FR2759372A1 - Nouveau canal cationique neuronal de mammifere sensible a l'acidite, son clonage et ses applications - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne une protéine constituant un canal cationique neuronal de mammifère sensible à l'amiloride et activé par les protons, ainsi que les molécules d'acide nucléique codant cette protéine.L'invention concerne aussi un procédé de criblage de substances capables de moduler l'activité de canaux ioniques neuronaux de rnammifère.

Description

NOUVEAU CANAL CATIONIQUE NEURONAL DE
MAMMIFÈRE SENSIBLE A L'ACIDITÉ, SON CLONAGE ET SES
APPLICATIONS.
La présente invention concerne une nouvelle famille de canaux ioniques de mammifère, notamment humain, sensible à l'acidité. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation moléculaire, chez l'homme et le rat, d'un nouveau canal cationique activé par les protons, dénommé ci-après "ASIC" pour désigner les termes anglais "Acid Sensing Ionic Channel". Le canal ASIC constitue le premier membre d'un groupe de canaux cationiques, appartenant à la famille des canaux sodium de dégénérine sensible à l'amiloride (6, 11-14), qui est activé transitoirement par une acidification extracellulaire.
La sensibilité à l'acide est associée à la fois à la nociception (1) et à la transduction du goût (2). La stimulation de neurones sensoriels par les acides revêt une grande importance, car l'acidité accompagne de nombreuses situations inflammatoires et ischémiques douloureuses. La douleur causée par les acides est interprétée comme étant médiée par des canaux cationiques présents au niveau des neurones sensoriels, et qui sont activés par les protons (3-5). Les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux ASIC de 1' invention sont proches de celles des canaux cationiques activés par les protons décrits dans les neurones sensoriels (3, 15, 16).
Toutefois, comme cela apparaîtra dans la description ciaprès, il n'a été à ce jour jamais décrit de canaux ioniques activés par un ligand plus simple que les canaux
ASIC
La présente invention a donc pour objet une protéine constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons. Plus particulièrement l'invention concerne la protéine constituant le canal ASIC dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
De tels dérivés sont ceux dont la séquence comprend une modification et/ou une suppression et/ou une addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, dès lors que cette modification et/ou supression et/ou addition ne modifie pas les propriétés fonctionnelles et structurelles du canal ASIC, principalement son activation par les protons. De tels dérivés peuvent être analysés par l'homme du métier selon les techniques décrites dans les exemples donnés ci-après qui ont permis de mettre en évidence les propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal ASIC.
Un exemple d'un tel dérivé fonctionnellement équivalent, est la protéine ASIC humaine dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2, et qui est sensiblement identique à celle du canal ASIC de rat représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1.
Un autre exemple d'un tel dérivé fonctionnellement équivalent, est la protéine constituant un canal cationique de dégénérine dénommé "MDEG" (14) ou "BNaCI" (20) dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3. MDEG a été décrit comme un canal cationique de mammifère sensible à l'amiloride qui est activé par des mutations responsables de neurodégénéréscence avec les dégénérines de C. elegans. Le canal MDEG est un parent structural du canal ASIC, dont la séquence en acides aminés présente environ 67% d'homologie avec la séquence du canal ionique MDEG. Toutefois, les propriétés électrophysiologiques de ces deux canaux sont différentes car ils ne sont pas activés par les mêmes changements de pH. Ainsi, la gamme de sensibilité de MDEG
(ECso = 4,05) est différente de celle de ASIC (EC5O = 6,2).
I1 a été montré que le canal MDEG est activé par les mêmes mutations que celles causant une dégénérescence neuronale chez C. elegans. Ainsi, comme les mutants de dégénérine de C. elegans hyperactifs, les mutants actifs de MDEG sont responsables d'une mort cellulaire, indiquant que l'acquisition de fonction par ce canal ionique neuronal serait impliquée dans plusieurs
Formes de dégénérescence neuronale de mammifère et notamment humaine. Mais aucune fonction physiologique normale de MDEG n'était connue jusqu'à la mise en évidence de son activation par les protons conformément aux canaux cationiques de la présente invention.
L'invention concerne aussi un canal cationique hybride constitué de l'association d'une première protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon 1 invention avec une seconde protéine constituant un canal ionique activé par les protons.
Avantageusement, ladite seconde protéine est aussi une protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon l'invention. A titre d'exemple d'une telle association, on peut citer l'association de la protéine du canal ASIC avec la protéine du canal MDEG, permettant de former un canal hybride présentant une troisième gamme de sensibilité au pH (EC50 = 4,8).
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre au moins une protéine constituant un canal ionique de l'invention et/ou contre un canal hybride ci-dessus, peuvent être préparés par les méthodes classiques décrites dans la littérature. Ces anticorps sont utiles pour rechercher la présence des canaux ioniques de 1 invention dans différents tissus humains ou animaux, mais ils peuvent aussi trouver des applications dans le domaine thérapeutique pour inhiber ou activer in vi vo, grâce à leur spécificité, un canal ASIC et/ou ses dérivés.
La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons. Plus particulièrement 1 'invention conceme une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour la protéine constituant le canal ASIC dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 1 ou pour un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine. Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine ASIC est celle représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID NO:1 ou sa séquence complémentaire. Une autre molécule d'ADN selon l'invention est celle représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEO ID NO
: 2 ou sous le numéro SEO ID NO : 3, ou leur séquence complémentaire.
Des molécules d'acide nucléique selon l'invention comprennent ou son constituées par
- la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 123 et 1700 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 1, ou sa séquence ccmplémentaire;
- la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 1 et 1542 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 2, ou sa séquence complémentaire
- la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 127 et 1663 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 3, ou sa séquence complémentaire;
L'invention conceme également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine constituant un canal ionique selon 1' invention. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des canaux de l'invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production d'une protéine constituant un canal cationique selon l'invention consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal cationique,
- à isoler, par tous moyens appropriés les protéines constituant les canaux ioniques de l'invention.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un canal ionique selon l'invention consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans une cellule,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression de canaux ioniques de 1' invention.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou 'inspectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agit de tout vecteur comme un plasmide.
L'invention concerne donc aussi les cellules transformées exprimant les canaux ASIC et/ou ses dérivés comme MDEG obtenues conformément aux procédés précédents.
Ces cellules sont utiles pour le criblage de substances capables de moduler la perception de l'acidité, tant en ce qui concerne la nociception que la transduction du goût. Ce criblage est effectué en mettant en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules exprimant les canaux ASIC, puis en mesurant, par tous moyens appropriés, les effets éventuels de ladite substance sur les courants desdits canaux. Des techniques électrophysiologiques permettent également ces études et font aussi l'objet de la présente invention dès lors qu'elles mettent en oeuvre les canaux ASIC ou leurs dérivés.
Ces criblages permettent d'identifier de nouveaux médicaments utiles dans le traitement ou la prévention de la douleur. Ils permettent également de rechercher des agents modulateurs du goût acide. En outre, ils permettent de rechercher des bloqueurs qui sont susceptibles d'inhiber des neurodégénéresences provoquées par hyperexpression de ces canaux. Les canaux ASIC ont en effet des propriétés de sélectivité ionique, notamment en ce qui concerne leur perméabilité sélective au sodium, potassium et calcium, qui les destinent à avoir des propriétés excitotoxiques lorsqu'ils sont hyperstimulés.
Une protéine constituant un canal ionique neuronal ASIC peut être aussi utile pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant la perception douloureuse de l'acidité qui intervient dans les maladies inflammatoires, les ischémies et dans un certain nombre de tumeurs. L'invention concerne donc aussi les composition pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une protéine constituant un canal ionique selon l'invention.
Une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine constituant un canal ASIC ou un dérivé de celui-ci, ou un vecteur comprenant cette molécule d'acide nucléique ou encore une cellule exprimant des canaux ASIC, sont aussi utiles pour la préparation d'animaux transgéniques. Il peut s'agir d'animaux sur-exprimant lesdits canaux, mais surtout d'animaux dit "knock out", c'est à dire présentant une déficience en ces canaux; ces animaux transgéniques sont préparés par des méthodes connues de l'homme du métier, et permettent de disposer de modèles vivants pour l'étude de pathologies animales associées aux canaux ASIC.
Les molécules d'acide nucléique de l'invention ou les cellules transformées par ladite molécule sont donc susceptibles d'être utilisées dans des stratégies de thérapie génique afin de compenser une déficience des canaux ASIC au niveau de un ou plusieurs tissus d'un patient. L'invention concerne donc aussi un médicament comprenant des molécules d'acide nucléique de l'invention ou de cellules transformées par lesdites molécules pour le traitement de pathologie impliquant les canaux ASIC et leurs dérivés.
Outre la propriété d'être activé par les protons et les applications décrites ci-dessus qui en résultent dans le domaine de la perception de l'acidité, le canal ASIC, du fait de sa parenté structurale avec le canal MDEO, est susceptible de se comporter comme une dégénérine neuronale à la suite de mutation.
La mort de certains neurones est caractéristique de plusieurs types de dégénérescences neuronales telles que les maladies d'Alzheimer, d'Huntington, de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie cérébelleuse. Seuls quelques gènes déficients sont connus et plusieurs restent encore à identifier. Le réseau neuronal primitif du nématode C. elegans constitue un bon modèle du développement et de la mort neuronal. La dégénérescence héréditaire chez C. elegans peut être due à des mutations des dégénérines deg 1, mec-4 et mec 10. Les homologies avec les sous-unités du canal sodium sensible à l'amiloride, le produit d'expression fonctionnel des chimères mec-4 du canal sodium épithélial, suggèrent que les dégénérines sont des canaux ioniques dont l'acquisition de fonction est la cause de dégénérescence neuronale.
La présente invention concerne donc aussi les applications du canal ASIC pour l'étude de ses modifications pathologiques susceptibles de conduire à des dégénérescences. Les techniques mises en oeuvre pour ces applications, par exemple pour le criblage de drogues, sont similaires à celles décrites précédemment pour la recherche d'agents modulateurs du goût ou d'analgésiques.
En outre, une protéine constituant un canal ionique neuronal ASIC peut être aussi utile pour la fabrication de médicaments destinés à traiter ou prévenir des pathologies impliquant une dégénéréscence neuronale cérébrale. L'invention concerne donc aussi les compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins une protéine constituant un canal ionique selon l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant aux travaux de recherche ayant mené à la mise en évidence et à la caractérisation du canal ASIC, et dans laquelle il sera fait référence aux séquences et dessins en annexe dans lesquels
- SEQ ID NO : 1 représente la séquence de 526 acides aminés de la protéine du canal ASIC déduite de la séquence de l'ADNc de rat.
- SEQ ID NO : 2 représente la séquence partielle de 514 acides aminés de la protéine du canal
ASIC déduite de la séquence partielle de l'ADNc humain.
- SEQ ID NO : 3 représente la séquence de 512 acides aminés de la protéine du canal MDEG déduite de la séquence de l'ADNc humain.
- La figure 1 représente l'alignement des séquences des protéines ASIC de rat (en haut) et humain (en bas) des séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2. La comparaison de ces séquences fait apparaître l'absence de 14 acides aminés au début de la phase codante humains par rapport à celle du rat.
La figure 2 représente la comparaison de la séquence de la protéine du canal ASIC avec la séquence d'autres canaux ioniques
- MDEG (14), un canal cationique de mammifère qui est activé par des mutations responsables de neurodégérescences avec les dégénérines de C. elegans.
- FaNaCh (10), un peptide d'un canal sodium de Helix aspersa qui est activé par la FMRFamide.
- La dégénérine MEC-4 (12) de C. elegans.
Dans cette figure, les résidus identiques ou similaires à ceux de ASIC sont imprimés respectivement en blanc sur fond noir et en noir sur fond gris. Les régions supposées transmembranaires (MI, MII) d'ASIC sont marquées par des barres noires.
La figure 3 représente l'arbre phylogénétique des protéines des sous unités aNaCh, ssNaCh, yNaCh, aNaCh du canal sodium sensible à l'amiloride et des dégénérines MEC-4, MEC-10 et DEG-1 de C. elegans.
La figure 4 représente la topologie qui est proposée pour cette dernière famille de canaux ioniques (30)
La figure 5 montre les propriétés biophysiques du canal ASIC1 activé par les protons.
- En a : les courants macroscopiques entrant enregistrés à -70 mV après des rapides changements du pH de pH 7,4 à pH 6.
- En b : La courbe dose réponse du pH extracellulaire. Le pH initial était de 7,4 et les points représentent les valeurs moyennes de 6 expériences.
L'encart dans cette figure montre les réponses typiques à -70 mV.
- En c : les relations Q-V des patch "outside-out" avec 140 mM de Na+(l) ou de Li+(-) dans la solution du bain. Q est la charge transportée durant la transition de pH acide. L'encart dans cette figure montre les réponses typiques dans un milieu contenant du Na+.
- En d : les courants activés par les protons H+ enregistrés à différents potentiels dans un patch "outside-out" dans un milieu contenant du Na+.
- En e : les relations moyennes i-V mesurées à partir de patch "outside-out" avec 140 mM de Na+(l), 140 mM de Li+(.) ou 1,8 mM de Ca2+ (A), en tant qu'ions perméables majoritaires dans les solutions externes ; les potentiels d'inversion étaient respectivement de 65 mV, 58 mV et -34 mV.
- En f : le courant de protons à travers le canal ASICl. Les relations entre le pic de courant et le voltage ont été mesurées à partir de patch "outside-out" dans une solution de Na+ libre, Ca2+ libre avec des pipettes contenant une solution de K+ libre, à pH 4 (g) et à pH 3 (I) . (À) représentent les résultats obtenus dans les mêmes conditions que (I) mais avec du KC1 dans la pipette.
L'encart dans cette figure montre les réponses typiques enregistrées dans les conditions (A).
La figure 6 montre l'effet du Ca2+ et de l'amiloride sur le courant ASIC.
- En a : les courants activés par les protons H+ enregistrés à différents potentiels membranaires à partir d'un patch outside-out avec 1,8 mM de Ca2+ dans une solution de Na+ libre ; les courants se sont inversés à -35 mV.
- En b : Les relations Q-V moyennes à partir d'un patch outside-out enregistrées dans des solutions de
Na+ libre contenant 1,8 mM de Ca2+ (o, potentiel d'inversion -34 mV) ou 0,1 mM de Ca2+ (*, potentiel d'inversion -80 mV).
- En c : L'effet du Ca2+ externe sur le pic macroscopique de courant entrant enregistré à -70 mV et activé par un changement rapide de pH de pH 7,4 à pH 6.
L'encart dans cette figure montre les réponses typiques.
Les points représentent les valeurs moyennes t se de 5 oocytes.
- En d : L'effet de l'amiloride sur les courants activés par les protons H+ enregistré à 0 mV à partir d'un patch outside-out.
- En e : L'inhibition du courant macroscopique (induit par un changement de pH de pH 7,4 à pH 6) à -70 mV par l'amiloride et dérivés. Les points représentent les valeurs moyennes + se de 5 oocytes.
La figure 7 montre la distribution tissulaire de l'ARNm du canal ASIC.
- En a : L'analyse en Northern blot de l'expression ARNm du canal ASIC dans des tissus humains.
- En b : L'analyse en RT-PCR de l'expression de 1'ARNm du canal ASIC dans le cerveau de rat et dans le ganglion de la racine dorsale (DRG). (+),(-) représentent respectivement les échantillons avec ou sans reverse transriptase. Des sections d'un gel d'agarose révélé au bromure d'éthidium 1%. Les flèches indiquent la taille escomptée (657 pb) du produit de PCR.
La figure 8 représente l'hybridation in situ.
- En a et b : L'hybridation de sections de 6 Am d'un ganglion de la racine dorsale d'un rat agé de 3 mois avec la sonde E marquée à la digoxigénine. En a : Une microphotographie à faible pouvoir éclairant
(grossissement de 30 fois). En b : Une image à haute résolution (grossissement de 80 fois) de a. On note le marquage intense des neurones de petit diamètre (flèches).
Des résultats similaires ont aussi été obtenus avec les sondes A, C et D.
- En c : La distribution de l'arum du canal
ASIC dans le cerveau d'un rat adulte analysée par hybridation in situ avec l'oligonucléotide antisens C. Des résultats identiques ont été obtenus avec l'oligonucléotide B. Les couleurs indiquent l'abondance
(rouge : haute expression ; bleu : non détectable). Les abréviations utilisées dans la figure sont les suivantes
Cer = Cerebellum ; Hip = Hyppocampe ; OB = Bulbe olfactif ; Cx = Cortex.
I - Matériels et Méthodes.
1) Clonage du canal ASIC.
Les séquences conservées de la famille de canaux ioniques ASIC ont été utilisées pour préparer les amorces PCR de séquences suivantes
TTYCCIGCIRTIACIITNTGYAAY, et
CAIARICCIAIITGNCCNCCDAWRTC.
Une banque d'ADNc de cerveau de rat
(Stratagène #936515) a été hybridée avec le produit de PCR de 1 kB de cerveau de rat et des clones partiels ont été isolés. L'extrémité 5é de l'ADNc (202 bp) a été isolée par
PCR après une ligation adaptée à l'ADNc double brin.
2) Electrophvsioloaie.
0,25 ng d'ARNc a été injecté dans des oocytes de Xenopus laevis et les microélectrodes d'enregistrement pour le voltage imposé et pour le patchclamp ont été mises en place deux jours après l'injection.
Les solutions de bains pour les enregistrements de patch outside-out et les pipettes pour les enregistrements de patch outside-out et de cellules totales, contenaient 140 mM KC1 (ou NMDG), 2 mM MgC12, 5 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7,4 (avec KOH). Les pipettes pour les enregistrements de patch outside-out et les solutions de bains pour les enregistrements de patch outside-out et de cellules totales, contenaient : 140 mM NaCl (ou LiCl ou NMDGC1), 2 mM MgC12, 1,8 mM CaC12, 10 mM Hepes, pH 7,4 (ajusté avec
HC1, NaOH, LiOH ou TMAOH). Les changements rapides de pH depuis le pH initial ont été obtenus par perfusion avec une solution de bain ajustée aux pH indiqués dans les figures. L'acidification intracellulaire des oocytes a été réalisée en injectant 50 nl de la solution interne à pH2 ou par perfusion et retrait d'un milieu de bain contenant 20 mM NH4C1. Aucun des courants enregistrés n'était contaminé par le courant Ca2+ sensible au Cl de l'oocyte de Xenopus. Les données ont été échantillonnées à 2 kHz et filtrées à 500 Hz pour l'nalyse (Logiciel Biopatch).
3) Analvse Nortern Blot, RT-PCR et hybridation in situ.
Le Northern blot a été obtenu auprès de la
Société Clontech (Palo Alto, Ca) et contenait environ 2 g d'ARN poly(A+) par ligne. Le blot a été hybridé avec un fragment du clone partiel humain (correspondant aux bases 270 à 764 du clone de rat) marqué au 32p, à 650C dans 6xSSC. Pour l'analyse RT-PCR, 5 g de 1'ARN total de cerveau de rat et 3 g de ganglion de la racine dorsale ont été reverse transcrits et 1/30 de l'échantillon a été amplifié par 30 cycles de PCR avec les amorces de séquences ci-dessous
ATTGCTCTTCCCATCTCTAT, et TTCAAGGCCCATACCTAAGT.
Les contrôles négatifs ont été traités de façon identique, à l'exception de la reverse transcriptase qui n'a pas été ajoutée. Les oligonucléotides antisens correspondant aux base 70 à 114 (A), 215 à 248 (B), 1821 à 1859 (C), 1896 à 1940 (D) et l'ADN double brin correspondant aux base 1685 à 2672 ont été utilisés pour les hybridations in situ. Les sections de cerveau de rat adulte ont été hybridées avec les oligonucléotides B ou C dont l'extrémité était marquée au 32p, pour une nuit à 370C dans 50% formamide, 2xSSC, puis lavées à température ambiante dans lxSSC. Le signal a été aboli par un excès 500 fois d'oligonucléotides non marqués. Les sections de ganglion de la racine dorsale ont été hybridées avec les oligonucléotides A, C ou D marqués par la digoxigénine(DIG)-dUTP et avec la sonde E marquée par DIG- d-UTP par PCR. Le marquage des sondes, la préparation des échantillons, l'hybridation et la visualisation des acides nucléiques DIG avec la phosphatase alcaline conjuguée à des anticorps anti-DIG ont été réalisés conformément aux protocoles du fournisseur (Boehringer Mannheim).
4) Analyse informatique.
L'alignement de séquences et l'arbre phylogénétique (substitution Kimura, option UPGMA) ont été réalisés avec le logiciel GCG (Genetics Computer Group,
Madison WI).
II - Résultats.
L'ADNc de 35 kb isolé de cerveau de rat code pour une protéine de 526 acides aminés qui présente, comme montré sur la figure 2, des homologies avec tous les membres clonés de la famille des canaux sodium de dégénérine sensibles à l'amiloride.
Comme montré sur la figure 5, l'expression de l'ARNc dans des oocytes de Xenopus a induit un courant entrant activé par les protons H+. Les propriétés biophysiques et la pharmacologie du canal ASIC sont proches de celles décrites pour les canaux cationiques activés par les protons des neurones sensoriels (3, 15, 16). Une baisse du pH extracellulaire au dessous d'un pH de 6, 9 active un courant entrant rapidement élevé et désensibilisé (figure 5 a et b). Ce canal est activé par les protons extracellulaires, puisque, comme montré sur la figure 5 (c et d), l'application d'un acide sur la face extracellulaire de patch outside-out active le canal.
L'acidification intracellulaire d'oocytes et l'acidification de la face intracellulaire de patch outside-out n'active pas le canal ASIC ni n'altère le courant ASIC induit par les protons extracellulaires.
L'analyse des courbes I-V de la figure 5 (c et e) enregistrées avec différents cations extracellulaires montre que Na+ est l'ion perméable majoritaire (canal de conductance simple 14,3 pS) . Comme le canal ionique sensible aux protons des neurones sensoriels (15, 16), le canal ASIC discrimine faiblement entre les cations (figure 5 c, e, f). En effet, le canal est aussi perméable à Li+, K+, Ca2+ et H+, avec des rapports pNa+/pLl+ - 1,3 (figure 5 c, e), pNa+/pK+ = 13
(figure 5 c, e), pNa+/Ca2+ = 2,5 (figure 5 e) et pNa+/H+ = 0,8 (figure 5 f). La perméabilité au Ca2+ de ASIC pourrait être un chemin d'entrée voltage indépendant de Ca2+ dans la cellule. Un courant entrant de Ca2+ dans la cellule à travers les canaux ASIC peut être détecté en l'absence de
Na+ extracellulaire (figure 6 a, b). Comme indiqué sur la figure 5 (e) la conductance unitaire pour Ca2+ était de 5,2 pS. En présence de 140 mM de Na+ extracellulaire, l'augmentation des concentrations en Ca2+ externe, a diminué l'amplitude du courant activé par les protons
(figure 6c), démontrant ainsi que Ca2+ inhibe la perméabilité au Na+. Un blocage par le Ca2+ externe est caractéristique du I (H+) des neurones sensoriels (17) .Le courant entrant activé par H+ dans les neurones sensoriels est inhibé par l'amiloride (18) et l'éthylisopropylamiloride (EIPA) (19) . Comme montré à la figure 6 (d, e) le canal ASIC présente la même pharmacologie et est bloqué de'façon réversible (Kd = 10 pLM) par l'amiloride et ses dérivés benzamil et EIPA.
Par ailleurs, la protéine du canal ASIC présente environ 67% d'homologie de séquences avec le canal ionique de dégénérine dénommé "MDEG" (14) ou "BNaCI"
(20). Toutefois, les propriétés électrophysiologiques de ces deux clones exprimés dans les oocytes de Xenopus sont clairement différentes
- Comme montré sur la figure 5a, le canal
MDEG n'est pas activé par les mêmes changements de pH que le canal ASIC.
- La substitution du résidu glycine en position 430 de MDEG par un acide aminé encombrant acide, comme la valine ou la phénylalanine active le canal (14), tout comme la mutation de l'alanine en position 704 de la dégénérine MEC-4 cause une neurodégéréscence chez C. elegans (12). Des mutations identiques d'ASIC (glycine en position 431 remplacée par la valine ou la phénylalanine) n entraînent pas d'activité et les mutants ne peuvent pas être activés par les protons.
Les canaux cationiques activés par les protons ont été décrits dans les neurones sensoriels mais aussi dans les neurones du système nerveux central (21).
La distribution tissulaire de l'expression de l'ARNm du canal ASIC est en accord avec cette observation. Comme rapporté dans la figure 7a, un transcrit de 4, 3 kb a été détecté dans le cerveau par analyse en Northern blot, et les résultats de la RT-PCR rapportés à la figure 7b montrent que le ganglion de la racine dorsale exprime l'ARNm de ASIC. La figure 8 (a,b) montre que l'ARNm de
ASIC est bien exprimé dans les petits neurones du ganglion de la racine dorsale, ce qui supporte le fait que ASIC est le canal cationique activé par les protons rapidement désensibilisant décrit dans les neurones sensoriels nociceptifs. Alors que la présence de canaux cationiques activés par les protons dans le ganglion de la racine dorsale est en accord avec leur fonction de détecteur de l'acidité dans la nociception, leur rôle dans le cerveau reste à établir. Les résultats d'hybridation in situ de la figure 8c montrent une expression large et hétérogène de l'ARNm du canal ASIC. Les niveaux d'expression les plus élevés ont été observés dans le bulbe olfactif principal, le cortex cérébral, l'hyppocampe, l'habenula, le noyau amygdaloïde basolatéral et le cerebellum. L'activité synaptique s' accompagne de changements du pH extracellulaire (22, 23) et les changements localisés rapides de pH dans ou à proximité de la fente synaptique sont sensiblement plus saturés et forts que les fluctuations macroscopiques du pH rapportées.
Les canaux cationiques activés par les protons sont les seuls canaux ioniques connus qui sont directement activés par un changement du pH et il a été envisagé que les fluctuations extracellulaires du pH jouent un rôle neuromodulateur (23). L'expression de canaux cationiques dans le cerveau supporte en outre l'hypothèse que les fluctuations de pH ne sont pas seulement une activation neuronale par un produit, mais davantage un chemin de communication dans le système nerveux central.
Outre les canaux cationiques activés par les protons rapidement inactivés, il a été rapporté la présence dans les neurones sensoriels de canaux cationiques activés par les protons présentant des cinétiques plus lentes (4, 24) . Les canaux cationiques activés par les protons forment probablement, comme d'autre canaux cationiques activés par un ligand (25, 26), une famille de canaux cationiques où différentes sousunités ou combinaisons de sous-unités constituent les canaux avec diverses propriétés pharmacologiques et biophysiques.
La sensation de l'acidité n'est pas uniquement impliquée dans la nociception, mais est aussi associée à la transduction du goût (2) . Les stimulations acides activent les canaux cationiques activés par les protons dans les cellules du goût (2, 27) et l'amiloride inhibe la perception du goût acide (2). Aussi, les données tant physiologiques que pharmacologiques indiquent que
ASIC et d'autres membres de cette famille sont impliqués dans la transduction du goût. Il est en effet particulièrement frappant que la même classe de canaux ioniques soit associée à différentes facettes de la perception sensorielle
- Les canaux sodium sensibles à l'amiloride sont associés à la transduction du goût salé (2).
- Les dégénérines de C. elegans sont impliquées dans la mécanotransduction et ont été proposées comme formant des canaux ioniques mécanosensibles (28, 29)
- les canaux ASIC sont impliqués dans la nociception et dans la transduction du goût acide.
Le clonage du canal ASIC permet de disposer d'un nouvel outil d'investigation de ce groupe de canaux ioniques et de développer des bloquants spécifiques trouvant leur utilisation notamment comme analgésiques.
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21 Krishtal, O.A., Osipchuk, Y.V., Shelest, T.N. & Srnirnoff, S.V. Brain
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J. Biol. Chem. 269, 12981-12986 (1994).
LISTE DE SÉQUENCES.
NOMBRE DE SÉQUENCES : 3
INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO:1 : i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE
A) LONGUEUR : 3562 paires de base
B) TYPE : acide nucléique
C) NOMBRE DE BRINS : double
D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : rat ix) CARACTERISTIQUE
A) NOM/CLE : ASIC
B) LOCALISATION : 123 .. 1700 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO:1 :
CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAGAAC CTGCGCCTGT 60 GCCTGTGCCT GTGCCTGTGC CTGTTTGAGA GCTGGAGACA CAGAAGGATC CCCTTGGCAA 120
GG ATG GAA TTG AAG ACC GAG GAG GAG GAG GTG GGT GGT GTC CAG CCG 167
Met Glu Leu Lys Thr Glu Glu Glu Glu Val Gly Gly Val Gln Pro
1 5 10 15
GTG AGC ATC CAG GCT TTC GCC AGC AGC TCC ACG CTG CAT GGT CTT GCC 215
Val Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu His Gly Leu Ala
20 25 30
CAC ATC TTC TCC TAT GAG CGG CTG TCT CTG AAG CGG GCA CTG TGG GCC 263
His Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser Leu Lys Arg Ala Leu Trp Ala
35 40 45
CTG TGC TTC CTG GGT TCG CTG GCC GTC CTG CTG TGT GTG TGC ACT GAG 311
Leu Cys Phe Leu Gly Ser Leu Ala Val Leu Leu Cys Val Cys Thr Glu
50 55 60
CGT GTG CAG TAC TAC TTC TGC TAT CAC CAC GTC ACC AAG CTT GAC GAA 359
Arg Val Gln Tyr Tyr Phe Cys Tyr His His Val Thr Lys Leu Asp Glu
65 70 75
GTG GCT GCC TCC CAG CTC ACC TTC CCT GCT GTC ACA CTG TGC AAT CTC 407
Val Ala Ala Ser Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu 80 85 90 95
AAT GAG TTC CGC TTT AGC CAA GTC TCC AAG AAT GAC CTG TAC CAT GCT 455
Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gln Val Ser Lys Asn Asp Leu Tyr His Ala
100 105 110
GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTC AAC AAC AGG TAT GAG ATC CCG GAC ACA 503
Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Asn Arg Tyr Glu Ile Pro Asp Thr
115 120 125
CAG ATG GCT GAT GAA AAG CAG CTA GAG ATA TTG CAG GAC AAG GCC AAC 551 Gln Met Ala Asp Glu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Gln Asp Lys Ala Asn
130 135 140
TTC CGG AGC TTC AAG CCC AAG CCC TTC AAC ATG CGT GAA TTC TAC GAC 599
Phe Arg Ser Phe Lys Pro Lys Pro Phe Asn Met Arg Glu Phe Tyr Asp
145 150 155
AGA GCG GGG CAC GAT ATT CGA GAC ATG CTG CTC TCG TGC CAC TTC CGT 647
Arg Ala Gly His Asp Ile Arg Asp Met Leu Leu Ser Cys His Phe Arg 160 165 170 175 GGG GAG GCC TGC AGC GCT GAA GAT TTC AAA GTG GTC TTC ACT CGG TAT 695
Gly Glu Ala Cys Ser Ala Glu Asp Phe Lys Val Val Phe Thr Arg Tyr
180 185 190 GGG AAG TGT TAC ACA TTC AAC TCG GGC CAA GAT GGG CGG CCA CGG CTG 743
Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Gln Asp Gly Arg Pro Arg Leu
195 200 205
AAG ACC ATG AAA GGT GGG ACT GGC AAT GGC CTG GAG ATC ATG CTG GAC 791
Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp
210 215 220
ATT CAG CAA GAT GAA TAT TTG CCT GTG TGG GGA GAG ACC GAC GAG ACA 839
Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu Thr
225 230 235
TCC TTC GAA GCA GGC ATC AAA GTG CAG ATC CAC AGT CAG GAT GAA CCC 887
Ser Phe Glu Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp.Glu Pro 240 245 250 255
CCT TTC ATC GAC CAG CTG GGC TTT GGT GTG GCT CCA GGT TTC CAG ACG 935
Pro Phe Ile Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr
260 265 270
TTT GTG TCT TGC CAG GAG CAG AGG CTC ATC TAC CTG CCC TCA CCC TGG 983
Phe Val Ser Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Pro Trp
275 280 285
GGC ACC TGC AAT GCT GTT ACC ATG GAC TCG GAT TTC TTC GAC TCC TAC 1031
Gly Thr Cys Asn Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Phe Phe Asp Ser Tyr
290 295 300
AGC ATC ACT GCC TGC CGG ATT GAT TGC GAG ACG CGT TAC CTG GTG GAG 1079
Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Leu Val Glu
305 310 315
AAC TGC AAC TGC CGT ATG GTG CAC ATG CCA GGG GAC GCC CCA TAC TGC 1127
Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Tyr Cys 320 325 330 335
ACT CCA GAG CAG TAC AAG GAG TGT GCA GAT CCT GCC CTG GAC TTC CTA 1175
Thr Pro Glu Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu Asp Phe Leu
340 345 350
GTG GAG AAA GAC CAG GAA TAC TGC GTG TGT GAG ATG CCT TGC AAC CTG 1223
Val Glu Lys Asp Gln Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro Cys Asn Leu
355 360 365
ACC CGC TAC GGC AAG GAG CTG TCC ATG GTC AAG ATC CCA AGC AAA GCC 1271
Thr Arg Tyr Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Ala
370 375 380
TCC GCC AAG TAC CTG GCC AAG AAG TTC AAC AAA TCG GAG CAG TAC ATA 1319
Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Gln Tyr Ile
385 390 395
GGG GAG AAC ATT CTG GTG CTG GAC ATT TTC TTT GAA GTC CTC AAC TAT 1367
Gly Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val Leu Asn Tyr 400 405 410 415
GAG ACC ATC GAG CAG AAA AAG GCC TAT GAG ATC GCA GGG CTG TTG GGT 1415
Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly Leu Leu Gly
420 425 430
GAC ATC GGG GGC CAG ATG GGG TTG TTC ATC GGT GCC AGC ATC CTC ACC 1463
Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu Thr
435 440 445
GTG CTG GAA CTC TTT GAC TAT GCC TAC GAG GTC ATT AAG CAC AGG CTG 1511
Val Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Glu Val Ile Lys His Arg Leu
450 455 460
TGC AGA CGT GGA AAG TGC CAG AAG GAG GCT AAG AGG AGC AGC GCA GAC 1559
Cys Arg Arg Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser Ser Ala Asp
465 470 475
AAG GGC GTG GCG CTC AGC CTG GAT GAC GTC AAA AGA CAC AAT CCC TGC 1607
Lys Gly Val Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His Asn Pro Cys 480 485 490 495
GAG AGC CTC CGA GGA CAT CCT GCC GGG ATG ACG TAC GCT GCC AAC ATC 1655
Glu Ser Leu Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala Ala Asn Ile
500 505 510
CTA CCT CAC CAT CCC GCT CGA GGC ACG TTT GAG GAC TTT ACC TGC TAA 1703
Leu Pro His His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe Thr Cys *
515 520 526 GCCCTCGCAG GCCGCTGTAC CAAAGGCCTA GGTGGGGAGG GCTGGGGGAG CAAGGGGCCC 1763 CCAACTGCCC CCAGCTACCC TGTGGACTTA ACTGCATTCC TGGTCAGTGG TTCCCTCTTG 1823
TCTGTGGTGA GAAAGGAGTC TTGACCATAG AGTCCTCTCC CAGCCTCTAT CCCATCTTTT 1943
TATTTTAATT TAATCACATT TGCTCTGTAA TATTGCTTGA GGCTGGGGAT CGTGATTTCC 2003
CCCCAGTTCT TTTATTGTTG AGAATAGTTT TCTCTATTCT GGGTTTTCTG TTATTTCAAA 2063 TGAATCTGCA AATTGCTCTT CCCATCTCTA TGAAGAATTG CGTTGGAATT TTGATGGGGA 2123 TTGTATTGAA TCTGTAGATT GCCTTTGGTA AGATGGCCAT TTTTACTATG TTAATCCTGC 2183 CAATTCATGA GCAAGGGAGA TCTTTCTATC TCTGAAATCT ACTTCAGTTT CTTTCTTCAG 2243
AGACTTGAAG TTCTTGTCAT AAAAATCTTT TTGGTTAGAG CCACACCAAG GTATTTTATA 2303 TTGTTTGTGA CTATTGTGAA TGGTGTCATT TCCCTAATTT CCTTCTCAGC CTACTTATCC 2363 TTTGAGTAGA GGAAGGCTTC TGATTTGTTT GGGTTAATTT TATACCCAGC TGCTTTGCTA 2423
AAGTTCTTTA TCAGGTTTAG GTGTTCTCTG GTGGAACTTT TGGGGTCACG TAAGAATACT 2483
ATTATATCAT CTGCAAATAG TGATATTTCA CTTCTTCCTT TCCAATTTCT ATCCCTCTGG 2543
GGACTTTTTG TTGTCTAATT GCTCTGGCTA GGACTTCAAA TTCTATATTG AATAGATAGG 2503
GAGAGAGTGG GCAGCCTTGT CTAGTTCCTG GTTTTCGTGG GATCGCTTCA AATTTCTCTC 2663
CATTTAGTTT GATATTGGCT ACTGGTTTGC TGTATATGGC TTTTACTGTA CTTAGGTATG 2723
GGCCTTGAAT TCCTGATATT TCCAAGACTT TTAACATGAA GGGGTTTTGA AATTTGCCAA 2783
ATGCTTTCTC AGCATCTAAT GAGATGATCA TGTGCCCTCC CCCCACCTTG AGTTTGTTTA 2843
TATAGTGGGT TACATGAAAG GATCATTTCT AATAGTCCAC AAGTCTGCCA AATCTTGCTG 2903
ATTGTGACTC ATTTCCATAG CAGGCTCTAT AACTTCTCTA ACAGATTGCA TTAAACTCTG 2963
CTTGGGGAAG GCATTACCTC TTGGTTGAAG CAATGTTGTA GTTTCTATGC CTGCTGAGTA 3023
AATAGCCTCA AGTCCAAGTA CTTGCCCAGA CTAATGATCA AACGTATCCA GGAGTTCCAT 3083
ACCAGAGATG TACTCTTCTC TCCTTTGAAG TACATTGCTG GAAGAGTAAT TGTGTTTGCT 3143
AGAGATACTC CTTCGAACTG CAAAAGAAAT CTCTTGGCTA AGCATATAAT CAAGCCTCAG 3203
GTTTTCTTTT TATTAAATAG CTGCTTGTAA GAAAGTGGAC ACTAAGCATA TACCTCAAAG 3263
GGAGACAGAA TGACTCTGTG CCTTCACTGA TGGAAGTCTG GGTTACAAAT TACATCAGAA 3323
GAACCTATCA TAGTGAAACA TCTCATTCCC CTGGTATAAT CCCTTCTAGA AATACACTTG 3383
TGACTCTGAA ATGTTATAAT CGTGACAACT AGGCTGTTAC AGATACACCA AGTTAAATTT 3443
GATAGAGAAA CCAGGCTTGG AGCCTCATGT CCATAGGGCA AGAGGAAGAT GCTGAGTGTT 3503
TAAGGTTGGT TTGAGCGAAG AACAATACCT TGTGTCACAA AAATGAAAGG AAAAAAGAAA 3563
AAAGGAAAGA AGGAAAGAAA GAGAGAGAAA GAAAAAGAAA GAAAGAAAAA AAAAAAAAA 3562
INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO:2 i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE
A) LONGUEUR : 1620 paires de base
B) TYPE : acide nucléique
C) NOMBRE DE BRINS : double
D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : homme ix) CARACTERISTIQUE
A) NOM/CLE : ASIC
B) LOCALISATION : 1 .. 1542 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO:2
CCG GTG AGC ATC CAG GCC TTC GCC AGC AGC TCC ACA CTG CAC GGC ATG 48
Pro Val Ser Ile Gln Ala Phe Ala Ser Ser Ser Thr Leu His Gly Met 1 5 10 15
GCC CAC ATC TTC TCC TAC GAG CGG CTG TCT CTG AAG CGG GCA CTG TGG 96
Ala His Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Leu Ser Leu Lys Arg Ala Leu Trp
20 25 30
GCC CTG TGC TTC CTG GGC TCG CTG GCT GTG CTG CTG TGT GTG TGC ACG 144
Ala Leu Cys Phe Leu Gly Ser Leu Ala Val Leu Leu Cys Val Cys Thr
35 40 45
GAG CGT GTG CAG TAC TAC TTC CAC TAc CAC CAT GTC ACC AAG CTC GAC 192
Glu Arg Val Gln Tyr Tyr Phe His Tyr His His Val Thr Lys Leu Asp
50 55 60
GAG GTG GCT GCC TCT CAG CTT ACC TTC CCT GCT GTC ACG CTG TGC AAC 240
Glu Val Ala Ala Ser Gln Leu Thr Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn 65 70 75 80
CTC AAC GAG TTC CGC TTT AGC CAA GTC TCC AAG AAT GAC CTG TAT CAT 288
Leu Asn Glu Phe Arg Phe Ser Gln Val Ser Lys Asn Asp Leu Tyr His
85 90 95
GCT GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTC AAC AAC AGG TAT GAG ATA CCA GAC 336
Ala Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Asn Arg Tyr Glu Ile Pro Asp
100 105 110
ACA CAG ATG GCA GAT GAA AAG CAG CTG GAG ATA CTG CAG GAC AAA GCC 384
Thr Gln Met Ala Asp Glu Lys Gln Leu Glu Ile Leu Gln Asp Lys Ala
115 120 125
AAC TTC CGC AGC TTC AAA CCC AAA CCC TTC AAC ATG CGT GAG TTC TAC 432
Asn Phe Arg Ser Phe Lys Pro Lys Pro Phe Asn Met Arg Glu Phe Tyr
130 135 140
GAC CGA GCT GGG CAC GAC ATT CGA GAC ATG CTG CTC TCC TGC CAC TTC 480
Asp Arg Ala Gly His Asp Ile Arg Asp Met Leu Leu Ser Cys His Phe 145 150 155 160
CGG GGG GAG GTC TGC AGC GCT GAA GAC TTC AAG GTG GTC TTC ACA CGC 528
Arg Gly Glu Val Cys Ser Ala Glu Asp Phe Lys Val Val Phe Thr Arg
165 170 175
TAT GGA AAG TGC TAC ACG TTC AAC TCG GGC CGA AAT GGG CGG CCG CGG 576
Tyr Gly Lys Cys Tyr Thr Phe Asn Ser Gly Arg Asn Gly Arg Pro Arg
180 185 190
CTG AAG ACC ATG AAG GGT GGG ACG GGC AAT GGG CTG GAA ATC ATG CTG 624
Leu Lys Thr Met Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu
195 200 205
GAC ATC CAG CAG GAC GAG TAC CTG CCT GTG TGG GGG GAG ACT GAC GAG 672
Asp Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Val Trp Gly Glu Thr Asp Glu
210 215 220
ACG TCT TTC GAA GCA GGC ATC AAA GTG CAG ATC CAT AGT CAG GAT GAA 720
Thr Ser Phe Glu Ala Gly Ile Lys Val Gln Ile His Ser Gln Asp Glu 225 230 235 240
CCT CCT TTC ATC GAC CAG CTG GGC TTT GGC GTG GCC CCA GGC TTC CAG 768
Pro Pro Phe Ile Asp Gln Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln
245 250 255
ACC TTT GTG GCC TGC CAG GAG CAG CGG CTC ATA TAC CTG CCC CCA CCC 816
Thr Phe Val Ala Cys Gln Glu Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Pro Pro Pro
260 265 270
TGG GGC ACC TGC AAA GCT GTT ACC ATG GAC TCG GAT TTG GAT TTC TTC 864
Trp Gly Thr Cys Lys Ala Val Thr Met Asp Ser Asp Leu Asp Phe Phe
275 280 285
GAC TCC TAC AGC ATC ACT GCC TGC CGC ATC GAC TGT GAG ACG CGC TAC 912
Asp Ser Tyr Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr
290 295 300
CTG GTG GAG AAC TGC AAC TGC CGC ATG GTG CAC ATG CCA GGG GAT GCC 960
Leu Val Glu Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala 305 310 315 320
CCA TAC TGT ACT CCA GAG CAG TAC AAG GAG TGT GCA GAT CCT GCT CTG 1008
Pro Tyr Cys Thr Pro Glu Gln Tyr Lys Glu Cys Ala Asp Pro Ala Leu
325 330 335
GAC TTC CTG GTG GAG AAG GAC CAG GAG TAC TGC GTG TGT GAA ATG CCT 1056
Asp Phe Leu Val Glu Lys Asp Gin Glu Tyr Cys Val Cys Glu Met Pro
340 345 350
TGC AAC CTG ACC CGC TAT GGC AAA GAG CTG TCC ATG GTC AAG ATC CCC 1104
Cys Asn Leu Thr Arg Tyr Gly Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro
355 360 365
AGC AAA GCC TCA GCC AAG TAC CTG GCC AAG AAG TTC AAC AAA TCT GAG 1152
Ser Lys Ala Ser Ala Lys Tyr Leu Ala Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu
370 375 380
CAA TAC ATA GGG GAG AAC ATC CTG GTG CTG GAC ATT TTC TTT GAA GTC 1200 Gln Tyr Ile Gly Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Val 385 390 395 400
CTC AAC TAT GAG ACC ATT GAA CAG AAG AAG GCC TAT GAG ATT GCA GGG 1248
Leu Asn Tyr Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Ile Ala Gly
405 410 415
CTC CTG GGT GAC ATC GGG GGC CAG ATG GGG CTG TTC ATC GGG GCC AGC 1296
Leu Leu Gly Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser
420 425 430
ATC CTC ACG GTG CTG GAG CTC TTT GAC TAC GCC TAC GGG GTC ATT AAG 1344
Ile Leu Thr Val Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ala Tyr Gly Val Ile Lys
435 440 445
CAC AAG CTG TGC CGA CGA GGA AAA TGC CAG AAG GAG GCC AAA AGG AGC 1392
His Lys Leu Cys Arg Arg Gly Lys Cys Gln Lys Glu Ala Lys Arg Ser
450 455 460
AGT GCG GAC AAG GGC GTG GCC CTC AGC CTG GAC GAC GTC AAA AGA CAC 1440
Ser Ala Asp Lys Gly Val Ala Leu Ser Leu Asp Asp Val Lys Arg His 465 470 475 480
AAC CCG TGC GAG AGC CTT CGG GGC CAC CCT GCC GGG ATG ACA TAC GCT 1488
Asn Pro Cys Glu Ser Leu Arg Gly His Pro Ala Gly Met Thr Tyr Ala
485 490 495
GCC AAC ATC GTA CCT CAC CAT CCG GCC CGA GGC ACG TTC GAG GAC TTT 1536
Ala Asn Ile Val Pro His His Pro Ala Arg Gly Thr Phe Glu Asp Phe
500 505 510
ACC TGC TGA GCCCCGCAGG CCGCCGAACC AAAGACCTAG ATGGGGAGGA CTAGGAGAGC 1595
Thr Cys *
514 GAGGGGGCCC CCAGCTGCCT CCTAA 1620
INFORMATION CONCERNANT LA SEO ID NO:3 i) CARACTRERISTIQUE DE LA SEQUENCE
A) LONGUEUR : 1666 paires de base
B) TYPE : acide nucléique
C) NOMBRE DE BRINS : double
D) CONFIGURATION : linéaire ii) TYPE DE MOLECULE : ADN vi) ORIGINE : homme ix) CARACTERISTIQUE
A) NOM/CLE : MDEG
B) LOCALISATION : 127 .. 1663 xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID NO:3
TCTGGCGCGA TGCTTACCTT GCGTTCTCTC CCCTGAACGT CAAGGTTTAA GCAGAGCCCG 60 AGGACTGGGA GCTCTTCTCT GAAATTCGAT CAACCTGAAG CCAGTTGCGG AACTGCACGG 120 GGTCCCG ATG GAC CTC AAG GAA AGC CCC AGT GAG GGC AGC CTG CAA CCT 169
Met Asp Leu Lys Glu Ser Pro Ser Glu Gly Ser Leu Gln Pro
1 5 10
TCT AGC ATC CAG ATC TTT GCC AAC ACC TCC ACC CTC CAT GGC ATC CGC 217
Ser Ser Ile Gln Ile Phe Ala Asn Thr Ser Thr Leu His Gly Ile Arg 15 20 25 30
CAC ATC TTC GTG TAT GGG CCG CTG ACC ATC CGG CGT GTG CTG TGG GCA 265
His Ile Phe Val Tyr Gly Pro Leu Thr Ile Arg Arg Val Leu Trp Ala
35 40 45
GTG GCC TTC GTG GGC TCT CTG GGC CTG CTG CTG GTG GAG AGC TCT GAG 313
Val Ala Phe Val Gly Ser Leu Gly Leu Leu Leu Val Glu Ser Ser Glu
50 55 60
AGG GTG TCC TAC TAC TTC TCC TAC CAG CAT GTC ACT AAG GTG GAC GAA 361
Arg Val Ser Tyr Tyr Phe Ser Tyr Gln His Val Thr Lys Val Asp Glu
65 70 75
GTG GTG GCT CAA AGC CTG GTC TTC CCA GCT GTG ACC CTC TGT AAC CTC 409
Val Val Ala Gln Ser Leu Val Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Leu
80 85 90
AAT GGC TTC CGG TTC TCC AGG CTC ACC ACC AAC GAC CTG TAC CAT GCT 457
Asn Gly Phe Arg Phe Ser Arg Leu Thr Thr Asn Asp Leu Tyr His Ala 95 100 105 110 GGG GAG CTG CTG GCC CTG CTG GAT GTC AAC CTG CAG ATC CCG GAC CCC 505
Gly Glu Leu Leu Ala Leu Leu Asp Val Asn Leu Gln Ile Pro Asp Pro
115 120 125
CAT CTG GCT GAC CCC TCC GTG CTG GAG GCC CTG CGG CAG AAG GCC AAC 553
His Leu Ala Asp Pro Ser Val Leu Glu Ala Leu Arg Gln Lys Ala Asn
130 135 140
TTC AAG CAC TAC AAA CCC AAG CAG TTC AGC ATG CTG GAG TTC CTG CAC 601
Phe Lys His Tyr Lys Pro Lys Gln Phe Ser Met Leu Glu Phe Leu His
145 150 155
CGT GTG GGC CAT GAC CTG AAG GAT ATG ATG CTC TAC TGC AAG TTC AAA 649
Arg Val Gly His Asp Leu Lys Asp Met Met Leu Tyr Cys Lys Phe Lys
160 165 170 GGG CAG GAG TGC GGC CAC CAA GAC TTC ACC ACA GTG TTT ACA AAA TAT 697
Gly Gln Glu Cys Gly His Gln Asp Phe Thr Thr Val Phe Thr Lys Tyr 175 180 185 190 GGG AAG TGT TAC ATG TTT AAC TCA GGC GAG GAT GGC AAA CCT CTG CTC 745
Gly Lys Cys Tyr Met Phe Asn Ser Gly Glu Asp Gly Lys Pro Leu Leu
195 200 205
ACC ACG GTC AAG GGG GGG ACA GGC AAC GGG CTG GAG ATC ATG CTG GAC 793
Thr Thr Val Lys Gly Gly Thr Gly Asn Gly Leu Glu Ile Met Leu Asp
210 215 220
ATT CAG CAG GAT GAG TAC CTG CCC ATC TGG GGA GAG ACA GAG GAA ACG 841
Ile Gln Gln Asp Glu Tyr Leu Pro Ile Trp Gly Glu Thr Glu Glu Thr
225 230 235
ACA TTT GAA GCA GCA GTG AAA GTT CAG ATC CAC AGT CAG TCT GAG CCA 889
Thr Phe Glu Ala Gly Val Lys Val Gln Ile His Ser Gln Ser Glu Pro
240 245 250
CCT TTC ATC CAA GAG CTG GGC TTT GGG GTG GCT CCA GGG TTC CAG ACC 937
Pro Phe Ile Gln Glu Leu Gly Phe Gly Val Ala Pro Gly Phe Gln Thr 255 260 265 270
TTT GTG GCC ACA CAG GAG CAG AGG CTC ACA TAC CTG CCC CCA CCG TGG 985
Phe Val Ala Thr Gln Glu Gln Arg Leu Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Trp
275 280 285
GGT GAG TGC CGA TCC TCA GAG ATG GGC CTC GAC TTT TTT CCT GTT TAC 1033
Gly Glu Cys Arg Ser Ser Glu Met Gly Leu Asp Phe Phe Pro Val Tyr
290 295 300
AGC ATC ACC GCC TGT AGG ATT GAC TGT GAG ACC CGC TAC ATT GTG GAA 1081
Ser Ile Thr Ala Cys Arg Ile Asp Cys Glu Thr Arg Tyr Ile Val Glu
305 310 315
AAC TGC AAC TGC CGC ATG GTT CAC ATG CCA GGG GAT GCC CCT TTT TGT 1129
Asn Cys Asn Cys Arg Met Val His Met Pro Gly Asp Ala Pro Phe Cys
320 325 330
ACC CCT GAG CAG CAC AAG GAG TGT GCA GAG CCT GCC CTA GGT CTG TTG 1177
Thr Pro Glu Gln His Lys Glu Cys Ala Glu Pro Ala Leu Gly Leu Leu 335 340 345 350
GCG GAA AAG GAC AGC AAT TAC TGT CTC TGC AGG ACA CCC TGC AAC CTA 1225
Ala Glu Lys Asp Ser Asn Tyr Cys Leu Cys Arg Thr Pro CyS Asn Leu
355 360 365
ACC CGC TAC AAC AAA GAG CTC TCC ATG GTG AAG ATC CCC AGC AAG ACA 1273
Thr Arg Tyr Asn Lys Glu Leu Ser Met Val Lys Ile Pro Ser Lys Thr
370 375 380
TCA GCC AAG TAC CTT GAG AAG AAA TTT AAC AAA TCA GAA AAA TAT ATC 1321
Ser Ala Lys Tyr Leu Glu Lys Lys Phe Asn Lys Ser Glu Lys Tyr Ile
385 390 395
TCA GAG AAC ATC CTT GTT CTG GAT ATA TTT TTT GAA GCT CTC AAT TAT 1369
Ser Glu Asn Ile Leu Val Leu Asp Ile Phe Phe Glu Ala Leu Asn Tyr
400 405 410
GAG ACA ATT GAA CAG AAG AAG GCG TAT GAA GTT GCT GCC TTA CTT GGT 1417
Glu Thr Ile Glu Gln Lys Lys Ala Tyr Glu Val Ala Ala Leu Leu Gly 415 420 425 430
GAT ATT GGT GGT CAG ATG GGA TTG TTC ATT GGT GCT AGT ATC CTT ACA 1465
Asp Ile Gly Gly Gln Met Gly Leu Phe Ile Gly Ala Ser Ile Leu Thr
435 440 445
ATA CTA GAG CTC TTT GAT TAT ATT TAT GAG CTG ATC AAA GAG AAG CTA 1513
Ile Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Tyr Glu Leu Ile Lys Glu Lys Leu
450 455 460
TTA GAC CTG CTT GGC AAA GAG GAG GAT GAA GGG AGC CAC GAT GAG AAT 1561
Leu Asp Leu Leu Gly Lys Glu Glu Asp Glu Gly Ser His Asp Glu Asn
465 470 475
GTG AGT ACT TGT GAC ACA ATG CCA AAC CAC TCT GAA ACC ATC AGT CAC 1609
Val Ser Thr Cys Asp Thr Met Pro Asn His Ser Glu Thr Ile Ser His
480 485 490
ACT GTG AAC GTG CCC CTG CAG ACG ACC CTG GGG ACC CTG GAA GAA ATA 1657
Thr Val Asn Val Pro Leu Gln Thr Thr Leu Gly Thr Leu Glu Glu Ile 495 500 505 510
GCC TGC TGA 1666
Ala Cys *
512

Claims (20)

REVENDICATIONS
1) Protéine constituant un canal cationique neuronal de mammifère sensible à l'amiloride et activé par les protons.
2) Protéine selon la revendication 1 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ IS No : 1 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
3) Protéine selon l'une des revedications 1 ou 2 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID
No : 2 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
4) Protéine selon l'une des revedications 1 ou 2 dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID
No : 3 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine.
5) Canal cationique hybride constitué de l'association d'une première protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 avec une seconde protéine constituant un canal ionique activé par les protons.
6) Canal cationique hybride selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite seconde protéine est une protéine constituant un canal ionique activé par les protons selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7) Canal cationique hybride selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il est constitué de l'association de deux protéines constituant un canal ionique activé par les protons, la première desdites protéines ayant la séquence en acides aminés qui est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ IS No : 1 ou un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine, et la seconde desdites protéines ayant la séquence en acides aminés qui est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3.
8) Anticorps monoclonal ou polyclonal dirigé contre au moins une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et/ou contre au moins un canal hybride selon l'une quelconque des revendications 5 à 7.
9) Molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine constituant un canal cationique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
10) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 9 comprenant ou constituée par la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 123 et 1700 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 1, ou sa séquence complémentaire.
11) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 9 comprenant ou constituée par la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 1 et 1542 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 2, ou sa séquence complémentaire.
12) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 9 comprenant ou constituée par la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 127 et 1663 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No : 3, ou sa séquence complémentaire.
13) Vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, avantageusement associée à des séquences de contrôle.
14) Procédé de production d'une protéine constituant un canal ionique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13 dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal ionique,
- à isoler, par tous moyens appropriés les protéines constituant les canaux ioniques.
15) Procédé d'expression d'une protéine constituant un canal ionique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans hôte cellulaire, caractérisé en ce qu'il consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique selon l'une des revendications 9 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13 dans ledit hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production de la protéine constituant le canal ionique.
16) Procédé selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que l'hôte cellulaire est choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes.
17) Cellule transformée exprimant des canaux cationiques neuronaux de mammifère sensibles à l'amiloride et activés par les protons, obtenue par le procédé selon l'une des revendications 14 à 16.
18) Procédé de criblage de substances capables de moduler l'activité de canaux ioniques neuronaux de mammifère, caractérisé en ce que l'on met en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules selon la revendication 17, puis l'on mesure, par tous moyens appropriés, les effets éventuels de ladite substance sur les courants des canaux cationiques sensibles à l'amiloride et activés par les protons.
19) Procédé selon la revendication 18 appliqué au criblage de substances capables de moduler la perception de l'acidité, tant en ce qui concerne la nociception que la transduction du goût.
20) Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins une protéine constituant un canal ionique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un canal hybride selon l'une quelconque 5 à 7 ou encore un anticorps selon la revendication 8.
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