FR2751876A1 - USE OF AN OLIGOSACCHARIDE AS AN IMMUNOMODULATOR, DERMATO-COSMETIC COMPOSITION AND COSMETIC TREATMENT METHOD - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention se rapporte à des composés utiles dans le domaine de l'immunologie et en particulier pour le traitement des réactions d'hypersensibilité responsables des allergies et des divers phénomènes d'intolérance. The present invention relates to compounds useful in the field of immunology and in particular for the treatment of hypersensitivity reactions responsible for allergies and various intolerance phenomena.
La défense immunologique contre les agents infectieux, les toxines ou les néoplasies passe par la reconnaissance de la nature étrangère d'un antigène (ou allergène) et l'activation de médiateurs cellulaires ou humoraux, visant à éliminer l'antigène étranger. Toutefois, ce mécanisme peut parfois être indésirable, lorsqu'il est trop intense, ou s'exerce à l'encontre d'antigènes de l'environnement qui ne sont pas intrinsèquement nocifs ; c'est également le cas lors de transplantation d'organe ou de greffes tissulaires. Immunological defense against infectious agents, toxins or neoplasms involves recognizing the foreign nature of an antigen (or allergen) and activating cellular or humoral mediators to eliminate foreign antigen. However, this mechanism can sometimes be undesirable, when it is too intense, or is exercised against environmental antigens that are not intrinsically harmful; this is also the case during organ transplantation or tissue grafts.
Les réactions immunologiques à la base de l'allergie ont été classées en 4 types: - Type I: Les mastocytes se lient aux anticorps IgE par leur récepteur Fc la fixation de l'antigène déclenche la dégranulation des mastocytes et la libération de médiateurs (histamine, SRS-A, ECF-A). The immunological reactions underlying the allergy have been classified into 4 types: - Type I: The mast cells bind to IgE antibodies by their Fc receptor antigen binding triggers the degranulation of mast cells and the release of mediators (histamine , SRS-A, ECF-A).
- Type Il : Les anticorps (IgG ou IgM) spécifiques réagissent avec l'antigène, à la surface des cellules cibles ; ceci entraîne une cytolyse, soit par action directe des cellules K, soit par activation du complément.- Type II: Specific antibodies (IgG or IgM) react with the antigen on the surface of the target cells; this leads to cytolysis, either by direct action of K cells or by activation of complement.
- Type III: Les anticorps (IgG ou IgM) forment, avec l'antigène et le complément, des complexes immuns qui se déposent dans les tissus et entraînent la production de facteurs chimiotactiques pour les polynucléaires neutrophiles ; il en résulte une inflammation locale.- Type III: Antibodies (IgG or IgM) together with antigen and complement form immune complexes that are deposited in tissues and lead to the production of chemotactic factors for neutrophils; this results in local inflammation.
- Type IV: Les lymphocytes T sensibilisés à l'antigène réagissent avec celui-ci et libèrent des lymphokines. Les lymphokines induisent une réaction inflammatoire et provoquent l'afflux des macrophages.Type IV: Antigen-sensitized T cells react with it and release lymphokines. Lymphokines induce an inflammatory reaction and cause the influx of macrophages.
Les lymphocytes sont donc des cellules-clés, dans l'immunité à médiation cellulaire ou humorale, notamment par la sécrétion d'anticorps. Lymphocytes are therefore key cells in cell-mediated or humoral immunity, in particular by the secretion of antibodies.
Les affections allergiques peuvent être l'expression d'un ou plusieurs types de réactions immunologiques. Allergic conditions may be the expression of one or more types of immunological reactions.
Ces réactions peuvent également être à la base de réactions d'intolérance aux produits d'hygiène et de soins, observées chez les peaux dites "hyperréactives". These reactions can also be the basis of intolerance reactions to hygiene and care products, observed in so-called "hyperreactive" skin.
Ces phénomènes sont dus à des facteurs génétiques intrinsèques et à une hypersensibilité acquise provoquée par l'environnement. These phenomena are due to intrinsic genetic factors and to an acquired hypersensitivity caused by the environment.
De manière inattendue, la demanderesse a maintenant trouvé que ces phénomènes d'hypersensibilité pouvaients être combattus par des oligosaccharides comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou de dérivés de tels oligosaccharides substitués par un résidu hydrophobe. Unexpectedly, the Applicant has now found that these hypersensitivity phenomena can be combatted by oligosaccharides comprising from 2 to 6 osidic residues, and having a non-reducing terminal galactose residue, or derivatives of such residue-substituted oligosaccharides. hydrophobic.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'oligosaccharides comprenant de 2 à 6 résidus osidiques et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou de leurs dérivés, pour la préparation de compositions immunomodulatrices, et en particulier de compositions destinées au traitement ou à la prévention des réactions d'hypersensibilité. The present invention relates to the use of oligosaccharides comprising from 2 to 6 osidic residues and having a non-reducing terminal galactose residue, or derivatives thereof, for the preparation of immunomodulatory compositions, and in particular compositions intended for treatment or the prevention of hypersensitivity reactions.
Des oligosaccharides particulièrement appropriés pourront être choisis dans le groupe constitué du mélibiose, du lactose et de leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. Particularly suitable oligosaccharides may be selected from the group consisting of melibiose, lactose and their derivatives obtainable by adding a hydrophobic residue.
Par substituants hydrophobes, on entend notamment les alkyles en C1-C18 linéaires ou ramifiés, les alkylamines en C1-C18, les acides carboxyliques en Cl-Clg linéaires ou ramifiés, éventuellement substitués, les amides primaires, secondaires ou tertiaires en C1-C18, linéaires ou ramifiés, et les arylalkyles en Cl-Cl8. Hydrophobic substituents are understood to mean in particular linear or branched C1-C18 alkyls, C1-C18 alkylamines, linear or branched, optionally substituted C1-C18 carboxylic acids, primary, secondary or tertiary C1-C18 amides, linear or branched, and arylalkyl Cl-Cl8.
Les dérivés d'oligosaccharides adaptés à la mise en oeuvre de l'invention peuvent notamment appartenir à l'une des catégories citées ci-après, dans lesquelles l'oligosaccharide répond à la formule générale suivante galactose-n ( ou p) - (Hex)p dans laquelle
n représente la position 1, 2, 3, 4 ou 6,
Hex représente un pentose ou un hexose en liaison Q ou B,
p est un nombre compris entre 1 et 5 a) - des glycosides répondant aux formules:
(I) oligosaccharide 1-O-R, dans lequel R est un résidu alkyle de 1 à
18 atomes de carbone, linéaire ou branché,
(Il) oligosaccharide 1-O-R-O-1-oligosaccharide dans laquelle
R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 10, b) - une osylamine acylée selon l'une des formules suivantes, dans lesquelles l'oligosaccharide est de préférence le lactose, le mélibiose ou le stachiose - des osylamines acylées répondant à l'une des formules suivantes
(III) oligosaccharide 1-NH-CO-R, dans laquelle
R est un résidu alkyle de 2 à 18 atomes de carbone, contenant 0, 1 ou
2 double liaisons,
. (il) oligosaccharide 1-NH-CO-R-CO-NH-1-oligosaccharide, dans
laquelle
R = (CH2)m, m étant compris entre 2 et 8, c) - une alkylamine acylée par un acide aldonique obtenu par oxydation d'un oligosaccharide
. (V) oligosaccharide -CO-NH-R, dans laquelle
R a la même signification que dans la formule (III),
. (VI) oligosaccharide CO-NH-R-NH-CO- oligosaccharide, où R a la
même signification que dans la formule (III), d) - soit un produit de réduction des bases de Schiff formé par des oligosaccharides avec des mono- ou diamines aliphatiques, et répondant à l'une des formules suivantes
. (VII) Gal- (Hex)n -X-HN-R,
. (VIII) Gal - (Hex)n - X-HN-R-NH-X- (Hex)n - Gal,
dans lesquelles
Hex est un hexose ou un pentose,
n =0,1 ou 2,
x = 1-NH2-hexitol, et
R a la même signification que dans (III).The oligosaccharide derivatives suitable for the implementation of the invention may belong in particular to one of the categories mentioned below, in which the oligosaccharide corresponds to the following general formula galactose-n (or p) - (Hex ) p in which
n represents the position 1, 2, 3, 4 or 6,
Hex represents a pentose or hexose in a Q or B bond,
p is a number between 1 and 5 a) - glycosides corresponding to the formulas:
(I) oligosaccharide 1-OR, wherein R is an alkyl residue of 1 to
18 carbon atoms, linear or connected,
(II) oligosaccharide 1-ORO-1-oligosaccharide in which
R = (CH2) m, m being between 2 and 10, b) - an acylated osylamine according to one of the following formulas, in which the oligosaccharide is preferably lactose, melibiose or stachiose - acylated osylamines answering to one of the following formulas
(III) oligosaccharide 1-NH-CO-R, wherein
R is an alkyl residue of 2 to 18 carbon atoms, containing 0, 1 or
2 double bonds,
. (II) oligosaccharide 1-NH-CO-R-CO-NH-1-oligosaccharide, in
which
R = (CH2) m, m being between 2 and 8, c) - an alkylamine acylated with an aldonic acid obtained by oxidation of an oligosaccharide
. (V) oligosaccharide -CO-NH-R, wherein
R has the same meaning as in formula (III),
. (VI) oligosaccharide CO-NH-R-NH-CO-oligosaccharide, where R has the
same meaning as in formula (III), d) - or a Schiff base reduction product formed by oligosaccharides with aliphatic mono- or diamines, and corresponding to one of the following formulas
. (VII) Gal- (Hex) n -X-HN-R,
. (VIII) Gal - (Hex) n - X - HN - R - NH - X - (Hex) n - Gal,
in which
Hex is a hexose or a pentose,
n = 0,1 or 2,
x = 1-NH2-hexitol, and
R has the same meaning as in (III).
Selon un mode particulièrement avantageux, l'oligosaccharide ou son dérivé tel que défini ci-dessus sera utilisé pour la préparation d'une composition contenant en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie topique externe. According to a particularly advantageous embodiment, the oligosaccharide or its derivative as defined above will be used for the preparation of a composition additionally containing pharmaceutically acceptable excipients suitable for external topical administration.
En effet, la demanderesse a trouvé que les réactions impliquées dans les troubles associés à l'hypersensibilité, peuvent être corrélés à la fixation, sur un récepteur spécifique des lymphocytes, de peptides résultant de la dégradation de l'élastine, notamment des peptides d'élastine. Indeed, the Applicant has found that the reactions involved in the disorders associated with hypersensitivity can be correlated with the binding, on a specific receptor of lymphocytes, of peptides resulting from the degradation of elastin, in particular peptides from elastin.
L'activation de ces récepteurs déclenche la libération d'enzymes lytiques, de 1,-glucuronidase, d'élastases et de radicaux libres comme l'ion superoxyde, ou le péroxyde d'hydrogène qui génère des radicaux hydroxyl.Activation of these receptors triggers the release of lytic enzymes, 1,1-glucuronidase, elastases and free radicals such as the superoxide ion, or hydrogen peroxide which generates hydroxyl radicals.
Ces produits peuvent entraîner la dégradation des macromolécules de la matrice extracellulaire, la fibronectine, le collagène et le hyaluronane. La fixation des peptides de I'élastine stimule également la prolifération des lymphocytes.These products can cause the degradation of macromolecules of the extracellular matrix, fibronectin, collagen and hyaluronan. Fixing the peptides of the elastin also stimulates the proliferation of lymphocytes.
Ces phénomènes jouent un rôle important dans les réactions immuno-allergiques à l'origine de l'atopie, notamment des dermatites atopiques ou des réactions d'anaphylaxie, de l'urticaire et des dermatites allergiques de contact. These phenomena play an important role in the immuno-allergic reactions causing atopy, including atopic dermatitis or anaphylaxis reactions, urticaria and allergic contact dermatitis.
Les sujets présentant des peaux dites "sensibles" ou hyperréactives sont de plus en plus nombreux dans la population. Une telle peau rougit ou picote facilement, son seuil de réactivité est abaissé par rapport aux autres peaux. Subjects with so-called "sensitive" or hyperreactive skins are more and more numerous in the population. Such skin flushes or tingles easily, its threshold of reactivity is lowered compared to other skin.
Le sujet ressent un inconfort cutané, associé à un érythème, et une fine desquamation peut survenir. The subject feels skin discomfort, associated with erythema, and thin desquamation may occur.
Tous ces symptômes seront améliorés ou même supprimés par l'emploi des compositions contenant des oligosaccharides selon l'invention ; le mélibiose, le lactose, ou leurs dérivés, suppriment partiellement ou totalement la prolifération cellulaire en particulier des lymphocytes préalablement stimulés ; ils peuvent également inhiber la potentialisation et la libération d'enzymes lytiques. All these symptoms will be improved or even eliminated by the use of compositions containing oligosaccharides according to the invention; melibiose, lactose, or derivatives thereof, partially or completely suppress cell proliferation, especially previously stimulated lymphocytes; they can also inhibit the potentiation and release of lytic enzymes.
Les compositions seront de préférence formulées dans des véhicules ne comportant pas de parfum ni d'agents allergisants. Les compositions pourront être sous forme de solutions, gels, lotions, crèmes, émulsions E/H ou H/E, ou d'émulsions multiples ou sous forme liposomée. Elles seront adaptées par l'homme du métier, en utilisant de préférence des agents adoucissants ou des tensioactifs doux. The compositions will preferably be formulated in vehicles having no perfume or allergenic agents. The compositions may be in the form of solutions, gels, lotions, creams, W / O or O / W emulsions, or multiple emulsions or in liposome form. They will be adapted by those skilled in the art, preferably using softening agents or mild surfactants.
Les compositions sont particulièrement adaptées au traitement ou à la prévention des réactions d'intolérance et/ou d'allergie de la peau et/ou des muqueuses. The compositions are particularly suitable for the treatment or prevention of intolerance reactions and / or allergies of the skin and / or mucous membranes.
En particulier, les compositions selon l'invention sont destinées à empêcher ou à diminuer la formation de radicaux libres. In particular, the compositions according to the invention are intended to prevent or reduce the formation of free radicals.
Les oligosaccharides ou leurs dérivés pourront être associés à d'autres agents permettant de protéger et/ou hydrater la peau tels que l'acide hyaluronique, la vitamine E, l'extrait glycolique de G. biloba, le sorbitol, les glycosaminoglycannes, l'alginate, etc ; il peuvent également être associés à des huiles végétales pour nourrir la peau et/ou à des actifs adoucissants et apaisants comme par exemple les extraits de vigne rouge, d'althéa, d'avoine, de tilleul, de camomille, de mélilot, de ruscus, procyanidols, a-bisabolol, huile de coco, acide 18 K glycyrrhétinique. The oligosaccharides or their derivatives may be combined with other agents that make it possible to protect and / or moisturize the skin, such as hyaluronic acid, vitamin E, the glycolic extract of G. biloba, sorbitol, glycosaminoglycans, alginate, etc .; they can also be combined with vegetable oils to nourish the skin and / or with softening and soothing active ingredients such as, for example, red vine extracts, althea, oats, linden, chamomile, sweetclover, ruscus , procyanidols, α-bisabolol, coconut oil, 18 K glycyrrhetinic acid.
Selon un autre aspect de l'invention, les oligosaccharides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus sont utilisés pour la préparation d'une composition qui contient en outre des excipients pharmaceutiquement acceptables, adaptés à une administration par voie parentérale ou entérale. According to another aspect of the invention, the oligosaccharides and their derivatives as defined above are used for the preparation of a composition which additionally contains pharmaceutically acceptable excipients, suitable for parenteral or enteral administration.
Les compositions préparées selon l'invention sont particulièrement utiles pour le traitement ou la prévention des réactions d'hypersensibilité médiée par les lymphocytes. The compositions prepared according to the invention are particularly useful for the treatment or prevention of lymphocyte mediated hypersensitivity reactions.
Elles sont en particulier destinées au traitement ou à la prévention des symptômes d'une affection choisie parmi l'atopie, les érythèmes polymorphes, xérodermites, lupus érythémateux, pemphigus, dermatites, psoriasis et eczémas. They are particularly intended for the treatment or prevention of the symptoms of a disorder selected from atopy, polymorphic erythema, xerodermitis, lupus erythematosus, pemphigus, dermatitis, psoriasis and eczema.
Les oligosaccharides présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, et leurs dérivés, substitués par un résidu hydrophobe peuvent être utilisés comme adjuvants limitant les réactions d'hypersensibilité susceptibles d'être provoquées par un autre principe actif. Oligosaccharides having a non-reducing terminal galactose residue, and derivatives thereof, substituted with a hydrophobic residue may be used as adjuvants limiting hypersensitivity reactions that may be caused by another active ingredient.
L'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique des peaux hyperréactives, caractérisée en ce qu'on applique par voie topique, une composition contenant au moins un oligosaccharide comprenant de 2 à 6 résidus osidiques, et présentant un résidu galactose en position terminale non réductrice, ou un dérivé d'un tel oligosaccharide substitué par un résidu hydrophobe, dans un véhicule cosmétologiquement acceptable. The subject of the invention is also a method for the cosmetic treatment of hyperreactive skin, characterized in that a composition containing at least one oligosaccharide comprising from 2 to 6 osidic residues and having a galactose residue in the terminal position is applied topically. non-reducing agent, or a derivative of such an oligosaccharide substituted with a hydrophobic residue, in a cosmetologically acceptable vehicle.
Des composés particulièrement préférés pour la mise en oeuvre de cette méthode sont le mélibiose, le lactose et leurs dérivés susceptibles d'être obtenus par addition d'un résidu hydrophobe. Particularly preferred compounds for the implementation of this method are melibiose, lactose and their derivatives may be obtained by adding a hydrophobic residue.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention.The following examples are intended to illustrate the invention.
Dans ces exemples, on se réfèrera aux figures suivantes
Fig. 1: Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'activité de stimulation
de la prolifération des lymphocytes par la k-élastine. Les
concentrations de lactose et de mélibiose sont de I zg/ml, 10 llg/ml,
100 llg/ml, 1 mg/ml et 2 mg/ml.In these examples, reference is made to the following figures
Fig. 1: Inhibition by lactose and melibiose of stimulation activity
proliferation of lymphocytes by k-elastin. The
concentrations of lactose and melibiose are 1 μg / ml, 10 μg / ml,
100 μg / ml, 1 mg / ml and 2 mg / ml.
Fig.2: Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'expression de l'activité
élastasique par les lymphocytes, stimulés par 2 ssg/ml de k-élastine.Fig.2: Inhibition by lactose and melibiose of the expression of activity
elastase by lymphocytes, stimulated with 2 μg / ml of k-elastin.
Activité dans le milieu de culture. Activity in the culture medium.
Fig.3 : Inhibition par le lactose et le mélibiose de l'expression de l'activité cathépsine G de lymphocytes stimulés par 2 yg/ml de k-élastine. Activité dans le milieu de culture. FIG. 3: Inhibition by lactose and melibiose of the expression of cathepsin G activity of lymphocytes stimulated with 2 μg / ml of k-elastin. Activity in the culture medium.
Exemple 1 1 - Methodes
Séparation des lvmphocvtes
Les lymphocytes utilisés pour ces expériences ont été obtenus à partir de sang circulant humain et également d'amygdales humaines après amygdalectomie. L'isolement des lymphocytes phériphériques est effectué comme suit : 5 ml de sang ont été déposés (dans les tubes de centrifugation de 15 ml) sur Ficoll-paque plus (Pharmacia) avec précaution afin de séparer les deux phases, puis centrifugés à 2000 rpm (soit 600 g) pendant 40 min. à température ambiante (20 C). La couche contenant les lymphocytes et les monocytes est récupérée et mélangée avec 10 ml de milieu RPMI, centrifugée à 1 500 rpm (soit 400 g) pendant 10 min. à 20 C. Le sédiment est remis en suspension dans 0,5 ml de RPMI, puis 4,5 ml supplémentaires de RPMI sont ajoutés et on effectue une nouvelle centrifugation à 1 500 rpm (soit 400 g) pendant 10 min. à 20 C. Le sédiment final est repris dans 10 ml de RPMI et les cellules sont comptées.Example 1 1 - Methods
Separation of lvmphocvtes
The lymphocytes used for these experiments were obtained from human circulating blood and also from human tonsils after tonsillectomy. The isolation of the peripheral lymphocytes is carried out as follows: 5 ml of blood were deposited (in the 15 ml centrifuge tubes) on Ficoll-Paque plus (Pharmacia) with care in order to separate the two phases, then centrifuged at 2000 rpm (ie 600 g) for 40 min. at room temperature (20 C). The layer containing the lymphocytes and monocytes is recovered and mixed with 10 ml of RPMI medium, centrifuged at 1500 rpm (ie 400 g) for 10 min. at 20 C. The sediment is resuspended in 0.5 ml of RPMI, then an additional 4.5 ml of RPMI is added and further centrifugation is carried out at 1500 rpm (ie 400 g) for 10 min. at 20 C. The final sediment is taken up in 10 ml of RPMI and the cells are counted.
Les monocytes et les macrophages sont éliminés par adhésion sur une surface plastique (incubation à 37 C pendant 2 heures dans un incubateur
CO2/O2).Monocytes and macrophages are removed by adhesion on a plastic surface (incubation at 37 C for 2 hours in an incubator
CO2 / O2).
Séparation des polynucléaires (PMN)
Après la première centrifugation à 2 000 rpm (soit 600 g), le résidu contenant les globules rouges et les PMN sont remis en suspension dans de l'alcool polyvinylique (PVA) à 1% dans du DPBS (tampon salin phosphate modifié de Dulbecco), (deux volumes par volume de sédiment), puis laissés sédimentés 20 min. à température ambiante. Le surnageant est alors centrifugé pendant 5 min. à 400 g à 4" C, le sédiment est lavé avec du DPBS afin d'éliminer le PVA par agitation douce, sans activer les PMN, suivi par 5 min. de centrifugation à 400 g à 4" C. Le surnageant est éliminé. Les globules rouges sont lysés par choc osmotique puis un excès de DPBS est ajouté afin de rétablir l'équilibre osmotique. Après centrifugation 5 min. à 400 g à 4" C, le sédiment, contenant les PMN est repris dans un faible volume de RPMI. Les cellules sont comptées et peuvent être lysées pour libérer les enzymes lytiques (élastase, cathepsine) par addition de 0,1%
Triton X-100 dans NaC1 1 M à 0 C pendant 20 min., suivie par une centrifugation 20 min. à 0 C. Le surnageant contient les enzymes.Polynuclear Separation (PMN)
After the first centrifugation at 2,000 rpm (ie 600 g), the residue containing red blood cells and PMNs is resuspended in 1% polyvinyl alcohol (PVA) in DPBS (Dulbecco's Modified Saline Phosphate Buffer). , (two volumes per volume of sediment), then left sedimented for 20 min. at room temperature. The supernatant is then centrifuged for 5 min. at 400 g at 4 ° C, the sediment is washed with DPBS to remove PVA by gentle shaking, without activating the PMN followed by 5 min centrifugation at 400 g at 4 ° C. The supernatant is removed. The red blood cells are lysed by osmotic shock and then an excess of DPBS is added to restore the osmotic balance. After centrifugation 5 min. at 400 g at 4 ° C, the PMN-containing sediment is taken up in a small volume of RPMI The cells are counted and can be lysed to release the lytic enzymes (elastase, cathepsin) by addition of 0.1%
Triton X-100 in 1M NaCl at 0 ° C for 20 min., Followed by centrifugation for 20 min. at 0 C. The supernatant contains the enzymes.
Préparation des lymphocytes à partir d'amygdales humaines
Des amygdales fraichement opérées sont coupées en petits morceaux en conditions stériles, dans 10 ml de RPMI. La suspension tissulaire est filtrée sur un filtre grossier afin d'éliminer les plus gros débris tissulaires. La suspension est mise dans un tube à essai et laissée sédimenter 15 min. à température ambiante. Le surnageant est mis sur
Ficoll-paque plus et centrifugé comme décrit pour des lymphocytes dérivés du sang. Les monocytes sont éliminés comme décrit pour les lymphocytes dérivés du sang. Le sédiment contenant les lymphocytes est remis en suspension et les cellules sont comptées après deux centrifugations comme décrit. Les lymphocytes obtenus à partir d'amygdales sont environ 50% du type T et à 50% du type B. Les lymphocytes d'origine sanguine sont environ à 80% de type T et à 20% de type B.Preparation of lymphocytes from human tonsils
Freshly operated tonsils are cut into small pieces under sterile conditions in 10 ml of RPMI. The tissue suspension is filtered through a coarse filter to remove larger tissue debris. The suspension is put in a test tube and allowed to settle for 15 minutes. at room temperature. The supernatant is put on
Ficoll-paque plus and centrifuged as described for lymphocytes derived from blood. Monocytes are removed as described for lymphocytes derived from blood. The sediment containing the lymphocytes is resuspended and the cells are counted after two centrifugations as described. Lymphocytes obtained from tonsils are approximately 50% T type and 50% type B. Blood lymphocytes are approximately 80% T type and 20% type B.
Culture des lvmphocvtes
Les lymphocytes isolés comme décrit ci-dessus sont cultivés dans des plaques à 24 puits Costar, 500 il de suspension de cellules/puits (5.105 cellules/ml soit 2,5.105 cellules/puits) dans du milieu RPMI 1640 (Eurobio) complété par 10% de sérum de veau foetal (ATGC), 2 mM de glutamine (Gibco), de la pénicilline et de la streptomycine (500 U/ml, 0,25 mg/ml), et phytohémagglutinine (SIGMA) 5 llg/ml. Après 4 jours d'incubation dans les conditions de culture de cellules (37"C, incubateur C02/O2) la suspension cellulaire est récupérée avec une pipette, centrifugée à 400 g pendant 10 min. à 20 C et le sédiment cellulaire est repris dans 0,5 ml de
RPMI (sans SVF), dispersé par agitation puis après addition de 10 ml de
RPMI sans SVF, centrifugé à nouveau à 400 g pendant 10 min. à 20 C.Culture of lvmphocvtes
The lymphocytes isolated as described above are cultured in Costar 24 well plates, 500 μl of cell suspension / well (5 × 10 5 cells / ml or 2.5 × 10 5 cells / well) in RPMI 1640 medium (Eurobio) supplemented with 10 % fetal calf serum (CGTA), 2 mM glutamine (Gibco), penicillin and streptomycin (500 U / ml, 0.25 mg / ml), and phytohemagglutinin (Sigma) 5 μg / ml. After 4 days of incubation under cell culture conditions (37 ° C., CO 2 / O 2 incubator) the cell suspension is collected with a pipette, centrifuged at 400 g for 10 min at 20 ° C. and the cell sediment is taken up in 0.5 ml of
RPMI (without FCS), dispersed by stirring and after addition of 10 ml of
RPMI without FCS, centrifuged again at 400 g for 10 min. at 20 C.
Après encore deux lavages comme décrit ci-dessus, le sédiment est repris dans 10 ml de RPMI, sans SVF et les cellules sont à nouveau mises en culture dans une plaque de Costar à 24 puits.After another two washes as described above, the sediment is taken up in 10 ml of RPMI without FCS and the cells are again cultured in a 24-well Costar plate.
Action des peptides de l'élastine
Une solution stérile de K élastine (75 kD, Solabia) est ajoutée, à la concentration indiquée (par exemple 2 crg/ml) aux cellules remises en culture dans le milieu sans SVF pendant 2,5 heures à 37 C. Après incubation, les plaques sont agitées doucement, les cellules récupérées par pipettage et comptées. La suspension est centrifugée 10 min. à 4" C à 1 500 rpm (soit 400 g), le surnageant est distribué dans des tubes Eppendorf 1 ml à raison de 500 pl par tube et conservé à -40" C s'il n'est pas utilisé immédiatement pour les dosages enzymatiques. Le sédiment cellulaire est remis en suspension dans du tampon d'extraction (Triton X-100 0,1%, NaCl 1 M, NaN3 0,02%, Brij 35 0,01%, pH 8). 1 ml pour 106 cellules, agité 15 min. à 1 600 g à 0 C et le surnageant obtenu par centrifugation comme décrit cidessus est réparti dans des tubes Eppendorf et conservé à -40" C pour les dosages enzymatiques.Action of elastin peptides
A sterile solution of K elastin (75 kD, Solabia) is added, at the indicated concentration (for example 2 μg / ml) to the cells returned to culture in the medium without FCS for 2.5 hours at 37 ° C. After incubation, the Plates are shaken gently, cells recovered by pipetting and counted. The suspension is centrifuged for 10 min. at 4 ° C. at 1500 rpm (ie 400 g), the supernatant is distributed in 1 ml Eppendorf tubes at a rate of 500 μl per tube and stored at -40 ° C. if it is not used immediately for the assays enzyme. The cell sediment is resuspended in extraction buffer (0.1% Triton X-100, 1 M NaCl, 0.02% NaN 3, 0.01% Brij, pH 8). 1 ml per 10 6 cells, stirred for 15 minutes. at 1600 ° C. at 0 ° C. and the supernatant obtained by centrifugation as described above is distributed in Eppendorf tubes and stored at -40 ° C. for enzymatic assays.
Détermination de l'activité enzvmatiaue de type élastase leucocvtaire
Le substrat synthétique utilisé pour doser l'activité enzymatique de type élastase est le Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val- pNA. 50 il de milieu de culture ou 20 jil de lysat cellulaire sont mélangés avec le tampon (tris-HCl 100 mM, CaCl2 0,05%, NaN3 0,02%, Brij 35 0,01%, pH 8) jusqu'à 190 ,ul, puis par 10 yl de solution de substrat 85 mM (dans N-méthylpyrrolidone) pour un volume total de 200 pl. La densité optique est lue immédiatement à 410 nm puis après 4, 24, 48 et 72 heures d'incubation à 37 C. L'activité élastasique est exprimée en nM de substrat hydrolysé par 106 cellules et par heure.Determination of enzymatic leukocyte elastase activity
The synthetic substrate used to assay the elastase enzyme activity is Me-O-Suc-Ala-Ala-Pro-ValpNA. 50 μl of culture medium or 20 μl of cell lysate are mixed with the buffer (100 mM Tris-HCl, 0.05% CaCl 2, 0.02% NaN 3, 0.01% Brij, pH 8) to 190. , then 10 μl of 85 mM substrate solution (in N-methylpyrrolidone) for a total volume of 200 μl. The optical density is read immediately at 410 nm and then after 4, 24, 48 and 72 hours of incubation at 37 C. The elastase activity is expressed in nM of substrate hydrolysed by 106 cells per hour.
Détermination de l'activité enzvmatique de la Cathepsine G
25 mg du substrat, Me O-Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA dans 1 ml de Nméthylpyrrolidone (40 nM) sont utilisés dans les mêmes conditions que cidessus. Determination of the enzymatic activity of Cathepsin G
25 mg of the substrate, Me O-Suc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA in 1 ml of N-methylpyrrolidone (40 nM) are used under the same conditions as above.
2 - Résultats
A) Effet des peptides de l'élastine sur la prolifération
des lymphocytes
Les passages de calcium produits par l'addition des peptides de l'élastine aux globules blancs du sang peuvent être considérés comme une indication du signal intracellulaire déclenchant un ensemble de fonctions cellulaires. L'une de celles-ci est l'entrée des cellules en prolifération. On a montré que cela était le cas pour des fibroblastes de derme humain en présence de peptides de l'élastine (Ghuysen-ltard et al,
C.R. Acad. Sci., 1992, 315: 473-478). Les résultats rapportés sur le tableau 1 montrent qu'une stimulation analogue de la prolifération des lymphocytes a été observée.2 - Results
A) Effect of elastin peptides on proliferation
lymphocytes
The calcium passages produced by the addition of elastin peptides to white blood cells can be considered as an indication of the intracellular signal triggering a set of cellular functions. One of these is the entrance of proliferating cells. This has been shown to be the case for human dermal fibroblasts in the presence of elastin peptides (Ghuysen-ltard et al.
CR Acad. Sci., 1992, 315: 473-478). The results reported in Table 1 show that similar stimulation of lymphocyte proliferation was observed.
Tableau 1
Concentration Nombre d'expériences Pourcentage de stimulation, en K élastine moyenne + SD
2 llg/ml 6 62,67+37,90
10 llg/ml 13 35,76+29,50
Une stimulation maximale est observée à 2 Fg/ml de peptides d'élastine et une stimulation un peu plus faible avec 10 Fg/ml de peptides d'élastine.Table 1
Concentration Number of experiments Percentage of stimulation, in K elastin mean + SD
2 llg / ml 6 62.67 + 37.90
10 μg / ml 13 35.76 + 29.50
Maximum stimulation is observed at 2 Fg / ml of elastin peptides and a slightly weaker stimulation with 10 Fg / ml of elastin peptides.
B) Libération d'activité protéolytique par les peptides
d'élastine
Quand des PMN ou des lymphocytes sont incubés dans des conditions de culture en présence de 2 cig/ml de K élastine, une augmentation graduelle de l'activité élastase et cathepsine peut être déterminée dans les extraits cellulaires et les lysats cellulaires. Cette augmentation est beaucoup plus marquée dans les cellules dérivées de sujets âgés athérosclérotiques. On n'observe pas une telle augmentation en l'absence de K élastine. L'addition des peptides d'élastine augmente l'activité protéolytique à la fois dans le milieu de culture (enzyme relarguée) et dans l'extrait cellulaire (enzyme liée à la cellule) pour l'élastase comme pour la cathepsine G, bien que cet effet soit beaucoup plus prononcé pour la libération d'activité enzymatique dans le surnageant de culture.B) Release of proteolytic activity by the peptides
elastin
When PMN or lymphocytes are incubated under culture conditions in the presence of 2 μg / ml K elastin, a gradual increase in elastase and cathepsin activity can be determined in cell extracts and cell lysates. This increase is much more marked in cells derived from elderly atherosclerotic subjects. Such an increase is not observed in the absence of K elastin. The addition of the elastin peptides increases the proteolytic activity in both the culture medium (released enzyme) and the cell extract (cell-bound enzyme) for both elastase and cathepsin G, although this effect is much more pronounced for the release of enzymatic activity in the culture supernatant.
C) Effet des peptides de l'élastine sur la survie cellulaire
Cette expérience est réalisée dans des conditions de culture comme décrit ci-dessus, en présence de phytohémaglutinine (PHA).C) Effect of Elastin Peptides on Cell Survival
This experiment is carried out under culture conditions as described above, in the presence of phytohemaglutinin (PHA).
5 ml d'aliquots de suspension de lymphocytes (2,5 106 cellules dans 5 ml) obtenus à partir d'amygdales humaines sont distribués dans des tubes à essai et des concentrations croissantes de K-élastine (BPM, PM < 10 kDa) sont ajoutées: 0,1 Fg/ml, 2 pg/ml, 10 Fg/ml, 500 zg/ml, 1 et 2 mg/ml. Après 4 jours d'incubation dans les conditions de culture les cellules sont récupérées et comptées. Le tableau 2 donne la perte en cellules en fonction de la concentration de peptides d'élastine ajoutés. 5 ml of lymphocyte suspension aliquots (2.5 106 cells in 5 ml) obtained from human tonsils are distributed in test tubes and increasing concentrations of K-elastin (BPM, PM <10 kDa) are added: 0.1 μg / ml, 2 μg / ml, 10 μg / ml, 500 μg / ml, 1 and 2 mg / ml. After 4 days of incubation under culture conditions the cells are recovered and counted. Table 2 gives the cell loss as a function of the concentration of elastin peptides added.
Tableau 2
Concentration de peptides d'élastine Pourcentage de perte cellulaire
Fg/ml déterminé par exclusion du bleu
de trypan
0 5,3
1 5,0
2 2,5
10 17,4
100 19,6
500 28,9
1000 39,3
2000 39,1
I1 apparaît que des peptides d'élastine exercent une activité cytotoxique à des concentrations élevées (mille fois supérieur à la concentration stimulant la prolifération cellulaire et le relargage des enzymes lytiques).Table 2
Concentration of Elastin Peptides Percentage of Cell Loss
Fg / ml determined by exclusion of blue
of trypan
0 5.3
1 5.0
2 2.5
10 17.4
100 19.6
500 28.9
1000 39.3
2000 39.1
It appears that elastin peptides exert cytotoxic activity at high concentrations (a thousand times higher than the concentration stimulating cell proliferation and the release of lytic enzymes).
Exemple 2: Effet du lactose et du mélibiose sur les réactions
médiées par le récepteur de l'élastine des
lymphocytes
1) Inhibition de la prolifération cellulaire
Comme représenté sur la figure l, des concentrations croissantes de lactose et de mélibiose suppriment progressivement l'effet de stimulation de croissance des peptides de l'élastine, suivi par une inhibition nette de la prolifération aux concentrations les plus fortes testées (1 et 2 mg/ml), équivalent à 5,84 10-3 mM). La plus forte inhibition de la prolifération est de l'ordre de 16 à 30% pour le lactose et de 26 à 58% pour le mélibiose.Example 2 Effect of Lactose and Melibiose on the Reactions
mediated by the elastin receptor
lymphocytes
1) Inhibition of cell proliferation
As shown in FIG. 1, increasing concentrations of lactose and melibiose gradually suppress the growth stimulating effect of the elastin peptides, followed by a net inhibition of proliferation at the highest concentrations tested (1 and 2 mg). ml), equivalent to 5.84-10-3 mM). The strongest inhibition of proliferation is of the order of 16 to 30% for lactose and 26 to 58% for melibiose.
2) Effet du lactose et du mélibiose sur le relarguage d'enzyme protéolytique déclenché par le récepteur de 1'élastine
Comme montré précédemment, on observe une augmentation de 40 à 120% de l'activité des enzymes protéolytiques dans le milieu de culture de même que dans le lysat cellulaire des lymphocytes humains cultivés en présence de 2 zg/ml de k-élastine. La stimulation de la libération d'une activité enzymatique lytique est inhibée efficacement par le mélibiose à partir de 1 llg/ml. Cette inhibition peut être démontrée aussi bien pour les activités élastases que pour la cathepsine G. Le lactose présente également une efficacité mais moins forte que celle du mélibiose (Figures 2 et 3).2) Effect of lactose and melibiose on the release of proteolytic enzyme triggered by the elastin receptor
As shown previously, there is an increase of 40 to 120% in the activity of proteolytic enzymes in the culture medium as well as in the cell lysate of human lymphocytes cultured in the presence of 2 μg / ml of k-elastin. Stimulation of the release of a lytic enzyme activity is effectively inhibited by melibiose from 1 μg / ml. This inhibition can be demonstrated for both elastase and cathepsin G activities. Lactose is also less effective than melibiose (Figures 2 and 3).
Exemple 3: Mise en évidence du récepteur de l'élastine sur les
sous-populations de lymphocytes humains
Méthodes
Anticorps utilisés - ler anticorps : anticorps anti récepteur de 67 kD d'élastine/laminine (bovin) (type: IgM) produit chez la souris (Elastin Products Company).Example 3 Demonstration of the Elastin Receptor on
subpopulations of human lymphocytes
Methods
Antibodies used - 1st antibody: anti-67 kD elastin / laminin (bovine) antibody (type: IgM) antibody produced in mice (Elastin Products Company).
- 2e anticorps: anticorps anti IgG + IgM (H + L) de souris produit chez la chèvre, marqué par la rhodamine (TRITC) (Jackson Immunoresearch
Laboratories) (pour la microscopie à fluorescence). - 2nd antibody: mouse anti-IgG + IgM (H + L) antibody produced in the goat, labeled with rhodamine (TRITC) (Jackson Immunoresearch
Laboratories) (for fluorescence microscopy).
- 2e anticorps : anticorps anti IgM (F(ab')2 de souris produit chez la chèvre, marqué par la r-phycoérythrine (Chemicon)) (pour la cytométrie de flux).2nd antibody: anti-IgM antibody (mouse F (ab ') 2 produced in the goat, labeled with r-phycoerythrin (Chemicon)) (for flow cytometry).
PROTOCOLE: a) Microscopie à fluorescence
Des lymphocytes humains sont isolés à partir des amygdales (comme décrit dans l'exemple 1) et mis en culture en présence de 5 ,ug/ml de phytohemagglutinine (pour les activer) et pour certaines cultures avec 2 yg/ml de kappa-élastine de haut poids moléculaire (75 kD) dans un milieu de RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau foetal (SVF). Après 48 à 120 heures d'incubation à 37 C, les lymphocytes sont lavés trois fois avec le milieu RPMI contenant 2% de SVF puis centrifugés (400 g, 10 minutes à 4"
C). Ensuite, on compte les cellules et on ajuste la densité cellulaire à 107 cellules/ml avec le milieu RPMI contenant 2% de SVF.PROTOCOL: a) Fluorescence microscopy
Human lymphocytes are isolated from the tonsils (as described in Example 1) and cultured in the presence of 5 μg / ml of phytohemagglutinin (to activate them) and for some cultures with 2 μg / ml of kappa-elastin. high molecular weight (75 kD) in RPMI 1640 medium with 10% fetal calf serum (FCS). After 48 to 120 hours of incubation at 37 ° C., the lymphocytes are washed three times with RPMI medium containing 2% FCS and then centrifuged (400 g, 10 minutes at 4 ° C.).
C). Then the cells are counted and the cell density is adjusted to 107 cells / ml with RPMI medium containing 2% FCS.
Puis, un volume (100 pl) de suspension cellulaire des lymphocytes humains (environ 106 cellules) est incubé avec 10 Ill de solution du premier anticorps (diluée au 1:100) pendant 30 minutes dans un bain de glace. On ajoute 1,5 ml de RPMI froid à 2% FCS, puis, les cellules sont lavées dans une centrifugeuse réfrigérée à 4" C (à 400 g pendant 10 minutes). Then, a volume (100 μl) of human lymphocyte cell suspension (approximately 10 6 cells) is incubated with 10 μl of the first antibody solution (diluted 1: 100) for 30 minutes in an ice bath. 1.5 ml of 2% FCS cold RPMI is added and the cells are washed in a refrigerated centrifuge at 4 ° C (at 400 g for 10 minutes).
On ajoute au culot la solution du deuxième anticorps (conjugué au
TRITC) (dilué au RPMI froid au 1:200). Après agitation douce de la suspension, on l'incube à 4" C pendant 30 minutes. Ensuite, on ajoute 1,5 ml de RPMI froid à 2% de SVF et on la centrifuge à 400 g à 4" C pendant 10 minutes.The solution of the second antibody (conjugated to
TRITC) (diluted to cold RPMI at 1: 200). After gentle stirring of the suspension, it was incubated at 4 ° C. for 30 minutes, then 1.5 ml of cold RPMI at 2% FCS was added and centrifuged at 400 g at 4 ° C for 10 minutes.
A l'issue de ce dernier lavage, les lymphocytes sont resuspendus dans le milieu résiduel après avoir enlevé le surnageant par décantation. At the end of this last washing, the lymphocytes are resuspended in the residual medium after removing the supernatant by decantation.
Puis, des frottis sont pratiqués sur des lames et séchés à l'air. Après fixation par l'éthanol absolu pendant 5 minutes, les lames sont réhydratées par immersion dans plusieurs bains de PBS et montées en glycérol tamponné (9 volumes de glycérol et 1 volume de PBS). Ce procédé de post-fixation augmente la brillance de l'immunofluorescence. Then, smears are performed on slides and dried in air. After fixing with absolute ethanol for 5 minutes, the slides are rehydrated by immersion in several PBS baths and mounted in buffered glycerol (9 volumes of glycerol and 1 volume of PBS). This post-fixation process increases the brightness of immunofluorescence.
Pour identifier les cellules marquées, des champs microscopiques sont examinés alternativement sous éclairage ultraviolet et en lumière visible. To identify the labeled cells, microscopic fields are examined alternately under ultraviolet light and visible light.
b) Fluorimétrie
A l'issue du dernier lavage, les lymphocytes sont suspendus dans 1 ml de PBS et les cellules sont analysées par cytofluorimétrie.(b) Fluorimetry
At the end of the last washing, the lymphocytes are suspended in 1 ml of PBS and the cells are analyzed by cytofluorimetry.
Les populations cellulaires caractérisées sont les suivantes - lymphocytes T totaux (CD3+) - lymphocytes T "helpers" (CD4+) - lymphocytes T suppresseurs (CD8+) - lymphocytes B (CD20+) - lymphocytes T activés (CD25+) - lymphocytes T mémoires (CDA+/CD45RO+) - granulocytes (CD15+)
Description des marqueurs utilisés
CD 3
Le complexe CD 3 est exprimé par toutes les cellules T humaines matures. Il a des poids moléculaires entre 16 et 28 kD composé de 5 chaînes (y, a, s, 5 > 4, ) associées avec le récepteur des cellules T d'une façon non- covalente. Il est impliqué dans la transmission des signaux d'activations.The cell populations characterized are as follows - total T cells (CD3 +) - T helper cells (CD4 +) - suppressor T cells (CD8 +) - B cells (CD20 +) - activated T cells (CD25 +) - memory T lymphocytes (CDA + / CD45RO +) - granulocytes (CD15 +)
Description of the markers used
CD 3
The CD3 complex is expressed by all mature human T cells. It has molecular weights between 16 and 28 kD composed of 5 chains (y, a, s, 5> 4,) associated with the T cell receptor in a non-covalent manner. He is involved in the transmission of activation signals.
CD 4
Le CD 4 (T4) reconnaît les molécules de CHM de classe II pendant l'interaction des cellules CD4+ avec les cellules présentant l'antigène ou des cellules cibles. C'est une glycoprotéine de 59 kD appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Il se trouve sur la sous-population "helper/inducer" des lymphocytes T (45% des lymphocytes du sang périphérique). CD 4
CD4 (T4) recognizes the class II CHM molecules during the interaction of CD4 + cells with antigen presenting cells or target cells. It is a 59 kD glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily. It is found on the "helper / inducer" subpopulation of T cells (45% of peripheral blood lymphocytes).
CD 8
La molécule CD 8 (T8, 30/32 kD) est une glycoprotéine composée de deux chaînes peptidiques. Il se trouve sur la sous-population cytotoxique/suppresseur des lymphocytes T (20-35% des lymphocytes du sang périphérique). I1 est aussi présent sur les cellules NK et sur 30% des cellules "nulles" du sang périphérique.CD 8
The CD8 molecule (T8, 30/32 kD) is a glycoprotein composed of two peptide chains. It is found on the cytotoxic / suppressor subset of T cells (20-35% of peripheral blood lymphocytes). It is also present on NK cells and on 30% of the "null" cells of the peripheral blood.
CD 15
L'antigène CD 15 (3FAL, X-haptène, SSEA) est un lacto-Nfucopentose III (200-185 kD). Au moins 5 antigènes majeurs de CD 15 sont présents sur la surface des cellules polynucléaires (environ 90% des granulocytes humains circulant) et sur une partie des monocytes circulants (30-60%). Cet antigène est absent de la surface des lymphocytes normaux.CD 15
The CD15 antigen (3FAL, X-hapten, SSEA) is a lacto-Nfucopentose III (200-185 kD). At least 5 major CD15 antigens are present on the surface of the polynuclear cells (approximately 90% of circulating human granulocytes) and on part of the circulating monocytes (30-60%). This antigen is absent from the surface of normal lymphocytes.
CD 20
L'antigène CD20 est une phosphoprotéine de 35/37kD. I1 est présent sur toutes les cellules B normales du sang périphérique, de l'amygdale et de la moëlle osseuse.CD 20
The CD20 antigen is a 35 / 37kD phosphoprotein. It is present on all normal B cells of peripheral blood, amygdala and bone marrow.
CD25
La molécule de CD25 correspond au récepteur de basse affinité de l'interleukine-2. C'est une glycoprotéine de 55 kD exprimée par les lymphocytes activés (T et B) mais aussi par les macrophages activés.CD25
The CD25 molecule corresponds to the low-affinity receptor for interleukin-2. It is a 55 kD glycoprotein expressed by activated lymphocytes (T and B) but also by activated macrophages.
CD45RO
C'est une glycoprotéine transmembranaire de 180 kD (l'isoforme de bas poids moléculaire de l'antigène commun des leucocytes) (LCA). Il est présent sur la surface des lymphocytes T, des thymocytes, des granulocytes, des monocytes (mais il est absent de la surface des macrophages) et sur une petite population des lymphocytes B. Les lymphocytes T exprimant le CD45RO sont des lymphocytes T mémoires (ou primed T cells) (45% des lymphocytes T du sang périphérique). CD45RO
It is a 180 kD transmembrane glycoprotein (the low molecular weight isoform of the common leukocyte antigen) (LCA). It is present on the surface of T lymphocytes, thymocytes, granulocytes, monocytes (but it is absent from the surface of macrophages) and on a small population of B lymphocytes. T lymphocytes expressing CD45RO are memory T lymphocytes ( or primed T cells) (45% of peripheral blood T lymphocytes).
Les cellules CD4+/CD45RO+ produisent les signaux "helper". Ce sont des producteurs précoces de IL-2 et IFNn. CD4 + / CD45RO + cells produce "helper" signals. They are early producers of IL-2 and IFNn.
Pour le marquage avec les anticorps anti CDx (produits Sigma, excepté l'anticorps anti CD25, de Serotec), on prend 100 yI de la suspension lymphocytaire (marquée déjà ou non) avec l'anticorps anti récepteur de l'élastine 67 kD à une densité cellulaire de 107 cellules/ml. For labeling with the anti-CDx antibodies (Sigma products, except the anti-CD25 antibody, from Serotec), 100 μl of the lymphocyte suspension (already labeled or not) is taken with the anti-67 kD elastin receptor antibody. a cell density of 107 cells / ml.
On ajoute 10 ml de l'anticorps anti CDx et on incube 30 minutes à 20
C (excepté avec l'anticorps anti CD25: l'incubation s'effectue à 0 C).10 ml of anti CDx antibody is added and incubated for 30 minutes at 20 minutes.
C (except with the anti-CD25 antibody: the incubation is carried out at 0 ° C.).
Ensuite, on ajoute 2 ml de PBS. Après deux lavages (deux centrifugations à 400 g pendant 10 minutes à 20 C), on prend le culot cellulaire, on y ajoute 0,5 ml de PBS et on analyse la suspension par cytofluorimétrie. Then 2 ml of PBS is added. After two washes (two centrifugations at 400 g for 10 minutes at 20 ° C.), the cell pellet is taken, 0.5 ml of PBS is added and the suspension is analyzed by cytofluorimetry.
On effectue également le marquage des cellules par des anticorps monoclonaux spécifiques de différents récepteurs des lymphocytes. The cells are also labeled with monoclonal antibodies specific for different lymphocyte receptors.
RESULTATS a) Microscopie à fluorescence
Mise en évidence du récepteur de l'élastine sur des Ivmphocvtes activés
Une partie des lymphocytes analysés, - ceux qui expriment le récepteur de l'élastine/laminine de 67 kD - montrent une immunofluorescence spécifique dans les conditions expérimentales décrites ci-dessus (cellules positives).RESULTS a) Fluorescence microscopy
Demonstration of Elastin Receptor on Activated Ivmphocvtes
Part of the lymphocytes analyzed, those which express the 67 kD elastin / laminin receptor, show a specific immunofluorescence under the experimental conditions described above (positive cells).
Le pourcentage de cellules positives au 4è iour de culture est évalué par microscopie à fluorescence: - les cellules cultivées en présence de 2 Fg/ml de kappa-élastine 28,52 + 12,60 - les cellules cultivées sans kappa-élastine 28,09 + 10,91 %
Il n'y a pas de différence significative entre les deux séries, l'activation par le PHA est un stimulus suffisant pour faire exprimer le récepteur de l'élastine. The percentage of cells positive at the 4th day of culture is evaluated by fluorescence microscopy: cells cultured in the presence of 2 μg / ml of kappa-elastin 28.52 + 12.60 cells cultured without kappa-elastin 28.09 + 10.91%
There is no significant difference between the two series, activation by the PHA is a sufficient stimulus to express the elastin receptor.
Le pourcentage de cellules positives au 5e jour de culture: - les cellules cultivées en présence de 2 ,ug/ml de kappa-élastine : 77,2% + 6,7%. Percentage of cells positive at day 5 of culture: cells cultured in the presence of 2 μg / ml of kappa-elastin: 77.2% + 6.7%.
Effet du lavage des cellules avec lactose ou mélibiose: - les cellules cultivées en présence de 2 llg/ml de kappa-élastine + lavées à la fin de la culture cellulaire avec une solution de 1 mg/ml de lactose: 26,6% # 6,7% (p < 0.001). Effect of washing cells with lactose or melibiose: cells cultured in the presence of 2 μg / ml of kappa-elastin + washed at the end of the cell culture with a solution of 1 mg / ml of lactose: 26.6% # 6.7% (p <0.001).
Avant lavage, 77,2% des cellules sont positives - les cellules cultivées 5 jours en présence de 2 pg/ml de kappa-élastine + lavées à la fin de la culture cellulaire avec une solution de 1 mg/ml de mélibiose: 18,3 % # 9,7% (p < 0.001). Before washing, 77.2% of the cells are positive - the cells cultured for 5 days in the presence of 2 μg / ml of kappa-elastin + washed at the end of the cell culture with a solution of 1 mg / ml of melibiose: 18, 3% # 9.7% (p <0.001).
Les cellules fluorescentes incubées uniquement avec le deuxième anticorps (témoins négatifs) et pas avec le premier anticorps ne montrent pas de fluorescence. Il apparaît donc que le mélibiose est plus efficace que le lactose pour désorber la sous-unité 67 kD du récepteur de l'élastine des lymphocytes : le lactose désorbe 66% du récepteur et le mélibiose 76% dans les conditions expérimentales utilisées. Fluorescent cells incubated only with the second antibody (negative controls) and not with the first antibody do not show fluorescence. It therefore appears that melibiose is more effective than lactose in desorbing the 67 kD subunit of the elastin receptor of lymphocytes: lactose desorbs 66% of the receptor and melibiose 76% under the experimental conditions used.
b) Cytofluorimétrie
Tableau 3
Pourcentage des lymphocytes humains exprimant le récepteur
de I'élastine aux différents jours de culture JO: au jour de la séparation des lymphocytes;
J2, J3, J5 : au deuxième; troisième; cinquième jour après la séparation des lymphocytes.(b) Cytofluorimetry
Table 3
Percentage of human lymphocytes expressing the receptor
of elastin at different days of culture OJ: at the day of separation of lymphocytes;
J2, J3, J5: to the second; third; fifth day after the separation of the lymphocytes.
% des cellules positives
Jour sans nbre avec 2 llg/ml P
kappa-élastine d'expériences de kappa-élastine
JO 1.12 + 0.2 % 6 1.15 + 0.1 %
J2 22.33+5.2.% 5 23.02+3.2%
J3 29.70+0.8 % 7 32.40 + 3.5 % 0.178
J5 59.91#4.9% 10 66.42 + 1.9 % 0.006
Il ressort de cette expérience que l'incubation des cellules avec le
PHA comme stimulant induit progressivement l'expression du récepteur de l'élastine. Cette induction est encore stimulée en présence de peptides d'élastine. Toutefois, cette stimulation ne devient significative qu'à partir du Sème jour de culture. Dans ces conditions environ deux tiers des lymphocytes ( > 66%) expriment le récepteur de l'élastine à leur surface. % of positive cells
Day without number with 2 llg / ml P
kappa-elastin from kappa-elastin experiments
OJ 1.12 + 0.2% 6 1.15 + 0.1%
J2 22.33 + 5.2.% 5 23.02 + 3.2%
J3 29.70 + 0.8% 7 32.40 + 3.5% 0.178
J5 59.91 # 4.9% 10 66.42 + 1.9% 0.006
It emerges from this experiment that the incubation of the cells with the
PHA as a stimulant gradually induces the expression of the elastin receptor. This induction is further stimulated in the presence of elastin peptides. However, this stimulation does not become significant until the 5th day of culture. Under these conditions about two-thirds of the lymphocytes (> 66%) express the elastin receptor on their surface.
- Résultats des doubles marquages
Tableau 4
Expérience de double marquage des lymphocytes pour
déterminer la nature des sous populations exprimant le
récepteur de l'élastine
% des cellules exprimant le récepteur (67 kD)
de l'élastine + le marqueur CDx
sans kappa élastine avec kappa élastine
R67kD+ 59.9 66.4 CD4+R67kD+ 26.5 45.7
CD8+R67kD+ 11.9 16.1 CD15+R67kD+ 0.0 0.0
CD20+R67kD+ 36.7 36.3
CD25+R67kD+ 39.6 46.9 CD45RO+R67kD+ 26.6 41.1
CDx+R67kD = cellules marquées simultanément par l'anticorps anti CDx et avec anticorps anti sousunité du récepteur de l'élastine de 67 kD. - Results of double markings
Table 4
Double lymphocyte labeling experiment for
determine the nature of the subpopulations expressing
elastin receptor
% of cells expressing the receptor (67 kD)
elastin + the CDx marker
without kappa elastin with kappa elastin
R67kD + 59.9 66.4 CD4 + R67kD + 26.5 45.7
CD8 + R67kD + 11.9 16.1 CD15 + R67kD + 0.0 0.0
CD20 + R67kD + 36.7 36.3
CD25 + R67kD + 39.6 46.9 CD45RO + R67kD + 26.6 41.1
CDx + R67kD = cells simultaneously labeled with anti-CDx antibody and anti-subunit antibody of the 67 kD elastin receptor.
Remarque : La somme des pourcentages ne donne pas 100% puisque une
cellule peut exprimer simultanément plusieurs récepteurs.Note: The sum of the percentages does not give 100% since a
cell can simultaneously express multiple receivers.
Dans cette expérience, la nature de la sous classe de lymphocytes exprimant le récepteur de l'élastine en présence et en absence de peptides d'élastine, a été déterminée par double marquage. In this experiment, the nature of the subclass of lymphocytes expressing the elastin receptor in the presence and absence of elastin peptides was determined by double labeling.
I1 apparaît que la plupart des sous classes lymphocytaires examinées expriment le récepteur de l'élastine, à l'exception des cellules CD15+ qui restent négatives. Or ce marqueur CD15 correspond aux PMN et à une partie de monocytes. It appears that most of the lymphocyte subclasses examined express the elastin receptor, with the exception of the CD15 + cells which remain negative. However, this marker CD15 corresponds to PMN and a part of monocytes.
Cette expression n'est stimulée d'une façon importante par la présence de peptides d'élastine que sur les lymphocytes CD4+ et CD45RO+ qui en présence de peptides d'élastine ont fortement augmenté l'expression du récepteur de l'élastine. I1 s'agit là d'une sous population de cellules considérée comme des cellules helpers et à mémoire. Le couplage du récepteur de l'élastine par rétroaction positive à sa propre synthèse après son activation serait donc spécifique de ces cellules. This expression is significantly stimulated by the presence of elastin peptides only on the CD4 + and CD45RO + lymphocytes which in the presence of elastin peptides strongly increased the expression of the elastin receptor. This is a subset of cells considered as helpers and memory cells. The coupling of the elastin receptor by positive feedback to its own synthesis after its activation would therefore be specific for these cells.
Exemple 4: Protection contre l'effet cytotoxique de la kappa
élastine de faible poids moléculaire sur les
lymphocytes 1) Isolement des lymphocytes
Isolement des lymphocytes selon la méthode décrite dans l'exemple 1.Example 4 Protection against the cytotoxic effect of kappa
elastin of low molecular weight on
lymphocytes 1) Isolation of lymphocytes
Isolation of lymphocytes according to the method described in Example 1.
On dilue la suspension cellulaire avec le RPMI contenant 5 mM de glutamine et 10% de SVF de façon à ce que la concentration soit 106 cellules/2ml. The cell suspension is diluted with RPMI containing 5 mM glutamine and 10% FCS so that the concentration is 106 cells / 2 ml.
2) Culture cellulaire (Jo)
On met les lymphocytes en culture dans des plaques Costar de 24 puits (500 > 1 suspension cellulaire/puit à concentration de 106 cellules/2ml) dans le milieu RPMI 1640 complémenté. La distribution des cellules est la suivante - 10 ml de suspension cellulaire sans K-élastine; - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 Fg/ml K-élastine, et 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine (contrôles avec kappa-élastine, sans lactose et mélibiose); - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine + 1 mg/ml mélibiose - 10 ml de suspension cellulaire avec 2 mg/ml K-élastine + 1 mg/ml lactose - 10 ml de suspension cellulaire avec 1 mg/ml mélibiose - 10 ml de suspension cellulaire avec 1 mg/ml lactose 3) Comptage des cellules en présence de bleu de trypan pour déterminer le pourcentage de cellules mortes
Au cinquième jour de culture (J4), on récupère la suspension cellulaire, on compte les cellules sur cellule de Malassez en présence de 0.1% de bleu de trypan (Sigma) (seules les cellules mortes sont colorées en bleu avec le bleu de trypan). On compte tout de suite après avoir ajouté le colorant à cause de la toxicité du bleu trypan. 2) Cell culture (Jo)
The lymphocytes are cultured in Costar plates of 24 wells (500 μl cell suspension / well at a concentration of 10 6 cells / 2 ml) in supplemented RPMI 1640 medium. The distribution of the cells is as follows - 10 ml of cell suspension without K-elastin; 10 ml of cell suspension with 2 μg / ml K-elastin, and 10 ml of cell suspension with 2 mg / ml K-elastin (controls with kappa-elastin, without lactose and melibiose); - 10 ml of cell suspension with 2 mg / ml K-elastin + 1 mg / ml melibiose - 10 ml of cell suspension with 2 mg / ml K-elastin + 1 mg / ml lactose - 10 ml of cell suspension with 1 mg / ml ml melibiose - 10 ml cell suspension with 1 mg / ml lactose 3) Count cells in the presence of trypan blue to determine the percentage of dead cells
On the fifth day of culture (D4), the cell suspension is recovered, the cells are counted on Malassez cell in the presence of 0.1% of trypan blue (Sigma) (only the dead cells are stained blue with trypan blue) . We count right after adding the dye because of the toxicity of trypan blue.
RESULTATS
TRAITEMENT nombre de cellules/ml % des cellules mortes
(bleu de trypan) sans kappa-élastine 5.8+0.6 9.2 + 0.4 avec 2 lg/ml kappaélastine (control) 10.23 + 3.5 6.6. + 1.3 avec 2 mg/ml kappaélastine 3.6 + 1.0 41.3 + 3.1 avec 1 mg/ml lactose 7.7+1.5 14.5+1.9 avec 1 mg/ml mélibiose 7.26 + 1.3 15.4 + 1.6 avec 2mg/ml kappaélastine + 1 mg/ml lactose 8.8. + 0.7 10.6 + 2.3 avec 2 mg/ml kappaélastine + 1 mg/ml mélibiose 8.8. + 1.6 10.5 + 0.9
Le tableau montre le pourcentage de cellules mortes en présente de peptides d'élastine et la protection contre la mort cellulaire par le lactose et le mélibiose. Cette protection est proche de 100% : la surmortalité (comparée au contrôl sans k-élastine) est de 32,1% avec 2mg/ml de peptides d'élastine. En présence de lactose ou de mélibiose cette surmortalité est de 1,3% (96% de protection). RESULTS
TREATMENT number of cells / ml% of dead cells
(trypan blue) without kappa-elastin 5.8 + 0.6 9.2 + 0.4 with 2 lg / ml kappaelastine (control) 10.23 + 3.5 6.6. + 1.3 with 2 mg / ml kappaelastine 3.6 + 1.0 41.3 + 3.1 with 1 mg / ml lactose 7.7 + 1.5 14.5 + 1.9 with 1 mg / ml melibiose 7.26 + 1.3 15.4 + 1.6 with 2 mg / ml kappaelastine + 1 mg / ml lactose 8.8 . + 0.7 10.6 + 2.3 with 2 mg / ml kappaelastine + 1 mg / ml melibiose 8.8. + 1.6 10.5 + 0.9
The table shows the percentage of dead cells present with elastin peptides and the protection against cell death by lactose and melibiose. This protection is close to 100%: the excess mortality (compared to the control without k-elastin) is 32.1% with 2 mg / ml of elastin peptides. In the presence of lactose or melibiose this excess mortality is 1.3% (96% protection).
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