin de l'abeille comporte de nombreux peptides et protéines, tous les composants ne semblent par allergéniques (4). La mélittine par exemple n'induit des IgE que chez 30 % des patients, alors que la proportion s'élève à plus de 90 % pour la phospholipase A2 (PLA2) qui est, de fait, considérée comme l'allergène majeur (API ml) (4,5). La séquence protéique de la phospholipase A2 du venin d'abeille (API ml) est illustrée à la figure 1 ; séquence est déduite de celle de l'ADNc complémentaire (36).

Les IgE possèdent la propriété de se fixer par leur fragment Fc à des récepteurs situés sur les mastocytes tissulaires et les basophiles du sang. Lorsque l'allergène se complexe aux IgE spécifiques fixées à la membrane des basophiles ou des mastocytes, il provoque la dégranulation de ces cellules et la libération de molé-

cules qui sont responsables des principales manifestations observées lors de l'accident allergique. Les IgE ne sont cependant pas seules responsables de l'allergie car bien que le taux d'IgE soit un indicateur de la maladie, il n'a aucune valeur diagnostique de l'état des patients. Il n'est pas rare que des patients aient des taux élevés d'IgE sans présenter de symptômes. L'apparition des IgE chez les patients allergiques résulte de la production de cytokines de type TH2 telles que l'IL-4, l'IL-5 et l'IL-13 et est inhibée par la synthèse d'IFN-y (6).

Ce sont principalement les lymphocytes T CD4 qui produisent ces cytokines. On retrouve effectivement chez les patients allergiques des cellules T spéci- fiques qui sécrètent plus d'IL-4 que d'IFN-y, alors que les cellules T isolées chez des sujets non allergiques produisent plus d'IFN-y que d'IL-4.

+
Les lymphocytes T CD4 de type TH2 et spécifiques des composants du venin participent donc activement à l'apparition et au maintien de l'allergie.

Pour protéger les sujets allergiques au venin d'abeille, il a été pro- posé, depuis longtemps, de désensibiliser les sujets allergiques par immunothérapie spécifique (ou ITS). Les mécanismes immunologiques de l'ITS, responsables de l'amélioration de l'état du patient restent mal compris. L'induction d'IgG spécifiques et + de sous-classe IgG4 (7) ainsi que la génération de cellules T CD8 suppressives (8) ont initialement été proposées pour rendre compte de l'efficacité du traitement. Mais plus récemment, il a été observé qu'au cours de la désensibilisation au venin d'abeille, la + prolifération des lymphocytes T CD4 spécifiques de l'allergène décroît alors que la sécrétion de l'IL-4 et de l'IL-5 diminue (9,10) ou est détournée vers la production d'IFN-y (11). Des résultats très similaires ont été également obtenus avec des aller- gènes de pollens (12). Ces observations semblent indiquer que l'amélioration de l'état du patient résulte d'une tolérance périphérique ou d'une dérive vers un profil de type + TH1 des lymphocytes T CD4 spécifiques de l'allergène. Elles sont de plus en accord avec des expériences effectuées chez l'animal. Il a été en effet montré pour plusieurs antigènes que dans des conditions d'injection proches de celles utilisées pour désensi- biliser (telles que l'injection sous-cutanée) l'anergie des lymphocytes T est induite

alors qu'une forte réponse est observée pour les mêmes antigènes lorsqu'ils sont injec- tés en présence d'adjuvant (13,14). L'ensemble de ces expériences permet de considé- + rer les lymphocytes T CD4 spécifiques du venin d'abeille comme les cellules cibles de l'immunothérapie.

+
Les lymphocytes T CD4 possèdent un récepteur T réarrangé qui leur permet de reconnaître sélectivement les fragments peptidiques issus de la dégra- dation de l'antigène par les cellules présentatrices et présentés par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe II (CMH II) (15). Les déterminants que portent ces fragments peptidiques et que reconnaissent effectivement les lympho- cytes T sont appelés épitopes T.

Lors de la désensibilisation, ce sont ces déterminants qui sont recon- nus par les lymphocytes T et qui donc constituent les éléments de base pour l'élabora- tion de molécules alternatives d'immunothérapie spécifique.

Il a été en effet observé in vivo chez la souris pour les allergènes Fel dl(poil de chat), Der p1(acarien : Dermatophagoïdes pterissimus) et Bet v1 (pollen de bouleau) que l'administration par voie nasale, orale ou sous-cutanée de peptides porteurs d'épitopes T de ces allergènes inhibe l'activation des lymphocytes T spéci- fiques (16-18) et module la réaction allergique (16,18).

Idéalement, les molécules de désensibilisation doivent posséder tous les épitopes de l'allergène et être dépourvues de réactivité vis-à-vis des IgE, de manière à éviter les risques d'accidents.

Plusieurs types de molécules sont d'ores et déjà à l'étude y compris dans le cadre de l'allergie au venin d'abeille et sont constitués soit de fragments pepti- diques, soit de protéines modifiées.

. Fragments peptidiques
Par une démarche empirique, l'utilisation de fragments peptidiques (19) pour désensibiliser les patients allergiques a été à plusieurs reprises proposée comme alternative à la désensibilisation spécifique conventionnelle y compris pour l'allergie au venin d'abeille (20,21).

Ces fragments ne possèdent généralement plus de réactivité vis-à-vis

des IgE, mais peuvent également avoir perdu leur capacité à être reconnus par les lymphocytes T.

Plus récemment, des fragments peptidiques d'allergène ont été choi- sis sur la base de leur capacité à stimuler des lymphocytes T de patients allergiques (22).

Dans le cas de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml), les fragments 50-69 et 83-97 ont été décrits comme étant actifs lors d'une étude compre- nant un seul patient (23).

Dans une étude comprenant quarante patients (24), ce sont les frag- ments 45-62 et 81-92 et 113-124 qui se sont révélés être actifs. Ces trois fragments ne sont épitopes T que pour 25 à 45 % des patients et les auteurs n'excluent pas l'exis- tence d'autres épitopes (24,25). Ces trois peptides sont en cours d'essai clinique et semblent donner des résultats encourageants (22). Muller et al. (22) les ont utilisés pour désensibiliser cinq patients allergiques dont les lymphocytes T prolifèrent en présence de ces peptides. Aucun effet systémique grave n'a été observé et les patients sont devenus tolérants aux piqûres d'abeille. Ceci démontre l'intérêt de l'utilisation de peptides pour désensibiliser, mais ne permet pas d'étendre l'utilisation de ces peptides à d'autres patients.

Un autre essai utilisant des peptides a été mis en place pour l'aller- gène du chat (Fel dl) (26). Plusieurs demandes relatives à des peptides du ragweed (WO 93/21321 ; 96/13589), du pollen du cèdre japonais (WO 93/01213 ; 94/01560) et du pollen de ray-grass (WO 94/21675 ; WO 94/16068) ont été déposées.

Tous les peptides décrits dans ces demandes ont été choisis sur la base de la stimulation de lymphocytes T d'un échantillon de patients allergiques.

La démarche suivie par ces différents auteurs (23,24 et 30) est basée sur des tests cellulaires et non sur des tests de liaison. Les résultats observés montrent que les peptides actifs varient selon les patients. Dans ces trois dernières études, les peptides contenant la zone 80-90 sont ceux qui sont le plus souvent épitope T. Ils montrent également que les lymphocytes de plusieurs patients sont stimulés par des peptides contenant la partie C-terminale de API ml.

Par exemple, Kammerer et al. (30) propose, selon le même principe du test de stimulation, d'utiliser de longs fragments d'API ml, en particulier le frag- ment 90-134. Toutefois, ces fragments sont spécifiques de certains patients et ne sont pas adaptés à un ensemble significatif de patients, du fait que leur sélection ne tient pas compte du type HLA des patients.

Les tests de stimulation permettent en effet de sélectionner des peptides adaptés à la désensibilisation d'un patient donné (22), mais ne permettent pas d'étendre l'utilisation de ces peptides à d'autres patients que ceux pour lesquels ils ont été élaborés.

. Protéines modifiées
Une autre alternative à l'utilisation d'allergènes natifs est celle d'allergènes modifiés de telle sorte qu'il n'y ait plus de réactivité vis-à-vis des IgE spécifiques de l'allergène, tout en conservant leur réactivité vis-à-vis des lymphocytes T.

Les IgE étant principalement dirigées contre des épitopes conformationnels, la perte de réactivité peut être facilement obtenue en détruisant la structure tridimensionnelle de l'allergène ce qui ne modifie par les épitopes T. C'est ce qui a été fait pour des mutants de Der f2 (27) et Der p2 (28) dans lesquels des ponts disulfures ont été rompus. Une autre façon de procéder est d'introduire dans l'allergène des mutations ponctuelles qui affectent la reconnaissance des IgE sans modifier la structure tridimensionnelle (29). Le faible nombre de mutations introduites est censé ne pas modifier les épitopes T.

Les différences importantes observées entre études traduisent la variabilité interindividuelle des épitopes T et rendent évidemment difficile le choix des molécules de désensibilisation. De plus, ces études qui n'utilisent qu'un échantillon de patients allergiques ne permettent pas d'assurer que tous les épitopes T sont conservés dans la molécule de désensibilisation.

C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à désensibiliser la grande majorité des sujets allergiques au venin d'abeille.

Un tel ensemble de peptides a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'Art antérieur sont actifs chez un

sujet allergique mais peuvent être totalement inefficaces pour un autre sujet parce que ce dernier ne reconnaît pas l'allergène par les mêmes déterminants.

Pour ce faire, les Inventeurs ont défini une relation entre les séquences peptidiques de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et des molé- cules du CMH de classe II, notamment les allèles du gène HLA-DRB 1, prépondérants dans les populations caucasiennes. Cette relation permet, de manière inattendue, de définir des molécules de désensibilisation et de traitement préventif de l'allergie au venin d'abeille qui tiennent compte du polymorphisme du CMH de classe II, notamment des molécules HLA-DR, et qui de par leur grande spécificité, induisent une meilleure désensibilisation qui se traduit par un risque significativement diminué des accidents (chocs) en cours de désensibilisation. Ceci représente un atout supplé- mentaire pour l'utilisation de tels peptides à titre préventif.

Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II (HLA II chez l'homme) sont des hétérodimères exprimés sur les cellules + présentatrices et présentent aux lymphocytes T CD4 les épitopes T des antigènes. Ces molécules sont capables de lier un répertoire important de peptides ayant des séquences très différentes, ce qui leur permet de présenter aux cellules T plusieurs peptides par antigène.

Il existe quatre types différents de molécules du CMH II par indi- vidu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne ss est codée par le gène DRB est la plus exprimée. On répertorie, actuellement plus de 200 allèles différents pour DRB1, qui définissent différents antigènes ou types, comme résumé dans le Tableau 1 ci-après.

Tableau 1: Molécules exprimées par différents allèles HLADRB1

<tb>
<tb> Antigène <SEP> Allèle <SEP> Alias
<tb> DR1 <SEP> DRB1*0101 <SEP> DR1
<tb> DR2 <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> * <SEP> 1501 <SEP> DR2w2b
<tb> DR3 <SEP> DRB <SEP> 1*0301 <SEP> DR3wl7
<tb> DR4 <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> *0401 <SEP> DR4w4
<tb> DRB <SEP> 1*0405 <SEP> DR4w <SEP> 15 <SEP>
<tb> DR7 <SEP> DRB <SEP> 1*0701 <SEP> DR7
<tb> DR8 <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> *0802 <SEP> DR8w2
<tb> DR9 <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> *0901 <SEP> DR9
<tb> DR11 <SEP> DRB1*1101 <SEP> DR5wll
<tb> DR12 <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> * <SEP> 1201 <SEP> DR5wl2
<tb> DR13 <SEP> DRBI*1301
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> * <SEP> 1302 <SEP> DR6wl9
<tb>

Chaque allèle possède ses propres propriétés de liaison. Il lie donc un répertoire de peptides qui lui est propre et qui diffère de celui d'un autre allèle, même sur un même antigène. La spécificité large des molécules HLA II et l'existence de plusieurs isoformes et d'un polymorphisme important font que de nombreux fragments différents de l'antigène peuvent être présentés aux lymphocytes T.

Les fréquences de chaque allèle ne sont pas identiques et varient d'une population à l'autre (35) : - l'allèle DRB 1 * 1304 représente à lui seul 25,4 % des allèles de la population sénégalaise contre 0 % en Allemagne et au Japon.

- l'allèle DRB 1 *0301 est observé avec une fréquence de 10 % chez les sénégalais et les allemands mais seulement à 0,4 % chez les japonais.

- en France, seuls sept allèles dépassent les 5 %. Il s'agit des allèles DRB1*0101, DRB1*0301, DRBl*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB 1 * 1501, comme illustré au Tableau II, ci-après.

Tableau II : Fréquence des allèles HLA-DR dans plusieurs populations caucasiennes

<tb>
<tb> FRA <SEP> DAN <SEP> GER <SEP> ITA <SEP> ROU <SEP> SPA <SEP> US <SEP> CAN
<tb> DRB1*0101 <SEP> 9,3 <SEP> 13,0 <SEP> 6,7 <SEP> 6,5 <SEP> 7,6 <SEP> 6,6 <SEP> 7,3 <SEP> 5,6
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> *0301 <SEP> 10,9 <SEP> 10,2 <SEP> 9,4 <SEP> 10,5 <SEP> 11,4 <SEP> 6,7 <SEP> 9,5 <SEP> 12,3
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> *0401 <SEP> 5,6 <SEP> 17,6 <SEP> 8,1 <SEP> 2,3 <SEP> 4,2 <SEP> 5,6 <SEP> 6,7 <SEP> 9,5
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> *0701 <SEP> 14,0 <SEP> 14,8 <SEP> 12,3 <SEP> 12,5 <SEP> 8,3 <SEP> 18,9 <SEP> 14,4 <SEP> 9,4
<tb> DRB1*1101 <SEP> 9,2 <SEP> 0,9 <SEP> 9,2 <SEP> 12,4 <SEP> 7,3 <SEP> 1,0 <SEP> 4,4 <SEP> 2,6
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> * <SEP> 1301 <SEP> 6,0 <SEP> 8,3 <SEP> 4,5 <SEP> 4,8 <SEP> 4,4 <SEP> 4,5 <SEP> 5,1 <SEP> 4,7
<tb> DRB1*1501 <SEP> 8,0 <SEP> 17,6 <SEP> 7,8 <SEP> 5,6 <SEP> 6,2 <SEP> 9,4 <SEP> 10,3 <SEP> 10,4
<tb> Total <SEP> 63 <SEP> 82 <SEP> 58 <SEP> 55 <SEP> 49 <SEP> 53 <SEP> 58 <SEP> 55
<tb>

Ils représentent à eux seuls 63 % de la population française. Ces mêmes allèles sont aussi les plus abondants dans les autres populations caucasiennes.

Leurs fréquences varient de 53 % (en Espagne) à 82 % (au Danemark). Pour les ÉtatsUnis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55 % de la population. Ils représentent donc à eux seuls 53 à 82 % des allèles des populations caucasiennes et font partie des différentes spécificités de séries HLA-DR.

Le rôle des molécules de CMH II dans l'allergie a historiquement été initié par la découverte d'association entre le taux d'IgE contre un allergène donné et certains allèles. Ces associations concernent de nombreux allergènes de faible masse moléculaire comme Amb a5, Loi p3 et Amb a6 (31) qui sont les allergènes pour lesquels les risques relatifs sont les plus importants. Ces associations ne sont pas systématiques ou correspondent à des risques relatifs très faibles.

Dans le cas du venin d'abeille, il a été montré que l'allèle HLA-DR7 est plus fréquent chez les patients allergiques que dans la population témoin (32) alors que l'allèle HLA-DR4 est au contraire sous-représenté chez les allergiques au venin d'abeille (33).

Le contrôle de la réponse en IgE (et en IgG) par les molécules de

classe II est encore plus clair chez la souris (34). Les souris H-2d et H-2k sont en effet bonnes répondeuses alors que les souris H-2 répondent peu ou pas à cet allergène.

La présente invention a pour objet des peptides aptes à désensibiliser un sujet allergique au venin d'abeille, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : - le fragment (1) correspondant aux positions P85-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille, - le fragment (2) correspondant aux positions P 81-93 de l'allergène majeur du venin d'abeille, - le fragment (3) correspondant aux positions P 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille, - le fragment (4) correspondant aux positions P76-88 de l'allergène majeur du venin d'abeille, - le fragment (5) correspondant aux positions P77-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille, et - le fragment (6) correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille.

Les fragments (1) et (2) forment le groupe I ; le fragment (3) forme le groupe II ; les fragments (4) et (5) forment le groupe III et le fragment (6) forme le groupe IV.

De tels peptides comprennent des déterminants ou épitopes T qui interagissent avec une ou plusieurs molécules HLA-DR issus des gènes DRB 1 ou autres DRB.

La présente invention englobe également les peptides tels que définis ci-dessus, polymérisés.

La présente invention a également pour objet des compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent : - au moins un peptide sélectionné dans le groupe A constitué par : * les peptides de groupe I, tel que défini ci-dessus et

* les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml), qui se lient au moins aux molécules HLA-DR codées par les allèles HLA DRB1*0101, DRB 1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions particulièrement bien adaptées au patient peuvent avantageusement être utilisées à titre préventif ou à titre curatif.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites compositions, elles sont constituées de préférence par un mélange de peptides comprenant : - au moins un peptide de groupe A tel que défini ci-dessus et au moins un autre peptide sélectionné dans les groupes suivants : - les peptides sélectionnés dans le groupe B constitué par : * les peptides de groupe II, tel que défini ci-dessus et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1*0101, DRB 1*0401 et

DRB 1 * 1101 (molécules DR1, DR4 et Drill), avec une activité de liaison < 1000 nM, - les peptides sélectionnés dans le groupe C constitué par : * les peptides de groupe III, tel que défini ci-dessus et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P76-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1*0701, DRBl*1101 et DRBl*1501 (molécules DR7, DR11et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - les peptides sélectionnés dans le groupe D constitué par : * les peptides de groupe IV tel que défini ci-dessus et

* les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molé-

cules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1*1101, DRB1*1301 et DRB 1 * 1501 (molécules DR11, DR13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM.

Selon un autre mode de réalisation desdites compositions, elles comprennent en outre, éventuellement, le peptide correspondant aux positions P18-30 et/ou le peptide correspondant aux positions P45-62 et/ou le peptide correspondant aux positions P 57-74 et/ou le peptide correspondant aux positions P65-82 et/ou le peptide correspondant aux positions PI 11-123, de l'allergène majeur du venin d'abeille, conformément au Tableau III ci-après et/ou les peptides incluant les peptides précités.

Tableau III: Peptides représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR

<tb>
<tb> 101 <SEP> 401 <SEP> 1101 <SEP> 701 <SEP> 301 <SEP> 1301 <SEP> 1501
<tb> P18-30
<tb> P45-62
<tb> P57-74
<tb> P65-82
<tb> P76-88
<tb> P77-94 <SEP> P77-94
<tb> P81-93
<tb> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97
<tb> P94-106 <SEP> P94-106 <SEP> P94-106
<tb> P111-123
<tb> P122-134 <SEP> P122-134 <SEP> P122-134
<tb>
ue manière avantageuse, aans @esdites compositions : - les peptides de groupe 1 peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide (P81-97) et/ou - les peptides de groupe III peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide (P76-94) et/ou

- les peptides de groupe II et de groupe III peuvent avantageusement être concaténés, pour former un seul peptide (P76-106).

De manière générale, les compositions selon l'invention comprennent au moins un peptide englobant au moins un de ceux décrits au Tableau III et qui sont adaptés au patient à désensibiliser.

Ces compositions désensibilisantes sont définies à partir des activités de liaison aux molécules HLA-DR des peptides qu'elles comprennent, de la fréquence d'allèles vis-à-vis desquels elles sont actives et de la complémentarité des zones d'interaction ou épitopes que portent lesdits peptides.

Pour un patient, pour lequel on ne connaît pas les molécules HLADR qu'il porte, on utilisera de préférence une composition selon l'invention qui comprend au moins un peptide de groupe A.

On peut y adjoindre, de manière avantageuse et de manière à augmenter le nombre d'épitopes : un peptide de groupe B ; un peptide de groupe C ; un peptide correspondant à la concaténation d'un peptide de groupe B et d'un peptide de groupe C et/ou un peptide de groupe D.

Pour les patients pour lesquels on connaît les molécules HLA, on utilisera soit les peptides précédemment définis, soit une combinaison de peptides englobant au moins ceux décrits au Tableau III, qui correspondent aux allèles que possèdent le patient.

Les peptides inclus dans lesdites compositions ont été avantageusement sélectionnés à l'aide d'un test de liaison HLA-DR/peptides comprenant (i) l'incubation des molécules HLA-DR purifiées, sélectionnées parmi celles concernant plus de 5 % d'une population donnée et notamment les molécules HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13et DR2, simultanément avec différentes concentrations de fragments de 13 à 18 acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml et avec un réactif RI constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente desdits peptides et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM, (ii) le transfert des complexes obtenus sur une plaque de type ELISA, préalable-

ment sensibilisée avec un anticorps spécifique de tous les HLA-DR, (iii) révélation des complexes molécules HLA-DR/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent, (iv) sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est-à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR et (v) choix des peptides les plus adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison < 1000 nM, correspondant à la concentration de ce peptide qui inhibe 50 % de la liaison du réactif RI (ICso).

Ces tests permettent, de manière non ambiguë, d'associer à chaque allèle les séquences des fragments capables de s'y lier ou au contraire qui ne s'y lient pas.

Cette démarche permet de définir des compositions désensibilisantes incluant des peptides qui se lient au plus grand nombre de molécules HLA-DR différentes et qui peuvent être ainsi avantageusement désensibilisantes pour la majorité des patients, même si l'on ne connaît pas leurs molécules HLA.

Cette démarche a en outre l'avantage de permettre la sélection de peptides significativement plus spécifiques vis-à-vis de la plupart des sujets allergiques que les démarches cherchant à sélectionner des peptides sur la base de leur capacité à stimuler des lymphocytes T de sujets allergiques.

Ainsi, les Inventeurs ont trouvé que seulement certains peptides ont une activité de liaison vis-à-vis de plusieurs des allèles les plus fréquents dans la population caucasienne conformément au Tableau III.

La présente invention a également pour objet des compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis ci-dessus sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Lesdites zones sont notamment modifiées par mutation ponctuelle ou délétion. La PLA2 de venin d'abeille est en effet capable d'accueillir de

nombreuses mutations et délétions (53,54). Il est donc possible d'obtenir des mutants n'ayant plus de réactivité aux IgE, comme ceux obtenus pour Bet VI (55). Par exemple, le mutant de PLA2 d'abeille dans lequel la lysine en position 25 a été subs- tituée est beaucoup moins antigénique pour des sérums d'apiculteurs que la molécule native (55).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis ci-dessus sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE, pour la préparation d'une une composition désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille.

La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de peptides aptes à être inclus dans une composition désensibilisante pour les allergies au venin d'abeille, caractérisé en ce qu'il comprend : (i) l'incubation des molécules HLA-DR purifiées sélectionnées parmi celles concernant soit moins de 5 % d'une population donnée, c'est-à-dire celles constituées par d'autres HLA-DR que les molécules HLA DR1, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13 et DR2, soit des molécules HLA-DR d'un patient donné, simultanément avec différentes concentrations de fragments de 13à 18acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml et avec un réactif RI constitué d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente des peptides, tels que définis ci-dessus (groupes A à D) et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM, (ii) le transfert des complexes obtenus sur une plaque de microtitration, préalablement sensibilisée avec un anticorps spécifique de toutes les molécules HLA-DR, (iii) la révélation des complexes molécules HLA-DR/réactif RI, fixés au fond de la plaque au moyen de conjugués convenables, tels que streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent, (iv) la sélection des peptides comprenant des épitopes différents, c'est-à-dire les plus représentatifs des différentes zones d'interaction entre l'allergène majeur du venin d'abeille et les molécules HLA-DR étudiées et (v) le choix des peptides les plus

adaptés, en fonction de la fréquence des allèles vis-à-vis desquels ils présentent une activité de liaison < 1000 nM, correspondant à la concentration de ce peptide qui inhibe 50 % de la liaison du réactif RI (ICso).

Les conditions d'incubation sont propres à chaque molécule HLADR (temps d'incubation, pH, réactif RI, concentration en HLA-DR ou en peptide).

Le réactif RI est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences suivantes : PKYVKQNTLKLAT, spécifique des allèles DRBI *0101, DRB 1*0401, DRBI * 1101, EAEQLRAYLDGTGVE,spécifique de l'allèle DRB 1 * 1501, AKTIAYDEEARGLE, spécifique de l'allèle DRB 1 *0301, AAYAAAKAAALAA, spécifique de l'allèle DRB 1 *0701 et TERVRLVTRHIYNREE, spécifique de l'allèle DRB1*1301.

D'autres réactifs RI peuvent être utilisés, notamment ceux décrits dans Southwood et al. (52).

De manière surprenante, le procédé de sélection selon l'invention est adapté à n'importe quelle molécule d'HLA-DR.

La présente invention a également pour objet un kit de sélection de peptides aptes à désensibiliser un sujet allergique au venin d'abeille, caractérisé en ce qu'il comprend différentes concentrations de fragments de 13 à 18 acides aminés chevauchants et couvrant entièrement la séquence de l'API ml, un ensemble de réactifs RI constitués chacun d'un fragment peptidique associé à un marqueur non radioactif, tel que la biotine et dont la séquence est différente des peptides tels que définis ci-dessus (groupes A à D) et est choisie de manière à ce qu'il présente une affinité vis-à-vis de la molécule HLA-DR choisie, telle qu'il puisse être utilisé à une concentration < 200 nM et un anticorps spécifique de toutes les molécules HLA-DR.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 représente la séquence protéique de la phospholipase A2 (API ml) du venin d'abeille, déduite de celle de l'ADN complémentaire,

- la figure 2 illustre l'activité de liaison aux molécules HLA-DR des peptides de treize acides aminés qui couvrent la séquence 15-37 de l'allergène majeur du venin d'abeille. Les résultats sont exprimés sous la forme de l/IC50. L'unité est la M-1 ; - la figure 3 illustre l'activité de liaison des peptides de treize acides aminés qui couvrent la séquence 107-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille aux molécules HLA-DR. Les résultats sont exprimés sous la forme l/IC50. L'unité est la M-1 ; - la figure 4 illustre les fréquences des déterminants de API mldans la population caucasienne. Cette représentation est basée sur les fréquences des allèles étudiés dans la population française. Dans d'autres populations caucasiennes, on retrouve sensiblement le même profil.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : des tests de liaison.

- Synthèse des peptides
Les peptides qui couvrent la séquence de l'allergène majeur du venin d'abeille (figure 1) ont été choisis à partir de la séquence déduite de celle de l'ADN complémentaire correspondant (36). Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS).

. Purification des molécules HLA-DR
Les molécules HLA-DR sont purifiées à partir de différentes lignées EBV homozygotes (52) par immunoaffinité. On peut notamment utiliser la méthode décrite dans Southwood et al. (52). Leur origine et les différents allèles qui les caractérisent sont décrits dans le Tableau IV.

Tableau IV

<tb>
<tb> Lignées <SEP> Spécificités <SEP> Allèles <SEP> DRB <SEP> Autres <SEP> allèles <SEP> DRB
<tb> LG2 <SEP> (52) <SEP> HLA-DR1 <SEP> DRB1*0101 <SEP> HOM2
<tb> SCHU <SEP> HLA-DR2 <SEP> DRB <SEP> 1*1501 <SEP> DRB5*0101
<tb> MAT <SEP> (52) <SEP> HLA-DR3 <SEP> DRB1*0301 <SEP> DRB3*0101
<tb> STEILIN
<tb> BOLETH <SEP> HLA-DR4 <SEP> DRB <SEP> 1*0401 <SEP> DRB4*0101
<tb> PREISS <SEP> (52)
<tb> PITOUT(52) <SEP> HLA-DR7 <SEP> DRB1*0701 <SEP> DRB4*0101
<tb> SWEIG <SEP> (52) <SEP> HLA-DR11 <SEP> DRB1*1101 <SEP> DRB3*0202
<tb> HHKB <SEP> (46) <SEP> HLA-DR13 <SEP> DRB1*1301 <SEP> DRB3*0101
<tb>

Les hybridomes sécréteurs d'un anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR est notamment celui décrit dans Southwood et al. (52) ou celui décrit dans Posch et al. (42). Les anticorps sont purifiés à partir de surnageants de culture sur des colonnes de Protéine A-Sépharose. Ces anticorps sont couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou Protéine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DR.

. Tests de liaison HLA-DR/peptides
Les tests de liaison des peptides aux molécules HLA-DR sont des tests en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, initialement mis au point par Hill sur la molécule HLA-DR (37). Ils sont effectués en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier dans la même expérience de nombreux échantillons. Brièvement, les molécules HLA-DR purifiées sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes concentrations du peptide à tester.

Après 24 à 72 heures d'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 (il de chaque échantillon sont transférés sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR. Les complexes molécules HLA-DR/peptides biotinylés, fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR sont

révélés au moyen de conjugué streptavidine-phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration de ce peptide qui inhibe 50% de la liaison du peptide biotinylé (IC50).

. Choix et optimisation des tests de liaison
Choix des allèles
Les allèles étudiés sont tous les allèles de la population française dont la fréquence dépasse les 5% de la population.

Il s'agit des allèles DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401,

DRB 1 *0701, DRB 1 * 1101, DRB 1 *1301 et DRBI*1501 (Tableau 1). Ils représentent à eux seuls 53 à 82% des allèles des populations caucasiennes et font partie de différentes spécificités des séries HLA-DR.

Spécificité des tests
Le choix des peptides biotinylés est l'élément déterminant de la spécificité du test. La plupart des cellules utilisées possèdent deux molécules HLA-DR différentes qui sont toutes les deux purifiées par un anticorps monomorphique spécifique des molécules HLA-DR et toutes les deux reconnues par le même anticorps. De manière à étudier sans ambiguïté la liaison d'un peptide à l'allèle DRB 1, il est nécessaire de s'assurer que le peptide biotinylé lie cet allèle et ne lie pas le produit de l'autre gène.

Dans ce but, un certain nombre de peptides, décrits dans le Tableau V, ont été utilisés.

Tableau V

<tb>
<tb> Réactif <SEP> RI <SEP> Séquences <SEP> Allèles <SEP> DRB <SEP> Références
<tb> HA <SEP> 306-318 <SEP> PKYVKQNTLKLAT <SEP> DRB1*0101 <SEP> 37-39
<tb> (=HA <SEP> 307-319) <SEP> DRB1*0401 <SEP> 37,40,41,42
<tb> DRB1*1101 <SEP> 38,39,42
<tb> A3 <SEP> 152-166 <SEP> EAEQLRAYLDGTGVE <SEP> DRB1*1501 <SEP> 43
<tb> MT <SEP> 2-16 <SEP> AKTIAYDEEARGLE <SEP> DRB <SEP> 1*0301 <SEP> 44
<tb> YKL <SEP> AAYAAAKAAALAA <SEP> DRB <SEP> 1*0701 <SEP> 41
<tb> Bl <SEP> 21-36 <SEP> TERVRLVTRHIYNREE <SEP> DRB1*1301 <SEP> 46
<tb>

Pour HLA-DRB 1 *0101, DRB 1 *0401 et DRB 1 * 11 O 1, le peptide ha 306-318 que d'autres auteurs avaient précédemment utilisé dans des tests de liaison sur ces allèles (37, 41), a été utilisé.

De même, pour DRB 1*0301 et DRB1*1501, les traceurs utilisés (réactif RI) dérivent de traceurs précédemment décrits (44), (45).

Pour DRB 1*0701, le peptide YKL a été décrit comme étant un très bon ligand (41) alors que le peptide B1 21-36 est un ligand naturel de DRB 1*1301 (46). Ni l'un ni l'autre n'ont été déjà utilisés comme traceurs.

Conditions et sensibilité des tests
Pour chaque molécule HLA-DRB1, la concentration en molécules du CMH II, la concentration du peptide biotinylé, le pH d'incubation et le temps d'incubation ont été optimisés. Pour les molécules HLA-DRB 1*101, DRB 1*0401 et DRB 1*0701, les conditions de tests en ELISA sont proches de celles déjà décrites par d'autres auteurs (37, 41). Pour les autres molécules HLA-DRB1qui ont été étudiées, il n'y a pas de tests en ELISA décrits dans la littérature. Le détail des conditions utilisées est décrit dans le Tableau VI.

Tableau VI

<tb>
<tb> Allèles <SEP> Concentration <SEP> Traceurs <SEP> Concentration <SEP> pH <SEP> Temps
<tb> protéine <SEP> traceur <SEP> optimal <SEP> d'incubation
<tb> ( g/ml) <SEP> (nM) <SEP> (h)
<tb> DRB1*0101 <SEP> 0,6 <SEP> HA <SEP> 306-318 <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 24
<tb> DRB1*0301 <SEP> 2,3 <SEP> MT <SEP> 2-16 <SEP> 50 <SEP> 4,5 <SEP> 72
<tb> DRB1*0401 <SEP> 1,6 <SEP> HA <SEP> 306-318 <SEP> 30 <SEP> 6 <SEP> 24
<tb> DRB1*0701 <SEP> 0,4 <SEP> YKL <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 24
<tb> DRB1*1101 <SEP> 1,3 <SEP> HA <SEP> 306-318 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 24
<tb> DRB1*1301 <SEP> 0,7 <SEP> B121-36 <SEP> 200 <SEP> 4,5 <SEP> 72
<tb> DRBl*1501 <SEP> 0,5 <SEP> A3 <SEP> 152-166 <SEP> 10 <SEP> 4,5 <SEP> 24
<tb>

La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC50 observées avec les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs (Tableau VII).

Tableau VII

<tb>
<tb> DRB <SEP> 1 <SEP> Alleles <SEP>
<tb> Peptides <SEP> 101 <SEP> 401 <SEP> 1101 <SEP> 701 <SEP> 301 <SEP> 1301 <SEP> 1501
<tb> PI-18 <SEP> 2300 <SEP> 7500- <SEP> 83000- <SEP> - <SEP> 11000
<tb> P5-22 <SEP> 1900 <SEP> 10000- <SEP> 58000- <SEP> - <SEP> 22000
<tb> P9-26 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 82000
<tb> P13-30 <SEP> 10000 <SEP> 5000 <SEP> 8000 <SEP> 880 <SEP> - <SEP> 20000P17-34 <SEP> 3500 <SEP> 2000 <SEP> 1300 <SEP> 560 <SEP> 67000 <SEP> 4300 <SEP> 5500
<tb> P21-38 <SEP> 1600 <SEP> 3000 <SEP> 1500 <SEP> 160 <SEP> 23000- <SEP> 85000
<tb> P25-42 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 50000- <SEP> P29-46- <SEP> 40000- <SEP> 85000 <SEP> 1500- <SEP> P33-50- <SEP> 80000- <SEP> 78000 <SEP> 13000- <SEP> 90000
<tb> P37-54- <SEP> 80000- <SEP> 88000- <SEP> - <SEP> P41-58- <SEP> - <SEP> - <SEP> 75000- <SEP> P45-62- <SEP> 68000- <SEP> 640 <SEP> 4300 <SEP> 1100 <SEP> 19000
<tb> P49-66 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1800 <SEP> 17000 <SEP> 15000 <SEP> 95000
<tb> P53-70- <SEP> - <SEP> - <SEP> 85000 <SEP> 120 <SEP> P57-74- <SEP> 35000 <SEP> 70000 <SEP> 75000 <SEP> 40 <SEP> - <SEP> 63000
<tb> P61-78 <SEP> 55000 <SEP> 29000 <SEP> 67000 <SEP> 23000 <SEP> 25000- <SEP> 55000
<tb> P65-82 <SEP> 4000 <SEP> 2500 <SEP> 4000 <SEP> 2100 <SEP> 13000- <SEP> 730
<tb> P69-86- <SEP> 15000- <SEP> 75000- <SEP> - <SEP> 490
<tb> P73-90- <SEP> - <SEP> - <SEP> 75000- <SEP> - <SEP> 23
<tb> P77-94 <SEP> 10000 <SEP> 13000 <SEP> 570 <SEP> 280 <SEP> 50000- <SEP> 220
<tb> P81-98 <SEP> 300 <SEP> 300 <SEP> 530 <SEP> 130 <SEP> 400 <SEP> 650 <SEP> 750
<tb> P85-102 <SEP> 70 <SEP> 300 <SEP> 850 <SEP> 100 <SEP> 320 <SEP> 300 <SEP> 1900
<tb> P89-106 <SEP> 180 <SEP> 140 <SEP> 600 <SEP> 7600 <SEP> 50000- <SEP> 38000
<tb> P93-110 <SEP> 350 <SEP> 220 <SEP> 750 <SEP> 72000 <SEP> 70000P97-114- <SEP> - <SEP> - <SEP> 77000 <SEP> 75000
<tb> P101-118 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 30000 <SEP> - <SEP> P105-122 <SEP> - <SEP> 950 <SEP> 30000 <SEP> 16000- <SEP> - <SEP> 80000
<tb> P109-126 <SEP> - <SEP> 1500 <SEP> 7000 <SEP> 12000 <SEP> 13000 <SEP> 10000 <SEP> 35000
<tb> P113-130 <SEP> - <SEP> 4500 <SEP> 11000 <SEP> 6100 <SEP> 3500- <SEP> 79
<tb> P117-134 <SEP> - <SEP> 55000 <SEP> 67 <SEP> 3700- <SEP> 350 <SEP> 56
<tb> références <SEP> 31 <SEP> 44 <SEP> 38 <SEP> 34 <SEP> 100 <SEP> 320 <SEP> 14
<tb>
Activité de liaison aux molécules HLA-DR des peptides de dix-huit acides aminés qui couvrent la séquence de l'allergène majeur du venin d'abeille. activité > 100000 nM Les résultats sont exprimés sous la forme d'ICso. L'unité est le nM. Les IC50 des meilleurs

peptides (IC 'so inférieure à 1000 nM) ont été entourées
Elles varient de 14 à 44 nM pour les allèles 101,401, 1101,701 et 1501 qui sont des valeurs très satisfaisantes. Elles ne sont que de 100 à 320 nM pour respectivement les allèles 301 et 1301 et traduisent une sensibilité de qualité moyenne.

Cartographie des déterminants de API ml restreints aux molécules
HLA-DR étudiées
Localisation des déterminants de API ml :au moyen de peptides de
18résidus
Les peptides qui sont naturellement présents sur les molécules HLADR ont des tailles qui varient entre 13 et 25 acides aminés environ, la taille la plus fréquemment rencontrée étant de 15 acides aminés. De manière à optimiser la recherche des peptides de API ml capables de se lier aux molécules HLA-DR, nous avons synthétisé trente peptides de 18 acides aminés qui se chevauchent de 14 acides aminés et qui donc contiennent tous les peptides de 15 résidus possibles de la séquence de API ml. Les capacités de liaison de chacun de ces peptides ont été testées sur les 7 allèles que nous avons retenus et sont exprimées sous la forme IC (Tableau VII).

Les allèles 101, 401 et 1101ont un profil d'activité très similaire et en particulier acceptent les 4 peptides (P81-98, P85-102, P89-106 et P93-110) comme ligands. Ils présentent toutefois des différences. Le peptide P105-122 lie en effet l'allèle 401, alors que les peptides P77-94 et P117-134 lient l'allèle 1101. L'allèle 701 possède 7 peptides actifs (P13-30, P17-34, P21-38, P45-62, P77-94, P81-98 et P85- 102) alors que 4 peptides (P81-98, P85-102, P53-70 et P57-74) sont actifs vis-à-vis de l'allèle 301. Les peptides P81-98 et P85-102 lient l'allèle 1301 avec une efficacité comparable à celle du peptide P117-134. Finalement, deux régions activent existent pour l'allèle 1501 et comprennent d'une part les peptides P65-82, P69-86, P73-90, P77-94, P81-98 et P85-102 et d'autre part les peptides P113-130 et PI 17-134.

Clairement chaque allèle possède un profil de liaison des peptides d'API ml qui lui est propre. Certains peptides ne se lient qu'à un seul allèle (par exemple P105-122 à l'allèle 401, P69-86 et P73-90 à l'allèle 1301). D'autres, au contraire, se lient à plusieurs allèles. C'est le cas en particulier du peptide P81-98, qui lie de manière significative les sept allèles étudiés et du peptide P85-102 qui lie six allèles de manière significative. Dans de nombreux cas, un peptide est commun à deux ou plusieurs allèles. Ces peptides communs définissent principalement trois zones

distinctes de la séquence d'API ml:i) une partie N-terminale que forment les peptides P13-30, P17-34, P21-38, ii) une partie centrale constituée par les peptides P77-94 à P93-110 et iii) une partie C-terminale qu'englobent les peptides PI 13-122 à PI 17-134.

On observe également que treize peptides sur les trente testés ont des activités de liaison > à 1000 nM, quelle que soit la molécule de CMH II étudiée. Ils sont donc peu ou pas actifs.

Le Tableau VIII ci-après illustre l'activité de liaison des peptides de 13 acides aminés qui couvrent la zone 73-108 de API ml aux molécules HLA-DR.

Tableau VIII

<tb>
<tb> Peptides <SEP> DRB <SEP> 1 <SEP> Alleles <SEP>
<tb> 101 <SEP> 401 <SEP> 1101 <SEP> 701 <SEP> 301 <SEP> 1301 <SEP> 1501
<tb> P73-85 <SEP> 28000 <SEP> 210
<tb> P74-86 <SEP> 65000 <SEP> 330
<tb> P75-87 <SEP> 15000 <SEP> 230
<tb> P76-88 <SEP> 2200 <SEP> 160
<tb> P77-89 <SEP> 2200 <SEP> 1400 <SEP> 780
<tb> P78-90 <SEP> 10000 <SEP> 3000 <SEP> 1100 <SEP> 190
<tb> P79-91 <SEP> 5000 <SEP> 3000 <SEP> 1300 <SEP> 1600
<tb> P80-92 <SEP> - <SEP> 6000 <SEP> 2800 <SEP> 1600
<tb> P81-93 <SEP> 2500 <SEP> 3200 <SEP> 1700 <SEP> 400
<tb> P82-94 <SEP> 8000 <SEP> 530 <SEP> 4300- <SEP> - <SEP> 33000
<tb> P83-95 <SEP> 4000 <SEP> 280 <SEP> 560 <SEP> 4500 <SEP> 2000P84-96 <SEP> 1900 <SEP> 2200 <SEP> 1700 <SEP> 1700 <SEP> 3700- <SEP> P85-97 <SEP> 120 <SEP> 210 <SEP> 570 <SEP> 63 <SEP> 600 <SEP> 58 <SEP> 33000
<tb> P86-98 <SEP> 2000 <SEP> - <SEP> 1800 <SEP> 470 <SEP> 1100 <SEP> 150 <SEP> 68000
<tb> P87-99 <SEP> 2500 <SEP> 22000 <SEP> 45000 <SEP> 280 <SEP> 1200 <SEP> - <SEP> 6500
<tb> P88-100 <SEP> 5300 <SEP> 14000- <SEP> 1200 <SEP> 12000- <SEP> 15000
<tb> P89-101 <SEP> 13000 <SEP> 13000 <SEP> - <SEP> 6000 <SEP> 45000- <SEP> 35000
<tb> P90-102 <SEP> 3500 <SEP> 1200 <SEP> 18000 <SEP> 65000 <SEP> 60000 <SEP> 40000
<tb> P91-103 <SEP> 870 <SEP> 380 <SEP> 3500 <SEP> 23000P92-104 <SEP> 270 <SEP> 120 <SEP> 7700P93-105 <SEP> 240 <SEP> 60 <SEP> 1200 <SEP> 50000
<tb> P94-106 <SEP> 200 <SEP> 280 <SEP> 1000P95-107 <SEP> 530 <SEP> 570
<tb> P96-108 <SEP> 1500 <SEP> 1400 <SEP> -
<tb>

Activité de liaison des peptides de 13 acides aminés qui couvrent la zone 73-108 de l'allergène majeur du venin d'abeille aux molécules HLA-DR. activité # 100000 nM
Les résultats sont exprimés sous la forme d'IC50. L'unité est le nM Les IC50 des meilleurs peptides (IC50inférieures à 1000 nM) ont été entourées.

Localisation précise des déterminants de API ml
De manière à mieux définir les zones de contact entre les peptides actifs et les molécules de CMH II, tous les peptides de treize résidus qui couvrent les

zones actives ont été synthétisés. La taille de treize acides aminés a été choisie comme compromis. Elle correspond à la taille minimale des peptides présents naturellement sur les molécules de CMH II et devrait être suffisamment petite pour discriminer deux surfaces de contact contenues dans un seul peptide de dix-huit acides aminés.

11peptides qui couvrent exhaustivement la partie N-terminale 15à 37 ont été testés sur les allèles 101,401, 701,1101 et 1301 (figure 2). Pour l'allèle 701, les peptides P18-30 à P22-34 présentent une activité significative de liaison qui dans le cas du peptide P 18-30 est équivalente à celle du peptide de dix-huit acides aminés P21-38.

Les allèles 401, 101 et 1101lient sensiblement les mêmes peptides que l'allèle 701. Cependant, les activités de liaison observées sont plus faibles, ce qui est en accord avec celles obtenues pour les peptides de dix-huit acides aminés.

La partie centrale a été étudiée sur les sept allèles au moyen de vingt-quatre peptides de treize résidus. Pour l'allèle 101, les peptides P85-97 d'une part et P91-103 à P95-107 d'autre part définissent deux zones distinctes d'interaction. Ces deux zones se retrouvent également pour les allèles 401 et 1101mais avec de petites variations. La première comporte en plus du peptide P85-97, les peptides P82-94 et P83-95 pour l'allèle 401 et le peptide P83-95 pour l'allèle 1101. La deuxième zone de contact est strictement identique entre l'allèle 401 et 101 alors qu'elle est réduite à un seul peptide (P94-106) pour l'allèle 1101. L'allèle 701 se caractérise par trois peptides ayant une bonne activité de liaison (P85-97, P86-98 et P87-99) qui correspond à celle des peptides de dix-huit acides aminés P81-98 et P85-102. La bonne activité de liaison du peptide P77-94 sur l'allèle 701 précédemment décrite n'est observée pour aucun des peptides treize résidus qui couvrent cette zone, les peptides P76-88 à P81-93 ayant une activité sensiblement moindre.

Le peptide P85-97 possède pour les allèles 301 et 1301, une activité de liaison, similaire à celle des peptides de 18 acides aminés P81-98 et P85-102, qui le contiennent. L'allèle 1301 accepte également le peptide P86-105 comme ligand. Pour l'allèle 1501, sept peptides dont six consécutifs (P73-85 à P78-90) et un isolé (P81-93) reflètent l'activité des trois peptides de dix-huit acides aminés (P73-90, P77-94 et P81- 98).

Finalement, la partie C-terminale de API ml a été étudiée pour les allèles 401, 1501, 1101 et 1301 au moyen de seize peptides de treize résidus. L'allèle
401 se caractérise par six peptides actifs (P109-121 à PI 14-126) alors que sept autres peptides (PI 16-128 à P122-14) se lient avec une forte affinité à 1501. Les peptides P121-133 et 122-134 sont également très actifs pour les allèles 1101 et 1301.

Ces résultats décrivent la localisation précise des déterminants de liaison de l'allergène majeur du venin d'abeille pour les sept allèles retenus et montrent clairement les différences et les similitudes entre les allèles pour les différents peptides d'API ml. De manière à rendre compte au mieux de l'activité et de la localisation de ces déterminants, il a été retenu, pour chacun d'entre eux, un peptide représentatif, le plus court possible et dont l'activité de liaison reflète celle du déterminant (Tableau III). On notera tout particulièrement que le peptide P85-97 est représentatif d'un déterminant pour les allèles 101, 401, 1101, 701, 301 et 1301 et que d'autres déterminants sont avantageusement situés près de ce peptide (P76-88, P77-94, P81-93, P94- 106).

Fréquences des déterminants de API ml dans la population caucasienne
De manière à évaluer l'impact des peptides les plus actifs (activité inférieure à 1000 nM) au sein de la population caucasienne, il a été calculé, pour chacun, la fréquence cumulée des allèles qu'ils sont capables de lier (figure 4). Appliquée à l'ensemble des peptides de 18 acides aminés qui couvrent entièrement la séquence de l'allergène majeur, cette représentation permet de pondérer l'activité des peptides testés. On observe nettement que la zone centrale allant du peptide P77-94 au peptide P93-110 est celle qui a le plus d'impact dans la population. Le peptide P81-98 se liant avec une bonne affinité à tous les HLA DR étudiés, couvre à lui seul 63 % de la population et cumule l'impact des déterminants portés par les peptides P85-97 et P81-93. L'adjonction de séquences en N et C-terminal permet d'ajouter à cette combinaison de déterminants d'autres zones d'interaction telles que P76-88, P77-94 et P93- 106 qui concernent des pourcentages non négligeables de la population. Enfin, on remarque en C-terminal, l'impact des peptides Pl 17-134 ou 122-134 supérieur à 20 %.

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Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les

variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS

1 ) Peptides aptes à désensibiliser un sujet allergique au venin d'abeille, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par : le fragment (1) correspondant aux positions P85-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (2) correspondant aux positions P 81-93 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (3) correspondant aux positions P 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (4) correspondant aux positions P76-88 de l'allergène majeur du venin d'abeille, le fragment (5) correspondant aux positions P77-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille, et le fragment (6) correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille, les fragments (1) et (2) formant le groupe I ; le fragment (3) formant le groupe II ; les fragments (4) et (5) formant le groupe III et le fragment (6) formant le groupe IV.

2 ) Peptides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont polymérisés.

3 ) Compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent : - au moins un peptide sélectionné dans le groupe A constitué par : * les peptides de groupe I, selon la revendication 1 ou la revendication 2 et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR codées par les allèles HLA DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRBI*0701, DRB1*1101, DRB1*1301 et DRB1*1501 (molécules DR1, DR3, DR4, DR7, DR 11, DR 13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

4 ) Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de préférence par un mélange de peptides comprenant : - au moins un peptide de groupe A tel que défini à la revendication 3 et au moins un autre peptide sélectionné dans les groupes suivants : - les peptides sélectionnés dans le groupe B constitué par :

* les peptides de groupe II selon la revendication 1 ou la revendica- tion 2 et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions 94-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille (API ml) et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB1*0101, DRB 1*0401 et DRB1*1101 (molécules DR1, DR4 et DR11), avec une activité de liaison < 1000 nM, - les peptides sélectionnés dans le groupe C constitué par : * les peptides de groupe III selon la revendication 1 ou la revendication 2 et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P76-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1*0701, DRB1*1101 et DRB1*1501 (molécules DR7, DR11et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM et - les peptides sélectionnés dans le groupe D constitué par : * les peptides de groupe IV selon la revendication 1 ou la revendication 2 et * les peptides constitués par des fragments d'au moins 13 acides aminés qui sont inclus dans ou comprennent le fragment correspondant aux positions P122-134 de l'allergène majeur du venin d'abeille et qui se lient au moins aux molécules HLA-DR exprimées par les allèles DRB 1 * 1101, DRB 1 * 1301 et DRB 1 *1501 (molécules DR 11, DR13 et DR2), avec une activité de liaison < 1000 nM.

5 ) Compositions selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre, le peptide correspondant aux positions P 18-30 et/ou le peptide correspondant aux positions P45-62 et/ou le peptide correspondant aux positions P57-74 et/ou le peptide correspondant aux positions P65- 82 et/ou le peptide correspondant aux positions PI 11-123, de l'allergène majeur du venin d'abeille, conformément au Tableau ci-après :

et/ou les peptiaes incluant les peptides précités.

<tb>

<tb> P122-134 <SEP> P122-134 <SEP> P122-134

<tb> P111-123

<tb> P94-106 <SEP> P94-106 <SEP> P94-106

<tb> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97 <SEP> P85-97

<tb> P81-93

<tb> P77-94 <SEP> P77-94

<tb> P76-88

<tb> P65-82

<tb> P57-74

<tb> P45-62

<tb> P18-30

<tb> 101 <SEP> 401 <SEP> 1101 <SEP> 701 <SEP> 301 <SEP> 1301 <SEP> 1501

<tb>

6 ) Compositions selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisées en ce que les peptides de groupe 1 peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide correspondant aux positions P81-97 de l'allergène majeur du venin d'abeille et/ou les peptides de groupe III peuvent avantageusement être concaténés pour former un seul peptide correspondant aux positions P76-94 de l'allergène majeur du venin d'abeille et/ou les peptides de groupe II et de groupe III peuvent avantageusement être concaténés, pour former un seul peptide correspondant aux positions P76-106 de l'allergène majeur du venin d'abeille.

7 ) Compositions désensibilisantes pour les allergies au venin d'abeille, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis aux revendications 1 à 6 sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

8 ) Utilisation d'une phospholipase A2 de venin d'abeille modifiée, dans laquelle les zones comprenant les peptides tels que définis aux revendications 1 à 6 sont conservées et les zones en dehors des zones précitées sont modifiées, de telle sorte qu'elles ne présentent plus de réactivité aux IgE, pour la préparation d'une

composition désensibilisante pour les allergies au venin d'abeille.