FR2699922A1 - Polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes vecteurs et hôtes les exprimant, et application au criblage des médicaments. - Google Patents

Abstract

Polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninerqique, médicaments à base de ces polypeptides, fragments nucléotidiques codant pour eux, sondes de détection de ces fragments, vecteurs et hôtes exprimant ces polypeptides, et application au criblage de médicaments. Nouveaux polypeptides ayant une activité de nouveaux récepteurs sérotoninergiques 5HT6 ou 5HT7 et fragments d'acides aminés codant pour ces polypeptides. Des hôtes cellulaires transformés par des vecteurs dans lesquels ont été insérés ces fragments expriment ces polypeptides. Applications de ces polypeptides et fragments à la formation d'anticorps, à la réalisation de médicaments, de sondes nucléotidiques de diagnostic et de détection, du criblage de médicaments destinés, notamment, au traitement d'affections neurologiques ou gastro-entérologiques et à l'identification de tissus ou cellules.

Description

La présente invention a trait à des polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique.

Elle a également trait à des séquences de nucléotides, et notamment d'ADN, codant pour ces polypeptides ainsi qu'à des vecteurs contenant lesdites séquences et à des cellules transformées pour exprimer lesdites séquences et notamment les gènes codant pour les récepteurs contenant1 ou constitués par, lesdits polypeptides, ces cellules permettant d'étudier l'activité d'agoniste ou antaqoniste desdits récepteurs.

L'invention a également trait à des sondes nucléotidiques susceptibles de se fixer par hybridation sur lesdites séquences ou lesdits gènes codant pour lesdits polypeptides et destinées au diaqnostic d'affections se traduisant par une modification qualitative ou quantitative de la formation ou de l'activité desdits récepteurs, chez l'homme ou l'animal, et notamment d'affections neurologiques, psychiatriques, qastro-entérologiques ou neuro-endocriniennes.

L'invention a également trait à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, humains ou non, dirigés contre lesdits polypeptides.

Elle a également trait à des moyens de criblage de candidats médicaments, permettant notamment d'étudier l'affinité de substances candidates pour lesdits polypeptides.

Enfin elle a trait à des médicaments, notamment pour le traitement des affections psychiatriques, neurologiques, qastro-entéroloviques ou neuroendocriniennes, et contenant des substances ayant une affinité élevée pour lesdits polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique ou encore des substances ayant une activité sur des cellules transfectées par lesdites séquences d'ADN codant pour lesdits polypeptides.

Elle a également trait à des médicaments actifs sur l'un, certains, ou la totalité des récepteurs sérotoninergiques déjà identifiés et/ou ceux décrits dans la présente invention et notamment à des médicaments agonistes ou antagonistes de la sérotonine.

I1 était admis jusqu'alors que les divers effets de la sérotonine résultaient de son interaction avec différentes classes de récepteurs communément désignés sous les noms de récepteurs 5HT1a, 5HTlb, 5HTlc, 5HTld, 5HTle, 5HT2, 5HT3 et 5HT4. Parmi ceux-ci, les séquences des récepteurs SHTla, 5 5HTlb, 5HTlc, 5HTld, 5HTle, 5HT2 et 5HT3 sont connues (Zifa et Fillion, Pharmacol. Reviews, 44, 401-457, 1992 ; McAllister et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 5517-5521, 1992).A l'exception du récepteur 5HT3, ces récepteurs appartiennent à la famille des récepteurs comportant sept domaines transmembranaires couplés à une protéine G et présentant un certain degré d'homologie avec les récepteurs de la famille des rhodopsines qui sont exprimés par les photorécepteurs de la rétine.

Ces récepteurs possèdent un profil pharmacoloqique particulier et sont couplés à différents messagers intracellulaires. Les récepteurs 5HTla, 5HTlb, 5HTid, 5HTle sont couplés négativement à l'adénylate cyclase alors que les récepteurs 5HTlc et 5HT2 sont couplés positivement à la phospholipase C conduisant à l'hydrolyse de phosphatidyl inositols. Le récepteur 5HT4 dont la séquence protéique n'est pas encore connue serait couplé positivement à l'adénylate cyclase.

L'existence de récepteurs sérotoninergiques distincts de ceux mentionnés ci-dessus, couplés positivement à l'adénylate cyclase et distincts du récepteur 5HT4, avait été suspectée par différents auteurs sur des observations indirectes portant sur des préparations biologiques complexes, mais ils n avaient jamais été isolés, ni identifiés quant à leur structure, ni entièrement définis par leurs propriétés pharmacologiques.

L'invention des nouveaux polypeptides ci-dessus a permis de découvrir de nouveaux récepteurs sérotoninergiques qui seront désignés, ci-après, par 5HT6 et 5HT7.

L'invention a pour objet de nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique (5HT6 ou 5HT7) choisis dans le qroupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après - Ensemble 1 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 448 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT6, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID n" 1 de la liste de séquences annexée ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 448 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fraqment soit capable de lier la sérotonine, ses agonistes ou ses antagonistes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 448 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 448 acides aminés mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7 ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergique homoloque du récepteur 5HT6.

- Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 127 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT7, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID N" 2 de la liste de séquences annexée ou des fragments peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que
- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 127 acides aminés ou tout site voisin sur un polypeptide enqlobant ladite séquence de 127 acides aminés et codé par un qène exprimant le récepteur 5HT7, et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sérotonine à ses agonistes ou antagonistes,
- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un qène exprimant le récepteur 5HT7 mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6,
- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7 mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninergiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6 ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninerique homoloque du récepteur 5HT7.

Dans la description qui suit, on définit par 5HT6 et 5HT7, non seulement les récepteurs de rat mais les récepteurs sérotoninergiques homoloques, humains ou non humains.

De préférence, les polypeptides de l'ensemble 1 contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 448 acides aminés, dont la présence est nécessaire, quand les polypeptides sont présentés sur une membrane cellulaire en présence de sérotonine tritiée et en présence d'un agoniste ou d'un antagoniste de la sérotonine, pour que l'affinité apparente desdits antagonistes ou agonistes corresponde à celle qui est indiquée dans le tableau 1 ci-dessous.

On voit notamment que l'affinité de la sérotonine pour les polypeptides du récepteur 5HT6 de l'invention est supérieure à celle du LSD.

On voit également, sur le tableau 1, que l'affinité du polypeptide récepteur exprimé dans les cellules est plus importante pour le spipérone que pour la miansérine.

Les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés en étant isolés, ou fixés sur des supports, d'une façon tout à fait classique, ou encore réunis à des séquences d'acides aminés sans relation avec les récepteurs 5HT6 ou 5HT7. Ils peuvent être glycosylés ou non et comporter des ponts disulfures.

La présente invention a également pour objet les compositions ayant une teneur notable en de tels polypeptides, par exemple des teneurs obtenues par expression dans un hôte recombinant, lesdits polypeptides pouvant éventuellement être présents sous forme de membranes cellulaires enrichies en polypeptides.

La présente invention a également pour objet les acides nucléiques contenant ou constitués par les séquences de nucléotides codant pour un quelconque des polypeptides selon l'invention.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent comprendre ou consister dans la séquence complète, c'est-àdire le gène, codant pour les récepteurs 5HT6 ou 5HT7 chez l'homme ou chez l'animal. Des acides nucléiques selon l'invention sont notamment des acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID n" 1 ou n" 2 ou des fragments de ces sequences placés dans le cadre de lecture, ainsi que les séquences homoloques, notamment chez l'homme.

Parmi les acides nucléiques selon l'invention, un acide nucléique particulièrement intéressant est celui constitué par la séquence s'étendant du nucléotide en position 135 à celui en position 1 478 dans l'identificateur SEQ ID n" 1 ou par ses homologues chez l'homme ou chez les animaux. Les acides nucléiques comprennent également les fragments codants pour les polypeptides plus courts définis précédemment.

Outre les variations de séquences nucléotidiques que l'on peut observer lorsque l'on passe des séquences d'ADN de rat représentées sur les identificateurs n" 1 et n" 2 à des séquences homologues chez l'homme ou d'autres espèces animales, les acides nucléiques selon l'invention peuvent comporter les variations propres à la dégénérescence du code ainsi que des mutations localisées dans la mesure où les acides nucléiques variants s'hybrident avec les sondes susceptibles de s'hybrider, de façon spécifique, avec les séquences ID n" 1 ou ID n" 2.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse chimique classique d'acide nucléique, par réplication dans des vecteurs qui les contiennent ou par tout autre moyen, et notamment multiplication par le procédé dit PCR à partir d'une faible quantité d'acide nucléique selon l'invention.

L'invention a également pour objet les vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et contenant un acide nucléique selon l'invention, tels que des plasmides, phages ou virus contenant une ou plusieurs séquences selon l'invention en un site non essentiel pour la réplication.

Les vecteurs selon l'invention peuvent contenir, le cas échéant, les éléments nécessaires pour l'expression dans un hôte cellulaire tels que promoteur, codon d'initiation, terminateur, séquence si-nal ou séquence d'ancrage ou tout autre élément utile de régulon.

L'invention a également pour objet les hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant selon l'invention et susceptibles d'exprimer la séquence codante selon l'invention pour la synthèse d'un polypeptide selon l'invention. Ces hôtes peuvent être des procaryotes, tels que par exemple E. colt, ou eucaryotes, par exemple des cellules de levure telles que S. cerevisiae ou des cellules de mammifère, par exemple cellules CHO.

L'invention a également pour objet les anticorps monoclonaux ou polyclonaux diriqés contre un polypeptide selon l'invention. Ces anticorps monoclonaux ou polyclonaux sont obtenus par induction à tartir d'un polypeptide selon l'invention et sont spécifiques des polypeptides selon l'invention, tout en étant susceptibles, ou non, de reconnaître d'autres récepteurs sérotoninergiques.

L'obtention de ces anticorps peut s'effectuer de façon classique, soit par injection d'un polypeptide selon l'invention à un organisme et recueil du sérum avec éventuellement purification des anticorps spécifiques, soit pour les anticorps monoclonaux, par les techniques classiques de fusion cellulaire formant des hybridomes.

Les anticorps selon l'invention sont utiles pour le diaqnostic, par réaction anticorps-antigène mise en évidence à l'aide d'une technique de révélation classique, pour diaqnostiquer des proliférations pathologiques de cellules exprimant le récepteur 5HT6 ou 5HT7.

L'invention a également pour objet les sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un des acides nucléiques selon l'invention ou avec leurs séquences complémentaires ou
ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur 5HT6 ou du récepteur 5HT7, et qui ne s'hybrident pas avec les séquences nucléiques ou les ARN correspondants des autres récepteurs sérotoninerqiques décrits ci-dessus.

D'une façon en soi connue, on préfère que les sondes comportent au moins 10, et de préférence au moins 15 à 17 acides nucléiques.

Les sondes selon l'invention sont utiles pour le diagnostic d'affections neurologiques, psychiatriques, gastro-entéroloqiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives des récepteurs 5HT6 ou 5HT7, y compris pour la recherche d'anomalies génétiques à ce niveau.

Les sondes sont utilisées de façon classique en étant mises en contact, dans les conditions usuelles, avec des préparations présentant des acides nucléiques de cellules suspectées de présenter une anomalie définie ci-dessus.

En particulier, les sondes peuvent être utilisées pour détecter une expression pathologique de l'un ou l'autre des récepteurs 5HT6 ou 5HT7 en révélant la présence de son
ARN messager.

De façon avantageuse pour l'expression en cellules eucaryotes, on peut utiliser le promoteur endogène des récepteurs sérotoninerqique ou des promoteurs viraux usuels, par exemple virus SV40 ou virus du sarcome de Rous.

Pour l'expression dans les bactéries, notamment E.

Coli, on peut insérer le gène sous le contrôle d'un promoteur usuel, par exemple promoteur de l'opéron lactose ou de l'opéron tryptophane.

L'invention a également pour objet un procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de
Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine, et psychiatriques telles que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire, ou qastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires.

Le criblage d'un médicament peut notamment utiliser la détection de la capacité d'une molécule sérotoninergique à se comporter comme liqand vis-à-vis d'un polypeptide selon l'invention, et consiste, par exemple, à mettre en contact, dans un milieu convenable, la molécule sérotoninergique avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour le polypeptide et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide, de manière telle que la liaison spécifique du liqand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimée, par exemple en détectant l'éventuel complexe ligand-polypeptide Ce procédé peut également comprendre la mesure d'une réponse induite par la liaison avec la cellule, telle que par exemple la production d'AMP cyclique de façon à permettre de différencier les molécules sérotoninergiques qui se comportent comme antagonistes et celles qui se comportent comme agonistes, et même de définir le caractère relatif de ces dernières.

Dans ce but de criblaqe, on peut également utiliser un procédé déterminant l'affinité d'un polypeptide de l'invention pour des ligands déterminés, dans lequel on cultive un hôte cellulaire transformé, conformément à l'invention, pour exprimer et présenter dans sa membrane le récepteur 5HT6 ou 5HT7 ou un polypeptide correspondant, après quoi on met la culture cellulaire en contact avec le ligand déterminé et on vérifie s'il se forme une liaison spécifique entre les hôtes cellulaires et les ligands, notamment par des tests de radioliaison et de préférence, de mesure du taux de production ou de libération d'un indicateur convenable tel que AMP cyclique, ou ions intracellulaires, ces derniers tests permettant de distinguer et de définir les agonistes et leur caractère partiel ainsi que les antagonistes.

Ce procédé permet éqalement de déterminer les fragments polypeptidiques selon l'invention, par exemple ceux comportant une partie de la séquence de 448 acides aminés SEQ ID N" 1, et qui comprennent les sites opérationnels permettant la liaison et/ou l'induction des réponses cellulaires précités.

On peut également identifier ainsi des cellules ou tissus exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide selon l'invention, ces cellules ou tissus étant ensuite utilisables pour servir à la mise au point ou au criblage de médicaments ou de ligands interaqissant avec les polypeptides selon l'invention.

L'invention a également pour objet des médicaments contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance active sur un polypeptide selon l'invention ayant une activité de récepteur 5HT6 ou 5HT7 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

L'invention a également pour objet des médicaments, contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur les autres récepteurs sérotoninergiques mais non active sur l'un au moins des récepteurs 5HT6 et 5HT7.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif.

Dans cette description, l'identificateur de séquence SEQ ID N" 1 représente la séquence d'un fragment d'ADN de 1661 bases, dont 448 codons, repérés sur la séquence codent pour un polypeptide de 448 acides aminés constituant un récepteur de la sérotonine désigné par 5HT6.

La séquence n" 2 représente un fragment d'ADN, dont 127 codons codent pour un polypeptide de 127 acides aminés constituant un fragment du récepteur 5HT7 de la sérotonine.

Les séquences précitées correspondent à des acides nucléiques chez le rat.

Les séquences nucléiques correspondantes chez d'autres mammifères et chez l'homme peuvent être obtenues par hybridation à partir d'une librairie ou d'une banque d'ADNc avec une sonde constituée par tout ou partie des séquences représentées, puis séquençage d'une façon tout à fait classique des fragments ainsi reconnus.

Clonage des récepteurs 5HT6 et 5HT7 de la sérotonine
1. Clonage du récepteur 5HT7
On a criblé une banque d'ADNc de cerveau de rat dans des conditions de stringence basse avec une sonde ADN marquée au 32p et correspondant à la séquence nucléotidique codant pour le récepteur de la substance P de rat. Dans ces conditions, un clone (hSP45) s'hybride fortement avec cette sonde. La séquence nucléotidique du fragment d'ADN (1 124 pb) ainsi isolé montre que cet ADNc comporte une séquence codant pour un peptide de 127 acides amines codant pour les régions MB6, MB7 et NH2 terminales d'une protéine et présentant des homoloqies avec la famille des récepteurs homologues à la rhodopsine.

2. Clonage du récepteur 5HT6
Un fragment d' ADI\J de ce clone (nucléotide 8 au nucléotide 539) est alors marqué au 32p, puis utilisé pour cribler une banque d'ADNc d'hypothalamus de rat (Stratagene) dans des conditions de stringence élevée. Douze clones sont alors isolés et analysés par analyse de restriction par les techniques de Southern et les clones possédant les inserts les plus longs sont sélectionnés. L'un d'eux, appelé ÂHPT3, comprend la séquence nucléotidique 404 à 1 661 de la séquence de la figure 1. Une sonde ADN marquée au 32p, située entre les nucléotides 404 et 607 est utilisée pour cribler une bande génomique de rat, coupée partiellement avec l'enzyme HaeIII. Un clone hybride fortement avec la sonde et un fragment positif, EcoRI-Hind III, de 6,5 kb est subcloné en plasmide (PGEM 4Z). Une séquence nucléotidique allant du nucléotide 1 au nucléotide 682 de la figure 1 est ainsi isolée et séquencée. Des amorces nucléotidiques (amorce 1 * 5'-GGAGATCTCCATTGTGCAGTCTCAGCCAATGA-3', située en aval du codon stop TGA de la figure 1, et amorce 2 5'-AAA AGC TTG GCG GGG TCG CCG GCT CCAT-3', située en amont de la première méthionine) sont alors synthétisées (synthétiseur d'ADN PCR-Mate.391A, Applied Biosystems).

Elles sont ensuite utilisées dans la technique de RT-PCR comme suit. On synthétise un ADNc monobrin en utilisant de la reverse transcriptase AMV (20U, Boehrinqer) et du poly(A) + ARNm (2 pg) d'hypothalamus de rat et l'amorce 1 décrite ci-dessus. Cette matrice est ensuite amplifiée (Kawazaki E.S. et al. 89-97 , "PCR Technoloqy"; éd. Erlich
H.A. Stockholm Press, 1989) en utilisant l'amorce 2 (75 mM de chacun) pendant 35 cycles comme suit (94,5"C 1 minute 30 ; 56"C, 1 minute 30 et 72 C, 3 minutes) avec 5U d'ADN polymérase Taq (Perkin Elmer Cetus).

Une bande d'ADN de taille prévue 1,5 kb est extraite après électrophorèse sur gel d'aqarose et digérée avec HindIII et Bql II, puis subclonée dans un plasmide pGEM 4Z. Le séquençage de plusieurs plasmides montre que la séquence obtenue est identique à la séquence délimitée par les amorces 1 et 2 de l'indicateur SEQ ID N 1.

3. Expression du récepteur 5HT6 dans des cellules
CHO.

METHODE
Les vecteurs d'expression dérivent du plasmide pSV
D2 (Giros, B. et al., Nature 342. 923-926, 1989). Le vecteur pour exprimer le récepteur 5HT6 est obtenu en remplaçant le fragment de restriction HindIII-BglII de pSVD2 par un fragment de restriction HindIII-BglII du clone RT-PCR obtenu ci-dessus, conduisant au plasmide pSV 5HT6. Ces constructions sont cultivées, puis purifiées sur gradient de chlorure de césium (Sambrook J. et al., Molecular cloning a laboratory manual. C. Nolan, ed., Cold Sprinq Harbor
Laboratory Press, 1989) et transfectées (Graham, F.L. et al., Virol. 52, 456-467, 1973) à des cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO-K1), déficientes en dihydrofolate réductase.Les transfectants stables sont sélectionnés dans un milieu de culture (Dubelcco's Modified Eagle medium) sans hypoxanthine et sans thymidine.

L'expression du récepteur 5HT6 est mise en évidence par la liaison de la sérotonine- H à des mémbranes de cellules transfectées ; selon la technique de Peroutka et
Snyder (Peroutka S.J. et Snyder S.L.; Mol. Pharmacol., 16, 687-699, 1979). Les expériences de liaison sont effectuées dans un tampon Tris-HCl 50mM pH = 7.6 (volume total 500 iil) contenant CaCl2 4 mM, 0,1 % d'acide ascorbique, parqyline 10 5M, et de la sérotonine-3H à une concentration de 1 à 2 nM.

RESULTATS
Les récepteurs 5HT6 ont été exprimés dans des cellules CHO qui, normalement, n'ont pas de sites de liaison vis-à-vis de la sérotonine-3H.

Dans des clones transfectés de cellules CHO, exprimant ces sites en permanence les valeurs de KD de la sérotonine sont de 1 nM pour le récepteur 5HT6 et les valeurs Bmax (Bmax représentant la concentration maximale en récepteur 5HT6) sont d'environ 1 pmol/mg de protéine de membrane.

Le tableau 1 indique clairement que le gène transfecté dans les cellules CHO code pour un récepteur sérotoninergique comme l'indique la forte affinité de la sérotonine et de ses dérivés tels que la 5-méthoxytryptamine. Cependant, la pharmacologie de ce récepteur 5HT6 ne peut en aucun cas être confondue avec celle d'un récepteur SHT1A (le 8-OH-DPAT présente une affinité inférieure au nanomolaire vis-à-vis de ce récepteur), 5HT2 (le spipérone et la kétansérine présentent des affinités de l'ordre du nM) ou 5HT4 (1'ICS 205 930 présente une affinité de 0.5 nM sur le récepteur 5HT3 et de 300 nM sur le récepteur 5HT4) ou une autre classe de récepteurs sérotoninergiques clonés à ce jour.

Caractérisation des transcrits du qène du récepteur 5HT6 dans plusieurs tissus
Des ARNs poly(A)+ sont préparées à partir de plusieurs tissus cérébraux ou périphériques de rat ou de cobaye (Chirqwin et coll., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979; Aviv et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 1408-1412, 1972). Des échantillons (8 llq) sont dénaturés, soumis à électrophorèse sur arrose, transférés sur des membranes de nitrocellulose et hybridés (Traiffort et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., 89, 2649-2653, 1992) en utilisant un fragment de 1 106 pb obtenu par amplification d'ADN à l'aide d'amorces oligonucléotidiques, puis marqué au 32p par la technique de "nick-translation". Ce fragment marqué correspond aux domaines transmembranaires 1 à 7 et est utilisé à raison de 14 z. 106 dpm/ml. Les membranes sont exposées pendant 7 jours à - 80"C avec des écrans amplificateurs. Chez le rat, deux transcrits (3,9 et 3,2 kb) sont observables dans les tissus cérébraux étudiés. L'hypothalamus, le tronc et l'hippocampe sont les régions qui semblent exprimer les plus fortes densités de transcrits du récepteur 5HT6. Chez le cobaye, deux transcrits (3,8 et 3,0 kb) sont également observables dans la pupart des réqions cérébrales étudiées.Le thalamus et le tronc semblent être les régions qui expriment les plus fortes densités de transcrits du récepteur 5HT6.

Réponses induites par la sérotonine dans les cellules CHO transfectées par le récepteur 5HT6
Accumulation d'AMPc : selon la technique décrite dans Traiffort E. et coll., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2644-2653, 1992), les cellules cultivées sur plaques de 96 puits sont lavées, puis incubées en présence de concentrations croissantes de sérotonine pendant 10 minutes à 37 C. L'AMPc est extrait, puis analysé par dosage radioimmunologique (New Enqland Nuclear). La sérotonine (300 nM) induit une stimulation d'AMPc importante (1,22 i 0.06 pmol/puits) comparativement au taux basal en absence de serotonine (0,07 # 0,03 pmol/puits). Cette mesure permet de déterminer le caractère agoniste d'une molécule.

TABLEAU 1 pharmacologie du récepteur 5HT6 exprimé dans des
cellules CHO
AGENT Ki (nM)
SEROTONINE 0.5
ICS 205930 > 30000 METOCLOPRAMIDE > 30000
SUMATRIPTAN 450 .METERGOLINE 43 8-OH-DPAT 60
LSD 8
METHYSERGIDE 40
SPIPERONE 19
MANSERINE 66
HALOPERIDOL > 300
CHLORPROMAZINE 51
LISURIDE 5
CLOZAPINE 31
SULPIRIDE 3200 CLORIMIPRAMINE 200
AMITRIPTILINE 100 7-OH-DPAT 720
BUFOTENINE 20 5-METHOXYTRYPTAMINE 0.66 DIHYDROERGOTAMIME 15
RU 24969 14
KETANSERINE > 2000
CYPROHEPTADINE 70
ANNEXE 1
LISTE DES SEQUENCE
SEQ ID n 1
Longueur de ia séquence : 1 661 paires de bases
Type de molécule séquence: ADNc monobrin
Sequence nucléotidique Ü récepteur 5HT6.

ccccccagtggccagccccggaccccatggctgggccgcgcggagccgagcgggcaaggtgaatccagccccggggccggctgccggagcgcttggcggggtcgccggctccatgg 116
gcagcggcgctcggcacg ATG ATG GAC GTT AAC AGC AGC OGC CGC CCC GAC CTC TAC GGC CAT CTC CGT TCA CTC ATC CTG CCG GAG GTG 206
M M D V N S S G R P D L Y G H L R S L I L P E V 24
GGG CGC GGG CTG CAG GAC CTG AGC CCC GAC GGT GGC GCC CAC CCT GTG GTG AGC TCC TGG ATG CCG CAC CTG CTG AGT GGC TTC CTA 293
G R G L G D L S P D G G A H P V V S S W M P H L L S G F L 53
GAG GTG ACG GCT AGC CCG GCG CCC ACC TGG GAC GCG CCA CCG GAC AAT GTC TCA GGC TGC GGG GAG CAG ATC AAC TAT GGC AGA GTG 380
E V T A S P A P T W D A P P D N V S G C G E Q I N Y G R V 82
GAG AAA GTT GTG ATC GGC TCC ATC CTG ACG CTC ATC ACG CTG CTG ACG ATC GCA GGC AAC TGC CTG GTG GTG ATC TCG GTG TGC TTC 467
E K V V I G S I L T L I T L L T I A G N C L V V I S V C F 111
GTC AAG AAG CTC CGC CAG CCC TCC AAC TAC CTG ATT GTG TCC CTG GCG CTG GCT GAC CTC TCG GTG GCC GTG GCG GTC ATG CCT TTC 554
V K K L R Q P S N Y L I V S L A L A Q L S V A V A V M P F 140
GTT AGT GTC ACC GAC CTC ATC GGG GGC AAG TGG ATC TTC GGC CAC TTC TTC TGC AAC GTC TTC ATC GCC ATG GAC GTC ATG TGC TGC 641
V S V T D L I G G K W I F G R F F C N V F I A N D V N C C 169
ACG GCC TCG ATC ATG ACC CTG TGC GTG ATC AGC ATC GAC AGG TAC CTT GGG ATC ACG AGA CCC CTC ACG TAC CCG GTG AGG CAA AAT 728
T A S I M T L C V I S I D R Y L G I T R P L T Y P V R Q N 198
GGG AAA TGT ATG GCC AAA ATG ATT CTG TCG GTC TGG CTG CTC TCT GCC TCC ATC ACC TTA CCT CCT CTC TTC GGA TGG GCT CAG AAT 815
G K C H A K M I L S V W L L S A S I T L P P L F G W A Q N 227
GTG AAC GAT GAC AAA GTG TGC TTG ATC AGC CAG GAT TTT GGC TAC ACG ATC TAC TCC ACT GCG GTG GCG TTT TAT ATC CCC ATG TCG 902
V K D D K V C L I S Q D F G Y T I Y S T A V A F Y I P K S 256
GTC ATG CTG TTC ATG TAC TAT CAG ATT TAC AAG GCC GCC AGG AAG AGT GCA GCC AAA CAC AAG TTC CCA GGC TTC CCA CGC GTG CAG 989
V M L F M Y Y G I Y K A A R X S A A K H K F P G F P R V G 285
CCG GAG AGT GTC ATC TCC CTG AAT GGT GTG GTG AAG CTC CAG AAG GAG GTG GAA GAG TGT GCG AAC CTT TCG AGA CTG CTC AAA CAC 1076
P E S V I S L N G V V K L Q K E V E E C A N L S R L L K H 314
GAA AGG AAA AAC ATC TCC ATC TTC AAG GGG GAA CAG AAA GCA GCC ACT ACC TTG GGG ATC ATC GTG GGA GCC TTC ACT GTG TGC TGG 1163
E R K N I S I F K R E Q X A A T T L G I I V G A F T V C V 343
CTG CCG TTT TTC CTC TTG TCC ACA GCC CGC CCC TTT ATC TGT GGC ACC TCC TGT AGC TGC ATT CCT CTG TGG GTG GAG AGG ACA TGT 1250
L P F F L L S T A R P F I C G T S C S C I P L W V E R T C 372
CTG TGG CTG GGC TAT GCA AAC TCT CTC ATT AAT CCT TTT ATA TAT GCC TTC TTC AAC CGG GAC CTG AGG ACC ACC TAT CGT AGC CTA 1337
L W L S Y A N S L I N P F I Y A F F N R D L R T T Y R S L 401
CTC CAG TGC CAG TAC CGG AAT ATC AAC CGG AAG CTC TCT GCT GCA GGC ATG CAT GAA GCC CTG AAA CTT GCT GAG AGG CCC GAG AGA 1424
L Q C Q Y R N I N R K L S A A G M H E A L K L A E R P E R 430
TCC GAG TTT GTG CTA CAA AAC TCT GAC CAC TGT GGG AAA AAG GOT CAT GAT ACA tgatccagagtggaaccctggatgaattcatgcagaacaggtg 1521
S E F V L Q N S D H C G K K G H D T 448
gacacaacacaacgaaatcattggctgagactgcacaatggaacatggcttctgtcttcttggcatggcttgaaatgtcacgaggggtgatctgttgtacaaagtgtatcatgggg 1637
agatggcaacctctcccttttttt 1661
SEQ ID n
Longueur de la séquence 1124 paires de bases
Type de nolécule séquence . ADlTc nbrin séquence partielle du récepteur 5HT7
gt GCC AGT TTC TCT CGT CTG CTT AAG AAC GAC AGG AAA 38
A S F S R L L K N D R K 12
AAC ATC TCC ATC TTC AAG CGG GAG CAG AAG GCG GCC GCT 77
N I S I F K R E Q K A A A 25
ACG TTG GGG ATC GTT GTG GGG GCC TTC TCT GTC TGC TGG 116
T L G I V V G A F S V C W 38
CTG CCC TTC TTC CTG ATG TCC ACG GCC AGG CCC TTC ATC 155
L P F F L M S T A R P F I 51
TGT GGG GTA GAA TGT AGC TGC GTT CCC CTC TGG GTG GAA 194
C G V E C S C V P L W V E 64
AGG TTT CTC CTC TGG CTG GGC TAC GCC AAC TCC CTC ATC 233
R F L L W L G Y A N S L I 77
AAC CCA TTC ATC TAT GCC TTC TTC AAC AGG GAC CTG AGG 272
N P F I Y A F F N R D L R 90
ACC ACC TAC CGT AAC ATC TTG CTC TGC AGG TAC AGG AAC 311 T T Y R N I L L C R y R N 103
ATT AAC CGC AAA CTC TCC GCC GCC TGC ATG CAC GAG GCC 350
I N R K L S A A C M H E A 116
ATC AAA CTG GCT GAG AGG CCG GAT CTG GAG ATC tagaaca 390
I K L A E R P D L E I 127
gtgtttcttaaacttctctaacactttqctacacaagqaccaqcaaactatg 442
gtttagatcagggtgtcaaacatttgactgcggcctgtgggtggtttgagta 494
ataaaaaaaaactcaatgtagtgataatggacttacattttacagtctcttc 546
actctgtccatcttgttaacaatcatcaaaacgaaagccgaacagtcaqgga 598
gcatcaaaatgacaaaaataaggtgcaaaatgagtttgacacccctagttta 650
aatgaaaacttgggcttgacatatgactaaattggagcagacaaccatctgt 702
ggtcacaggtcacagacaggggtgaaaacactactctagagatctatcagtc 754
atgaggtagagaggctactgcatgtgtatagatgctgacatatgtcatactg 806
tatggacttacatttacagtctcttcactctgtcgtctgtacatcatcaaac 858
gaagccgaaaaggctacatgcatgtgtatagaataactqacattattgttca 910
tacctggcacacacaagaacattagatccacatcttgtcaggttatacacag 962
tacattttgcagtgttcatttcacttaaagagttcattttaacactacstca 1014
gataacatatagtcccactctacagagtgtaaaaagtactctgattgtagtg 1066
ttacattttgagtgttaatgtaacacttcatattataaaatattaacattcg 1118
atttca 1124

Claims (17)

REVENDICATIOITS

1. Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotonineraique (5HT6 ou 5HT7) choisis dans le groupe des polypeptides formés par les ensembles 1 et 2 définis ci-après - Ensemble 1 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 448 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT6, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID n" 1 de la liste de séquences annexées ou des fragments peptidiques de cette séquence, lesdits fragments étant tels que

- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 448 acides aminés et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sérotonine, ses agonistes ou ses antagonistes,

- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 448 acides aminés mais qui ne reconnaissent aucun des autres récepteurs sérotoninergiques, y compris le récepteur 5HT7,

- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 448 acides aminés mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninerqiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT7 ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergique homologue du récepteur 5HT6.

- soit ils sont capables d'induire des anticorps reconnaissant ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7 mais ne reconnaissant aucun des récepteurs sérotoninerqiques décrits ci-dessus, y compris le récepteur 5HT6 ou des polypeptides ou fragments analogues correspondant à d'autres espèces, y compris l'espèce humaine, et relatifs au récepteur sérotoninergiue homologue du récepteur 5HT7.

- soit ils sont reconnus par des anticorps qui reconnaissent également ladite séquence de 127 acides aminés et/ou un polypeptide codé par un qène exprimant le récepteur 5HT7 mais qui ne reconnaissent aucun des autres recepteurs sérotoninergiques, y compris le récepteur 5HT6,

- soit ils contiennent le ou les sites contenus dans ladite séquence de 127 acides aminés ou tout site voisin sur un polypeptide enqlobant ladite séquence de 127 acides aminés et codé par un gène exprimant le récepteur 5HT7, et dont la présence est nécessaire pour que le fragment soit capable de lier la sérotonine, ses agonistes ou antagonistes,

- Ensemble 2 des polypeptides constitués par ou contenant la séquence de 127 acides aminés de rat, relative au récepteur 5HT7, définie dans l'identificateur de séquence SEQ ID " 2 de la liste de séquences annexée ou des fragments peptidiques de ces polypeptides, lesdits fragments étant tels que

2. Polypeptides de l'ensemble 1 de la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils contiennent les sites faisant partie de ladite séquence de 448 acides aminés, dont la présence est nécessaire, quand les polypeptides sont présentés sur une membrane cellulaire en présence de sérotonine tritiée et en présence d'un agoniste ou d'un antagoniste de la sérotonine, pour que l'affinité apparente desdits antagonistes ou agonistes corresponde à celle qui est indiquée dans le tableau 1.

3. Acides nucléiques contenant ou constitués par les séquences de nucléotides codant pour un quelconque des polypeptides selon la revendication 1.

4. Acides nucléiques consistant dans ou comprenant la séquence complète codant pour les récepteurs 5HT6 ou 5HT7 chez l'homme ou chez l'animal.

5. Acides nucléiques comprenant ou constitués par les séquences SEQ ID n" 1 ou n 2 ou des fragments de ces séquences placés dans le cadre de lecture, ainsi que les séquences homologues, notamment chez l'homme.

6. Acide nucléique selon la revendication 5 constitué par la séquence s'étendant du nucléotide en position~135 à celui en position 1 478 dans l'identificateur

SEQ ID n" 1 ou à ses homoloques chez l'homme ou chez les animaux.

7. Vecteurs recombinants, utilisables pour le clonage ou pour l'expression des acides nucléiques, et contenant un acide nucléique selon l'une des revendications 3 à 6.

8. Hôtes cellulaires transformés par un vecteur recombinant selon la revendication 7 et susceptibles d'exprimer la séquence codante pour la synthèse d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2.

9. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2.

10. Sondes nucléotidiques s'hybridant avec l'un des acides nucléiques selon l'une des revendications 3 à 6 ou avec leurs séquences complémentaires ou ARN correspondants, en étant spécifiques du récepteur 5HT6 ou du récepteur 5HT7, et qui ne s'hybrident pas avec les séquences nucléiques ou les ARN correspondants des autres récepteurs sérotoninergiques.

11. Sondes selon la revendication 10 pour le diagnostic d'affections neurologiques, psychiatriques, gastro-entéroloaiques ou neuro-endocriniennes liées à des anomalies qualitatives ou quantitatives des récepteurs 5HT6 ou 5HT7.

12. Procédé de criblaqe de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine7 et psychiatriques telles que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire, ou gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou écritoires, dans lequel on met en contact, dans un milieu convenable, une molécule candidate avec les membranes d'un hôte cellulaire transformé par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface membranaire des sites spécifiques de ce polypeptide, l'éventuel complexe liqand-polypeptide qui se forme étant alors détecté.

13. Procédé de criblage de médicaments destinés aux traitements d'affections neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les troubles du sommeil, la migraine, et psychiatriques tels que les troubles de l'humeur, les dépressions, les états psychotiques, ou neuro-endocriniennes, et notamment les dysfonctionnements de l'axe hypothalamo-hypophysaire, ou gastro-entérologiques, notamment troubles fonctionnels de l'intestin, troubles moteurs ou sécrétoires dans lequel on mesure une réponse induite par la liaison d'une molécule candidate avec une cellule, transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à présenter à la surface menbranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de telle manière que la mesure d'un signal tel que la production d'AliP cyclique permette de différencier les molécules sérotoninergiques qui se comportent comme antagonistes et celles qui se comportent comme agonistes.

14. Procédé de criblaqe de ligands marqués tels que ligands radioactifs ou fluorescents dans lequel on mesure la liaison spécifique de ligands candidats avec la membrane d'une cellule transformée par un vecteur comprenant un insert codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 et susceptible d'exprimer ledit polypeptide de façon à exprimer à la surface membranaire un ou plusieurs sites spécifiques de ce polypeptide de manière telle que la liaison spécifique du ligand candidat puisse être évaluée ou indirectement estimee.

15. Procédé d'identification de tissus ou cellules exprimant spontanément à leur surface membranaire un polypeptide selon l'une des revendications 1 et 2 de telle manière que lesdits tissus ou cellule, puissent servir à la mise au point de médicaments ou liqands marqués selon les revendications 12 à 14.

16. Médicaments contenant, dans une dose prévue pour être administrée, une quantité thérapeutiquement efficace d'une substance active sur un polypeptide ayant une activité de récepteur 5HT6 ou 5HT7 dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

17. Médicaments contenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'une substance active sur les autres récepteurs sérotoninergiques mais non active sur l'un au moins des récepteurs 5HT6 et 5HT7.