FR2776522A1 - Utilisation de fragments d'adn pour la preparation d'un medicament a appliquer localement - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation de fragments d'ADN pour la préparation d'un médicament destiné au traitement curatif ou préventif de maladies hyperprolifératives ou d'états précancéreux affectant des cellules épithéliales, telles que psoriasis, vitiligo, dermatite atopique ou dermatose hyperprolifératives ou sensibles aux UV, maladies hyperprolifératives ou à médiation allergique d'autres épithéliums; à l'atténuation du photo-vieillissement; à la prophylaxie contre le risque de développement d'un cancer de la peau ou à la réduction de ce risque.

Description

La peau humaine est constituée de deux couches, le

derme et l'épiderme. L'épiderme, qui est la couche ex-

terne des deux couches constituant la peau, comporte de nombreux types de cellules différentes, comprenant des mélanocytes et des kératinocytes. Les mélanocytes sont

des cellules spécialisées de la couche basale de l'épi-

derme, qui synthétisent la mélanine; la mélanine se ras-

semble ensuite dans des mélanosomes puis est transportée

dans des kératinocytes.

L'exposition de la peau au soleil conduit à la syn-

thèse de la vitamine D, à l'érythème solaire et au bron-

zage, qui constitue la principale forme de protection en-

dogène de la peau contre une atteinte subséquente par ir-

radiation ultraviolette (UV). Diverses modifications mor-

pholiques et enzymatiques apparaissent au niveau cellu-

laire dans des mélanocytes épidermiques en réponse à une

irradiation par les UV. La mélanine, dont la teneur aug-

mente dans la peau "bronzée", sert de filtre ayant un pouvoir d'absorption dans la gamme ultraviolette et offre

une photoprotection de l'individu.

Le spectre maximal d'action pour l'érythème se situe dans la plage UV-B de 290 à 305 nm. Les rayons UV-B sont absorbés par les protéines et les acides nucléiques de

l'épiderme, entraînant la production de dimères de thy-

mine, dont on sait qu'ils sont formés par irradiation UV d'ADN nucléaire et excisés du brin d'ADN par l'action

d'enzymes hautement spécifiques, comprenant des endonu-

cléases. S'ils ne sont pas éliminés, ces dimères peuvent bloquer des fourches de réplication d'ADN générant des régions d'ADN monocaténaire. Le défaut d'élimination de dimères de thymine et d'autres formes d'altération de l'ADN dans le génome peuvent conduire à des mutations

somatiques entrainant une carcinogenèse.

Dans des bactéries, il est connu que de l'ADN mono-

caténaire libéré en fragments au cours de la réparation

d'ADN ou exposé au niveau de fourches de réplication blo-

quées peuvent interagir avec des protéines nucléaires qui régulent ensuite l'expression de gènes spécifiques dans

l'ADN comme partie de la réponse SOS analogue de l'orga-

nisme à une altération par les UV. La réponse par bron- zage de la peau pourrait raisonnablement être considérée

comme une partie de la réponse SOS dans la peau d'un mam-

mifère. Toutefois, le stimulus précis de bronzage induit

par les UV reste inconnu.

L'irradiation par des UV est utilisée avec succès dans la photothérapie et dans la photochimiothérapie pour certaines affections dermatologiques. Par exemple, le

psoriasis est une maladie dermatologique courante toiu-

chant 1 à 2 % de la population. Le psoriasis peut être traité par irradiation aux UV-B, seule ou conjointement

avec des agents tels que le goudron de houille ou l'an-

thraline, ou par irradiation aux UV-A en association avec des psoralènes (PUVA-thérapie). D'autres affections qui

sont sensibles au traitement par irradiation aux UV com-

prennent la dermatite atopique et le vitiligo. Malgré les

bienfaits de la photothérapie et de la photochimiothéra-

pie, ces traitements comportent les mêmes risques que l'exposition chronique au soleil, à savoir production de

rides, "photo-vieillissement" et cancer de la peau.

La présente invention a trait à la réparation de

tout type d'altération de l'ADN, en totalité ou en par-

tie, par l'induction de mécanismes de réparation de l'ADN

tels qu'une réparation par excision de nucléotides. L'al-

tération de l'ADN peut être causée par une irradiation

ultraviolette ou par exposition à des substances chimi-

ques induisant une altération de l'ADN ou des cancérogè-

nes tels que le benzo(a)pyrène (BP).

La présente invention a trait en outre à des procé-

dés de traitements curatifs ou préventifs de maladies hy-

perprolifératives ou d'états précancéreux affectant des

cellules épithéliales, comme le psoriasis ou d'autres ma-

ladies de peau, comprenant l'eczéma de contact et d'au-

tres dermatoses hyperprolifératives, précancéreuses ou

sensibles aux rayons ultraviolets, chez un mammifère.

L'invention concerne en outre des moyens de prophylaxie

contre le cancer de la peau ou de réduction de la proba-

bilité de développement d'un cancer de la peau, ainsi que

de réduction de la gravité du photovieillissement résul-

tant de l'exposition au soleil, chez un mammifère, y com-

pris l'homme. Les procédés consistent à mettre en contact avec des cellules (ou à introduire dans des cellules) d'un mammifère, des fragments d'ADN monocaténaire (par

exemple oligopolynucléotides ou polynucléotides), des dé-

soxynucléotides, des dinucléotides, des dimères de dinu-

cléotides ou leur mélange, de manière que les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les

dimères de dinucléotides soient disponibles pour les cel-

lules. En variante, des cellules sont mises en contact avec un agent qui accroit l'activité de la protéine p53 et stimule par conséquent la réparation de l'excision de

nucléotides. Les fragments, désoxynucléotides ou dinu-

cléotides, ou l'agent qui accroît l'activité de p53 me-

nant à une stimulation de la réparation de l'excision de nucléotides, peuvent être introduits topiquement, par

voie orale, par aérosol ou par tous autres moyens appro-

priés, par exemple par instillation. Les fragments d'ADN ou les désoxynucléotides ou les dinucléotides peuvent

être irradiés par la lumière ultraviolette.

L'invention propose aussi des compositions utiles dans les procédés indiqués ci-dessus, comprenant des fragments d'ADN, des désoxynucléotides, des dinucléotides ou des dimères de dinucléotides ou un agent qui accroît

l'activité de p53 et stimule donc la réparation de l'ex-

cision de nucléotides, dans un véhicule de libération ap-

proprié, tel que des liposomes.

La Figure 1 est une représentation graphique de la

vitesse de croissance des cellules d'un cancer épider-

moide humain dosées avec de l'eau (diluant), 100 pM de pTpT (T2) ou 100 pM de pdApdA (A2). Le jour 0 est le jour précédant le dosage; les jours 1, 3, 4 et 5 sont des

jours qui font suite au dosage.

La Figure 2 est une représentation graphique de la vitesse de croissance cellulaire de fibroblastes humains normaux dosés avec de l'eau (diluant) ou 100 pM de pTpT (T2). Le jour 0 est le jour qui précède le dosage; les

jours 1, 3, 4 et 5 sont des jours qui font suite au do-

sage. Les valeurs représentent des moyennes les écarts

types de cultures en double.

La Figure 3 est une représentation graphique de la vitesse de croissance cellulaire de cellules cervicales cancéreuses humaines dosées avec de l'eau (diluant) ou

avec 100 pM de pTpT (T2). Le jour 0 est le jour qui pré-

cède le dosage; les jours 1, 4 et 6 sont des jours qui

font suite au dosage.

La Figure 4 est une représentation graphique du ren-

dement de lignées cellulaires de mélanome humain dosées

avec un diluant ou 100 pM de pTpT (T2).

La Figure 5 est une représentation graphique de la vitesse de croissance cellulaire de kératinocytes humains normaux dosés avec de l'eau (diluant) ou avec 100 pM de pTpT (T2). Le jour 0 est le jour qui précède le dosage; les heures 8, 24, 48 et 72 sont des heures qui font suite au dosage. Les valeurs représentent des moyennes les

écarts types de cultures en double.

La Figure 6 est une représentation graphique du nom-

bre moyen de cellules de fibroblastes néonatals humains

dosées avec de l'eau, T2 ou A2.

La Figure 7 est une représentation graphique du nom-

bre moyen de cellules de fibroblastes néonatals humains

dosés avec l'eau, T2 ou A2.

La Figure 8 est une représentation graphique de la vitesse de croissance cellulaire de fibroblastes humains normaux dosés avec l'eau (diluant) ou avec 100 pM de pTpT

(T2). Le jour 0 précède le dosage. Les valeurs représen-

tent des moyennes les écarts types de cultures en dou- ble. La Figure 9 est une représentation graphique de la vitesse de croissance de cellules de cancer du poumon H1299 p53-nulles, dosées avec de l'eau (diluant) ou 100 pM de pTpT (T2). Le jour 0 précède le dosage; les

jours 1, 2, 3 et 4 sont des jours qui font suite au do-

sage. Les valeurs représentent des moyennes les écarts

types de cultures en double.

La Figure 10 est une représentation graphique de la stimulation de la réparation d'ADN d'un plasmide reporter dans des kératinocytes humains traités avec pTpT. Cases vides: plasmide témoin d'irradiation simulée; cases

pleines: plasmide irradié par les UV.

La Figure 11 est une représentation graphique de la stimulation de la réparation d'ADN d'un plasmide reporter

dans des fibroblastes humains traités au pTpT. Cases vi-

des: plasmide témoin d'irradiation simulée; cases plei-

nes: plasmide irradié aux rayons UV.

On donne ci-après une description détaillée de l'in-

vention.

La présente invention est basée sur l'observation de la Demanderesse selon laquelle le traitement de cellules

avec des fragments d'ADN peut provoquer une réponse pro-

tectrice vis-à-vis de l'exposition subséquente à une ir-

radiation ultraviolette ou à des agents chimiques. Il est probable que le pTpT et d'autres acides nucléiques à chaine courte miment les produits d'altération de l'ADN ou des produits intermédiaires remaniés d'altération de

l'ADN. Il a déjà été montré que ces composés déclen-

chaient une réponse mélanogène (bronzage) de la peau (brevet des Etats-Unis d'Amérique N 5 643 556, dont les enseignements sont incorporés ici dans leur intégralité à

titre documentaire), récapitulant ainsi la réponse pro-

tectrice mélanogène à l'irradiation ultraviolette, et la présente invention montre que le résultat est l'induction du mécanisme d'action de p53, comprenant la régulation

favorisante de gènes capables d'être induits par p53, im-

pliqués dans la réparation d'ADN, tels que p21, l'anti-

gène nucléaire de cellules prolifératives (PCNA) et la protéine de xeroderma pigmentosum du groupe A (XPA). Les fragments d'ADN de la présente invention miment le signal d'altération de l'ADN, menant à l'induction du mécanisme d'action de réparation de l'excision de nucléotides et l'arrêt transitoire de croissance cellulaire qui permet une réparation plus importante de l'ADN avant la division cellulaire, en l'absence de stress génotoxique. Cette "simulation " est utile dans la chimioprotection contre la carcinogenèse. En particulier, l'invention a trait à l'utilisation de fragments d'ADN, de désoxynucléotides, de dinucléotides et de dimères de dinucléotides, tels que définis ci-après, ou d'un agent qui accroît l'activité de la protéine p53, pour le traitement préventif ou curatif de certaines maladies hyperprolifératives ou de certains états précancéreux affectant des cellules telles que les

cellules épithéliales, les kératinocytes ou les fibro-

blastes, comprenant des maladies de la peau telles que le

psoriasis et des dermatoses hyperprolifératives, précan-

céreuses ou induites par les rayons ultraviolets, telles

que l'eczéma de contact, chez les mammifères et en parti-

culier chez l'homme. L'invention concerne en outre l'uti-

lisation de fragments d'ADN, de désoxynucléotides, de di-

nucléotides ou de dimères de dinucléotides ou d'agents

qui stimulent l'activité de la protéine p53 pour la ré-

duction du photovieillissement (processus dû en partie à une altération cumulative d'ADN) ou pour la prophylaxie ou la réduction de la probabilité de développement d'un cancer de la peau chez un mammifère. L'invention propose en outre des compositions comprenant ces fragments d'ADN,

désoxynucléotides, dinucléotides ou dimères de dinucléo-

tides ou agents qui stimulent l'activité de la protéine p53. Dans une forme de réalisation de l'invention, des fragments d'ADN d'une longueur d'environ 2-200 bases, des désoxynucléotides (simples bases), des dinucléotides ou

des dimères de dinucléotides, sont administrés au mammi-

fère dans un véhicule approprié. L'expression "fragments d'ADN" utilisée dans le présent mémoire se rapporte à des

fragments d'ADN monocaténaire, des fragments d'ADN bica-

ténaire ou un mélange de fragments d'ADN monocaténaire et

de. fragments d'ADN bicaténaire. Le terme "désoxynucléo-

tides" se rapporte à un type unique de désoxynucléotide ou à un mélange de différents désoxynucléotides. Le terme

"dinucléotides" peut comprendre un type unique de nucléo-

tide ou différents types de nucléotides, et peut compren-

dre un mélange de différents types de dinucléotides. Dans une forme de réalisation appréciée, les nucléotides des

dinucléotides sont des désoxynucléotides. Des dinucléoti-

des représentatifs comprennent d(pT)2, d(pC)2, d(pA)2, d(pCpT), d(pTpC), d(CpT), d(TpC) et d(TpT), o T désigne

la thymine, C est la cytosine, d signifie désoxy et p si-

gnifie phosphate (voir Niggli, Photochem. Photobiol.

38(3):353-356 (1988)). Une combinaison d'au moins deux ou plus de deux fragments d'ADN, de désoxynucléotides, de

dinucléotides et/ou de dimères de dinucléotides peut aus-

si être utilisée. Les fragments d'ADN, les désoxynucléo-

tides ou les dinucléotides peuvent être irradiés par les

rayons ultraviolets. Cette irradiation par des rayons ul-

traviolets mène à une photodimérisation entre deux rési-

dus pyrimidiques adjacents (en l'occurrence thymine (T) et cytosine (C)) présents dans les fragments d'ADN ou les dinucléotides.

Comme représenté par la présente invention, le dinu-

cléotide de la thymidine réduit la vitesse de croissance cellulaire de plusieurs types de cellules humaines com- prenant le cancer épidermoide, le cancer des cellules cervicales, le mélanome, les kératinocytes néonatals et

les fibroblastes néonatals normaux (Exemples 1 à 5, res-

pectivement). Le pTpT réduit aussi la vitesse de renou-

vellement de l'épiderme dans le modèle du cobaye (Exemple 6). En outre, le traitement de cellules par le pTpT mène

à la localisation nucléaire de p53 (Exemple 7) et à l'in-

duction de gènes régulée par p53 (Exemple 8) tels que les gènes intervenant dans la réparation d'ADN (Exemples 1 et

7).

Le prétraitement de cellules par le pTpT stimule

leur aptitude à réparer une altération de l'ADN par irra-

diation ultraviolette et par le benzo(a)pyrène qui est un agent chimique cancérogène (Exemples 8 et 9), au moins en

partie par l'activation de p53 et la régulation favori-

sante de gènes dont la transcription est activée par p53, tels que le gène p21/Waf/Cip 1. Le prétraitement de la

peau par le pTpT mène également à un taux réduit de muta-

tion in vivo induite par les rayons ultraviolets (Exemple

12).

Les fragments d'ADN sont aussi des mimétiques effi-

caces des rayons ultraviolets. Par exemple, un oligomère

nona-nucléotidique, GAGTATGAG (SEQ ID N: 1) a été capa-

ble de stimuler la mélanogenèse dans des mélanocytes hu-

mains et d'induire l'expression de p21/Waf/Cip 1 dans une lignée de cellules de cancer épidermoide. En outre, une version brouillée du nonamère, TAGGAGGAT (SEQ ID N: 2) et des versions tronquées du nonamère originel, AGTATGA (SEQ ID N : 3) et GTATG (SEQ ID N: 4), ont aussi été capables de stimuler la mélanogenèse dans des mélanocytes humains (Exemple 11). Des fragments plus longs et des

fragments manquant du 5'-phosphate ont été moins effica-

ces dans la stimulation de la mélanogenèse (Exemple 13).

Ainsi, l'activité de simulation ultraviolette de pTpT est reproduite de façon tout à fait spectaculaire par des oligonucléotides (par exemple dans la plage de 2 à 200

nucléotides, normalement dans la plage de 5 à 20 nucléo-

tides et plus particulièrement dans la plage de 5 à 10

nucléotides). Les oligonucléotides de la présente inven-

tion sont donc utiles dans des procédés de prévention du cancer et du photovieillissement par stimulation de la réparation de l'ADN et activation de la pigmentation par l'accroissement de la production de la mélanine. Il est connu que la mélanine absorbe les photons dans la région de l'ultraviolet et, en conséquence, sa présence réduit

le risque de cancer et de photovieillissement.

Le dinucléotide de thymidine, pTpT, mime certains

effets de la lumière ultraviolette comprenant le déclen-

chement de la mélanogenèse et la stimulation de la pro-

duction de kératinocytes de TNFa. (Exemple 4). Le TNFx est

aussi induit par le pTpT dans un modèle d'hypersensibili-

té de contact chez la souris (Exemple 10). Le dinucléo-

tide pdApdA ne parvient pas à induire ces réponses.

Le rayonnement UV-B est un puissant inhibiteur de la phase d'induction de l'hypersensibilité de contact (CH) et le TNFx est un médiateur de cet effet suppresseur. Le dinucléotide de la thymidine (pTpT), servant de substrat

à la formation du dimère de thymidine induite par la lu-

mière ultraviolette, simule plusieurs effets du rayonne-

ment UV-B comprenant un accroissement de l'expression de

la tyrosinase et de la teneur en mélanine dans des méla-

nocytes de culture et le bronzage de la peau chez des co-

bayes. Les dinucléotides d'adénine (pApA), moins communé-

ment dimérisés par UF, sont moins efficaces.

Comme indiqué dans l'Exemple 9, ces fragments d'ADN miment aussi l'effet suppresseur du rayonnement UV-B sur

l'hypersensibilité de contact dans le modèle de la sou-

ris. Comme démontré par la présente invention, l'injec-

tion intracutanée de pTpT peut inhiber l'induction d'une hypersensibilité de contact et peut activer le gène de TNFa in vivo. Ces observations élargissent le spectre des effets du rayonnement UV-B simulés par pTpT et démontrent

que les produits photo-induits d'ADN et/ou leur répara-

tion assurent la médiation des conséquences biologiques

du rayonnement UV-B.

Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di-

nucléotides ou les dimères de dinucléotides peuvent être obtenus à partir de toute source appropriée, ou bien il peut s'agir de fragments d'ADN, de désoxynucléotides, de

dinucléotides ou de dimères de dinucléotides synthéti-

ques. Par exemple, de l'ADN de sperme de saumon peut être

dissous dans l'eau et le mélange peut ensuite être auto-

clavé pour fragmenter l'ADN.

Un "agent qui élève l'activité de la protéine p53", au sens du présent mémoire, est un agent (par exemple un médicament, une molécule, un fragment d'acide nucléique ou un nucléotide) qui accroît l'activité de la protéine

p53 et mène par conséquent à une accentuation des méca-

nismes de réparation d'ADN, tels qu'une réparation de l'excision de nucléotides, par l'induction de protéines impliquées dans la réparation d'ADN, telles que PCNA et XPA. L'activité de la protéine p53 peut être élevée par

stimulation directe de la transcription ou de la traduc-

tion d'ADN ou ARN de p53; par accroissement de l'expres-

sion ou de la production de protéine p53; par élévation de la stabilité de la protéine p53; par accroissement de la résistance à la dégradation de l'ARNm de p53 ou la protéine p53; par provocation de l'accumulation de p53 dans le noyau d'une cellule; par l'augmentation de la quantité de p53 présente; ou par un autre mode d'accentuation de l'activité de p53. La protéine p53

elle-même est aussi un agent qui accroit sa propre acti-

vité. On peut utiliser en association plusieurs agents qui accroissent l'activité de p53. En variante ou en ou-

tre, l'agent qui accroît l'activité de p53 peut être uti-

lisé conjointement avec des fragments d'ADN, des désoxy-

nucléotides ou des dinucléotides, comme décrit ci-dessus.

Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di-

nucléotides ou les dimères de dinucléotides ou les agents qui accroissent l'activité de la protéine p53 peuvent

être appliqués seuls ou en association avec d'autres com-

posés tels que des parfums ou des colorants. Ils peuvent

être appliqués dans un véhicule tel que l'eau, une solu-

tion de sel, ou dans un autre véhicule de libération ap-

proprié. Ce véhicule peut être n'importe quel véhicule de libération approprié qui délivre les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroît l'activité de la

protéine p53. Dans une forme de réalisation, du propylè-

neglycol est utilisé comme véhicule de libération. Dans

une forme de réalisation appropriée, on utilise un mé-

lange de propylèneglycol, d'éthanol et de myristate

d'isopropyle (1:2,7:1) contenant 3 % d'acide benzylsulfo-

nique et 5 % d'alcool oléylique. Dans une autre forme de réalisation, on utilise une préparation de liposomes. La

préparation de liposomes peut être constituée de tous li-

posomes qui traversent la couche cornée et s'incorporent à la membrane cellulaire, ce qui mène à la libération du contenu de liposomes dans la cellule. Par exemple, on

peut utiliser des liposomes tels que ceux qui sont dé-

crits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 077 211 au nom de Yarosh, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 621 023 au nom de Redziniak et al., ou

vet des Etats-Unis d'Amérique N 4 508 703 au nom de Red-

ziniak et al. Le véhicule de libération peut contenir des parfums,

* des colorants, des agents stabilisants, des écrans solai-

res ou d'autres ingrédients.

Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di-

nucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroit l'activité de p53 sont appliqués aux cellules concernées (ou introduits dans ces cellules ou mis en

contact avec elles) d'une manière appropriée. Les "cellu-

les concernées", au sens du présent mémoire, sont les

cellules qui risquent d'être affectées ou qui sont affec-

tées par la maladie hyperproliférative ou un état précan-

céreux, ou des cellules qui sont affectées par des condi-

tions d'altération de l'ADN telles qu'une irradiation ul-

traviolette ou une exposition à des agents chimiques en-

dommageant l'ADN, tels que le benzo(a)pyrène. La présente

invention englobe plus particulièrement des cellules épi-

théliales, comprenant des mélanocytes et des kératinocy-

tes, de même que des cellules épithéliales buccales, res-

piratoires, vésicales et cervicales. Comme on le démon-

trera dans le présent mémoire, les procédés et les compo-

sitions de la présente invention et leurs procédés

d'utilisation inhibent la croissance de cellules épithé-

liales provenant de nombreuses sources.

Dans une forme de réalisation, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroît l'activité de p53 sont appliqués topiquement à la surface de la peau. Dans d'autres formes de réalisation, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroit l'activité de p53 sont délivrés à d'autres cellules épithéliales qui sont

reconnues comme opposant moins de résistance à la péné-

tration de ces substances que ne le fait la peau, par

exemple par voie orale à l'épithélium buccal ou intesti-

nal; par aérosol à l'épithélium respiratoire; par ins-

tillation à l'épithélium vésical; ou par d'autres moyens

à d'autres cellules ou tissus de l'organisme. Les frag-

ments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou

les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroit l'ac-

tivité de p53 sont appliqués au moment opportun en une quantité efficace. Le "moment opportun" varie en fonction du type et du poids moléculaire des fragments d'ADN, des désoxynucléotides, des dinucléotides ou des dimères de dinucléotides ou de l'agent que l'on utilise; de l'état à traiter ou à prévenir; des résultats escomptés; et du patient individuel. Une "quantité efficace", au sens du présent mémoire, est une quantité ou une concentration

suffisante pour atteindre le résultat souhaité. La quan-

tité efficace dépend du type et du poids moléculaire des fragments d'ADN, des désoxynucléotides, des dinucléotides ou des dimères de dinucléotides ou de l'agent que l'on utilise, de l'état que l'on doit traiter ou prévenir; des résultats escomptés et du patient individuel. Par

exemple, pour le traitement curatif ou préventif du pso-

riasis, ou pour des dermatoses hyperprolifératives, pré-

cancéreuses ou induites par les rayons ultraviolets, la quantité efficace est la quantité nécessaire pour faire disparaître les symptômes de la maladie, pour réduire la surface de peau affectée par la maladie ou pour prévenir

la formation d'aires affectées. La concentration va géné-

ralement d'environ 2 à 300 pm, et elle dépend du type et

du poids moléculaire des fragments d'ADN, des désoxynu-

cléotides, des dinucléotides ou des dimères de dinucléo-

tides ou de l'agent que l'on utilise; de l'état que l'on doit traiter ou prévenir; des résultats escomptés; et

du patient individuel. Dans une forme de réalisation ap-

préciée, la concentration va de 50 à 200 pm; dans une forme de réalisation plus appréciée, la concentration va

de 75 à 150 pm.

Dans une première forme de réalisation de la pré-

sente invention, des fragments d'ADN tels que des frag-

ments d'ADN monocaténaire, des désoxynucléotides, des di- nucléotides ou des dimères de dinucléotides ou un agent

qui accroît l'activité de p53, sont appliqués, en l'ab-

sence de véhicule ou dans un véhicule de libération ap-

proprié, aux cellules concernées du mammifère en vue de

traiter ou de prévenir une maladie hyperproliférative af-

fectant des cellules épithéliales. Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroît l'activité de p53 peuvent être appliqués uniquement aux régions affectées, ou bien ils peuvent être appliqués à titre prophylactique

à des régions communément affectées par la maladie hyper-

proliférative.

Dans une forme de réalisation appréciée de l'inven-

tion, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di-

nucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent

qui accroît l'activité de p53 sont appliqués, en l'ab-

sence de véhicule ou dans un véhicule de libération ap-

proprié, à l'épiderme en vue du traitement curatif ou

préventif du psoriasis. Les fragments d'ADN, les désoxy- nucléotides, les dinucléotides sous les dimères de dinu-

cléotides, ou l'agent qui accroît l'activité de p53 peu-

vent être appliqués uniquement aux régions affectées, ou bien ils peuvent être appliqués à titre prophylactique à

des régions communément affectées de l'épiderme.

Dans une autre forme de réalisation appréciée de l'invention, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides, ou l'agent qui accroît l'activité de p53, sont appliqués, en l'absence de véhicule ou dans un véhicule de libération approprié, à l'épiderme en vue du traitement curatif ou préventif de la dermatite atopique, de l'eczéma de contact ou d'une inflammation à médiation allergique d'autres épithéliums comme la rhinite allergique ou la

conjonctivite allergique (rhume des foins) chez un mammi-

fère. Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di- nucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent

qui accroît l'activité de p53 peuvent être appliqués uni-

quement aux régions affectées, ou bien ils peuvent être

appliqués à titre prophylactique à des régions de l'épi-

derme communément affectées. Dans une autre forme de ré-

alisation appréciée de l'invention, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides, ou l'agent qui accroît l'activité de

p53 sont appliqués, seuls ou dans un véhicule de libéra-

tion approprié, à l'épiderme en vue du traitement curatif

ou préventif du vitiligo. Les fragments d'ADN, les dé-

soxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de di-

nucléotides ou l'agent qui accroît l'activité de p53 peu-

vent être appliqués uniquement aux régions affectées, ou bien ils peuvent être appliqués à titre prophylactique à

des régions de l'épiderme communément affectées.

Dans une autre forme de réalisation appréciée, des fragments d'ADN, des désoxynucléotides, des dinucléotides ou des dimères de dinucléotides ou un agent qui accroît

l'activité de p53 sont appliqués, seuls ou dans un véhi-

cule de libération approprié, à l'épiderme en vue du

traitement curatif ou préventif d'autres dermatoses hy-

perprolifératives, précancéreuses ou de sensibilité aux

rayons ultraviolets.

Dans une seconde forme de réalisation, des fragments d'ADN, des désoxynucléotides, des dinucléotides ou des

dimères de dinucléotides ou un agent qui accroît l'acti-

vité de p53 sont appliqués, seuls ou dans un véhicule de libération approprié, à l'épiderme en vue de la réduction

du photovieillissement ou de la prophylaxie contre le dé-

veloppement d'un cancer de la peau ou de la réduction de la probabilité d'un tel développement. Les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les

dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroit l'activi-

té de p53 sont appliqués à un moment opportun (c'est-à- dire à un moment suffisamment proche de l'exposition de la peau à des rayons ultraviolets): les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides peuvent être appliqués avant, pendant ou après l'exposition aux rayons ultraviolets. On peut les appliquer quotidiennement ou à des intervalles réguliers

ou intermittents. Dans une forme de réalisation appré-

ciée, les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les di-

nucléotides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui accroît l'activité de p53 peuvent être appliqués sur une base journalière à de la peau qui peut être exposée à

la lumière solaire au cours de la journée.

Dans une autre forme de réalisation de l'invention,

les fragments d'ADN, les désoxynucléotides, les dinucléo-

tides ou les dimères de dinucléotides ou l'agent qui ac-

croit l'activité de p53 sont appliqués, en l'absence d'un véhicule ou dans un véhicule de libération approprié, à

des cellules d'un individu (par exemple des cellules épi-

théliales) en vue du traitement curatif ou préventif d'états hyperprolifératifs précancéreux, ou pour réparer ou empêcher une altération de l'ADN causée par des agents

chimiques endommageant l'ADN, tels que le benzo(a)pyrène.

L'invention est en outre illustrée par les exemples suivants:

EXEMPLE 1: Application à des cellules de cancer épider-

moide humain

Des cellules de la lignée cellulaire SCC12F de can-

cer épidermoide humain ont été maintenues en milieu pri-

maire pour kératinocytes (300 ml de DME, 100 ml de sup-

plément nutritif F-12, 50 ml d'Adénine 10x, 50 ml de sé-

rum de veau foetal, 5 ml de pénicilline/streptomycine et

0,5 ml de facteur de croissance épidermique et de l'hy-

drocortisone jusqu'à une concentration finale de 1,4 pg/ml) et ont été dosées avec de l'eau (diluant), 100 pm de pTpT (T2, Midland Certified Reagent Company, Midland,

TX) ou 100 pM de pdApdA (A2). Les cellules ont été récol-

tées avant le dosage (jour 0) et 1, 3, 4 et 5 jours après

le dosage, et elles ont été comptées au moyen d'un comp-

teur Coulter. Après la récolte, les cellules ont été traitées en vue de l'isolement de l'ARN total et elles ont été analysées par buvardage de Northern. L'addition

de pTpT (T2) à des cellules d'épithélioma épidermoïde hu-

main a conduit à des élévations prononcées de la vitesse

de croissance des cellules, comme représenté sur la Fi-

gure 1. L'addition d'un désoxyadénine dinucléotide témoin (pdApdA ou A2), composé présentant une grande similitude

avec pTpT mais non aisément dimérisé par irradiation ul-

traviolette et par conséquent non excisé au cours de la réparation d'ADN induite par les rayons ultraviolets, n'a

aucun effet (A).

Dans un second essai, on a cultivé des cellules SCC12F de la manière décrite ci-dessus. Deux ou trois jours après l'ensemencement, on a ajouté aux cultures pré-confluentes du milieu neuf additionné de 100 pM de T2,

ou de diluant comme témoin. Les cellules ont été recueil-

lies par trypsination quotidiennement et elles ont été comptées à l'aide d'un compteur Coulter. Le rendement en cellules dans des cultures traitées avec T2 a été réduit de 75 % comparativement au rendement obtenu pour des

cultures témoins en double après cinq jours (Figure 2).

Cela correspond à des doublements de population de 2,3 au

cours de cette période pour les cellules témoins, compa-

rativement à un doublement égal à l'unité pour des cellu-

les traitées au T2. Ces résultats démontrent en outre que

l'application des fragments d'ADN inhibe la multiplica-

tion cellulaire, y compris la multiplication de cellules cancéreuses.

Dans un troisième essai, il a été démontré que l'ad-

dition de thymidine dinucléotides (T2) à des cellules d'épithélioma épidermolde humain pendant 24-72 heures conduisait à une régulation favorisante d'au moins trois gènes: arrêt de croissance et altération d'ADN (GADD ), inhibiteur dérivé de cellules sénescentes (Sdi I), et complémentation croisée de réparation d'excision

(ERCC-3) (données non représentées). Des cultures en dou-

ble de cellules SCC12F ont été maintenues dans un milieu

de croissance pour kératinocytes à base de milieu de Ea-

gle modifié selon Dulbecco (DMEM; GIBCO/BRL, Gaithers-

burg, MD) additionné de 10 % de sérum de veau foetal (Hy-

clone Labs, Logan, UT) et de facteur de croissance épi-

dermique, comme décrit (M.C. Hollander et al., J. Biol.

Chem. 268:328-336 (1992)). On a ajouté à des cultures pré-confluentes du milieu neuf additionné de 100 uM de pTpT, ou un volume égal de diluant. Les cellules ont été

recueillies quotidiennement après les additions et trai-

tées en vue de l'isolement de l'ARN total par la méthode d'extraction au Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) en suivant le protocole du fabricant. Dix microgrammes d'ARN provenant de chaque échantillon ont été soumis à une électrophorèse sur gel, transférés à un

filtre de nylon et sondés de la manière décrite antérieu-

rement (A. Nada et al., Exp. Cell Res. 211:90-98 (1994)).

L'ADNc pour GADD 45 a été généré par réaction en chaîne de la polymérase en utilisant des amorces basées sur la

séquence du gène GADD 45 humain (T. Mitsudomi et al., On-

cogene 7:171-180 (1992)). L'ADNc pour ERCC 3 a été acquis

auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Rock-

ville, MD). L'ADNc de SDI 1 était un don du docteur J. Smith et a été décrit antérieurement (N.C. Walworth et R.

Bernards, Science 271:353-356 (1996)).

Comparativement au témoin contenant le diluant, les ARNm pour GADD 45, ERCC 3 et SDI 1 ont déjà présenté une

régulation favorisante au bout de 24 heures dans des cel-

lules traitées au pTpT, et sont restés à un niveau élevé pendant plusieurs jours. L'addition du désoxyadénine di- nucléotide (A2) témoin a été moins efficace ou inefficace en ce qui concerne l'induction de ces gènes (données non représentées). Des résultats comparables ont été obtenus

dans des essais préliminaires avec des cellules de méla-

nome S91 et des fibroblastes humains normaux (résultats

non représentés).

L'évolution de l'induction dans le temps est sembla-

ble à ce que l'on observe après irradiation par des rayons ultraviolets pour les deux gènes qui ont fait l'objet de cette étude (GADD 45 et SDI 1) (A.J. Fornace et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8800-8804 (1988); M.C. Hollander et al., J. Biol. Chem. 268:24385-24393 (1993); Q. Zhan et al., Mol. Cell. Biol. 14:2361-2371 (1994); W.S. El-Deiry et al., Cancer Res. 54:1169-1174 (1994); et W.S. El-Deiry et al., Cell 75:817-825 (1993)), et elle a aussi été semblable à l'évolution de

l'induction du gène de la thyrosinase par T2 dans des mé-

lanocytes et des cellules de mélanome (W. Maltzman et L. Czyzyk, Mol. Cell Biol. 4:1689-1694 (1984); et X. Lu et D.P. Lan, Cell 75:765-778 (1993)). Il est connu que Sdi I est impliqué dans la régulation du cycle cellulaire et

plus particulièrement dans le blocage de la division cel-

lulaire. On sait que GADD 45 et ERCC-3, enzyme humain de réparation de l'ADN, sont impliqués dans la réparation

d'une altération d'ADN induite par les rayons ultravio-

lets. La réponse au pTpT est identique à celle que l'on observe après irradiation ultraviolette de ces lignées

cellulaires, et elle est donc analogue à la réponse à di-

vers antimétabolites tels que le méthotrexate, qui sont cliniquement efficaces dans le traitement d'affections

hyperprolifératives de la peau.

EXEMPLE 2: Application à des cellules cancéreuses cervi-

cales humaines Des cellules cancéreuses cervicales humaines (cellu- les HeLa) ont été maintenues en milieu DME additionné de % de sérum de veau et dosées avec de l'eau (diluant) ou 100 pM de pTpT (T2). Les cellules ont été recueillies 1, 4 et 6 jours après le dosage et comptées à l'aide d'un

compteur Coulter.

L'addition de pTpT (T2) aux cellules cancéreuses cer-

vicales humaines a eu pour résultat des réductions pro-

noncées de la vitesse de croissance cellulaire, comme re-

présenté sur la Figure 3.

EXEMPLE 3: Application à des cellules humaines de méla-

nome Des lignées de cellules humaines de mélanome CRL

1424, Malma, Sk Mel 2 et Sk Mel 28 ont été acquises au-

près de l'American Type Culture Collection (ATCC). Les

lignées cellulaires ont été maintenues dans du DME addi-

tionnées de 2 % de sérum de veau et dosées avec de l'eau (diluant), du DME ou 100 pM de pTpT (T2) dans du DME. Une semaine après le dosage, les cellules ont été recueillies

et elles ont comptées à l'aide d'un compteur Coulter.

L'addition de pTpT (T2) à l'une quelconque des quatre différentes lignées cellulaires humaines de mélanome a

conduit à des élévations prononcées des rendements cellu-

laires, comme représenté sur la Figure 4.

EXEMPLE 4: Application à des kératinocytes humains Des kératinocytes néonatals humains normaux ont été cultivés de la manière décrite ci-dessus dans l'Exemple 1 pour des cellules SCC12F, et ils ont été traités avec

pM de T2 ou un diluant utilisé comme témoin. Les cel-

lules ont été récoltées en vue de comptages. Le rendement

en cellules dans des cultures traitées avec T2 a été ré-

duit de 63 %, comparé à celui de cultures témoins en dou-

ble après trois jours (Figure 5). Cela correspond à un doublement de population dans cet intervalle de temps

pour des cellules témoins, tandis que le nombre de cellu-

les traitées avec T2 est resté le même. Ces résultats dé- montrent que l'application des fragments d'ADN inhibe la

multiplication cellulaire.

L'analyse par buvardage de Northern des kératinocy-

tes humains normaux traités avec pTpT pendant 24-72 heu-

res montre l'induction du gène alpha du facteur nécrosant

des tumeurs (TNF) (résultats non représentés). La cyto-

kine immunomodulatrice, dont l'induction par irradiation ultraviolette est connue, peut donc être induite par pTpT. L'utilisation par application locale de fragments

d'ADN, de désoxynucléotides, de dinucléotides ou de dimè-

res de dinucléotides peut donc être utile dans l'immuno-

modulation de réactions cutanées et dans le traitement curatif ou préventif de maladies ou d'affections mettant

en jeu des médiateurs immunitaires.

EXEMPLE 5: Inhibition de la croissance cellulaire de fi-

broblastes néonatals normaux par des fragments d'ADN Des fibroblastes néonatals humains normaux ont été

inoculés dans des boîtes de culture Falcon P35 à une den-

sité de 9 x 104 cellules par boite. Le milieu de culture consistait en DME additionné de 10 % de sérum de veau, en quantité de 2 ml par boîte. Un jour après l'inoculation, les cultures ont été additionnées de 100 pl de T2 2 mM dans du DME ou de 100 pl de A2 2 mM dans du DME, ou d'eau (témoin). Les cellules de deux boîtes ont été recueillies

et comptées avant les additions, ce qui a donné une va-

leur initiale ou valeur au "jour 0". Des prélèvements ont été effectués sur des boîtes en double de chacune des conditions indiquées, cinq jours après l'addition des

suppléments, et le nombre de cellules a été déterminé.

Tous les comptages de cellules ont été effectués à l'aide d'un compteur Coulter. Les résultats sont représentés sur

les Figures 6 et 7. Ces résultats indiquent que l'appli-

cation des fragments d'ADN inhibe la multiplication cel-

lulaire. Dans un second essai, des fibroblastes néonatals hu- mains normaux ont été inoculés et cultivés de la manière décrite ci- dessus dans l'Exemple 1 pour des cellules SCC12F. Les cultures ont été additionnées de 100 pl de T2 2 pM ou d'eau (témoin), et elles ont été recueillies en vue de comptages cellulaires. Le rendement en cellules dans des cultures de fibroblastes traitées avec T2 a été

réduit de 40 % comparativement à celui de cultures té-

moins en double après trois jours (Figure 8). Cela correspond à des doublements de population d'un facteur 4 dans cet intervalle de temps pour des cellules témoins, comparativement à des doublements d'un facteur 3,6 pour des cellules traitées avec T2. Ces résultats démontrent en outre que l'application des fragments d'ADN inhibe la

multiplication cellulaire.

EXEMPLE 6: Effet d'applications de pTpT sur l'Indice de Marquage Epidermique

Des cobayes ont reçu une ou deux applications topi-

ques journalières de 100 pM de pTpT ou le véhicule seul comme témoin pendant trois jours. Le quatrième jour, on a effectué des biopsies à l'emporte-pièce et on a maintenu les échantillons pendant 7 ou 8 heures dans du milieu

primaire pour kératinocytes additionné de 10 pCi/ml de 3H-

thymidine (activité spécifique 9,0 Ci/mmole, NEN). Les tissus ont ensuite été rincés avec du milieu froid et

fixés dans de la formaline à 10 % tamponnée au phosphate.

Après une série d'étapes de déshydratation, les tissus ont été enrobés dans de la paraffine. Des coupes de 6 pm ont été effectuées et montées sur des lames de verre,

plongées dans de l'émulsion NTB-2 Nuclear Track et main-

tenues à l'obscurité à 4 C pendant 7 jours. Les coupes

ont été développées dans du révélateur Kodak D-19 et co-

lorées à l'hématoxyline et à l'éosine. L'indice de mar-

quage a été mesuré par calcul du pourcentage de noyaux

marqués parmi 100 kératinocytes de base.

Résultats: Indice de marquage 2 applications journalières Véhicule (témoin) PTpT

4 1,4 1,5 0,7

1 application journalière Véhicule (témoin) PTpT

4,5 2,1 2 0

On a représenté les résultats l'écart-type.

L'indice de marquage (mesure de la vitesse de renou-

vellement épidermique) est plus faible dans la peau trai-

tée au pTpT que dans la peau traitée avec le véhicule

(test T par séries appariées, > 0,03) dans les deux es-

sais. Ces résultats démontrent que les fragments d'ADN

réduisent la vitesse de renouvellement épidermique.

EXEMPLE 7: Râle de p53 dans la réparation d'ADN Il est connu que les deux gènes GADD 45 et SDi 1 sont régulés quant à leur transcription par la protéine anti-oncogène p53 (M.B. Kastan et al., Cell 71:587-597

(1992)); W.S. El-Deiry et al., Cell 75:817-825 (1993)).

Après irradiation par des rayons ultraviolets et par des rayons y, de même qu'après traitement des cellules avec des agents chimiques endommageant l'ADN, il se produit

* rapidement une stabilisation et une accumulation nu-

cléaire de p53 (M. Fritsche et al., Oncogene 8:307-318

(1993); W.G. Nelson et M.B. Kastan, Mol. Cell Biol.

14:1815-1823 (1994); X. Lu et D.P. Lane, Cell 75:765-778 (1993)), après quoi cette protéine se lie à des séquences

consensus promoteurs spécifiques et module la transcrip-

tion de gènes régulés (X. Lu et D.P. Lane, Cell 75:765-

778 (1993)). Des données récentes suggèrent que p53 peut aussi être activé par la liaison d'ADN monocaténaire courts, ainsi que de certains peptides et anticorps, au

domaine terminal carboxyle de cette protéine (L. Jayara-

man et C. Prives, Cell 81:1021-1029 (1995); T.R. Hupp et al., Cell 83:237-245 (1995)). En vue de déterminer si

l'effet inhibiteur du dinucléotide pTpT sur la proliféra-

tion cellulaire est sous la médiation de p53, on a exami-

né la réponse de croissance d'une lignée cellulaire nul-

les en p53, à savoir les cellules de cancer du poumon H1299. Les cellules H1299 nulles en p53 (Y. Sanchez et al., Science 271:357- 360 (1996)) ont été maintenues dans du DMEM additionné de 10 % de sérum de veau. On a ajouté à des cultures préconfluentes du milieu neuf additionné

de 100 pM de pTpT ou de diluant. On a recueilli les cel-

lules plusieurs jours consécutifs par trypsination et on les a comptées à l'aide d'un compteur Coulter. Comme le montre la Figure 9, il n'y a pas eu d'inhibition de la

prolifération des cellules H1299 traitées au pTpT compa-

rativement aux témoins traités avec le diluant.

L'effet de pTpT sur le taux et la distribution in-

tracellulaire de p53 dans des fibroblastes néonatals nor-

maux a été examiné par coloration à l'immunoperoxydase en utilisant un anticorps monoclonal spécifique de p53 (mAb

421, Oncogene, Cambridge, MA). Des cultures préconfluen-

tes ont été traitées avec 100 pM de pTpT ou le diluant pendant 24 heures avant la coloration des cellules. Les cellules ont tout d'abord été fixées pendant une minute dans du fixateur Histochoice (Amresco, Solon, OH) puis elles ont été rincées pendant 5 minutes dans du PBS. On a détecté le p53 en utilisant le kit Vectastain Elite ABC

(Vector Laboratories, Burlingame, CA) et l'anticorps mo-

noclonal mAb 421 spécifique de p53. Dans un laps de temps

de 24 heures, on a détecté un accroissement de p53 intra-

nucléaire dans des cellules traitées au pTpT comparative-

ment à des cellules traitées avec le diluant (résultats

non représentés), comme cela a été rapporté après irra-

diation par des rayons ultraviolets (M. Fritsche et al., Oncogene 8:307318 (1993); W.G. Nelson et M.B. Kastan, Mol. Cell Biol. 14:1815-1823 (1994); H. Lu et D.P. Lane, Cell 75:765-778 (1993)). Ces résultats sont en conformité avec l'induction des gènes GADD 34 et SDI 1 régulés par p53 dans des fibroblastes (résultats non représentés) de

même que dans des cellules SCC12F, par le pTpT.

Dans un autre essai, on a trouvé que le pTpT indui-

sait l'expression d'ARNm de SDI 1 d'une manière dépen-

dante de p53. Des cultures préconfluentes de cellules H1299 ont été transfectées avec un vecteur d'expression

contenant l'ADNc de p53 humain de type sauvage sous l'in-

fluence du promoteur/activateur humain de cytomégalovirus (Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Oncology Center). Des transfections témoins ont été effectuées en utilisant le vecteur duquel l'ADNc de p53 avait été éliminé. Les transfections ont été conduites au moyen du Lipofectin Reagent Kit (GIBCO/BRL). Un jour après la transfection, les cellules ont été recueillies en vue de l'analyse par

buvardage de Western en utilisant 20 pg de protéine to-

tale de la manière décrite (M. Yaar et al., J. Clin. In-

vest. 94:1550-1562 (1994)). On a détecté le p53 en utili-

sant l'anticorps mAb 421, une immunoglobuline anti-souris liée à de la peroxydase de raifort (Amersham, Arlington

Heights, IL) et un kit ECL (Amersham) en suivant les di-

rectives du fabricant. Au moment o la protéine a été re-

cueillie, des cultures en double de cellules H1299 trans-

fectées avec le vecteur d'expression de p53 (appelé

"p53") ou le vecteur de contrôle ("Ctrl") ont été addi-

tionnées de diluant (DMEM) ou de 100 pM de pTpT. Au bout de 24 heures, les cellules ont été recueillies, traitées

en vue de l'isolement de l'ARN et de l'analyse par buvar-

dage de Northern avec une sonde d'ADNc de SDI 1. L'ana-

lyse de l'autoradiographie a été effectuée au moyen d'un ordinateur Macintosh Ilsi et d'un analyseur Macintosh One, et la brillance et le contraste ont été ajustés de manière à afficher au maximum des différences des signaux autoradiographiques. Les résultats ont indiqué que les cellules H1299 nulles en p53 exprimaient un très faible niveau de transcrit de SDI 1 et que ce niveau n'était pas

affecté par l'addition de pTpT (résultats non représen-

tés). La transfection de ces cellules avec un vecteur d'expression de p53 de type sauvage a élevé le niveau de

SDI 1 et a rendu ce transcrit apte à être induit par ad-

dition de pTpT (résultats non représentés). L'analyse par buvardage de Western a confirmé que les cellules H1299 n'exprimaient normalement pas de p53 et que les cellules H1299 transfectées exprimaient des taux élevés de p53

(résultats non représentés). Ces données suggèrent forte-

ment que le pTpT accroît l'activité de transcription de p53. EXEMPLE 8: Stimulation de la réparation d'ADN L'expression d'un plasmide reporter altéré par les

rayons ultraviolets, contenant le gène de chloramphéni-

col-acétyltransférase (CAT) bactérienne sous l'influence des séquences de promoteur et d'activateur SV40, dont on a déjà montré l'aptitude à détecter la capacité réduite de réparation de l'ADN dans des lymphocytes humains en association avec des cancers de la peau liés à l'âge ou de survenue précoce (Q. Wei et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. 1 USA, 90:1614-1618 (1993)), a été utilisée pour me-

surer la capacité de réparation de l'ADN de fibroblastes

et kératinocytes néonatals normaux provenant de peau hu-

maine.

On a établi des kératinocytes nouveau nés de la ma-

nière décrite (B.M. Stanulis-Praeger et B.A. Gilchrest, J. Cell. Physiol. 139:116-124 (1989)) en utilisant une version modifiée de la méthode de Rheinwald et Green (B.A. Gilchrest et al., J. Invest. Dermatol. 101:666-672 (1993)). Des kératinocytes de premier passage ont été

maintenus dans un milieu à faible teneur en Ca2+ sans dif-

férenciation (K-Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Des fibroblastes ont été établis à partir d'explants dermiques de la manière décrite (J.G. Rhein- wald et J. Green, Cell 6:331-343 (1975)) et ils ont été maintenus dans du DMEM additionné de 10 % de sérum de boeuf. Les cellules ont été traitées avec 100 pM de pTpT ou avec un volume égal de diluant (DMEM) pendant 5 jours avant la transfection. On a transfecté des cultures en double de chaque condition en utilisant le Lipofectin Reagent Kit (GIBCO/BRL) et 5 pg d'ADN reporter, vecteur de contrôle de pCAT (Promega, Madison WI). Avant la

transfection, l'ADN vecteur a été soumis à une irradia-

tion factice ou exposé à 100 mJ/cm2 de rayonnement UV-B émis par un simulateur solaire à arc de xénon de 1 kW (XMN 1000-21, Optical Radiation, Azuza, CA), mesuré à 285 + 5 nm au moyen d'un radiomètre de recherche (modèle IL

1700 A, International Light, Newburyport, MA) de la ma-

nière décrite (M. Yaar et al., J. Invest. Dermatol.

:70-74 (1985)). Des cellules ont été recueillies 24 heures après la transfection dans un tampon de lyse prévu dans le CAT Enzyme Assay System (Promega, Madison, WI) en

utilisant le protocole proposé par le fabricant. L'acti-

vité enzymatique de CAT a été déterminée d'après le pro-

tocole de comptage par scintillation liquide et au moyen

des composants du kit du système d'essai. Du chloramphé-

nicol marqué [50-60 mCi (1,85-2,22 GBq)mmole] a été ac-

quis auprès de New England Nuclear (Boston, MA). La concentration en protéine dans les extraits cellulaires a été déterminée par la méthode de Bradford (Anal. Biochem. 72:248 (1986)). L'activité en CAT a été exprimée en cpm/100 pg de protéine et elle est représentée comme pourcentage d'activité de cellules transfectées avec le

plasmide exposé à l'irradiation fictive.

Dans des essais préliminaires, l'exposition du plas-

mide à une dose d'irradiation solaire simulée (100 mJ/cm2, mesuré à 285 nm) avant la transfection a été identifiée comme conduisant à une réduction d'environ 75 % de l'activité en CAT titrée dans des lysats cellu-

laires 16 à 24 heures après la transfection, comparative-

ment à l'activité du plasmide exposé à l'irradiation fic-

tive, transfecté dans des cultures en double. Toutefois, des kératinocytes (Figure 10) et des fibroblastes (Figure 11) prétraités avec 100 pM de pTpT pendant cinq jours avant la transfection ont présenté une activité en CAT de plus de 50 % de celle de témoins transfectés ayant subi une irradiation fictive. Du fait que le plasmide reporter

était sans réplication, le niveau d'activité en CAT re-

flète directement le degré de réparation d'ADN du gène de CAT endommagé par les rayons ultraviolets, rétablissant son activité biologique. Cesrésultats indiquent donc que le traitement au pTpT de fibroblastes et de kératinocytes

humains normaux fait plus que doubler la capacité de cel-

lules à réparer en une période de 24 heures l'altération

d'ADN induite par les rayons ultraviolets. Il a été dé-

montré que des cellules humaines en culture réparaient

plus de 70 % des produits induits par la lumière ultra-

violette dans des limites de 24 heures après l'irradia-

tion ((D.L. Mitchell et al., Environmental UV Photobiolo-

gy (publié sous la direction de A.R. Young et al.), 345-

377 (Plenum Press, New York et Londres, 1993)). L'expres-

sion activée du plasmide irradié par les rayons ultravio-

lets dans des cellules traitées au pTpT n'a pas résulté

d'un accroissement général de la transcription plasmidi-

que dans ces cellules, parce que l'expression du plasmide soumis à l'irradiation fictive n'a pas été plus grande

que dans des cellules non traitées au pTpT.

EXEMPLE 9: Activation de p53 et réparation de produits d'addition BP- ADN Culture de cellules On a établi des kératinocytes humains nouveau- nés, en utilisant une version modifiée (Stanislus et al., J. Invest. Dermatol. 90:749-754 (1998)) de la méthode de Rheinwald et Green (Cell 6:331-343 (1975)). Des kératino- cytes de premier passage ont été maintenus dans un milieu sans différenciation contenant une faible concentration

en ion calcium (K-Stim, Collaborative Biomedical Pro-

ducts, Bedford, MA).

La lignée de cellules de cancer du poumon H1299 nulle en p53 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) a été maintenue en milieu d'Eagle modifié

par Dulbecco (DMEM; GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) addi-

tionné de 10 % de sérum de boeuf (Hyclone Labs, Logan,

UT).

Transfection de cellules H1299 avec un vecteur d'ex-

pression de p53 Des cultures pré-confluentes de cellules H1299 ont été transfectées avec un vecteur d'expression contenant l'ADNc de p53 humain de type sauvage sous le contrôle du promoteur/activateur humain de cytomégalovirus (Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Oncology Center). On a effectué des transfections témoins en utilisant le même vecteur sans ADNc de p53. Les transfections ont été conduites de

la manière précédemment décrite. Un jour après la trans-

fection, des cellules ont été recueillies en vue du bu-

vardage de Western en utilisant 20 pg de protéine totale de la manière décrite. On a détecté le p53 en utilisant

l'anticorps monoclonal Do-1 (Ab-6) connu pour son apti-

tude à détecter à la fois des formes actives et inactives

de la protéine (Oncogene, Cambridge, MA), une Ig anti-

souris liée à la peroxydase de raifort (Amersham, Arling-

ton Heights, IL) et un kit ECL (Amersham), en suivant les

directives du fabricant.

Dosage de p53 avec utilisation du plasmide reporter hGH

Des kératinocytes humains normaux ont été transfec-

tés avec le plasmide (pPG-GH) reporter de l'hormone de croissance humaine (hGH) au moyen du Lipofectamine Rea-

gent Kit (GIBCO/BRL) de la manière suggérée par le fabri-

cant et avec addition de 0,5 pg de pG-GH à chaque boîte

de culture p35. Le plasmide pPG-GH contient la région co-

dant l'hormone hGH sous le contrôle du promoteur de thy-

midine kinase (TK) et de la séquence consensus de p53, et

il est connu que la production de protéine hGH est pro-

portionnelle à l'activité de p53 (Kern et al., 1992). La transfection a été effectuée en présence de 100 pM de pTpT (Midland Certified Reagent Company, Midland, TX) ou d'un volume égal de diluant. En même temps, le vecteur de contrôle de PS-P-galactosidase (Promega, Madison, WI) a été co-transfecté afin de déterminer le rendement de transfection (Norton et Coffin, 1985). Quatre heures après la transfection, le milieu a été enlevé et remplacé par du milieu de K- Stim additionné ou non de 100 pM de pTpT. Vingt quatre heures après la transfection et le

traitement au pTpT, on a récolté 400 pl du milieu de cha-

que boîte de culture de 35 mm et on a ajouté 100 pl de

solution d'anticorps 125I-hGH (Nichols Institute Diagnos-

tics, San Juan Capistrano, CA) pour détecter la sécrétion

de hGH. Les cellules ont été récoltées dans du tampon Re-

porter Lysis Buffer (Promega) d'après un protocole prévu par le fabricant et 150 pl de ce lysat ont été utilisés pour le dosage de la 5galactosidase au moyen d'un kit de dosage de P-galactosidase (Promega). Des échantillons de chacune des boîtes de culture en trois exemplaires ont été soumis à une évaluation de la synthèse de hGH et de P-galactosidase. Des cellules H1299 ont été transfectées de la même

façon avec le vecteur d'expression p53 ou un vecteur té-

moin. Deux jours après la transfection, ces cellules ont été cotransfectées avec le plasmide pPG-GH et le vecteur

de contrôle de PSV-3-galactosidase et elles ont été trai-

tées avec 100 pM de pTpT. Vingt quatre heures plus tard, on a récolté 250 pl du milieu et du lysat cellulaire et

on les a traités de la manière décrite ci-dessus.

Dosage de CAT

Le vecteur pCAT (Promega) a été traité avec du ben-

zo(a)pyrène-7,8-diol-9,10-époxyde (BPDE) de la manière décrite (Athas et al., Cancer Res 1991) pour produire un plasmide moins endommagé et un plasmide plus endommagé, ce qui avait été auparavant montré instructif dans des études examinant différentes capacités de réparation dans des cellules humaines. Sur la base de l'incorporation de 3H-BPDE à l'ADN, le plasmide moins endommagé contenait 25 produits d'addition par plasmide de 5 kilobases et le

plasmide le plus endommagé contenait 50 produits d'addi-

tion. Ce vecteur sans réplication contient le gène de la

chloramphénicol-acétyltransférase sous contrôle des sé-

quences de promoteur et d'activateur SV40. Des kératino-

cytes humains et des cellules H1299 transfectées par p53 ont été prétraités avec 100 pM de pTpT ou volume égal de diluant (DMEM) seul pendant 48 heures, puis ils ont été transfectés avec le vecteur de contrôle pCAT modifié par BP (0,5 ug/ml) ou le vecteur non modifié (0,5 pg/ml)

conjointement avec le vecteur de contrôle de PSV-p-

galactosidase (0,5 ig/ml). Des cellules ont été recueil-

lies dans le tampon Reporter Lysis Buffer (Promega) 24 heures après la transfection. L'activité enzymatique de CAT a été déterminée au moyen du protocole de comptage par scintillation liquide et avec les composants du kit

d'analyse (Promega). Du chloramphénicol marqué au 4C [50-

mCI (1,85-2,22 GBq)mmole] a été acquis auprès de New England Nuclear (Boston, MA). L'activité en CAT a été

normalisée avec l'activité en P-galactosidase.

Analyse par buvardage de Western Des cellules ont été traitées avec 100 pM de pTpT ou un volume égal de diluant seul pendant 48 heures. Les protéines cellulaires totales ont été recueillies dans un tampon consistant en 0,25 M de chlorhydrate de Tris (pH 7,5), 0,375 M de NaCl, 2,5 % de désoxycholate de sodium, 1 % de Triton XW-100, 25 mM de MgCl2, 1 mM de fluorure de

phénylméthylsulfonyle et 0,1 mg/ml d'aprotinine. Les pro-

téines (100 pg par échantillon) ont été séparées par électrophorèse sur gel à 7,5-15 % de dodécyl-sulfate de sodium et de polyacrylamide et transférées à une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Keene NH). Après le transfert, le gel a été coloré au bleu Coomassie pour vérifier l'égalité de charge, comme visualisé par les

protéines résiduelles de haut point moléculaire. Les mem-

branes ont été bloquées dans du Tween-20 à 0,05 % dans du PBS avec 5 % de lait (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Les réactions des anticorps ont été conduites avec

les anticorps suivants: anti p53 (AB-6), anti PCNA (Ab-

2) (Oncogene Science) et anti-XPA (FL-273) (Santa Cruz

Biotechnology). De l'immunoglobuline de mouton anti-

souris liée à de la peroxydase de raifort (Amersham, Ar-

lington Heights, IL) (pour p53 et PCNA) et de l'IgG de chèvre anti-lapin (Bio-Rad) (pour XPA) ont été utilisés comme anticorps secondaires. La liaison a été détectée

par le kit de détection ECL (Amersham).

Pour mesurer la réparation de produits d'addition

BP-ADN, on a utilisé un système plasmidique reporter al-

téré par BP et non répliquant, contenant le gène bacté-

rien de chloramphénicol-acétyltransférase (CAT), de la manière décrite dans l'Exemple 8. Pour des kératinocytes humains de premier passage, le rendement de transfection,

tel que mesuré par le vecteur d'expression de P-

galactosidase co-transféré, a été de 40-70 %. Comparati-

vement à des cellules traitées au diluant, les kératino-

cytes humains traités au pTpT ont montré un doublage ap-

proximatif de l'expression de CAT par rapport à des

cultures en double transfectées avec le vecteur CAT té-

moin non altéré, lorsqu'ils ont été transfectés avec le vecteur le moins altéré par BP (environ 25 produits d'ad-

dition/plasmide) ou le vecteur le plus altéré par BP (en-

viron 50 produits d'addition/plasmide).

Pour confirmer l'activation de p53 par pTpT dans un second essai, on a utilisé un plasmide reporter exprimant le gène de l'hormone de croissance humaine (hGH) sous

l'influence d'un promoteur pouvant induire p53. L'activa-

tion de p53 accroît sa liaison à la séquence consensus dans le plasmide, ce qui conduit à la transcription de la séquence codant hGH et finalement à la sécrétion de hGH

dans le milieu.

Des kératinocytes humains traités au pTpT ont montré une augmentation de 45 % 25 % de la sécrétion de hGH comparativement à des cellules traitées au diluant. Ces résultats indiquent que le pTpT active le p53 dans des

kératinocytes humains normaux de même que dans des cellu-

les H1299 p53-transfectées.

Pour confirmer le fait que le pTpT facilite la répa-

ration de produits d'addition BP-ADN par activation de p53, des cellules H1299 p53-nulles ont été transfectées avec le vecteur d'expression de p53 et l'expression de la

protéine p53 a ensuite été confirmée par analyse par bu-

vardage de Western 48 heures après la transfection; dans des cultures parallèles, 48 heures après la transfection avec le vecteur d'expression ou de contrôle de p53 puis

traitement de la manière décrite ci-dessus. Dans des cel-

lules p53 + H1299, la réparation a été comparable à celle que l'on avait observée dans des kératinocytes normaux; et le plasmide contenant un faible degré d'altération par BP a été réparé plus efficacement, en proportion de 80 % 50 % dans des cellules prétraitées au pTpT, que dans des cellules prétraitées avec le diluant; et le plasmide contenant un haut degré d'altération par BP a été réparé

avec une efficacité plus de trois fois supérieure. Toute-

fois, dans des cellules p53 - H1299, la capacité de répa-

ration a été la même que dans les groupes de traitement. Ces résultats démontrent que la réparation activée de

produits d'addition BP-ADN par pTpT nécessite p53.

L'activation par pTpT de p53 dans des cellules H1299 transfectées transitoirement avec hGH + H1299 sensible à p53 a conduit à une augmentation de 40 % de la sécrétion de hGH comparativement à des cellules traitées avec le diluant. Ces résultats démontrent en outre que le pTpT

améliore la qualité de transcription de p53 par une ac-

centuation de la liaison à sa séquence consensus d'ADN.

L'analyse par buvardage de Western a été utilisée

pour examiner l'effet du traitement par pTpT sur l'ex-

pression de gènes choisis connus pour leur implication

dans la réparation d'ADN. Des kératinocytes humains nor-

maux ont été traités avec du pTpT pendant deux jours avant que la protéine cellulaire soit recueillie. Le pTpT a régulé de façon favorisante les taux de p53, de PCNA et de protéine XPA d'un facteur 2 à 3 pendant deux jours de traitement. EXEMPLE 10: Inhibition de l'hypersensibilité de contact sur le modèle de la souris Des souris C57B16 ont été soumises au traitement suivant avant d'être sensibilisées avec l'allergène DNFB, à travers la peau de l'abdomen; sans prétraitement, avec irradiation UV-B (200 J/m2/jour pendant 4 jours), pTpT, pApA ou le véhicule seul (30 pl à 100 pM, deux fois par jour pendant 5 jours). Les souris prétraitées avec les

rayons UV-B ou le pTpT ont montré une suppression pronon-

cée des réactions par enflure des oreilles à la provoca-

tion par le DNFB (0,6 0,2 et 0,9 0,3) comparativement à des animaux non traités ou traités avec le véhicule (4,3 0,6 et 3,3 0,2), tandis que les souris traitées au pApA ont présenté des réactions intermédiaires (2,5 0,6). On a mesuré l'activation du gène TNFx en se servant de souris ayant un transgène reporter de CAT portant le promoteur entier de TNFc et la région 3'-non traduite. Les souris transgéniques ont été soumises au traitement

suivant avant l'examen de la peau pour évaluer l'expres-

sion de CAT: irradiation par UV-B (200-700 J/m2), injec-

tion intracutanée de pTpT (100 pM); lipopolysaccharide

(LPS 1 pg/ml) comme témoin positif, ou véhicule seul.

L'activité de CAT a été détectée dans la peau traitée

avec UV-B LPS ou pTpT (mais non avec le véhicule seul).

EXEMPLE 11: Activité UV-mimétique dépendant d'oligonu-

cléotides

L'induction de mélanogenèse dans des cellules de mé-

lanome de souris Cloudman S91 par l'oligomère penta-

nucléotidique, CATAC (SEQ ID N 5) et un oligomère nona-

nucléotidique, GAGTATGAG (SEQ ID No 1) a été examinée. On

a fait incuber en double des cellules de mélanome de sou-

ris Cloudman S91 avec 100 pM d'oligomère ou un volume égal de diluant (H20) pendant cinq jours. Les cellules ont

ensuite été recueillies, comptées et rassemblées par cen-

trifugation en vue de l'analyse de la mélanine. Dans trois essais, la teneur en pigment après incubation avec

le nona-mère, le penta-mère et le pTpT a augmenté respec-

tivement de 418 % 267 %, de 61 % 60 % et de 155 % % par rapport aux niveaux du témoin. Le nonamère, mais non le pentamère, a aussi stimulé la mélanogenèse dans

des mélanocytes humains, produisant une élévation de 51-

62 % après une semaine en culture. Comme dans le cas de

pTpT, l'oligonucléotide nona-mère, mais non l'oligonu-

cléotide penta-mère, a aussi induit l'expression du gène p21/Waf 1/Cip 1 en moins de 48 heures dans une lignée d'épithélioma épidermoide, élevant le taux de cet ARNm de 200-300 % comparativement à une élévation de 100-150 % sous l'action de pTpT. On a évalué des variations de cet oligonucléotide, à savoir: un nonamère brouillé (TAGGAGGAT, SEQ ID N 2) et deux versions tronquées, un heptamère (AGTATGA, SEQ ID N0 3) et un pentamère (GTATG SEQ ID N 4). Les deux nonamères ont été également actifs, induisant une élévation de 800 % de la teneur en mélanine. Les versions tronquées (heptamère et pentamère) ont aussi actives, induisant des élévations respectives de 640 % et de 670 %. Ces résultats montrent ensemble que

l'activité UV-mimétique de pTpT peut être doublée de fa-

çon tout à fait spectaculaire par d'autres oligonucléoti-

des. EXEMPLE 12: Effet de fragments d'ADN sur la réparation d'ADN in vivo Des souris transgéniques portant de multiples copies

génomiques d'un plasmide reporter LacZ ont été utilisées.

On a appliqué 100 uM de pTpT dans du polypropylèneglycol à une oreille et le véhicule seul à l'autre oreille, une fois par jour pendant 4 jours. Le cinquième jour, les deux oreilles ont été exposées à 100 mJ/cm2 de lumière UV-B. Cette opération a été répétée une fois par semaine

pendant 3 à 5 ou 7 semaines (trois souris par groupe).

Une semaine après l'irradiation finale, on a récolté les plasmides LacZ de l'épiderme auriculaire. En utilisant

des méthodes bien connues dans la pratique, on a recueil-

li les plasmides de l'ADN génomique par digestion par des

enzymes de restriction et liaison spécifique à la pro-

téine LacI. Les plasmides LacZ mutants ont été choisis positivement par transfection dans des bactéries et la

croissance sur milieu sélectif et la fréquence de muta-

tion ont été déterminées. Au bout de 3, 5 et 7 semaines,

la peau traitée au pTpT a présenté une fréquence de muta-

tion inférieure de 20 à 30 % à celle de la peau traitée avec le diluant (respectivement, 200 contre 293, 155 contre 216 et 261 contre 322). Les résultats ont montré que la réparation d'ADN activé par le pTpT réduisait les mutations in vivo induites par les rayons ultraviolets et

ils suggèrent que l'application topique de ce dinucléo-

tide pourrait être utilisée pour abaisser la vitesse de mutation dans de la peau humaine exposée à un facteur cancérogène.

EXEMPLE 13: Effet de la longueur de chaîne de l'oligonu-

cléotide et du 5'-phosphate sur la stimulation de phéno-

types protecteurs induits par les rayons ultraviolets

Des cellules de mélanome Cloudman S91 ont été trai-

tées avec un oligonucléotide 20-mère (GCATGCATGCATTACGTACG (SEQ ID N 6)) à une concentration de 100 pM. Un échantillon séparé de cellules a été traité de la même façon avec 100 pM de pTpT. Les résultats ont

* montré que les cellules S91 traitées avec l'oligonucléo-

tide 20-mères présentaient un accroissement de 50 % du pigment par rapport aux cellules témoins traitées avec le diluant. En revanche, des cellules traitées avec le pTpT ont montré un accroissement de 400-900 % de la teneur en pigment. Par conséquent, bien que cet oligonucléotide 20 mères induise un certain phénotype protecteur sous la forme de la production accrue de pigment, on a observé qu'ils stimulaient avec beaucoup moins d'activité que le

pTpT le phénotype protecteur induit par des rayons ultra-

violets.

On a mesuré l'effet de la forme 5'-phosphorylée par

rapport à la forme non phosphorylée de pTpT et de l'oli-

gonucléotide nonamère (GAGTATGAG (SEQ ID N 1)). Dans trois essais, on a traité des cellules S91 avec du pTpT, du TPT ou le diluant, ou bien on a traité les cellules avec la forme 5'-phosphorylée comparativement à la forme

non phosphorylée de SEQ ID N0 1. La stimulation de la mu-

tagenèse au-dessus des témoins pour pTpT comparativement à TPT, a été respectivement de 385 % contre 12,5 %, de 50

% contre 0 % et de 900 % contre 360 %. Dans un essai sé-

paré, le nonamère 5'-phosphorylé a élevé la teneur en pigment de 1000 100 % des valeurs témoins, tandis que la forme non phosphorylée a stimulé une élévation de 600 %. Ces résultats concordent avec les données publiées montrant que l'absorption d'ADN oligomères est facilitée

par le 5'-phosphate.

Il va de soi que la présente invention n'a été dé-

crite qu'à titre explicatif mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées

sans sortir de son cadre.

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de fragments d'ADN choisis entre des

fragments d'ADN monocaténaire, des fragments d'ADN bica-

ténaire, un mélange de fragments d'ADN monocaténaire et bicaténaire, des désoxynucléotides, des dinucléotides et

des dimères de dinucléotides pour la préparation d'un mé-

dicament destiné à traiter chez un mammifère - par exem-

ple chez un être humain - une maladie hyperproliférative

affectant des cellules épithéliales, le psoriasis, le vi-

tiligo ou une dermetite atopique.

2. Utilisation suivant la revendication 1, caracté-

risée en ce que les fragments d'ADN ont une longueur

d'environ 3 à 200 bases.

3. Utilisation suivant la revendication 1 ou 2, ca-

ractérisée en ce que les dinucléotides ou les dimères de dinucléotides sont choisis dans le groupe consistant en: d(pT)2, d(pC)2, d(pA)2, d(pCpT), d(pTpC), d(CpT), d(TpC)

et d(TpT).

4. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisée en ce que les fragments d'ADN monocaténaire, les fragments d'ADN bicaténaire, un mélange de fragments d'ADN monocaténaire et bicaténaire, les désoxynucléotides, ou les dinucléotides sont irradiés

par des rayons ultraviolets.

5. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes pour la préparation d'un médicament destiné à traiter une dermatite atopique, une dermatite de contact ou une inflammation à médiation allergique d'autres épithéliums, telle que rhinite allergique ou conjonctivite allergique, à réduire la sensibilité à une

maladie hyperproliférative induite par les rayons ultra-

violets, à inhiber des dermatoses induites par les rayons

ultraviolets, à atténuer le photovieillissement, à ré-

duire. le risque de cancer de la peau ou à prévenir ou at-

ténuer l'altération de l'ADN causée dans une cellule par

irradiation ultraviolette ou par des agents chimiques en-

dommageant l'ADN chez un mammifère.

6. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes pour la préparation d'un médicament comprenant des fragments d'ADN, destiné au traitement d'une maladie hyperproliférative affectant des cellules

épithéliales, par administration orale et/ou en aérosol.

7. Utilisation avant la revendication 8, caractéri-

sée en ce que les cellules épithéliales sont des cellules

cancéreuses ou des cellules de la peau.

8. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisée en ce que le traitement

comprend l'application topique du médicament.

9. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi-

cations précédentes, caractérisée en ce que les fragments

d'ADN sont présents dans un véhicule permettant leur li-

bération.

10. Utilisation suivant la revendication 9, caracté-

risée en ce que le véhicule comprend (a) des liposomes

et/ou (b) du propylèneglycol et/ou (c) un diacylglycérol.

11. Procédé pour accroître l'activité de p53 dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en

contact de la cellule concernée avec une quantité effi-

cace de fragments d'ADN choisis dans le groupe consistant

en: fragments d'ADN monocaténaire, fragments d'ADN bica-

ténaire, désoxynucléotides, dinucléotides, dimères de di-

nucléotides et leurs associations.

12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que l'activation de p53 conduit à la réparation de

l'excision de nucléotides dans la cellule.

13. Composition caractérisée en ce qu'elle contient, en quantité suffisante pour accroître l'activité de p53 dans une cellule ou pour inhiber la prolifération d'une

cellule, des fragments d'ADN ayant une séquence de nu-

cléotides choisie dans le groupe consistant en SEQ ID

N 1 (GAGTATGAG), SEQ ID N 2 (TAGGAGGAT), SEQ ID N 3

(AGTATGA), SEQ ID N 4 (GTATG), SEQ ID N' 5 (CATAC), SEQ

ID No 6 (GCATGCATGCATTACGTACG), et un véhicule.