FR2764803A1 - Composition absorbable renfermant des bacteries propioniques susceptible de degager du monoxyde d'azote dans le tube digestif humain ou animal - Google Patents

Abstract

Utilisation de bactéries propioniques pour l'obtention d'une composition d'alimentation courante ou d'une composition diététique ou médicamenteuse absorbable susceptible de dégager des quantités physiologiquement significatives de monoxyde d'azote dans le tube digestif humain ou animal.

Description

La présente invention concerne une composition d'alimentation courante ou

une composition diététique ou mé-

dicamenteuse absorbable renfermant des bactéries propioniques susceptibles de dégager des quantités physiologiquement si-5 gnificatives de monoxyde d'azote dans le tube digestif humain ou animal.

Pendant de nombreuses décennies, on a totalement ignoré que le monoxyde d'azote constitue l'un des éléments nécessaires à la vie et à son maintien; par suite jusqu'à ces quatre ou cinq dernières années, les chercheurs ne se sont pas penchés sur les bienfaits associés à la présence de

cet oxyde, que ce soit en médecine, en nutrition ou en phy-

siologie.

Ce n'est que tout dernièrement que l'on a attri-

bué au monoxyde d'azote un nombre impressionnant de fonctions physiologiques et que l'on a émis l'hypothèse que ce gaz pou-

vait être impliqué au premier chef dans des fonctions aussi diverses que le contrôle de la pression artérielle, la fonc- tion cytotoxique non spécifique des macrophages, l'agrégation20 plaquettaire et la neurotransmission ou encore le contrôle de

la motricité du tube digestif.

A partir de cette supposition, les recherches portant sur le monoxyde d'azote se sont multipliées et

l'importance de ce gaz a pu être confirmée.

Il est connu que le monoxyde d'azote, qui est un gaz très instable (demivie inférieure à 5 secondes dans les systèmes biologiques), est produit par biosynthèse au sein de l'organisme humain ou animal à partir de la Larginine par un groupe d'enzymes dénommées NO-synthases (NOS) dont il existe

deux types principaux, à savoir d'une part les NOS constitu-

tives qui sont exprimées notamment dans les cellules endothé-

liales, les plaquettes sanguines et les neurones et, d'autre part, les NOS inductibles qui sont exprimées principalement par certaines cellules du système immunitaire (macrophages et polynucléaires notamment) par le muscle lisse vasculaire et

les cellules endothéliales. Il est à noter que la production de NO par les NOS inductibles est, de plusieurs ordres de grandeurs, supé-

rieure à la production de NO par les NOS constitutives, mais que dans tous les cas, cette production demeure relativement faible. Or, et compte tenu du rôle bénéfique susmentionné

du monoxyde d'azote, il serait souhaitable de pouvoir augmen-

ter cette production en particulier en utilisant la voie na-

turelle du métabolisme alimentaire.

On n'a cependant jusqu'à présent jamais proposé

de moyens permettant de parvenir à ce résultat.

L'objet de l'invention est de combler cette la-

cune.

Conformément à l'invention, on a pu parvenir au but recherché en constatant que, de manière surprenante, un type particulier de bactéries, les bactéries propioniques, sont susceptibles de produire du monoxyde d'azote, et que parmi ces bactéries, certaines espèces et certaines souches

parmi ces espèces en produisent de grandes quantités.

Il s'agit là de bactéries propioniques qui, bien que n'appartenant pas au groupe des bactéries lactiques ou bifidobactéries classiquement introduites dans l'organisme par le biais de desserts lactés ou autres produits laitiers fermentés, sont néanmoins présentes en alimentation humaine depuis des siècles: ce sont en effet elles qui permettent

l'obtention des trous lors de la fabrication du fromage dé-

nommé " emmental " qui en fin d'affinage renferme environ

10 cellules/g de bactéries propioniques.

Il est à noter que la fermentation de ces bacté-

ries produit entre autre de l'acide propionique, de l'acide

acétique et du dioxyde de carbone.

La constatation susmentionnée est d'autant plus

surprenante que l'on a pu vérifier que des bactéries lacti-

ques, des bifidobactéries et/ou des levures, utilisées cou-

ramment dans le domaine agro-alimentaire, ne produisent pas

de monoxyde d'azote.

L'invention se rapporte, en conséquence, à l'utilisation de bactéries propioniques pour l'obtention

d'une composition d'alimentation courante ou d'une composi- tion diététique ou médicamenteuse absorbable susceptible de5 dégager des quantités physiologiquement significatives de mo- noxyde d'azote dans le tube digestif humain ou animal.

Conformément à l'invention, cette composition peut être constituée par une préparation élaborée et/ou pré-

sentée sous forme liquide (en particulier d'un liquide fer-10 menté), sous forme déshydratée ou d'humidité intermédiaire.

Plus précisément, il est à noter que, sans pour cela sortir du cadre de l'invention, la composition peut se présenter: - soit sous forme d'une préparation spécifique se justifiant par sa seule finalité physiologique, à savoir l'ingestion

de bactéries propioniques susceptibles de dégager des quan-

tités physiologiquement significatives de monoxyde d'azote, - soit sous forme d'une préparation alimentaire élaborée ayant parallèlement une finalité autre plus strictement énergétique ou fonctionnelle; dans ce dernier cas, les bactéries propioniques peuvent être ajoutées ou incorporées dans les aliments eux-mêmes notamment dans des fromages,

dans des fibres alimentaires telles que des flocons de cé-

réales, ou encore dans des laits fermentés, crèmes des-

serts, gâteaux et/ou boissons bienfaisantes, etc.

Conformément à l'invention, les bactéries propio-

niques peuvent être introduites sous forme de biomasse ou

sous la forme d'un levain susceptible de se multiplier in si-

tu. Lorsqu'elle est déshydratée, la composition se

présente, avantageusement, sous forme de fractions indivi-

duelles renfermant la dose de bactéries devant être absorbée régulièrement. Ces fractions peuvent être ingérées directement ou être préalablement diluées dans un liquide; elles peuvent être conditionnées sous une forme permettant de faciliter

l'absorption: comprimés, sachets de poudre granulée, li-

quide,...

On a vérifié que de telles préparations déshydra-

tées concentrées de bactéries propioniques conservées une an-

née à +4 C voient leur concentration baisser de moins de

un Log.

uLo. L'expérience a prouvé que des gélules gastroré- sistantes ou non correspondent à un type de conditionnement

particulièrement avantageux.

Selon une autre caractéristique de l'invention,

chaque fraction individuelle renferme un grand nombre de bac-

téries, de préférence plus de 10 bactéries.

Diverses expérimentations (résumées ci-dessous)

ont permis de vérifier l'aptitude toute particulière de dif-

férentes souches de bactéries propioniques à produire du NO au cours de leur culture, d'abord indirectement à partir de la mesure des ions nitrites NO2 puis directement par analyse

en spectrométrie de masse en milieu anaérobie.

Au cours de ces expérimentation, on a, dans un premier temps, étudié la concentration en nitrites dans des milieux riches en arginine et pauvres en nitrates (50 MM) et

on s'est rendu compte que l'arginine n'est pas un élément dé-

terminant dans la production de NO observée.

Dans un second temps, on a expérimenté des mi-

lieux supplémentés en nitrates. Les résultats obtenus dans ce dernier cas ont révélé le caractère nitrate dépendant de la

production de monoxyde d'azote.

1 - Essais préliminaires comparatifs Différentes souches bactériennes (inoculum yaourt, bifidobactéries, lactobacillus) ont été cultivées

en présence d'un milieu lait reconstitué (100 ml) supplé-

menté par un extrait de levures (10 g/l) puis incubées à 370C. L'accumulation de nitrite a été mesurée au cours

du temps.

Ces essais préliminaires ont été réalisés dans les conditions suivantes: * incubation à 37 C pendant 0, 4, 7 ou 10 heures, * 3 répétitions,

* dosage des nitrites par système Bran-Luebbe.

En raison de la nature des extraits à analyser,

une étape de purification des échantillons a été succes-

sivement mise en oeuvre par une double centrifugation (2 x 10 min., 4 C, 15 000 rpm), suivie d'une ultrafiltra- tion sur cartouche miniprep 10 (rétention des protéines

de PM > 10kD) puis d'une purification partielle par pas-

sage de l'échantillon sur résine Waters C18 (55-105 gm)

Cette méthode a, dans un premier temps, été tes-

tée sur des échantillons étalons de nitrite (Figure 1), puis sur des extraits de culture de Lactobacillus incubés

7 heures auxquels a été ajoutée ou non une quantité con-

nue de nitrite (Figure 2).

La figure 1 représente les profils colorimétri-

ques obtenus sur une chaîne d'analyse automatique Bran Luebbe: (1) d'un milieu de culture de bifidobactéries après heures d'incubation, (2) d'une solution standard de nitrite, (3) de cette même solution ultrafiltrée,

(4) de cette même solution ultrafiltrée et passée sur ré-

sine C18.

La figure 2 représente les profils colorimétri-

ques obtenus sur une chaîne d'analyse automatique Bran Luebbe: (1) d'un milieu de culture de Lactobacillus après heures d'incubation à 37 C,

(2) (3) d'une solution standard contenant 410 pg de ni-

trite/l, (4) (5) d'un milieu de culture de Lactobacillus après

heures d'incubation à 37 C auxquels a été ajou-

tée une quantité connue de nitrite afin d'obtenir

une solution à 820 gg/l de nitrite.

Ces échantillons ont été purifiés par centrifuga-

tion ultrafiltration et passage sur résine C18 dans les

conditions décrites précédemment.

Conformément à ces essais, aucune accumulation de nitrite n'a pu être détectée que ce soit à partir

d'inoculum de yaourt, de bifidobactéries ou de Lactoba-

cillus, ce quel que soit le temps d'incubation (0, 4, 7

ou 10 heures).

2 - Mise en évidence de l'accumulation de nitrite par des cultures de bactéries propioniques

On a préalablement recherché la présence éven-

tuelle de nitrate ou de nitrite dans la préparation du milieu YEL par dosage colorimétrique (kit Boerhinger):

on a ainsi pu mettre en évidence la présence d'une quan-

tité non négligeable de nitrate dans ce milieu (concentration de l'ordre de 50 à 100 iM) qui pourrait

provenir de l'extrait de levure utilisé pour la fabrica-

tion de ce milieu; en revanche, on a vérifié que le mi-

lieu YEL était totalement exempt de nitrite.

Des cultures de bactéries propioniques (1 g de

lyophilisat pour 100 ml de milieu YEL) ont été testées.

Ces essais ont été mis en oeuvre dans les condi-

tions suivantes: * incubation à 30 C pendant 24, 48 ou 72 heures, * 3 répétitions pour l'incubation de 24 heures, * arrêt de l'incubation par ébullition, * purification du produit par centrifugation et passage de l'extrait sur résine C18,

* dosage des nitrites dans le milieu par analyse sur sys-

tème Bran-Luebbe.

On a dosé les nitrites accumulés par les bacté-

ries propioniques afin d'établir une cinétique d'accumulation des nitrites en fonction du temps

d'incubation des bactéries sur milieu YEL.

La figure 3 représente, d'une part, les varia-

tions de la quantité de nitrite produite (en gg/100 ml de culture) en fonction du temps d'incubation (en heures) (F) et d'autre part les variations de la turbidité (absorbance à X = 650 nm) également en fonction du temps

d'incubation (O).

Cette figure montre que la quantité de nitrite est maximale à 24 heures puis diminue ensuite de façon

significative après 48 et 72 heures d'incubation.

On peut raisonnablement penser que cette chute résulte de la réduction du nitrite en NO, N20 ou autres

composés par la nitrite réductase.

Conformément à l'invention, on a pu prouver que

l'accumulation de NO2 dépend des espèces ou souches de bacté-

ries propioniques mises en oeuvre.

Cette situation a été vérifiée par les essais ré-

sumés ci-dessous:

3 - Mise en évidence et comparaison des accumulations de ni-

trite dans le milieu de culture dans le cas de 9 souches de 4 espèces différentes de bactéries propioniques Conformément à cet essai, on a étudié les souches P20, P23, 2408, 2410, 2500 et 2501 de l'espèce

P.freudenreichii et les souches TL221, TL223 et TL207 ap-

partenant respectivement aux espèces P. thoenii,

P.acidipropionici et P.jensenii.

Il est à noter que les souches TL (technologie laitière) sont des souches appartenant à l'INRA-LRTL, tandis que la souche P23 (ou ITG23) a été enregistrée à la Collection Nationale des Cultures de Micro- organismes (CNCM) de l'Institut Pasteur sous le numéro 1-1804 en

date du 18.12.96.

Les différentes souches de bactéries propioniques (1 g de lyophilisat ou 5 ml de culture fraîche) ont été cultivées sur 100 ml de milieu YEL contenant environ 50,M de nitrate, selon les conditions suivantes: * incubation à 30 C pendant 12, 24, 36 ou 48 heures, * 3 répétitions, * arrêt de l'incubation par ébullition, * purification du produit par centrifugation et passage de l'extrait sur résine C18, * accumulation de nitrite dans le milieu, mesurée par analyse sur système Bran-Luebbe, * estimation de la fermentation de chaque culture mesurée

par lecture de l'absorbance à 650 nm.

Les résultats obtenus pour chaque souche sont

rassemblés sur la figure 4.

Celle-ci représente, dans chaque cas, les varia-

tions de l'accumulation de nitrite (O) et de la turbidi-

té du milieu de culture (O) en fonction de la durée d'incubation. Chaque valeur correspond à la moyenne +

l'écart type de la moyenne pour n = 3.

Il convient de noter que les échelles d'accumulation du nitrite sont 25 fois plus grandes dans

le cas des souches P23 et TL223.

Ces résultats prouvent que la croissance bacté-

rienne, estimée d'après l'évolution de la turbidité du milieu de culture, est proche pour l'ensemble des souches étudiées, atteignant environ 2 à 2,5 DO après 48 heures d'incubation, à l'exception de la souche TL221 pour

laquelle la turbidité n'atteint que 0,6 DO après 2 jours.

En revanche, il existe des différences hautement

significatives quant à l'accumulation de nitrite en fonc-

tion du temps.

En effet, les souches 2500, 2408, P20, 2501, 2410, TL207 et TL221 accumulent une quantité relativement peu importante de nitrite, le maximum (0,1 gg de NO2 /ml) étant atteint respectivement après 36, 12, 36, 12, 12, 24

et 24 heures d'incubation.

A l'opposé, une accumulation beaucoup plus forte de nitrite a été obtenue avec des souches P23 et TL223

qui accumulent, au maximum, 1,8 gg de NO2 /ml après, res-

pectivement, 36 et 24 heures d'incubation.

Il est à noter que la souche de bactéries propio-

niques analysée dans le second essai susmentionné (figure 3) avait une position intermédiaire avec une accumulation

maximale de NO2, d'environ 0,5 gg/ml.

Ces essais ont donc permis de constater qu'il existe des différences significatives entre les quantités de nitrite pouvant être produites par différentes souches de bactéries propioniques de quatre espèces différentes, ces différences étant indépendantes de la croissance de

ces souches.

Ces résultats ont pu être confirmés par l'étude pour chaque souche de l'évolution de la concentration en nitrite du milieu de culture en fonction de sa turbidité

et donc approximativement de la croissance bactérienne.

Les résultats de ces derniers essais sont rappor-

tés sur la figure 5 sur laquelle chaque valeur correspond

à la moyenne l'écart type de la moyenne pour n = 3.

Les essais susmentionnés ont été de nature à éta-

blir que, parmi les souches étudiées, la souche TL223 est la plus fortement accumulatrice de nitrites, ces nitrites disparaissant après 12 heures. Cette souche a donc été retenue dans le cadre d'essais complémentaires portant sur la mesure directe de la production de monoxyde d'azote par analyse en spectrométrie de masse en milieu anaérobie. 4 Mesure préliminaire de la production de NO par la souche TL223 sous atmosphère d'hélium Conformément à ces essais, les cultures ont été

réalisées dans des tubes de 10 ml contenant 5 ml de mi-

lieu YEL contenant environ 50 uM de nitrate et 0,25 ml de

culture fraîche de la souche TL223.

L'atmosphère des tubes a été immédiatement éva-

cuée par un flux d'hélium (100 ml/min.) pendant

secondes.

L'accumulation de NO dans l'atmosphère des tubes

a ensuite été mesurée au cours du temps dans les condi-

tions suivantes: * incubation à 30 C pendant 24, 48 ou 72 heures, * 4 répétitions,

* mesure de l'accumulation de NO par analyse en spectro-

métrie de masse, * estimation de la fermentation de chaque culture mesurée

par lecture de l'absorbance à 650 nm.

Lors d'un essai préliminaire, le système de puri-

fication de gaz (Roboprep G+) - spectromètre de masse

(Twenty-Twenty) a été calibré par des quantités croissan-

tes de monoxyde d'azote.

Ce gaz a été généré à partir de NaNO2 en présence

d'une solution de KI et H2SO4.

L'identification et la quantification du monoxyde 14 16 d'azote ont été réalisées par sa masse: 30 pour N 0

16 14 17

et 31 pour N O et N O. Cette identification a en-

suite été confirmée par la mesure du rapport isotopique:

16 14 17 14N16

31/30 = [15N O + N O] /4N O. Il est à noter que le rapport isotopique théorique 31/30 du NO est de 0,00367 en l'absence de contamination par 1' O.

Les résultats de cet essai préliminaire sont rap-

portés sur la figure 6 sur laquelle la partie gauche (A) correspond à la courbe d'étalonnage du spectromètre de masse utilisé pour la quantification du monoxyde d'azote tandis que la partie droite (B) correspond à la mesure du

rapport isotopique 31/30.

Les résultats proprement dits de cet essai sont

rapportés sur la figure 7.

Plus précisément, la figure 7A représente les va-

riations de l'accumulation de NO dans l'atmosphère des tubes en fonction de la turbidité du milieu tandis que la figure 7B représente les variations de cette accumulation

en fonction du temps d'incubation.

Les barres verticales ou horizontales indiquent, lorsqu'elles sont plus larges que le symbole, l'écart

type de la moyenne pour n = 4.

Une comparaison de la figure 7B (qui représente l'évolution au cours du temps de la turbidité du milieu de culture sous hélium) avec la figure 4 (qui représente cette même évolution à l'air) montre que la croissance de la souche TL223 n'est pas affectée significativement par

une atmosphère constituée essentiellement d'hélium.

On a également pu établir que la vitesse d'accumulation du monoxyde d'azote dans l'atmosphère est constante durant environ les 45 premières heures d'incubation, puis s'infléchit ensuite (figure 7B), ce il qui correspond à une turbidité proche de 1,5 DO (figure 7A). Après environ 65 heures d'incubation (turbidité supérieure à 1,7 DO), environ 1,5 gg de NO sont accumulés dans l'atmosphère d'hélium pour 1 ml du milieu de culture. L'ordre de grandeur obtenu est compatible avec les teneurs en nitrite mesurées dans le milieu pour des

cultures au contact de l'air.

Dans ce dernier cas, on avait en effet pu consta-

ter (figure 5) que la souche TL223 accumulait au maximum 1,8 Hg de NO2 /ml pour une turbidité de 1,5 DO, ce qui

correspond à environ 1,2 gg de NO/ml.

A partir de cette mesure directe préliminaire de

la production de NO par la souche TL223, on a cherché, con-

formément à l'invention, à confirmer la voie de synthèse de

ce monoxyde d'azote, et on a eu à cet effet l'idée de recher-

cher si celle-ci est stimulée par un apport de nitrite ou de nitrate. Une telle stimulation a pu être vérifiée grâce aux essais résumés ci-dessous: - Etude de la stimulation de la production de NO par apport de nitrite ou de nitrate Dans le but de rechercher si la production de NO par les bactéries propioniques est possible à partir de

NO2 ou de NO3, on a recherché si l'on observe une aug-

mentation de la production de NO par la souche TL223 lorsqu'elle est en presence de 1 mM de KNO2 ou de KNO3 (avec et sans marquage isotopique au N. Cette expérimentation a été effectuée dans les conditions suivantes: * la souche TL223 a été ensemencée à 1 % dans un milieu YEL seul (témoin) ou avec addition de 1 mM de KNO2, de

15

KNO3 ou de K NO3 avec un marquage isotopique à N à %), * incubation à 30 C pendant 24, 48 et 72 heures, * 3 répétitions par point et par traitement,

* accumulation du NO et détermination du rapport isotopi-

que par spectrométrie de masse, * estimation de la fermentation de chaque culture (turbidité) mesurée par lecture de l'absorbance à 650 nm, * dosage du nitrate et du nitrite après récupération des milieux bactériens, centrifugation et mesure par kit Boerhinger. On a également analysé l'accumulation de NO en fonction de la concentration en NO3 (100, 150, 350, 650 et 1050.M) ou en N02 (50, 100, 400, 800, 1000 MM) après une incubation de 72 heures à 30 C (TL223 ensemencée à

1 % dans un milieu YEL).

Les échantillons à analyser ont été distribués dans des tubes d'analyse de NO dont l'atmosphère a été

immédiatement évacuée par un flux d'hélium (flush à l'hé-

lium) pendant 150 s afin d'obtenir des conditions anaéro-

bies strictes.

L'effet du flush à l'hélium sur une éventuelle détection de NO par le spectromètre de masse a été testé sur un milieu YEL stérile: ce milieu YEL, préalablement

flushé à l'hélium, a été incubé à 30 C pendant 72 heures.

Après 0, 24, 48 et 72 heures d'incubation (3 répétitions) on n'a détecté aucune production de NO et les valeurs de

turbidité sont restées nulles.

On a ainsi pu vérifier la qualité du flush à l'hélium, l'absence de toute contamination bactérienne et l'absence d'interaction entre le flush à l'hélium et la

mesure de NO par spectrométrie de masse.

Les essais susmentionnés ont permis d'obtenir les résultats rapportés sur la figure 8, en ce qui concerne la cinétique d'accumulation du NO en présence de nitrite

ou de nitrate.

Plus précisément:

- la figure 8A représente les variations de l'accumula-

tion de NO en fonction du temps, - la figure 8B représente les variations de la turbidité en fonction du temps,

* - la figure 8C représente les variations du rapport iso-

topique [masse 31/(masses 30+31)] en fonction du temps, - la figure 8D représente les variations de la production

de NO en fonction de la turbidité.

Chacune de ces figures concerne la souche TL223 cultivée sur un milieu YEL seul, en présence de 1 mM de

- -0 et14 -

nitrate ( NO3 - marqué à 50 % et NO3) et en présence

de 1 mM de nitrite.

Les barres verticales représentent l'écart type de la moyenne pour n = 3 lorsqu'elles sont plus grandes

que le symbole.

Ces figures prouvent que l'accumulation de NO chez TL223 cultivé sur 1 mM de KNO3 (marqué à l'azote 15 ou non marqué) ou sur 1 mM de KNO2 est proche de 7 ug de NO/ml après 48 heures d'incubation à 30 C; cette valeur est 3,5 fois supérieure à la production de NO dans le cas d'un milieu YEL non supplémenté en nitrate ou en nitrite

(figure 8A). Ces différences ne sont pas dues à des va-

riations de croissance engendrées par la composition du milieu car la turbidité en fin de croissance, est du même ordre de grandeur sur un milieu YEL seul (4,5 unités DO

après 72 heures) et sur un même milieu additionné en ni-

trate ou en nitrite (environ 5 unités DO après 72 heures

- figures 8B et 8D).

La figure 8C révèle que l'apport de K NO3 marqué à 50 % permet d'obtenir du NO avec un marquage à environ % après 48 heures d'incubation: l'azote de masse 15 apporté sous forme de nitrate est donc retrouvé dans le

NO synthétisé par la souche TL223.

On a, en outre observé que lorsque la souche TL223 est cultivée sur K NO3, le profil du pic de masse 31 (15 N 160) augmente très fortement par rapport au NO

analysé sur un milieu YEL contenant du nitrate non mar-

qué, ce qui permet de confirmer cette situation.

De plus, l'addition de 1 mM de KNO3 ou de KNO2 non marqué entraîne une production de NO avec un rapport isotopique de 0,75 % (48 heures d'incubation - figure

8C), ce qui est très proche des valeurs du rapport isoto-

pique naturel du NO (environ 0,4 %).

Ces dernières observations confirment de manière très claire que le gaz analysé en spectrométrie de masse

était bien du NO.

Ces essais ont donc permis de constater que la souche TL223 est capable de synthétiser du NO directement

à partir de nitrite ou en présence de nitrate après ré-

duction de celui-ci en nitrite.

Sur la base des valeurs du rapport isotopique ob-

tenues sur milieu YEL additionné de 1 mM de K N03 marqué à 50 %, il est possible de déduire le taux de conversion

du nitrate en nitrite: ainsi, environ 20% du K NO3 ap-

porté est transformé en monoxyde d'azote par la souche

TL223.

Le nitrate, initialement présent dans le milieu YEL stérile, explique la production de NO observée chez

TL223 (de l'ordre de 2 gg de NO/ml après 72 heures d'in-

cubation - figure 7).

Les variations de la production de NO en fonction

de la concentration en nitrite ou en nitrate sont repré-

sentées sur la figure 9. Plus précisément: - la figure 9A représente les variations de la production de NO et l'évolution de la turbidité en fonction de la concentration initiale en nitrate, chez la souche TL223 cultivée sur milieu YEL après 72 heures d'incubation, - la figure 9B représente les variations de la production de NO et l'évolution de la turbidité en fonction de la concentration initiale en nitrite, chez la souche TL223 cultivée sur milieu YEL après 72 heures d'incubation,

- la figure 9C représente les variations du taux de con-

version du nitrate en NO, en fonction de la concentra-

tion initiale en nitrate,

- la figure 9D représente les variations du taux de con-

version du nitrite en NO, en fonction de la concentra-

tion initiale en nitrite.

Sur ces figures, les concentrations en nitrate ont été corrigées en tenant compte de la présence d'environ 50 iM de nitrate dans le milieu YEL seul et

sont les suivantes: 100, 150, 350, 550, 650 et 1050 MM.

Les concentrations en nitrite sont les suivan-

tes: 50, 100, 400, 800 et 1000 pM.

Ces figures montrent que pour les gammes choi-

sies, la production de monoxyde d'azote par la souche TL223 est proportionnelle à la concentration initiale en nitrate (figure 9A) ou en nitrite (figure 9B) du milieu

YEL. Cette relation est linéaire.

Dans les deux cas, aucune phase de plateau n'a

été observée, ce qui laisse supposer que les concentra-

tions en nitrate ou nitrite utilisées ne permettent pas d'obtenir le niveau maximum d'accumulation de NO par la

bactérie propionique TL223.

Il est également à noter que la présence de for-

tes concentrations en nitrate ou en nitrite n'affecte pas la croissance bactérienne vu que les valeurs de turbidité à 72 heures sont très proches pour toutes les concentra-

tions qui ont été testées.

Il convient, par ailleurs, de souligner que les

droites obtenues sur les figures 9A et 9B sont superposa-

bles, ce qui permet de prouver que le NO produit provient directement du nitrite ou du nitrate via la réduction de

celui-ci en nitrite.

De plus, ces résultats montrent que chez la sou-

che TL223, l'étape de réduction du nitrate en nitrite n'est pas limitante pour les concentrations en nitrate

choisies dans cette expérimentation.

Il est également important de souligner que le taux de conversion du NO3 (figure 9C) et du NO2 (figure

9D) évolue en fonction de la quantité de substrat dispo-

nible, passant de 20 à 60 % lorsque la concentration en

NO3 ou NO2 passe de 1000 à 100 pM.

Ceci suggère que la production de NO est forte-

ment régulée et qu'elle est prioritaire par rapport à

l'utilisation de l'azote nitrique pour les synthèses azo-

tées. A partir des conclusions susmentionnées, on a étudié la production de NO chez 12 souches de bactéries propioniques de deux espèces différentes. Les résultats de ces essais sont résumés ci-dessous: 6 Etude de la production de NO chez différentes souches propioniques

Conformément à cet essai, les souches de bacté-

ries propioniques retenues ont été les suivantes: P.freudenreichii: LS410, LS2501, LS2502, ITG 23, CNRZ89,

CNRZ277, CNRZ81.

P.acidipropionici: TL223, NCDO1072, PR75, CNRZ80,

CNRZ86, CNRZ287.

Il est à noter que les souches CNRZ80, CNRZ81, CNRZ86, CNRZ89, CNRZ277 et CNRZ287 appartiennent à la collection publique INRA-CNRZ tandis que la souche NCDO1072 appartient à la collection britannique National

Collection of Dairy Organisms; les autres souches appar-

tiennent quant à elles à des collections privées.

Après ensemencement sur milieu YEL en présence de

550 MM de nitrate, les cultures bactériennes ont immédia-

tement été réparties par 5 ml dans des tubes étanches et flushées à l'hélium (conditions anaérobies). Ensuite, les

souches propioniques ont été soumises aux conditions ex-

périmentales suivantes: * incubation à 30 C pendant 24, 48 et 72 heures, * 3 répétitions, * accumulation du NO dans l'atmosphère et détermination du rapport isotopique par spectrométrie de masse, * estimation de la fermentation de chaque culture mesurée par lecture de l'absorbance à 650 nm, * dosage du nitrate et du nitrite après récupération des milieux bactériens, centrifugation et mesure par kit Boerhinger. La figure 10 représente les variations de l'accumulation de NO en fonction du temps chez la souche TL223 et les 12 autres souches de bactéries propioniques,

cultivées sur un milieu YEL en présence de 550 MM de ni-

trate. La souche TL223 a été représentée dans chaque cas

dans un but de comparaison.

Les barres verticales représentent l'écart type de la moyenne pour n=3 lorsqu'elles sont plus grandes que

le symbole.

Cette figure montre l'existence de fortes diver-

gences entre les souches propioniques.

De manière globale, en comparant les niveaux de production de NO après 72 heures d'incubation, on peut classer les souches en trois catégories: * souches capables de produire de 4 à 4,5 ug NO/ml: TL223, CNRZ80, NCDO1072 et PR75. Le rapport isotopique du NO produit par ces souches est compris entre 2 et 2,5 % (T=72 h), * souches capables de produire environ 2 Bg NO/ml:

CNRZ81, CNRZ86, CNRZ89, CNRZ277, LS2502, ITG23. Le rap-

port isotopique du NO produit par ces souches se situe entre 4 et 5,5 % (T=72 h), * souches produisant moins de 1 gg NO/ml: LS410, LS2501 et CNRZ287. Malgré la présence de 550 1M de nitrate dans le milieu de culture, ces 3 souches n'ont produit

que de très faibles quantités de NO et le rapport iso-

topique était de l'ordre de 10 à 13 % (T=72 h). Ces va-

leurs suggèrent que les pics de masses 30 et 31

détectés chez ces bactéries pourraient ne pas corres-

pondre à du monoxyde d'azote.

Il est à noter que chez les souches appartenant aux deux premières catégories, le NO produit ne diminue

pas en fin de croissance et qu'il ne semble donc pas ré-

utilisé par les bactéries propioniques: il y a donc ac-

cumulation du NO.

La figure 11 représente les variations de la pro-

duction de NO en fonction de la turbidité chez les

13 souches de bactéries propioniques susmentionnées, cul-

tivées sur milieu YEL en présence de 550 1M de nitrate.

la souche TL223 a été représentée dans chaque cas dans un

but comparatif.

Les barres verticales représentent l'écart type de la moyenne pour n=3, lorsqu'elles sont plus grandes que le symbole.

La figure 12 représente les variations de la tur-

bidité (DO à 650 nm) en fonction du temps chez les 13 souches de bactéries propioniques analysées, cultivées

sur milieu YEL en présence de 550 MM de nitrate.

La souche TL223 est représentée, dans chaque cas,

dans un but comparatif.

Les barres verticales représentent l'écart type de la moyenne pour n=3, lorsqu'elles sont plus grandes

que le symbole.

Les souches produisant le plus de NO (TL223, CNRZ80, NCDO1072 et PR75) atteignent toutes des valeurs de turbidité élevées (4 à 5 unités DO après 72 heures d'incubation.

Parmi ces souches, il est à noter que les bacté-

ries NCDO1072 et PR75 croissent moins vite que TL223, mais sont capables d'accumuler très rapidement de fortes

concentrations en NO.

Ainsi, PR75 produit 2,8,g de NO/ml pour une tur-

bidité de 0,5 unités DO. Le maximum de production de NO est enregistré pour des valeurs de turbidité d'environ 1,5 unité DO pour NCDO1072 et PR75, contre 3,4 unités DO

pour TL223.

Pour " affiner " ces résultats, on a analysé l'évolution des concentrations en NO, nitrate et nitrite

des milieux de culture des 13 souches de bactéries pro-

pioniques étudiées en fonction du temps d'incubation.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le ta-

bleau ci-dessous dans lequel les concentrations sont ex-

primées en jM. Pour chaque souche, les mesures ont été effectuées sur un tube, après élimination des bactéries

par centrifugation.

Concentration Concentration Production de nN enN NO en NoNO 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h

LS410 674 638 596 0 5 22 13 18 23

LS2501 645 649 406 6 13 215 12 26 35 LS2502 338 0 0 176 122 16 12 53 72 ITG23 441 218 24 11 246 278 10 36 62 CNRZ89 595 160 42 16 171 154 10 38 74 CNRZ277 559 435 246 17 3 85 12 42 66 CNRZ81 0 0 0 400 12 0 26 66 71.. ci. p o......

TL223 0 0 0 271 0 0 71 149 152

NCDO1072 0 2 0 370 3 0 50 148 146 PR75 11 2 0 185 1 0 91 147 146 CNRZ80 0 0 0 146 0 0 93 136 140 CNRZ86 594 491 0 14 41 405 9 28 62 CNRZ287 624 570 646 0 0 5 9 20 29

Ce tableau permet de faire les constatations suivantes: - les souches produisant 4 gg NO/ml sont capables de ré- duire entièrement le nitrate disponible (soit 550 iM) après 24 heures d'incubation. De plus, elles peuvent réduire totalement le nitrite obtenu au cours des 48 premières heures d'incubation - les souches LS410 et CNRZ287, très faibles productrices

de NO, ne sont pas capables d'absorber significative-

ment le nitrate présent dans le milieu.

- chez les souches présentant une accumulation intermé-

diaire de NO, on peut observer des évolutions des te-

neurs en nitrate et en nitrite très différentes traduisant des vitesses d'absorption du N03 et/ou de réduction du N03 et du N02 très différentes. Ainsi, la souche CNRZ81 est capable de réduire la totalité du nitrate après 24 heures d'incubation. Après 48 heures, CNRZ81 réalise également la réduction de l'ensemble du N02 obtenu par réduction du N03. A l'opposé, CNRZ277 possède encore 246 gM de N03 et 85 MM de N02 après

72 heures d'incubation.

Les essais résumés ci-dessus ont révélé que cer-

taines souches propioniques sont capables de réduire le ni-

trate du milieu de culture et de fournir ainsi le nitrite

nécessaire à la synthèse de NO.

Il est à noter que les souches propioniques qui produisent le plus de NO (TL223, CNRZ80, NCDO1072 et PR75)

appartiennent toutes à l'espèce P.acidipropionici et possè-

dent, en outre, toutes une activité nitrate réductase.

A l'inverse, les souches produisant apparemment

moins, voire pas du tout, de NO (limite de détection du spec-

tromètre de masse) sont également des bactéries qui ne possè-

dent pas d'activité nitrate réductase connue (LS410, LS2501

et CNRZ287).

Pour certaines souches propioniques, il semble que la cinétique de production de NO ne soit pas directement

liée à l'activité nitrate réductase.

Compte tenu de ces résultats, l'invention se rap-

porte également à une composition diététique ou médicamen-

teuse absorbable, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une préparation renfermant une quantité importante de préférence plus de 10 cellules/g, de souches de bactéries

propioniques sélectionnées en fonction de leur capacité à dé-

gager et/ou à accumuler du monoxyde d'azote à raison d'au

moins 1 ug/ml de milieu YEL contenant 550 gM de nitrate.

Selon une autre caractéristique de l'invention,

cette composition renferme des bactéries propioniques appar-

tenant à au moins l'une des souches TL223, CNRZ80, CNRZ86 et

NCDO1072 de l'espèce P.acidipropionici.

Parmi ces souches, la souche TL223 s'est révélée

particulièrement avantageuse.

Il est également à noter que la souches CNRZ80 présente un intérêt tout particulier d'un point de vue

" productivité " vu qu'elle est capable d'accumuler une con-

centration importante de NO, ce très rapidement (pour des va-

leurs de turbidité relativement faibles). Selon une autre caractéristique de l'invention, cette composition renferme des bactéries propioniques appar-

tenant à au moins l'une des souches ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 et LS2502 de l'espèce P.freudenreichii.

Il est à noter que, conformément à une autre ca-

ractéristique de l'invention, la composition peut également renfermer d'autres bactéries telles que des bifidobactéries

et/ou des bactéries lactiques.

Pour compléter les résultats obtenus ci-dessus,

on a effectué des tests sur deux types de bactéries non pro-

pioniques: E.coli et Lactobacillus farciminis connues pour

leur aptitude à réduire les nitrites.

Les résultats de ces tests sont résumés ci-

dessous: 7 - Etude de la production de NO par les souches E.coli et L. farciminis Ces tests complémentaires ont principalement été effectués compte tenu de l'existence de la publication " Heme- dependent and heme-independent nitrite reduction by lactic acid bacteria results in different N-containing products " Gudrun Wolf, Elke K. Arendt, Ute Pfâhler and Walter P. Hammes - International Journal of Food Microbiology, 10 (1990) 323-330) qui mentionne que certaines bactéries lactiques (L.farciminis) sont capables de produire

du monoxyde d'azote à partir de nitrite.

Des expériences préliminaires ont montré qu'après 5 h 30 de croissance de la souche L.farciminis dans du MRS

additionné de 1 mM de nitrate, on ne détectait plus de ni-

trate ni de nitrite dans le milieu de culture.

La même constatation a été faite en ce qui con-

cerne la souche E.coli après 7 h 30 de croissance sur milieu

BHI additionné de 1 mM de nitrate.

Il est connu, qu'au cours de sa croissance, la souche L.farciminis acidifie le milieu MRS (environ pH 5

après 5-6 heures de culture).

Or, on a pu constater, à partir d'essais réalisés

sur milieu YEL, que les nitrites se transforment en NO en mi-

lieu acide.

Ces essais ont été réalisés dans les conditions expérimentales suivantes: - acidification du milieu YEL par de l'HCl, - apport de nitrite à une concentration de 400 gM, - autoclavage des milieux,

- trois répétitions.

Les résultats obtenus sont rassemblés sur la fi-

gure 13 qui représente les variations en fonction du pH de la production de NO dans le milieu YEL additionné de nitrites

après incubation à 37 C pendant 24 heures.

Cette figure est de nature à prouver qu'il existe une production notable de NO à partir du nitrite du milieu

lorsque celui-ci est acide, cette production augmentant lors-

que le pH diminue.

Par suite, on a effectué des tests comparatifs de la production de NO par L.farciminis et par E.coli qui est réputée non productrice de NO (Brittain T, Blackmore R,

Greenwood C & Thomson AJ (1992) - Bacterial nitrite - redu-

cing enzymes - Eur. J. Bio. Chem., 209, 793-802).

Ces tests ont été réalisés dans les conditions suivantes: - incubation à 37 C sur milieu BHI (E.coli) ou MRS (L.farciminis), - apport de nitrate dans le milieu à une concentration de 1 mM, - flushage de l'atmosphère de chaque tube par de l'hélium pendant 100 secondes, - trois répétitions,

- mesure de la turbidité en fin d'incubation.

Ces essais ont permis d'obtenir les résultats

rapportés sur la figure 14.

Plus précisément: - la figure 14A représente les variations de la production de NO en fonction du temps d'incubation, - la figure 14B représente les variations de la production de

NO en fonction de la turbidité du milieu.

Il est à noter que les valeurs obtenues pour la production de NO sont toutes nettement inférieures au seuil de 1 Mg/ml qui a été considéré ci-dessus comme significatif:

il en résulte qu'il n'y a pas accumulation de NO dans les tu-

bes de culture.

Ces résultats indiquent donc que l'absence de ni-

trate et de nitrite observée dans l'expérience préliminaire après respectivement 5 h 30 (L.farciminis) et 7 h 30 (E.coli) n'est pas compensée par une accumulation de NO qui pourrait

être soit d'origine chimique (liée à l'acidification du mi-

lieu) soit d'origine bactérienne.

Ces résultats ont été, dans le cas de la souche

L.farciminis, confirmés par des tests effectués sur des bac-

téries se trouvant sous forme de resting cells à pH régulé à 6,5 par un tampon phosphate contenant du lactate dans les conditions opératoires suivantes: - incubation à 37 C, - apport de nitrite à une concentration de 400 MM, - flushage de l'atmosphère de chaque tube par de l'hélium pendant 100 secondes, - trois répétitions,

- mesure de la turbidité en fin d'incubation.

Cette analyse a permis d'obtenir les résultats rapportés sur la figure 15: - la figure 15A représente les variations de la production de NO en fonction du temps d'incubation, - la figure 15B représente les variations de la production de

NO en fonction de la turbidité.

Ces résultats confirment ceux obtenus précédem-

ment, à savoir que les quantités de NO produites sont trop faibles pour être significatives et donc que la souche L.farciminis n'est pas susceptible d'accumuler le monoxyde d'azote. Il est toutefois possible que cette souche produise du monoxyde d'azote en début de croissance, mais que le NO

éventuellement produit soit réutilisé par la bactérie.

Des essais complémentaires ont été réalisés sur les souches TL223 et CNRZ80 sous forme de resting cells après

incubation à 30 et également à 37 C.

8 - Evolution de la production de NO par des bactéries pro- pioniques sous forme de resting cells Cette expérimentation a été effectuée dans les conditions suivantes: - resting cells suspendues dans un tampon phosphate contenant du lactate à pH 6,5, - incubation à 30 C ou à 37 C, - apport de nitrite à une concentration de 400 gM, - flushage de l'atmosphère de chaque tube par de l'hélium pendant 100 secondes, - trois répétitions,

- mesure de la turbidité en fin d'incubation.

Il est à noter que lors des tests relatifs à l'incubation à 30 C, on a examiné, outre les souches TL223 et CNRZ80, la souche CNRZ81 avec une concentration bactérienne

doublée.

Cette expérimentation a permis d'obtenir les ré-

sultats rapportés sur les figures 16 et 17. Plus précisé-

ment: - la figure 16A représente les variations de la production de NO par des resting cells à 30 C en fonction de la durée d'incubation, - la figure 16B représente les variations de la production de NO par des resting cells à 30 C en fonction de la turbidité du milieu, - la figure 17A représente les variations de la production de NO par des resting cells à 370C en fonction de la durée d'incubation, - la figure 17B représente les variations de la production de NO par des resting cells à 37 C en fonction de la turbidité

du milieu.

Ces résultats sont de nature à prouver qu'il existe une production conséquente de NO par des resting cells non seulement dans le cas des deux souches de l'espèce P.acidipropionici (TL223 et CNRZ80) mais également dans le cas de la souche de l'espèce P.freundenreichii (CNRZ81). La

souche TL223 est la plus productive.

Globalement, à des concentrations identiques de bactéries, la production de NO par des resting cells est du

même ordre que celle observée dans le cas de bactéries culti-

vées sur milieu YEL.

* La production de NO par des resting cells inter-

vient essentiellement lors des cinq premières heures d'incubation; au-delà de cette période, la production est faible. On a ainsi pu observer qu'à 37 C, la production de NO est identique (TL223) ou légèrement supérieure (CNRZ80)

à celle obtenue à 30 C.

Les avantages associés à l'ingestion de bactéries

propioniques ont, en outre, été vérifiés par des investiga-

tions réalisées in vivo chez l'homme sain.

9 - Etude de l'effet de l'ingestion de bactéries propioniques sur le transit intestinal chez l'homme sain Cette étude a été réalisée en milieu hospitalier

au CHU de Caen sur une série de 19 sujets masculins vo-

lontaires sains.

Au début de ce test, on a fait absorber quoti-

diennement à chaque volontaire 10 marqueurs radio opa-

ques, ce pendant 8 jours consécutifs, conformément au protocole décrit dans les publications Arhan P, Devroede

G, Jehannin B et coll. Dis Colon Rectum 1981; 24:625-9.

et Bouchoucha M, Devroede G. Arhan P et coll. Dis Colon

Rectum 1992; 35:773-82.

Selon ce protocole, l'étude du transit est effec-

tuée par comptage des marqueurs radio opaques ingérés

dans les différentes aires de la cavité abdominale répar-

tis sur un cliché d'abdomen de face. Ces aires (côlon droit, côlon gauche et rectosigmoide) sont définies par ième des lignes fictives joignant la 5 vertèbre lombaire au contour de la cavité pelvienne. Le temps de transit est calculé selon la formule T = 1/N. n. At; N étant

égal à 10 marqueurs, n représentant le nombre de mar-

queurs comptés dans une région et At étant égal à

24 heures.

Le jour suivant cette ingestion, c'est-à-dire le iême 9 jour, on a fait subir aux volontaires une radiogra-

phie de l'abdomen de face sans préparation.

A partir du jour suivant, c'est-à-dire du iême jour, on a fait ingérer quotidiennement à chaque volontaire, ce pendant 2 semaines, une gélule contenant

5 10 bactéries propioniques issues d'une banque de sou-

ches utilisées dans l'industrie fromagère, donc parfaite-

ment inoffensives pour l'homme.

Une seconde étude du temps de transit similaire à la première a été effectuée durant la seconde semaine ijme d'ingestion des propioniques, c'est-à-dire du 17 au ieme

26 jour.

Cette étude a révélé un ralentissement significa-

tif du temps de transit du côlon gauche (p < 0,05 confor-

mément au test statistique Wilcoxon Matched-Paired Signed-Ranks Test.); les temps de transit du colon droit

et du rectosigmoide n'ont pas été significativement modi-

fiés par l'ingestion des propioniques.

Cette étude a donc permis de prouver que l'inges-

tion de bactéries propioniques a une influence sur la mo-

tricité intestinale; on peut supposer que ces résultats

sont liés à la synthèse de monoxyde d'azote par les bac-

téries propioniques.

Claims (7)

R E V E N D I C A T IONS

1 ) Utilisation de bactéries propioniques pour l'obtention d'une composition d'alimentation courante ou d'une composi-

tion diététique ou médicamenteuse absorbable susceptible de5 dégager des quantités physiologiquement significatives de mo- noxyde d'azote dans le tube digestif humain ou animal.

2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que

la composition est constituée par une préparation déshydra- tée.

3 ) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que

la composition se présente sous forme de fractions indivi-

duelles renfermant la dose de bactéries devant être absorbée régulièrement. 4 ) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que

chaque fraction individuelle renferme plus de 10 bactéries.

) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est constituée par une préparation liquide

fermentée ou non.

6 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est une préparation élaborée, les bactéries propioniques étant ajoutées ou incorporées dans des aliments

tels que des fromages ou des fibres alimentaires.

7 ) Composition diététique ou médicamenteuse absorbable, caractérisée en ce qu'

elle est constituée par une préparation renfermant une quan-

tité importante de préférence plus de 10 cellules/g de sou-

ches de bactéries propioniques sélectionnées en fonction de leur capacité à dégager et/ou à accumuler du monoxyde d'azote à raison d'au moins 1 Mg/ml de milieu YEL contenant 550 MM de nitrate. 8 ) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu' elle renferme des bactéries propioniques appartenant à au moins l'une des souches TL223, CNRZ80, CNRZ86 et NCDO1072 de

l'espèce P.acidipropionici.

9 ) Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu' elle renferme des bactéries propioniques appartenant à la

souche TL223 de l'espèce P.acidipropionici.

) Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu' elle renferme des bactéries propioniques appartenant à la

souche CNRZ80.

) Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce qu' elle renferme des bactéries propioniques appartenant à au moins l'une des souches ITG23, CNRZ81, CNRZ89, CNRZ277 et

LS2502 de l'espèce P.freudenreichii.

12 ) Composition selon l'une quelconque des revendications 7

à 11, caractérisée en ce qu'

elle renferme en outre d'autres bactéries telles que des bi-

fidobactéries et/ou des bactéries lactiques