FR2747396A1 - Procede de detection d'une sequence d'acide nucleique a analyser - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet un procédé de détection d'une séquence d'acide nucléique à analyser comprenant les étapes consistant à: a) mettre en contact ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec un mélange comprenant une sonde oligonudéotidique de 4 à 6 bases et une paire de séquences oligonudéotidiques flanquant ladite sonde, ou leurs dérivés portant des groupements aromatiques polycydiques, éventuellement hétérocycliques, ladite sonde et/ou lesdites séquences oligonudéotidiques étant marquée(s), dans des conditions permettant l'hybridation de ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec ledit mélange; b) soumettre les hybrides formés à une réaction de ligation entre ladite sonde oligonudéotidique de 4 à 6 bases et lesdites séquences oligonudéotidiques flanquantes ou leurs dérivés; c) analyser les produits de ligation.
Description
La présente invention concerne la biologie moléculaire et peut être appliquée au diagnostic de maladies génétiques et d'autres maladies dues à des changements dans la structure des acides nucléiques, y compris des mutations ponctuelles difficiles à diagnostiquer, ainsi qu'au diagnostic des affections virales par la détection des acides nucléiques viraux.
Le procédé le plus proche de celui de la présente invention est un procédé de détection de séquences d'acides nucléiques contenant des mutations ponctuelles au moyen d'une sonde oligonucléotidique complémentaire de 'ADN à analyser, préparée par ligation, dans un "complexe complémentaire", de deux oligonucléotides (de 8 et 14 bases de long), un des deux oligonucléotides étant marqué au 32P [Dan Y. Wu et
Bruce R. Wallace, Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage
T4 DNA ligase, Gene (1989) 245-254]. En présence d'une mutation dans un site complémentaire d'hybridation des oligonucléotides, le rendement de sonde ligaturée en un hybride imparfait est inférieur au rendement de sonde ligaturée formant un hybride parfait.
Bruce R. Wallace, Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage
T4 DNA ligase, Gene (1989) 245-254]. En présence d'une mutation dans un site complémentaire d'hybridation des oligonucléotides, le rendement de sonde ligaturée en un hybride imparfait est inférieur au rendement de sonde ligaturée formant un hybride parfait.
Le facteur maximal de discrimination d'une mutation ponctuelle (3 à 5 fois) est observé dans le cas où l'hybride imparfait formé par les deux oligonucléotides et 'ADN présente un mésappariement au niveau du site de ligation.
L'inconvénient de ce procédé est une sélectivité faible dans le cas de la formation des hybrides imparfaits lors d'une mutation ponctuelle sur l'ADN. La différence de rendement en produit ligaturé entre le cas où 'ADN est normal (" régulier") et le cas où l'ADN est muté ("irrégulier") atteint trois à cinq fois (facteur de discrimination).
L'invention a pour objet une méthode de diagnostic à haute sélectivité (haut facteur de discrimination) de maladies virales, génétiques et d'autres maladies dues à des changements dans la structure des acides nucléiques, y compris des mutations ponctuelles.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de détection d'une séquence d'acide nucléique à analyser comprenant les étapes consistant å:
a) mettre en contact ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec un mélange comprenant une sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et une paire de séquences oligonucléotidiques flanquant ladite sonde, ou leurs dérivés portant des groupements aromatiques polycycliques, éventuellement hétérocycl iques,
ladite sonde eVou lesdites séquences oligonucléotidiques étant marquée(s),
dans des conditions permettant l'hybridation de ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec ledit mélange;
b) soumettre les hybrides formés à une réaction de ligation entre ladite sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et lesdites séquences oligonucléotidiques flanquantes ou leurs dérivés;
c) analyser les produits de ligation.
a) mettre en contact ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec un mélange comprenant une sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et une paire de séquences oligonucléotidiques flanquant ladite sonde, ou leurs dérivés portant des groupements aromatiques polycycliques, éventuellement hétérocycl iques,
ladite sonde eVou lesdites séquences oligonucléotidiques étant marquée(s),
dans des conditions permettant l'hybridation de ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec ledit mélange;
b) soumettre les hybrides formés à une réaction de ligation entre ladite sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et lesdites séquences oligonucléotidiques flanquantes ou leurs dérivés;
c) analyser les produits de ligation.
De manière préférentielle, lesdites séquences oligonucléotidiques flanquant la sonde, ou leurs dérivés, peuvent comprendre de 6 à 14 nucléotides.
Lesdites séquences d'acide nucléique à détecter peuvent notamment comprendre une ou des mutations ponctuelles.
De manière préférentielle, lors de la détermination d'une mutation, on choisit la séquence de ladite sonde oligonucléotidique de telle sorte que la mutation à détecter soit localisée au niveau d'au moins un site de ligation.
Par "séquences flanquantes", on entend des séquences adjacentes à ladite sonde oligonuciéotidique, qui possèdent une extrémité libre susceptible de se lier à ladite sonde par une liaison 3'-5' phosphodiester, sous l'action d'une ligase.
L'expression "sonde ou séquences ol igonucléotiques marquée(s)" signifie que ladite sonde et/ou lesdites séquences oligonucléotiques portent un ou des agents de marquage les rendant détectables. Lesdits agents de marquage (appelés aussi "marqueurs" ou "rapporteurs") peuvent être notamment un groupe fluorescent, une enzyme, ou un élément radioactif, la liaison d'un marqueur à une séquence nucléotidique étant bien connue de l'homme du métier.
Par "conditions d'hybridation", on entend les conditions d'hybridation mises en oeuvre de manière usuelle par l'homme du métier (Sambrook et al. , Molecular Cloning, A laboratory Manual, 9.47-9.62, 1989).
Conformément à l'invention, on peut utiliser des oligonucléotides dérivés, portant des groupements aromatiques polycycliques éventuellement hétérocycliques, qui stabilisent les hybrides. De préférence, ces groupements aromatiques peuvent être di-, tri-, tetra-, ou pentacycliques. Ils peuvent éventuellement comporter un ou plusieurs hétéroatomes, choisis de préférence parmi 0, S, et N. De préférence, ces groupements aromatiques polycycliques peuvent comporter de 6 à 18 atomes de carbone. Des exemples de tels groupements aromatiques sont notamment le naphtyle, le phénanthryle,
I'indolyle, le quinolyle, le quinazolyle, I'acridinyle, le phénanthrolinyle, le phénazinyle, etc.
I'indolyle, le quinolyle, le quinazolyle, I'acridinyle, le phénanthrolinyle, le phénazinyle, etc.
Conformément à l'invention, on utilise comme sonde oligonucléotidique, un (tétra-, penta-, hexa-)mère ligaturé avec deux oligonucléotides courts ou leurs dérivés portant des groupements aromatiques polycycliques, permettant la formation d'un hybride parfait complémentaire de la séquence d'ADN à analyser. Habituellement, pour détecter des acides nucléiques étrangers par hybridation ou des mutations ponctuelles à l'aide de ligase, on utilise comme sonde oligonucléotidique des oligonucléotides étendus formant des hybrides stables avec les séquences d'acide nucléique analysées. Néanmoins, de tels oligonucléotides sont également capables de former des hybrides imparfaits suffisamment solides avec un acide nucléique, ce qui mène à une réduction de la sélectivité de détection des séquences d'acide nucléique à analyser.
Les oligonucléotides, en particulier les tétranucléotides, possèdent, dans des conditions physiologiques, des propriétés d'hybridation extrêmement limitées. Dans le procédé selon l'invention, une sonde oligonucléotidique courte (tétra-, penta-, hexa-mère) est flanquée des deux côtés par des oligonucléotides ou leurs dérivés portant des groupes stabilisant les hybrides, contribuant à la formation d'un hybride entre la sonde et la séquence à analyser. L'hybride formé avec une sonde oligonucléotidique courte (tétra-, penta-, hexa-mère) est stabilisé par les interactions coopératives entre les résidus nucléotidiques terminaux lors de la formation d'hybrides parfaits en tandem. En présence d'une mutation au niveau du site de ligation d'une sonde oligonucléotidique, la stabilité de l'hybride diminue considérablement, ce qui constitue la cause de la haute sélectivité offerte par le présent procédé. Le facteur supplémentaire contribuant à l'augmentation de la sélectivité de la ligation des sondes oligonucléotidiques en tandem réside dans la capacité d'une enzyme à détecter les mésappariements de 2-3 nucléotides près d'un site de ligation tel que décrit dans l'article de Kazuo et Leslie E. Orgel, Unexpected substrate specificity of T4 DNA ligase revealed by in vitro selection, Nucleic Acids, Research, 1993, 21, 22872291, lors de la ligation d'oligonucléotides matrices capable de former des structures en épingles à cheveux.
Le procédé est bon marché, facile à mettre en oeuvre, et peut être appliqué dans une large gamme de températures et de concentrations en oligonucléotides. Le facteur de discrimination des séquences contenant des mutations est supérieur à 100.
Des variantes de réalisation de la présente invention sont illustrées dans les exemples suivants.
EXEMPLES
Des recherches ont été effectuées sur des acides nucléiques constitués par des produits d'amplification symétrique d'ADN (PO : cible "régulière" non mutée, P1-P4 cibles contenant toutes les douze substitutions ponctuelles possibles dans la région centrale tétranucléotidique).
Des recherches ont été effectuées sur des acides nucléiques constitués par des produits d'amplification symétrique d'ADN (PO : cible "régulière" non mutée, P1-P4 cibles contenant toutes les douze substitutions ponctuelles possibles dans la région centrale tétranucléotidique).
5'TGCCTGGAGCTGCTTGATGC@ PO fragment d'ADN
CGACp
ACGGACCTp GAACTACGp
pNnI sonde pNnII
TCGACGp
ACGGACGp AACTACGp
ACGGACCTCGACp GAACTACGp
CGACp
ACGGACCTp 5'TGCCTGGAXCTGCTTGATGC# P1 X=A, T, C 5'TGCCTGGAGXTGCTTGATGC# P2 X=A, T, G 5'TGCCTGGAGCXGCTTGATGC P3 X=A, C, G 5'TGCCTGGAGCTXCTTGATGC P4 X=A, T, C
où pNn est un oligonucléotide ou son dérivé portant un groupement aromatique polycyclique (n > 6).
CGACp
ACGGACCTp GAACTACGp
pNnI sonde pNnII
TCGACGp
ACGGACGp AACTACGp
ACGGACCTCGACp GAACTACGp
CGACp
ACGGACCTp 5'TGCCTGGAXCTGCTTGATGC# P1 X=A, T, C 5'TGCCTGGAGXTGCTTGATGC# P2 X=A, T, G 5'TGCCTGGAGCXGCTTGATGC P3 X=A, C, G 5'TGCCTGGAGCTXCTTGATGC P4 X=A, T, C
où pNn est un oligonucléotide ou son dérivé portant un groupement aromatique polycyclique (n > 6).
EXEMPLE 1
On utilise une concentration de 10-8 à 10-5 M d'acide nucléique cible (PO), et une séquence complémentaire d'un fragment de cet acide nucléique, formée par une sonde tétraoiigonucléotidique (CGACp) et une paire d'oligonucléotides (ACGGACCTp et GAACTACGp) à une concentration de 10-8 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P, soit l'oligonucléotide Il comporte un groupe de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15 ml d'une solution de tampon de ligation (MgC12 0.001-0.01 M, ATP 1-10 mM, dithiothréitol 1-10 mM, pH 7-8), à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes.
On utilise une concentration de 10-8 à 10-5 M d'acide nucléique cible (PO), et une séquence complémentaire d'un fragment de cet acide nucléique, formée par une sonde tétraoiigonucléotidique (CGACp) et une paire d'oligonucléotides (ACGGACCTp et GAACTACGp) à une concentration de 10-8 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P, soit l'oligonucléotide Il comporte un groupe de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15 ml d'une solution de tampon de ligation (MgC12 0.001-0.01 M, ATP 1-10 mM, dithiothréitol 1-10 mM, pH 7-8), à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes.
On a analysé le produit de ligation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
Le rendement en produit ligaturé est de 30 à 40 %.
EXEMPLE la
On procède comme décrit à l'exemple 1. A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise ledit tétramère qu'on ligature avec ladite paire de dérivés oligonucléotidiques portant des groupements à base de phénazine.
On procède comme décrit à l'exemple 1. A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise ledit tétramère qu'on ligature avec ladite paire de dérivés oligonucléotidiques portant des groupements à base de phénazine.
Le rendement en produit ligaturé est de 35 à 40 % en électrophorèse.
EXEMPLE 2
On procède comme décrit à l'exemple 1. A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise un hexamère TCGACGp. Les oligonucléotides utilisés sont ACGGACCp et AACTACGp.
On procède comme décrit à l'exemple 1. A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise un hexamère TCGACGp. Les oligonucléotides utilisés sont ACGGACCp et AACTACGp.
Le rendement en produit ligaturé est de 50 à 60 % en électrophorèse.
EXEMPLE 3
On procède comme décrit à l'exemple 1.
On procède comme décrit à l'exemple 1.
A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise un dodécamère ACGGACCTCGACp ligaturé avec un octaoligonucléotide GAACTACGp.
Le rendement en produit ligaturé est de 60 à 70 %.
EXEMPLE 4
On procède comme décrit à l'exemple 1.
On procède comme décrit à l'exemple 1.
A titre de sonde oligonucléotidique, on utilise ledit tétramère ligaturé avec un octaoligonucléotide.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 %.
EXEMPLE 5
On utilise l'acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 105M, le complexe complémentaire étant formé par P1 + l'oligonucléotide I ACGGACCTp + la sonde tétraoligonucléotidique
CGACp + l'oligonucléotide 11 GAACTACGp (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde et des oligonucléotides est de 10-8 à 10-5 M.
On utilise l'acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 105M, le complexe complémentaire étant formé par P1 + l'oligonucléotide I ACGGACCTp + la sonde tétraoligonucléotidique
CGACp + l'oligonucléotide 11 GAACTACGp (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde et des oligonucléotides est de 10-8 à 10-5 M.
Soit la sonde est marquée au 32P soit l'oligonucléotide II porte un groupe de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de tampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On a analysé le produit de ligation par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 6
On utilise l'acide nucléique P1 (X=T), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + I'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques).
On utilise l'acide nucléique P1 (X=T), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + I'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques).
L'expérience est menée telle que décrite à l'exemple 5.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 %.
EXEMPLE 7
On utilise l'acide nucléique P1 (X=C), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 +
I'oligonucléotide I + une sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide Il (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience a été menée tel que décrit à l'exemple 5.
On utilise l'acide nucléique P1 (X=C), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 +
I'oligonucléotide I + une sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide Il (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience a été menée tel que décrit à l'exemple 5.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 %.
EXEMPLE 8
On utilise l'acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + 'oligonucléotide I ACGGACCp + la sonde hexanucléotidique TCGACGp + l'oligonucléotide Il AACTACGp (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience a été menée tel que décrit à l'exemple 5.
On utilise l'acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + 'oligonucléotide I ACGGACCp + la sonde hexanucléotidique TCGACGp + l'oligonucléotide Il AACTACGp (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience a été menée tel que décrit à l'exemple 5.
Le rendement en produit ligaturé est de 5 à 7 %.
EXEMPLE 9
On utilise un acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + le dodécanucléotide ACGGACCTCGACp + un octaoligonucléotide GAACTACGp. L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 5.
On utilise un acide nucléique P1 (X=A), à une concentration de 10-8 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P1 + le dodécanucléotide ACGGACCTCGACp + un octaoligonucléotide GAACTACGp. L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 5.
Le rendement en produit ligaturé est de 30 à 40 %.
EXEMPLE 10
On utilise l'acide nucléique P2 (X=A), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + l'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + l'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 104 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P soit l'oligonucléotide
Il porte un groupement de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de tampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On analyse le produit ligaturé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
On utilise l'acide nucléique P2 (X=A), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + l'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + l'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 104 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P soit l'oligonucléotide
Il porte un groupement de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de tampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On analyse le produit ligaturé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 11
On utilise l'acide nucléique P2 (X=T), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + 'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 10.
On utilise l'acide nucléique P2 (X=T), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + 'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 10.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 12
On utilise l'acide nucléique P2 (X=G), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + l'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + 'oligonucléotide Iî (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 10.
On utilise l'acide nucléique P2 (X=G), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P2 + l'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + 'oligonucléotide Iî (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 10.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 13
On utilise l'acide nucléique P3 (X=A), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P3 + l'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + l'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 10-8 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P soit l'oligonucléotide
Il porte un groupement de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de tampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On analyse le produit ligaturé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
On utilise l'acide nucléique P3 (X=A), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P3 + l'oligonucléotide I + la sonde tétranucléotidique + l'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 10-8 à 10-5 M. Soit la sonde est marquée au 32P soit l'oligonucléotide
Il porte un groupement de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de tampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On analyse le produit ligaturé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 14
On utilise l'acide nucléique P3 (X=C), à une concentration de 10-8 à îO5 M, le complexe hybride étant formé par P3 + l'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + l'oligonucléotide
II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 13.
On utilise l'acide nucléique P3 (X=C), à une concentration de 10-8 à îO5 M, le complexe hybride étant formé par P3 + l'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + l'oligonucléotide
II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 13.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 15
On utilise l'acide nucléique P3 (X=G), à une concentration de 10-8 à îO5 M, le complexe hybride étant formé par P3 +
I'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + I'oligonucléotide
II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 13.
On utilise l'acide nucléique P3 (X=G), à une concentration de 10-8 à îO5 M, le complexe hybride étant formé par P3 +
I'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + I'oligonucléotide
II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 13.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 16
On utilise l'acide nucléique P4 (X=A), à une concentration de 10-8 à 1 î- M, le complexe hybride étant formé par P4 + oligonucléotide
I + la sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 104 à 10-5 M.
On utilise l'acide nucléique P4 (X=A), à une concentration de 10-8 à 1 î- M, le complexe hybride étant formé par P4 + oligonucléotide
I + la sonde tétranucléotidique + I'oligonucléotide II (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). La concentration de la sonde ou des oligonucléotides est de 104 à 10-5 M.
Soit la sonde est marquée au 32p soit l'oligonucléotide Il porte un groupe de fluorescéine. La réaction de ligation est effectuée dans 15ml de solution de Itampon de ligation à une température de 20, 25 et 37 C pendant 15 à 30 minutes. On analyse le produit ligaturé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 20 % dans des conditions dénaturantes.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 17
On utilise l'acide nucléique P4 (X=T), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P4 + 'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + l'oligonucléotide 11 (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 16.
On utilise l'acide nucléique P4 (X=T), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P4 + 'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + l'oligonucléotide 11 (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 16.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
EXEMPLE 18
On utilise l'acide nucléique P4 (X=C), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P4 +
I'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + 'oligonucléotide
Il (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 16.
On utilise l'acide nucléique P4 (X=C), à une concentration de 104 à 10-5 M, le complexe hybride étant formé par P4 +
I'oligonucléotide I + la sonde tétraoligonucléotidique + 'oligonucléotide
Il (ou les dérivés des oligonucléotides portant des groupements aromatiques polycycliques). L'expérience est menée comme décrit à l'exemple 16.
Le rendement en produit ligaturé est de 0 % en électrophorèse.
On évalue l'efficacité de détermination des mutations ponctuelles dans les séquences d'acides nucléiques d'après le facteur de discrimination calculé comme étant le rapport du rendement en produit ligaturé dans le cas d'une hybridation parfaite avec une séquence ne comportant pas de mutation ponctuelle sur le rendement en produit ligaturé dans le cas d'une séquence comportant une mutation ponctuelle.
Plus le facteur de discrimination est élevé, et plus la détection de la séquence d'acides nucléiques recherchée est précise.
Comme on peut le constater sur les données du tableau,
I'utilisation de la sonde tétraoligonucléotidique courte permet d'obtenir le facteur de discrimination le plus élevé et considérablement supérieur à celui obtenu par l'état de la technique sous les conditions décrites dans l'état de la technique Cela donne l'assurance d'une détection fiable des séquences d'acides nucléiques prédéterminées, y compris des séquences contenant des mutations ponctuelles.
I'utilisation de la sonde tétraoligonucléotidique courte permet d'obtenir le facteur de discrimination le plus élevé et considérablement supérieur à celui obtenu par l'état de la technique sous les conditions décrites dans l'état de la technique Cela donne l'assurance d'une détection fiable des séquences d'acides nucléiques prédéterminées, y compris des séquences contenant des mutations ponctuelles.
TABLEAU
Facteur de discrimination des mutations ponctuelles dans les séquences d'ADN à analyser.
Facteur de discrimination des mutations ponctuelles dans les séquences d'ADN à analyser.
<tb>
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* Dans les exemples 5 à 7, et 10 à 18, le facteur de discrimination est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 1. Dans l'exemple 8 il est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 2. Dans l'exemple 9 il est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 3.
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* Dans les exemples 5 à 7, et 10 à 18, le facteur de discrimination est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 1. Dans l'exemple 8 il est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 2. Dans l'exemple 9 il est calculé par rapport au rendement en produit ligaturé obtenu dans l'exemple 3.
pNn est un oligonucléotide ou son dérivé portant un groupement aromatique polycyclique (n > 6).
Claims (8)
1. Procédé de détection d'une séquence d'acide nucléique à analyser comprenant les étapes consistant à:
a) mettre en contact ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec un mélange comprenant une sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et une paire de séquences oligonucléotidiques flanquant ladite sonde, ou leurs dérivés portant des groupements aromatiques polycycliques, éventuellement hétérocycliques,
ladite sonde et/ou lesdites séquences oligonucléotidiques étant marquée(s),
dans des conditions permettant l'hybridation de ladite séquence d'acide nucléique à analyser avec ledit mélange;
b) soumettre les hybrides formés à une réaction de ligation entre ladite sonde oligonucléotidique de 4 à 6 bases et lesdites séquences oligonucléotidiques flanquantes ou leurs dérivés;
c) analyser les produits de ligation.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdites séquences d'acide nucléique à analyser comprennent une ou des mutations ponctuelles.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la séquence de ladite sonde oligonucléotidique est telle que la mutation à détecter est localisée au niveau d'au moins un site de ligation de ladite sonde.
4. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel lesdites séquences oligonucléotidiques flanquant la sonde, ou leurs dérivés, comprennent de 6 à 14 nucléotides.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite sonde est flanquée par au moins une séquence oligonucléotidique portant un groupe à base de phénazine.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les produits de ligation sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ladite sonde est marquée au 32P.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel au moins une desdites séquences oligonucléotidiques porte un groupement de fluorescéine.
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|---|---|---|---|
| PCT/RU1996/000087 WO1997038131A1 (fr) | 1996-04-11 | 1996-04-11 | Procede de detection d'une chaine d'acides nucleiques devant etre analysee |
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|---|---|
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| FR2747396B3 FR2747396B3 (fr) | 1998-07-17 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2012003330A3 (fr) * | 2010-06-30 | 2012-12-06 | Stratos Genomics, Inc | Identification multiplexée de séquences d'acide nucléique |
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|---|---|---|---|---|
| US7108973B2 (en) * | 2002-03-20 | 2006-09-19 | Ken-Shwo Dai | Human PEN11B-related gene variant associated with lung cancers |
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|---|---|---|---|---|
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1997
- 1997-04-08 FR FR9704290A patent/FR2747396B3/fr not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012003330A3 (fr) * | 2010-06-30 | 2012-12-06 | Stratos Genomics, Inc | Identification multiplexée de séquences d'acide nucléique |
| US8586301B2 (en) | 2010-06-30 | 2013-11-19 | Stratos Genomics, Inc. | Multiplexed identification of nucleic acid sequences |
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