FR2765589A1 - Fragment d'adn comprenant le promoteur de la ribulose reductase nadph specifique de yamadazyma ohmeri, vecteur le contenant et procede de preparation de proteines utilisant ce vecteur - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique du microorganisme Yamadazyma ohmeri (auparavant appelé Pichia ohmeri). Elle concerne également un gène hybride dans lequel le propre promoteur d'un gène d'intérêt a été remplacé par le fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique, ainsi qu'un vecteur contenant ledit gène hybride.Elle concerne en outre une souche de microorganisme de Y. ohmeri transformée avec ledit vecteur ainsi qu'un procédé de préparation de protéines par la mise en culture d'une souche de Y. ohmeri dans laquelle ledit vecteur a été introduit.

Description

FRAGMENT D'ADN COMPRENANT LE PROMOTEUR DE LA RIBULOSE
REDUCTASE NADPH SPECIFIQUE DE YAMADAZYMA OHMERI, VECTEUR
LE CONTENANT ET PROCEDE DE PREPARATION DE PROTEINES
UTILISANT CE VECTEUR
La présente invention a pour objet un fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique du microorganisme Yamada- zyma ohmeri (auparavant appelé Pi chia ohineri)
L'invention a également pour objet un gène hybride dans lequel le propre promoteur d'un gène d'intérêt a été remplacé par le fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique.

On entend par gène d'intérêt, notamment les deux catégories suivantes
- les gènes des voies métaboliques principales ou
secondaires de Y. ohmeri (dans le cadre d'une
modification desdites voies métaboliques) tels
que les gènes impliqués dans le cycle des pento
ses phosphates, et
- les gènes codant pour des activités enzymatiques
qu'il serait nécessaire de sécréter.

Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur contenant ledit gène hybride.

Encore un autre objet de l'invention consiste en une souche de micro-organisme de Y. ohmeri transformée avec ledit vecteur.

L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de protéines par la mise en culture d'une souche de Y. ohmeri dans laquelle ledit vecteur a été introduit.

Un promoteur est un fragment d'ADN nécessaire à l'initiation de la transcription des gènes. Ce fragment d'ADN est le plus souvent situé en amont de la région co- dante, et donc proche de l'extrémité 5' d'un gène. On dl- que le promoteur est la partie 5' d'un gène.

Le promoteur est la cible de la régulation de la transcription. A cette fin, il comporte certaines séquences d'ADN caractéristiques. Ces séquences, appelées éléments cis, sont reconnues par 1'ARN polymérase. Elles permettent la fixation du complexe d'initiation de la transcription, dont 1'ARN polymérase fait partie (facteurs de transcription primaires), et ainsi la mise en route de la transcription. I1 existe également d'autres séquences d'ADN qui permettent la iaison avec des protéines régulatrices supplémentaires de la transcription. Ces nouvelles protéines de régulation sont appelées facteurs de transcription secondaires agissant en trans. Ces dernières peuvent être soit des répresseurs, soit des activateurs de la transcription, directement associées ou non au complexe d'initiation. On entend par facteurs de transcription pri- maires, ou facteurs cellulaires de transcription primaires, les protéines de régulation qui sont impliquées dans la constitution du complexe d'initiation de la transcription (dont 1'ARN polymérase fait partie).

Certaines régions du promoteur sont particulièrement importantes en ce qui concerne la reconnaissance par les ARN polymérases. Par exemple, 1'art polymérase II des eucaryotes se fixe sur une région appelée "boîte TATA" se situant à environ 25 nucléotides en amont du site d'initiation de la transcription. Cependant, 1'ARN polymérase II seule n'est pas capable de reconnaître un promoteur, puisque d'autres protéines facteurs de transcription primaires (telles le facteur C qui se lie à 1'ARN polymérase et la guide dans la recherche du site d'initiation) sont nécessaires aux polymérases pour localiser les promoteurs.

Les promoteurs dits "constitutifs" n'ont pas systématiquement besoin de facteurs de transcription secondaires pour initier l'expression des gènes. Des exemples de tels promoteurs sont le promoteur du gène de l'alcool déshydrogénase I (ADHI), celui du gène de la 3-phosphoglycérate kinase (PGK) ou encore celui du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GPD).

I1 existe également des promoteurs dits "inductibles". Pour eux, la présence de certaines molécules agissant en tant que facteurs de régulation est nécessaire afin qu'ils puissent initier la transcription d'un gène. On entend par facteur de régulation de la transcription une protéine ou un métabolite qui, en se combinant au(x) facteur(s) de transcription secor.-aire(s) activera ou inhibera leur(s) action(s). Comme exer.ples, on peut citer le promoteur du gène GAL10 de la levure qui autorise l'expression sélective de séquences fusionnées lorsque le milieu contient du galactose, ou encore le promoteur du gène PH05 qui fonctionne en réponse aux concentrations en phosphates inorganiques.

Dans l'art antérieur, on trouve des systèmes d'expression dans lesquels le promoteur propre d'un gène d'intérêt a été remplacé par un autre promoteur afin de contrôler l'expression du produit de ce gène dans différentes conditions ou de l'induire à des taux plus élevés qu'avec son propre promoteur.

Après de nombreuses recherches, la Société Demanderesse est parvenue à identifier et à séquencer la région 5', qui correspond au promoteur, du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique de t. ohmeri. La Société Demanderesse a constaté que ce promoteur pouvait augmenter de manière remarquable l'expression de gènes autres que celui de la ribulose réductase NADPH-spécifique dans Y. ohmeri. De ce fait, il présente un intérêt industriel, car il permet de construire des outils génétiques pour la production éventuelle de protéines par la mise en culture de souches transformées de Y. ohmeri. Le promoteur peut en effet être utilisé dans le but d'augmenter la concentration intracellulaire de la protéine d'intérêt afin de modifier la voie métabolique à laquelle elle appartient. Mais, en utilisant des séquences particulières telles que des signaux de sécrétion propres à Y. ohmeri, le promoteur autorise également la sécrétion de ladite protéine.

Y. ohmeri est une levure osmotolérante. Elle est capable de se développer dans un environnement où la pression osmotique est élevée. En réponse à un choc osmotique, Y. ohmeri produit des polyols qui sont des osmolytes aptes à contrebalancer l'osmolarité du milieu externe.

La nature et la quantité de polyols synthétisés dépendent, entre autres, des conditions de culture. Ainsi, sur un milieu contenant du glucose, Y. ohmeri produit du Darabitol.

La voie de biosynthèse du D-arabitol chez Y. ohmeri est similaire à celle décrite pour Zygosaccharomyces mellis et Zygosaccharomyces rouxii. Le D-ribulose-5phosphate, généré par la voie oxydative des pentoses phosphates, est déphosphorylé par une phosphatase acide afin de produire le D-ribulose. Celui-ci est ensuite réduit en
D-arabitol par une ribulose réductase NADPH-spécifique.

La voie métabolique des pentoses phosphates chez Y. ohmeri est décrite sur la Figure 1.

Le séquençage de la région 5' du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique a permis à la Société Demanderesse de mettre au point un système de vec teurs d'expression dont la mise en oeuvre permet le contrôle de l'expression d'un gène d'intérêt par le remplaçement de son propre promoteur par celui de la ribulose réductase NADPH-spécifique.

Ainsi, l'invention concerne un fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique de Y. onmeri. La séquence d'ADN correspondant à ce fragment est présentée sur la Figure 2.

Cette séquence présente certains éléments caractéristiques qui se trouvent dans la plupart des régions de promoteurs en général, et dans les levures en particulier.

Une séquence TATAAA se trouve en position + 34 de l'enchaînement nucléotidique du fragment d'ADN conforme à l'invention (le nucléotide n"l étant le premier de la séquence décrite sur la Figure 2). Elle pourrait correspondre à la boîte TATA qui, chez les eucaryotes, fixe des facteurs de transcription primaires et est impliquée dans le positionnement approprié de l'ARN polymérase afin d'assurer une initiation correcte de la transcription.

On trouve une séquence CCAAT en position +22. 0
Cette séquence peut correspondre à la séquence CCAAT conservée chez les eucaryotes et qui est reconnue par un grand nombre de facteurs de transcription. Cette séquence
CCAAT est peut être impliquée dans la liaison de l'ARN po lymérase au site d'initiation de la transcription.

Le fragment d'ADN conforme à l'invention est dépourvu de séquence d'initiation de traduction, afin de permettre sa fusion à toute partie codante d'un gène ou à toute séquence nucléotidique du type cadre de lecture ouvert. Ceci permet d'éviter le décalage du cadre de lecture lors de l'expression du produit du gène.

L'invention concerne également un gène hybride dans lequel le promoteur d'un gène d'intérêt a été rempla cé par le fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique de Y.

ohmeri, de telle manière que l'expression dudit gène d'intérêt est désormais sous le contrôle de ce dernier.

Le gène hybride peut être construit en utilisant toute méthode zonnue de l'homme du métier. On procède tout d'abord à l'identification d'un gène d'intérêt dont on souhaite augmenter ou modifier l'expression, puis on remplace la région 5' de ce gène par le fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADP;:-spécifique.

Le gène hybride est ensuite inséré dans un vecteur d'expression qui peut être une cassette ou un plasmide.

Ainsi, l'invention concerne en outre un vecteur plasmidique contenant le gène hybride.

Ce vecteur doit également comporter toute séquence nécessaire à sa manipulation préalablement à son introduction dans Y. or.meri.

Ainsi, il doit contenir des sites de clonage appropriés, c'es--à-dire des sites d'enzyme de restriction compatibles avec la stratégie de clonage choisie (linker ou polylinker).

Il doit également comprendre deux origines de réplication, celle permettant son assemblage dans E. coli
(séquence ori) et celle permettant sa rép?ication dans
Y. ohmeri (séquence autonome de réplication, ARS).

Le vecteur doit aussi comporter au moins un marqueur de résistance à un antibiotique (on peut citer comme exemple, l'ampioilline pour E. coli ou la phléomycine pour
Y. ohmeri) et/ou au moins un marqueur d' auxotrophie tel que LEU2 ou URA3 pour Y. ohmeri.

Il peut s'avérer nécessaire que le vecteur comporte, à l'extrémité 3' du gène hybride, une séquence de terminaison de transcription et/ou des signaux de polyadénylation reconnaissable par Y. ohmeri en cas de transformation. Ceci permettrait d'éviter une terminaison de transcription anarchique.

L'invention concerne également une souche de
Y. ohmeri transformée avec un vecteur comprenant un gène hybride dans lequel le promoteur d'un gène d'intérêt a été remplacé par un fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NSSPH-spécifique de
Y. ohmeri.

La Société Demanderesse a également mis au point un procédé de préparation de protéines par la mise en culture des souches de Y. ohmeri transformées avec un vecteur conforme à l'invention.

Ce procédé est caractérisé par le fait que
- on construit un gène hybride dans lequel le promo
teur d'un gène d'intérêt a été remplacé par le
fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène co
dant pour la ribulose réductase NSDPH-spécifique,
- on insère ledit gène hybride dans un vecteur plas
midique,
- on introduit ledit vecteur plasmidique dans Yamada
zyma ohmeri, afin d'obtenir une souche transformée,
- on cultive ladite souche transformée sur un milieu
approprié, et
- on récupère éventuellement la protéine ainsi obte
nue.

Le vecteur plasmidique utilisé dans le procédé selon l'invention doit comporter toute séquence nécessaire à sa manipulation comme il a déjà été indiqué ci-dessus. Il peut donc contenir, outre le gène hybride, des séquences dites "polylinker" qui renferment des sites d'enzyme de restriction qui sont choisis en fonction de la stratégie de clonage adoptée.

I1 doit également comprendre deux origines
(séquences ori et ARS) de réplication, et peut contenir une séquence de terminaison de transcription, et/ou des signaux de polyadénylation, selon l'origine du gène d'intérêt considéré.

I1 doit comprendre, encore, des marqueurs de résistance à des antibiotiques et/ou des marqueurs d'auxotrophie.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention on cultive la souche sur un milieu contenant du glucose (200 g/l), du Corn Steep (40 g/l) et du MgS0s
(2 g/l), à une température comprise entre environ 25 et environ 40 C, et de préférence entre environ 30 et environ 38"C, et à un pH compris entre environ 3 et environ 7, et de préférence entre environ 5 et environ 6.

L invention pourra être mieux comprise à l'aide des exemples non-limitatifs décrits ci-dessous.

EXEMPLE 1 : Construction d'un vecteur d'expression capable de se répliquer dans Y. ohmeri
Les séquences 2u, habituellement utilisées en tant qu'origines de réplication dans les levures ne fonctionnent pas efficacement dans Y. ohmeri. En conséquence, il a été nécessaire d'isoler une origine de réplication propre à Y. ohmeri ainsi que des marqueurs spécifiques (URA3 et LEU2). La technique utilisée est celle décrite dans Piredda et Gaillardin, Yeast (1994) 10 1601-1612 et repose sur la recherche d'un fragment d'ADN susceptible d'autoriser la réplication d'un plasmide spécifique de bactérie dans la levure (fragment d'ADN tiré d'une banque "shot gun" de Y. oi?meri i .

Cette technique a permis l'obtention du vecteur plig 3 qui correspond à un plasmide pBR322 portant une séquence autonome de réplication (ARS) et le marqueur URA3.

Sa carte de restriction est présentée sur la Figure 3.

EXEMPLE 2 : Isolation et clonage du gène de la xylulose réductase de Y. stipitis et son insertion dans un vecteur plasmidique
La séquence du gène codant pour la xylulose réductase (XYL2) de Y. stipitis a été publiée par Kotter et al.

(Current Genetics (1990), 18 493-500).

On a utilisé cette séquence pour générer des amorces 5'-TCTAGACCACCCTAAGTCGT-3' (sens) et S'-CGATCCACTATAGTCGAAGG-3' (anti-sens). Les oligonucléotides ont été synthétisés par la Société AMERSHAM et les dosages des amorces signalés par leur fiche technique correspondante.

On a utilisé ces amorces dans une réaction PCR
("Polymerase Chain Reaction" ou amplification génique en chaine), ce qui a permis d'amplifier directement le gène à partir de l'ADN chromosomique total de Y. stiptis.

On a réalisé les réactions de PCR dans des microtubes de 0.5 ml. Le mélange réactionnel de 50 > 1 comprend l'ADN matrice, 1 AM de chaque amorce, 200 SM de dNTP , le tampon fourni avec l'enzyme et 1 unité de Taq polymérase de marque Biotaq. On a recouvert le mélange réactionnel de 40 ul d'huile de paraffine.

On a effectué 30 cycles de PCR en suivant le profil de température
Dénaturation : 94"C pendant 30 secondes
Hybridation : 600C pendant 3C secondes
Polymérisation : 72"C pendant 30 secondes.

Ensuite, on a cloné le fragment d'ADN correspondant à XYL2 dans le site de restriction SmaI du vecteur pBluescript SK- (Stratagène).

On a soumis ce vecteur à une digestion avec les enzymes de restriction SalI et BarvI afin d'obtenir le fragment SalI-BamHI comprenant le gène XYL2 qu'on a souscloné dans le vecteur plig 3.

Ainsi, on a obtenu un vecteur qu'on a appelé plig 62, dont la carte de restriction est présentée sur la
Figure 4.

EXEMPLE 3 : Identification, isolation et clonage du gène de la ribulose réductase NADPH-spécifique de Y. ohmeri
On a construit une banque d'expression du génome de Y. ohmeri dans kgtll Sfi-Not à l'aide des kits "Riboclone cDNA synthesis" et "Riboc:one EcoRI adaptor ligation system" de Promega, selon le schéma présenté à la
Figure 5.

On a purifié les ARN messagers de Y. ohmeri à l'aide du kit "PolyAttract mRNA isolation system" de Promega.

On a obtenu 20 ug d'ARNm à partir de 1 mg d'ARN total, dont on a utilisé 5 ug pour construire la banque d'expression.

On a initié la synthèse du premier brin d'ADNc en utilisant une amorce poly(T) portant un site NotI, afin de permettre l'orientation spécifique des molécules d'ADNc dans Xgtll Sfi-Not.

On a ensuite synthétisé le second brin d'ADNc. On a converti les extrémités franches des molécules d'ADNc double brin en extrémités cohésives EcoRI par l'addition d'adaptateurs portant cette extrémité préformée.

On a traité l'ADNc avec la polynucléotide kinase puis on l'a soumis à une digestion par NotI. On a ensuite éliminé les adaptateurs libres.

On a fait une ligature entre les séquences d'ADNc ainsi obtenues, présentant des extrémités 3'-NotI et 5'-EcoRI, et les bras NotI-EcoRI du vecteur kgtll.

On a isolé l'ADNc de la ribulose réductase NADPH- spécifique par criblage de la banque d'expression à l'aide d'un anticorps polyclonal spécifique. La méthode utilisée est celle décrite dans Current Protocols in Molecular Bio- logy, première édition, 1987, Wiley Interscience. Ce gène a été appelé YoRR.

On a ensuite séquencé l'SDNc de YoRR par la méthode décrite dans Current Protocols in Molecular Biology, première édition, 1987, Wiley Interscience.

La séquence 5' de ce gène est présentée sur la Figure 2.

Afin d'isoler le gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique, l'insert d'S3Nc cloné dans Xgtll a été utilisé pour cribler une banque d'ADN génomique de
Y. ohmeri. Le criblage de 5000 colonies à l'aide de cette sonde d'ADNc a permis de sélectionner deux clones donnant un signal d'hybridation positif. Le séquençage des deux inserts correspondants a révélé une parfaite colinéariié avec celle de l'ADNc.

Le gène YoRR a été cloné dans les sites SalI-NheI d'un vecteur plasmidique dérivé de pBR322 qui s'appelle poRR08 et dont la carte de restriction est présentée sur la Figure 6.

On a extrait du vecteur poRR08 le fragment d'ADN correspondant à la région 5' du gène par une digestion avec les enzymes de restriction Sal I et Ava II.

EXEMPLE 4 : Construction d'un gène hybride contenant le promoteur de YoRR et le gène XYL2 de z. stipitis et son insertion dans un vecteur plasmidique
On a extrait le promoteur de XYL2 (dans la construction obtenue dans l'exemple 2 ci-dessus) grâce à une digestion avec les enzymes de restriction SalI et AccI.

Ensuite, on a introduit la séquence correspondant au promoteur de YoRR, en utilisant les enzymes de restriction SalI et AvaII, obtenant ainsi le gène XYL2 dont ia région du promoteur est remplacée par celle de YoRR.

L'activité exonucléasique de la T4 DNA ligase a été utilisée pour faciliter la ligature entre les sites AccI et
AvaII. On a ainsi obtenu le vecteur pi g 7.78. La Figure 7 récapitule les différentes étapes de construction du vecteur plig 7.78.

EXEMPLE 5 : Transformation de souches de Y. ohmeri avec les différents vecteurs
La transformation de souches de Y. ohmeri par les vecteurs plasmidiques peut être réalisée par électroporation selon les protocoles et conditions connus de l'homme du métier et décrits, par exemple dans Guide to Electroporation and Electrofusion édité par Chang, Chassy, Sanders et Sowers, Academic Press Inc, 1992.

En ce qui concerne les conditions de l'électroporation, on a utilisé la méthode de Becker et
Guarente ("High efficiency transformation of yeast by electroporation" in Guthrie & Fink (Eds.) Methods in Enzymology Academic Press Inc. San Diego, (1991) 194 182-185) à la différence près que le sorbitol a été remplacé par du xylose, en tant qu'agent osmoprotecteur. En effet, le sorbitol est métabolisé par Y. ohmeri, et le fait de le remplacer par du xylose permet d'éviter toute lyse cellulaire.

Ainsi, 100 à 1000 ng d'ADN plasmidique ont été introduits dans 40 ul de solution de Y. Ohmeri électrocompétente (obtenue par lavage, concentration et reprise dans 10 % de DMSO pour atteindre la densité de 1010 cellules / ml). La solution ainsi obtenue a été soumise à un choc électrique délivré par un électroporateur de marque BIO RADz (25uF ; 2,5 kv ; 200Q).

EXEMPLE 6 : Mesures des activités xylulose réductase avec les différents promoteurs
Les souches recombinantes obtenues ont été appelées Yo XR pour les transformants contenant le vecteur plig 62 et Yo XRm pour ceux obtenus avec le vecteur plig 7.78. On a utilisé comme témoin une souche auxotrophe pour l'uracile qu'on a appelé Yo URA-, transformée avec le vecteur plig 3.

Ces souches ont été mises en culture sur un milieu contenant 100g/l de glucose, 3 g/l d'extrait de levure, 2 g/l de KH2P04 et 1 g/l de MgSO4 dans des erlenmeyers.

Après 40 heures de culture, on a effectué un dosage enzymatique. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous, et sont exprimés en umoles de cofacteurs transformés par minute, par ml et par mg de protéines totales.

Tableau 1

<tb> Souches <SEP> XR <SEP> NADH
<tb> <SEP> (40 <SEP> h)
<tb> <SEP> U/mg
<tb> Yo <SEP> URA- <SEP> 0,8
<tb> <SEP> Yo <SEP> XR <SEP> 1 <SEP> ,4
<tb> <SEP> Yo <SEP> XRm <SEP> 28,6
<tb>
Les résultats montrent clairement que le remplacement du promoteur de la xylulose réductase de Y. stipitis par celui de la ribulose réductase NADPH spécifique de Y.

ohmeri permet d'augmenter l'activité xylulose réductase de 20 fois.

Les mêmes essais ont été réalisés en fermenteurs de 2 litres, et avec des milieux contenant 200 g/l de glucose, 40 g/l du Corn Steep, et 2 g/l de MgSO4. Après 40 heures de culture, on a effectué un dosage enzymatique et on obtient les résultats présentés dans le Tableau 2 cidessous
Tableau 2

<tb> Souches <SEP> XR <SEP> NADH
<tb> <SEP> (41 <SEP> h)
<tb> <SEP> U/mg
<tb> Yo <SEP> URA- <SEP> 2,9
<tb> <SEP> Yo <SEP> XR <SEP> 4,8
<tb> <SEP> Yo <SEP> XRm <SEP> 47, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
L'optimisation des conditions de culture a permis d'atteindre 80 à 100 U/mg d'activité spécifique pour la souche Yo XRm après 20 heures de production.

EXEMPLE 8 : Efficacité du promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifiqlWe pour l'expression de gènes bactériens
Le gène bactérien d'intérêt choisi est celui qui code pour la 5-phospho-3-épi.mérase d'Alcaligenes eutro plus.

La partie codante du gène a été isolée par PCR à partir de l'ADN génomique d'A. eutrophus grâce aux amorces 5'-CCTGATCGAGGCGACCTGAC-3' (sens) et 5' GACAGGTCTCCTATAGATTG-3' (anti-sens).

Le fragment amplifié est ensuite borné par deux linker EcoRI, permettant ainsi de l'insérer aux sites Eco
RI d'un vecteur plasmidique dérivé du pKK 223-3 (Gene bank accession nO M 77749-IG 0335). La stratégie et le vecteur plasmidique résultant sont indiqués sur la Figure 8.

Afin de réaliser une fusion à l'ATG de la 5-phospho-3-épimérase, une méthode PCR à 3 amorces a été réalisée (comme indiqué dans la Figure 9) avec les amorces 5'-GGATCCGTAGAAATCTTGTTATC-3' (oligo A - sens), 5'-CAACCCAAGCCACCGTACGTAGAAAATCAAATTATTCCCAGG-3' (oligo Banti-sens) et 5'-CACCAACAGGTAGTGTAGCTTCAC-3' (oligo C- anti-sens), à partir du vecteur poRR08 et PKK223-PEP.

Le fragment d'ADN chimérique comprenant la partie codante du gène de la 5-phospho-3-épimérase sous contrôle du promoteur du gène de la ribulose réductase NADPH spécifique est récupéré grâce aux enzymes de restriction Spe I et Sal I. Il est ensuite inséré dans le vecteur plasmidique plig 3 aux sites correspondants.

Le plasmide résultant, appelé po PRE3 (dont la carte de restriction est présentée sur la Figure 10), est ensuite introduit dans la levure Y. ohmeri par électroporation.

On a déterminé l'efficacité du promoteur par détection des ARNm correspondant au gène chimérique en utilisant la technique du Northern blot. Les ARNm totaux ont été extraits par la méthode décrite dans Current Protocols in Molecular Biology, première édition, Wiley Interscience
(CPMB), mis à migrer en gel d'acrylamide en conditions dé naturantes en présence de formaldéhyde et transférés sur une membrane de Nylon.

Une sonde spécifique du gène PSP a ensuite été élaborée (fragment EcoRI-EcoRI complet du PK223-PEP utilisé, marqué au 3-P par la technique du ranoom labelling décrit dans CPMB) et mise à hybrider avec la membrane, suivant le protocole décrit dans CPMB.

La photographie présentée sur la Figure 11 montre clairement la présence majoritaire d'un transcript de taille attendue (environ 720 bases), 10 à 20 fois supérieur à un transcript correspondant à un gène standard pris en contrôle interne (résultats non présentés ici).

La Figure 11 démontre ainsi l'efficacité du promoteur conforme à l'invention en ce qui concerne la transcription de gènes bactériens.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique de Ya madazyma ohmeri.

2. Gène hybride caractérisé par le fait que le promoteur d'un gène d'intérêt a été remplacé par le fragment d'ADN défini à la revendication 1.

3. Vecteur plasmidique contenant le gène hybride tel que défini à la revendication 2.

4. Vecteur plasmidique selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comprend deux origines de réplication.

5. Vecteur plasmidique selon l'une ou l'autre des revendications 3 et 4, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un marqueur de résistance à un antibiotique.

6. Vecteur plasmidique selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins un marqueur d'auxotrophie.

7. Souche de Y. ohmeri transformée avec un vecteur comprenant un gène hybride dans lequel le promoteur d'un gène d'intérêt a été remplacé par un fragment d'ADN comprenant le promoteur du gène codant pour la ribulose réductase NADPH-spécifique de Yamadazyma ohmeri.

8. Procédé de préparation de protéines caractérisé par le fait que

- on construit un gène hybride dans lequel le promo

teur d'un gène d'intérêt a été remplacé par le

fragment d'ADN défini à la revendication 1,

- on insère ledit gène hybride dans un vecteur plas

midique,

- on introduit ledit vecteur plasmidique dans Yamada

za ohmeri, afin d'obtenir une souche transformée,

- on cultive ladite souche transformée sur un mi

lieu approprié, et

- on récupère éventuellement la protéine ainsi obte

nue.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le vecteur est un vecteur tel que défini à l'une quelconque des revendications 3 à 6.

10. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 8 et 9, caractérisé par le fait que l'on met en oeu- vre le procédé à une température comprise entre environ 25 et environ 40"C, et de préférence entre environ 30 et environ 38oC, à un pH compris entre environ 3 et environ 7, et de préférence entre environ 5 et environ 6.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé par le fait que l'on met en su- vre le procédé dans un milieu contenant du glucose, du

Corn Steep et du MgSO,.