FR2836926A1

FR2836926A1 - Substrat oligonucleotidique et procede permettant d'analyser la presence d'activites de reparation de lesions de l'adn

Info

Publication number: FR2836926A1
Application number: FR0207358A
Authority: FR
Inventors: Didier Gasparutto; Jean Cadet
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2003-09-12

Abstract

La présente invention se rapporte à un substrat oligonucléotidique et à un procédé permettant d'analyser la présence d'une activité de réparation de lésions de l'ADN. Le substrat oligonucléotidique comprend : un oligonucléotide définissant une zone d'appariement; une lésion déterminée au niveau de ladite zone d'appariement; un marqueur émettant une énergie de fluorescence et une molécule réceptrice absorbant l'énergie de fluorescence émise par le marqueur; le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie étant fixés sur ledit oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que lorsque le marqueur émet de l'énergie à ladite longueur d'onde définie ladite molécule réceptrice l'absorbe de manière détectable, et de telle manière que lorsque ladite lésion déterminée est réparée au moyen d'un ou plusieurs enzyme (s) de réparation de lésions de l'ADN, ladite distance entre le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie est modifiée de manière détectable.

Description

SUBSTRAT OLIGONUCLEOTIDIQUE ET PROCEDE PERMETTANT
D'ANALYSER LA PRESENCE D'ACTIVITES DE REPARATION DE
LESIONS DE L'ADN
DESCRIPTION Domaine technique
La présente invention se rapporte à un substrat oligonucléotidique et à un procédé permettant d'analyser la présence d'activités de réparation de lésions de l'ADN. Il s'agit d'une nouvelle méthode d'analyse qualitative et quantitative de détection d'activités enzymatiques de réparation des lésions de l'ADN in vitro.

L'ADN, acide désoxyribonucléique, présent au sein de chaque cellule des êtres vivants, est le support de l'information génétique et permet le contrôle du fonctionnement de chaque cellule. L'intégrité du message génétique est continuellement remise en question par la génération d'erreurs qui peuvent se produire lors des étapes de réplication ou de transcription de l'ADN. En outre, une multitude d'agents et de processus génotoxiques d'origine exogène ou endogène peuvent altérer l'ADN.

Parmi les agents et processus exogènes, c'est à dire les diverses sources d'agressions extérieures à l'organisme cellulaire, on peut citer les rayonnements UV ou ionisants, le stress oxydant, les agents chimiques, les drogues anti-tumorales, les xénobiotiques, etc. Parmi les processus endogènes, on peut citer les erreurs de réplication, l'instabilité

chimique des bases nucléiques et l'implication des formes réactives de l'oxygène produites au cours du métabolisme énergétique cellulaire ou de réactions immunitaires et inflammatoires.

La grande majorité des lésions de l'ADN, autre que les coupures directes, correspond à une modification de la base nucléique, par exemple une oxydation, une désamination, une alkylation, une fragmentation, une contraction, une hydrolyse, un pontage, etc. Ainsi à l'heure actuelle, plus d'une centaine de nucléosides modifiés issus de réactions de modification de l'ADN ont été identifiés. Ces lésions incluent également des cassures simple et double brin, des sites abasiques, des modifications de bases nucléiques ou encore des pontages ADN-ADN et ADNprotéines.

Ces modifications de l'information génétique peuvent rester silencieuses ou peuvent entraîner des processus pathologiques tels que la létalité, la mutagenèse, la cancérogenèse, le vieillissement cellulaire ou encore des désordres neurologiques. En fait, la toxicité de ces lésions ou dommages générés dans l'ADN dépend de leur pouvoir mutagène ou létal lors des étapes de réplication et de transcription et de l'efficacité des systèmes de réparation cellulaire à les éliminer.

Heureusement, la cellule a développé des systèmes enzymatiques de réparation efficaces qui peuvent prendre en charge la grande majorité de ces dommages. Il existe en effet de nombreuses protéines de réparation de l'ADN, présentes à la fois chez les

procaryotes et les eucaryotes, dont le rôle consiste à éliminer les bases ou séquences modifiées ou mal appariées au sein de l'ADN.

La présente invention concerne trois grands mécanismes de réparation impliqués dans l'élimination de ce type de dommages : la réparation par excision des mésappariements de bases (RMB), la réparation par excision de bases (REB), et la réparation par excision de nucléotides (REN). Le point commun à tous ces processus de réparation réside dans l'étape initiale d'excision et d'élimination du dommage, sous la forme d'une nucléobase, d'un nucléoside ou d'un oligonucléotide, qui induit une coupure de la chaîne nucléique. Cette étape d'excision est suivie au sein de la cellule d'étapes de polymérisation et de ligation qui conduisent à la régénération d'un fragment d'ADN intègre.

Les systèmes de réparation des cassures simple et double brin par recombinaison homologue ou re-ligation non homologue n'entrent pas dans le cadre de la présente invention et ne seront pas discutés dans la présente, au même titre que la réparation par réversion.

Dans le texte qui suit, les références entre crochets renvoient à la liste de références annexée.

Etat de la technique
De nombreux travaux de recherche ont été consacrés ces dernières années à l'étude des lésions de l'ADN. Ces travaux concernent notamment

l'identification, la formation et la mesure des lésions ou altérations de ce biopolymère, ainsi que la détermination des propriétés structurales et biologiques de ces dernières. Ces travaux concernent aussi les activités cellulaires de réparations de ces lésions.

Plusieurs méthodes, basées sur l'utilisation d'oligonucléotides modifiés, permettent par exemple d'évaluer les activités enzymatiques d'excision des dommages de l'ADN. Cependant ces procédés et leurs utilisations restent malheureusement limités à la recherche fondamentale et n'ont pas débouché sur des outils ou applications industrielles et médicales, notamment dans le domaine du diagnostic. Ceci est essentiellement dû à la complexité, à la difficulté d'automatisation ou encore à la faible sensibilité de ces techniques.

Dans la plupart des cas, le substrat oligonucléotidique contenant la ou les lésions à étudier est marqué radioactivement à une de ses extrémités. Par exemple, dans la technique décrite par D'Ham et al., 1999, [l], l'action de l'enzyme est déterminée après électrophorèse sur gel de polyacrylamide du mélange réactionnel. Cette technique est très sensible du fait de la détection radioactive.

Toutefois, l'utilisation de la radioactivité et d'une analyse électrophorétique présente des inconvénients si bien qu'elle nécessite la mise en place d'une instrumentation importante et de précautions d'emploi particulières, qui rendent cette méthode lourde à

mettre en oeuvre et non adaptée à une analyse à haut débit en routine.

Une autre approche méthodologique décrite par D'Ham et al. 1999, [1], évite l'emploi de la radioactivité. Elle utilise l'analyse des fragments nucléiques par spectrométrie de masse en mode MALDITOF. Cette technique n'est qu'informative car elle permet d'accéder au mécanisme d'excision de la lésion.

En revanche, du fait de son manque de sensibilité et de sa difficulté de quantification, cette analyse n'est absolument pas adaptée à la détermination en routine d'activités enzymatiques. En outre, elle nécessite un investissement important.

Une autre technique basée sur la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM) a été utilisée dans l'art antérieur pour détecter des activités enzymatiques de réparation des bases

modifiées de l'ADN. Des études décrites notamment par Dizdaroglu et al., 2000, [2], ont été effectuées à partir d'oligonucléotides de synthèse ou des fragments d'ADN soumis à des rayonnements ionisants. Cette technique, spécifique de la lésion excisée, présente cependant des inconvénients si bien qu'elle nécessite un investissement en matériel analytique important et une préparation d'échantillons lourde et délicate- étape de dérivatisation-pouvant générer des artefacts lors de la quantification de l'activité enzymatique à mesurer.

D'autres auteurs, comme Shivji et al., 1999, [3], ont utilisé un test différent pour analyser les capacités de réparation de dommages par des extraits

cellulaires de diverses origines. Dans ce test, de courts oligonucléotides, contenant une ou plusieurs lésions spécifiques, sont incorporés par ligation enzymatiques soit au sein de fragments d'ADN double-brin linéaires plus longs, c'est à dire de 140- 200 paires de bases, soit au sein de plasmides, c'est à dire de fragments d'ADN double-brin circulaires.

L'analyse des activités d'excision du dommage ou de resynthèse du brin d'ADN s'effectue par autoradiographie après électrophorèse, soit par visualisation des sites de coupure générés par les enzymes de réparation au sein du fragment préalablement marqué au P, soit par quantification des nucléotides radioactifs incorporés au cours de l'étape de resynthèse du brin d'ADN faisant suite à l'élimination du dommage. Ce système s'avère cependant complexe et difficile à mettre en oeuvre, car il implique une étape de ligation enzymatique, d'électrophorèse, d'autoradiographie, une manipulation de radioactivité, etc., et par conséquent il est difficilement utilisable en routine comme technique de criblage ( screening ) rapide.

Il existe en conséquence un réel besoin d'un procédé qui surmonte l'ensemble des problèmes techniques précités, et notamment qui soit fiable, sensible, facile à mettre en oeuvre, qui permet une analyse précise à la fois quantitative et qualitative d'activités de réparation des dommages de l'ADN et qui présente un coût de mise en oeuvre réduit par rapport aux procédés précités de l'art antérieur.

Description détaillée de l'invention
La présente invention a précisément pour but de palier les nombreux inconvénients des techniques d'analyse de réparation de l'ADN de l'art antérieur en fournissant un substrat, son procédé de fabrication, et un procédé génériques très sensibles pour la détection et quantification d'activités de réparation des dommages de l'ADN dans un échantillon.

Le substrat de la présente invention est un substrat oligonucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend : un oligonucléotide définissant une zone d'appariement constituée soit de deux brins complémentaires ayant une structure de type double brin, soit d'un seul brin complémentaire avec une structure de type en épingle à cheveux, une lésion déterminée au niveau de la zone d'appariement, un marqueur émettant une énergie de fluorescence lorsqu'il est excité à une longueur d'onde définie, une molécule réceptrice absorbant l'énergie de fluorescence émise par le marqueur à ladite longueur d'onde définie, le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie étant fixés sur ledit oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que lorsque le marqueur émet de l'énergie à ladite longueur d'onde définie ladite molécule réceptrice l'absorbe de manière détectable, et de telle manière que lorsque ladite lésion déterminée est

réparée au moyen d'un ou plusieurs enzyme (s) de réparation de lésions de l'ADN, ladite distance entre le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie est modifiée de manière détectable.

La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication du substrat oligonucléotidique de la présente invention, comprenant les étapes suivantes : - synthèse d'un oligonucléotide double brin ou simple brin replié en une structure en épingle à cheveux, de manière à ce que l'oligonucléotide synthétisé présente une zone d'appariement, - incorporation, lors de la synthèse de l'oligonucléotide, ou encore au sein de l'oligonucléotide synthétisé, au niveau de la zone d'appariement, d'une lésion déterminée, fixation sur l'oligonucléotide, lors de sa synthèse ou après sa synthèse, d'un marqueur fluorescent émettant une énergie de fluorescence lorsqu'il est excité à une longueur d'onde déterminée, et d'une molécule réceptrice absorbant l'énergie de fluorescence émise par le marqueur à ladite longueur d'onde, le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie étant fixés sur ledit oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que lorsque le marqueur émet de l'énergie à ladite longueur d'onde définie ladite molécule réceptrice l'absorbe de manière détectable, et de telle manière que lorsque ladite lésion déterminée est

La présente invention se rapporte également à un procédé d'analyse d'une activité enzymatique de réparation de lésions de l'ADN dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - mettre un substrat oligonucléotidique selon l'invention dans ledit échantillon dans des conditions qui permettent à l'activité enzymatique de réparation de la lésion dudit substrat de s'exprimer, - suivre l'évolution du signal de fluorescence du marqueur fluorescent à ladite longueur d'onde définie.

La présente invention est basée sur l'utilisation d'un nouveau substrat oligonucléotidique fluorescent, comportant une lésion déterminée, permettant une mesure directe de l'activité enzymatique de réparation par une technique de transfert d'énergie de fluorescence (FRET). Elle permet de la détection et la quantification en temps réel d'activités enzymatiques de réparation des lésions de l'ADN.

Les trois mécanismes de réparation de l'ADN concernés par la présente invention sont cités cidessus. Ils prennent en charge dans les cellules vivantes la plupart des lésions nucléiques par un processus enzymatique commun de coupure puis excision du motif anormal ou endommagé. Ces trois mécanismes de réparation impliquent plusieurs étapes : reconnaissance

de la lésion, incision du brin endommagé, ré-synthèse du nouveau fragment d'ADN intègre et ligation finale comme le décrit Friedberg et al., 1995, [4].

Les processus de réparation par excision de bases (REB) et de réparation par excision des bases mésappariées (RMB) font intervenir au cours de l'étape initiale une famille d'enzymes appelées ADN N-glycosylases, protéines conservées au cours de l'évolution et que l'on retrouve de la bactérie à l'homme en passant par la levure. Ces enzymes peuvent être spécifiques d'un substrat ou reconnaître des catégories de modifications. Dans le cas des ADN N-glycosylases du REB, ces dernières peuvent reconnaître et éliminer les bases oxydées, fragmentées, alkylées, pontées ou encore les sites abasiques.

Concernant le processus de réparation des bases mésappariées, les enzymes impliquées réparent les mauvais appariements présents au sein de l'ADN et issus principalement d'erreurs de réplication. Les ADN N-glycosylases peuvent posséder, outre leur activité N-glycosylasique responsable de l'élimination de la base anormale, une activité endonucléase génératrice d'une coupure de la chaîne oligonucléotidique. Dans le cas où l'ADN N-glycosylase ne possède pas d'activité endonucléase, l'élimination du site abasique néo-formé est effectuée au sein de la cellule par action d'une seconde enzyme de type AP-endonucléase.

Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (REN) fait intervenir plusieurs protéines au sein d'un complexe enzymatique d'excision agissant dans l'étape initiale de cette voie de réparation.

Cette dernière prend en charge essentiellement les dommages volumineux issus de processus radio-, photoou chimio-induits, par exemple les photoproduits UV dimériques, les pontages ADN-ADN intra-brins, les adduits, etc. Contrairement au système de réparation par excision de bases (REB) qui élimine uniquement le nucléoside endommagé, le système de réparation par excision de nucléotides (REN) excise un fragment oligonucléotidique contenant la lésion, en réalisant une incision de part et d'autre de cette dernière, qui conduit à l'élimination d'un fragment de 12 bases chez les procaryotes et d'une trentaine de bases chez les eucaryotes. Il est maintenant bien établi que certaines pathologies humaines graves telles que le xeroderma pigmentosum ou la maladie de Cockaine, se manifestant notamment pas une hypersensibilité aux rayonnements solaires, sont liées à des déficiences de ce système de réparation.

La présente invention représente un outil puissant pour l'analyse et l'étude de l'ensemble de ces processus enzymatiques de réparation de l'ADN qui utilisent ces mécanismes de coupure et d'excision.

Des oligonucléotides marqués utilisés comme substrats oligonucléotidiques constituent l'invention décrite ici. Il s'agit d'oligonucléotides doubles brins, formés de deux brins complémentaires ou simple brin, auto-complémentaire, replié en épingle à cheveux ( hairpin ), de quelques dizaines de bases de longs, contenant une ou plusieurs lésions déterminées, c'est à dire définie (s) et connue (s), de l'ADN. Ces

oligonucléotides vont servir de cibles aux enzymes de réparation précités.

Selon l'invention, la ou les lésion (s), sont constituées d'une ou de plusieurs base (s), nucléoside (s) ou séquence (s) modifié (s), par exemple par une oxydation, une désamination, une alkylation, une fragmentation, une contraction, une hydrolyse, un pontage, etc. Elles peuvent être incorporées lors de la synthèse de l'oligonucléotide, par exemple par les techniques classiques de synthèse chimique, synthèse enzymatique ; ou encore au sein de l'oligonucléotide déjà synthétisé par exemple par une réaction chimique ou photochimique spécifique classique telles que celles citées dans la présente description.

Selon l'invention, l'oligonucléotide de la présente invention peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier pour la synthèse d'un oligonucléotide. On peut citer par exemple les techniques de synthèse chimique sur support solide des oligonucléotides. En effet, la grande réactivité des monomères nucléotidiques, appelés synthons, la mise au point de conditions de couplage et de déprotection douces, ou encore l'automatisation des étapes d'assemblage sur support solide, permettent d'accéder avantageusement à une grande diversité d'oligonucléotides modifiés ou non, c'est à dire comportant ou non une lésion au sens de la présente invention. Par exemple, les technique décrites dans les documents de Beaucage et Iyer, 1992, [5] ou de Agrawal, 1993, [6] sont utilisables pour synthétiser un

oligonucléotide selon la présente invention, comportant ou non une lésion.

La méthode d'assemblage chimique sur support solide apparaît être une technique de choix pour accéder aux oligonucléotides contenant une ou plusieurs lésions spécifique (s) de l'oligonucléotide utilisable (s) dans la présente invention. En effet, en utilisant cette technique, la lésion de l'oligonucléotide peut être facilement incorporée au cours de la synthèse de ce dernier en remplaçant une ou plusieurs bases azotées normales, c'est à dire les bases azotées de la séquence choisie pour répondre à la définition du substrat de la présente invention, par des bases azotées modifiées chimiquement ou par d'autres molécules qui induisent la lésion déterminée recherchée.

Selon l'invention, la ou les lésion (s) de l'oligonucléotide peuvent être incorporées au sein de l'oligonucléotide en utilisant les techniques décrites dans Butenandt et al., 1999, [7] ; Wang et al., 1998, [8] ; Gasparutto et al., 2000a, [9] ou Ide, 2001, [10]. Il peut s'agir par exemple aussi de modifications telles que des modifications de bases puriques ou pyrimidiques, de sites abasiques, de bases pontées, d'adduits ou équivalentes. Les techniques de modification post-synthèse d'oligonucléotides décrites par Gasparutto et al., 1998, [11] ; Kung et Bolton, 1997, [12] ; D'Ham et al., 1999, [1] ; Duarte et al., 2000a, [13] ; ou de synthèse enzymatique pour l'incorporation de lésions nucléiques particulièrement labiles décrite par Hatahet et al., 1994, [14] ; Purmal

et al., 1998, [15]. Ces fragments nucléotidiques contenant des lésions spécifiques en des sites précis sont excellents pour constituer le substrat oligonucléotidique de la présente invention.

Selon l'invention, des lésions doubles peuvent également être insérées dans des oligonucléotides par les méthodes de condensation chimique décrites par Bourdat et al. 2000, [16], et David-Cordonnier et al., 2001, [17].

Selon l'invention, l'oligonucléotide présente une zone d'appariement constituée soit de deux brins complémentaires ayant une structure de type double brin, soit d'un seul brin complémentaire avec une structure de type en épingle à cheveux. Il s'agit bien entendu d'une zone d'appariement entre les bases azotées complémentaires d'un brin à l'autre ou intracomplémentaires dans le cas d'un seul brin replié sur lui même pour adopter une structure en épingle à cheveux. Les figures 2 à 8 annexées représentent schématiquement ces zones d'appariements qui correspondent aux zones de liaisons inter ou intra brin (s).

Lorsque l'oligonucléotide, qui constitue le substrat de la présente invention, est sous forme de simple brin ayant une structure en épingle à cheveux, par exemple telle que représentée sur les figures 4,7 et 8, il n'est pas nécessaire que la boucle non appariée formée par le repliement de l'oligonucléotide ait une constitution particulière. En effet, cette boucle, lorsqu'elle n'intervient pas dans le mécanisme de reconnaissance enzymatique des enzymes de réparation

de la lésion, peut être constituée par exemple d'une suite de bases azotées identiques, telle que polyA, polyT, polyC, polyG, ou non identiques, ou d'une chaîne alkyle ayant de 3 à 100 carbones, de polyéthylène glycol, ou de toute autre structure ne gênant pas le repliement de l'oligonucléotide en une structure en épingle à cheveux, l'appariement des bases complémentaires de la zone d'appariement de l'oligonucléotide, et l'action des enzymes de réparation de la lésion.

Avantageusement, selon l'invention, la longueur de la zone d'appariement est d'environ 10 à 100 bases azotées, par exemple d'environ 14 à 50 bases. Elle sera bien entendue adaptée suivant le type d'enzyme dont on désire analyser l'activité.

Par exemple, selon la présente invention, les oligonucléotides décrits par Cadet et al., 2000, [18] ; Gasparutto et al., 2000a, [8] ; Ide, 2001, [9], sont utilisables pour la détection et la quantification d'activités de réparation de lésions de l'ADN impliquant des ADN N-glycosylases appartenant au système REB, et les oligonucléotides décrits par Kuraoka et al., 2000, [19], sont utilisables pour la détection et la quantification d'activités de réparation de lésions de l'ADN effectuées par des complexes protéiques impliqués dans le processus REN ; lorsqu'ils sont modifiés en substrats oligonucléotidiques selon la présente invention.

Selon la présente invention, le marqueur fluorescent et la molécule réceptrice sont choisis de manière à ce qu'un transfert d'énergie de fluorescence

puisse avoir lieu entre le marqueur et la molécule réceptrice. Ce transfert d'énergie est un processus physique au cours duquel l'énergie émise par le marqueur excité, à une certaine longueur d'onde, est absorbée par la molécule réceptrice.

La première condition pour que le transfert d'énergie de fluorescence, ait lieu est que le spectre de fluorescence du donneur et le spectre d'absorption de l'accepteur se chevauchent. La figure 1 est une représentation schématique des spectres d'un marqueur et d'une molécule réceptrice absorbante qui se chevauchent, et qui sont donc utilisables dans la présente invention. Sur cette figure, J (À) indique la longueur d'onde définie, choisie dans la zone de chevauchement des spectres, de manière à ce que l'énergie de fluorescence émise par le marqueur lorsqu'il est excité à cette longueur d'onde soit absorbée par la molécule réceptrice.

La deuxième condition pour que le transfert d'énergie de fluorescence ait lieu est que le marqueur fluorescent et la molécule réceptrice soit fixés sur l'oligonucléotide à une distance telle que le transfert d'énergie puisse se réaliser. En effet, le processus de FRET utilisé dans la présente invention est fonction de la distance séparant le marqueur et la molécule réceptrice et varie selon l/d6, d étant la distance séparant le marqueur de la molécule réceptrice.

Le principe de cette transmission d'énergie est connu et décrit notamment dans les documents Wu et Brand, 1994, [20], Förster, 1946, [21] ; et Clegg, 1995, [22]. Les marqueurs, molécules réceptrices, et

distances les séparant utilisables pour fabriquer le substrat oligonucléotidique de la présente invention peuvent être ceux décrits dans ces documents.

A titre d'exemple, le marqueur peut être choisi parmi la fluorescéine et ses dérivés, la famille des Alexa, par exemple l'Alexa Fluor488 (marque de commerce), la rhodamine et ses dérivés, la famille des cyanures, la famille des Bodipy (marque de commerce).

A titre d'exemple, la molécule réceptrice ("Quencher") peut être choisi parmi la rhodamine et ses dérivés, le dabcyl (marque de commerce), la famille des Alexa (marque de commerce), la famille Bodipy (marque de commerce), la famille des cyanures.

Par exemple, les couples fluorescéine/dabcyl ; fluorescéine/tétraméthylrhodamine ; Alexa Fluor 350/Alexa Fluor 488 conviennent avantageusement pour la mise en oeuvre de la présente invention. Le tableau 1 suivant donne encore quelques exemples de couples marqueur fluorescent/molécules réceptrice correspondante qui conviennent avantageusement pour la mise en oeuvre de la présente invention..

Tableau I

<tb>
<tb> Marqueur <SEP> fluorescent <SEP> Molécules <SEP> réceptrices
<tb> [Abs/Em <SEP> (nm)] <SEP> [Abs/Em <SEP> (nm)]
<tb> Fluorescéine <SEP> [492/520] <SEP> Tétraméthylrhodamine
<tb> [565/580]
<tb> Fluorescéine <SEP> [492/520] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb> Tétraméthylrhodamine
<tb> [565/580] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb> Coumarine <SEP> [370/450] <SEP> Fluorescéine <SEP> [492/520]
<tb> Tet <SEP> [521/536] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb> Hex <SEP> [535/556] <SEP> BHQ-1 <SEP> [534/-]
<tb>

<tb>
<tb> Alexal <SEP> Fluor <SEP> 546 <SEP> [556/573] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb> Alexal <SEP> Fluor <SEP> 488 <SEP> [495/519] <SEP> Alexa <SEP> Fluor <SEP> 546 <SEP> [556/573]
<tb> Cy3 <SEP> [552/570] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb> Bodipy <SEP> FL-X <SEP> [503/512] <SEP> Dabcyl <SEP> [453/-]
<tb>
Dans ce tableau 1 : Dabcyl (marque de commerce) : acide 4- (4'diméthylaminophénylazo) benzoïque (Molecular Probes Inc. ) ; Tet (marque de commerce) : Tétrachloro-6carboxyfluorescéine (Applied Biosystems Inc.) ; Hex (marque de commerce) : Hexachloro-6carboxyfluorescéine (Applied Biosystems Inc.) ; Alexa Fluor (marque de commerce) (Molecular Probes Inc. ) ; Cy3 (marque de commerce) : Cyanine 3 (Amersham Pharmacia) ; BHS61 (marque de commerce) : Black Hole Quencher (Biosearch Techynologies Inc.) ; et Bodipy FL-X (marque de commerce) : (Molecular Probes Inc.).

Dans ce tableau, les récepteurs sont indiqués en face des marqueurs pour chaque couple.

Le marqueur et la molécule réceptrice, indépendamment, peuvent être fixés sur les oligonucléotides, au cours de la synthèse de ces dernier ou après celle-ci, par les techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple celles décrites dans le document [5] et le document [6].

A tire d'exemple, lorsque le marqueur est la fluorescéine, et la molécule réceptrice le dabcyl, la distance les séparant lorsqu'ils sont fixés sur

l'oligonucléotide est comprise de préférence entre 10 o et 100 A afin que le transfert d'énergie puisse se faire dans de bonnes conditions.

Selon la présente invention, un ou plusieurs marqueurs fluorescents, un fluorochrome donneur et une molécule réceptrice, fluorescente ou non, appelée "quencher", dans une configuration compatible avec un processus de transfert d'énergie de fluorescence (FRET) peuvent être utilisés.

Selon l'invention, le marqueur fluorescent et la molécule réceptrice seront placés sur l'oligonucléotide, par rapport à la lésion, de manière à ce que lorsque ladite lésion est réparée par le ou les enzyme (s) de réparation des lésions de l'ADN, la distance qui les sépare soit modifiée de manière détectable. Ainsi, la relative proximité du marqueur fluorescent avec la molécule réceptrice ("quencher") au sein du substrat oligonucléotidique initial de la présente invention, c'est à dire avant réparation de sa lésion, va induire un transfert d'énergie de fluorescence du donneur excité vers l'accepteur, réduisant par la même l'intensité de fluorescence du premier. Lors de la réaction de réparation enzymatique de la lésion, qui peut être une incision, une excision de la lésion ou dommage ou de fragments d'acides nucléiques ou toute autre transformation liée aux différents systèmes de réparation de l'ADN, une déstabilisation du duplex d'ADN est induite. La séparation puis l'éloignement spatial du marqueur donneur d'énergie et de la molécule réceptrice de ladite énergie qui en découle, dus à la réparation de

la lésion, va modifier, voir interrompre le transfert d'énergie entre ces deux protagonistes et se traduire par une modification des propriétés de fluorescence du substrat oligonucléotidique de la présente invention. Bien entendu, pour pouvoir suivre l'activité de réparation de la lésion, la modification de la fluorescence doit être détectable par les moyens de mesures utilisés.

Les figures 2 à 7 annexées sont des représentations schématiques montrant différents modes de réalisation du substrat oligonucléotidique de la présente invention, référencé S pour la structure double brin, et S2 pour la structure simple brin en épingle à cheveux. Ces différents modes de réalisation, conformes à la présente invention, se distinguent par les éléments suivants : - par la nature de l'oligonucléotide qui est soit double brin, référencé os (figures 2,3, 5 et 6), soit simple brin replié en une structure en épingle à cheveux, c'est à dire auto-complémentaire, référencé 02 (figures 4, et 7), tous deux constitués de bases azotées N .

- par la disposition du marqueur, référencé D , sur le substrat ; - la disposition de la molécule réceptrice, référencée A sur le substrat ; - par la disposition et la nature de la lésion, référencée X , sur le substrat, cette lésion pouvant être une de celles précitées, par exemple une base modifiée ou mutée, ou mésappariée.

Ces schémas représentent également les différents mécanismes de réparation de la lésion, par excision de base ou réparation des mésappariements (figures 2,3 et 4), et par excision de nucléotides (figures 5,6 et 7), et représentent l'éloignement spatial du marqueur et de la molécule réceptrice produit par la réparation de la lésion. Sur ces figures, à gauche sont représentés les substrats oligonucléotidiques de la présente invention,

comportant la lésion X , et à droite, les substrats en cours de réparation, dans lesquels la lésion X a été excisée, soit isolément, soit avec un fragment < x f de séquence oligonucléotidique du substrat.

Enz indique l'activité enzymatique de réparation, et les flèches larges, référencées t représentent le transfert d'énergie entre le marqueur et la molécule réceptrice, transfert qui est barré sur les figures de droite pour indiquer que celui-ci ne se fait plus. Le caractère E : indique l'énergie émise ou absorbée : la taille de l'éclair indique schématiquement l'importance de l'énergie. La direction de l'éclairdans le sens allant de la partie large vers la partie effilée de l'éclair-montre si cette énergie est émise ou absorbée par le marqueur et la molécule réceptrice.

Aucun éclair n'est représenté lorsqu'il y a ni émission, ni absorption de l'énergie.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de la présente invention, le marqueur et la molécule réceptrice seront choisis tels et fixés sur l'oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que le transfert d'énergie entre eux se fasse de manière non radiative. Ainsi, dans sa forme initiale,

le substrat comportant la lésion, le marqueur et la molécule réceptrice, n'émet pas d'énergie lorsque le marqueur est excité, car celle-ci est absorbée entièrement par la molécule réceptrice. Lorsque la lésion est réparée, le marqueur et la molécule absorbant l'énergie étant éloignés, le marqueur, fixé ou non sur le substrat réparé, émet encore de l'énergie, mais celle-ci n'est plus absorbée par la molécules réceptrice. Il est donc aisé de suivre en temps réel l'activité de réparation de la lésion en suivant l'augmentation du signal émis par le marqueur.

La lecture de l'évolution de la fluorescence peut se faire par les techniques connues de l'homme du métier, par exemple par spectrophotométrie, par exemple UV visible, ou spectrofluorimétrie.

Le procédé d'analyse de la présente invention consiste à utiliser le substrat oligonucléotidique de la présente invention en tant que substrat enzymatique pour analyser si dans un échantillon il existe une activité enzymatique de réparation de la lésion du substrat. Il est basé sur l'analyse de la coupure ou de la transformation au sens large, par une ou plusieurs protéine (s) enzymatiques des systèmes de réparation de l'ADN. La protéine de réparation (enzyme) peut être recherchée par le procédé de l'invention dans un échantillon purifié ou dans un milieu biologique.

Ce procédé présente les avantages d'être simple, rapide et automatisable. En effet, selon le procédé de l'invention, la variation du signal de fluorescence du marqueur, ou rapporteur, est proportionnel à la quantité de dommages reconnus et éliminés par le ou les

enzymes de réparation, ce qui permet une quantification précise et rapide de l'activité enzymatique de réparation d'un échantillon.

Cette analyse est bien entendu réalisée dans des conditions permettant l'activité enzymatique de se manifester. Ces conditions sont notamment les conditions de température, de pH et de force ionique requises du fait de la nature protéique des enzymes.

Le procédé de la présente invention, est avantageusement réalisé en milieu liquide homogène afin que la lecture de l'activité enzymatique de l'échantillon soit fiable et reproductible.

Un témoin de mesure peut être réalisé, en appliquant le procédé de l'invention par exemple à un échantillon ne contenant pas d'enzymes de réparation ou à un échantillon contenant des enzymes de réparation, mais avec un substrat de la présente invention ne comportant pas de lésion, par exemple tel que celui de la séquence ID nOl.

L'invention se différencie de l'art antérieur notamment par les points suivants : - L'utilisation de fragments d'ADN, oligonucléotides, double brin ou mieux encore d'un seul fragment d'ADN auto-complémentaire, contenant une lésion ou une combinaison de lésions nucléiques spécifique, comme substrat défini pour une ou des protéines impliquées dans la réparation de l'ADN.

- L'utilisation d'une méthode de détection par fluorescence, et plus particulièrement par transfert d'énergie de fluorescence (FRET) entre un marqueur fluorophore (dans la présente, on utilise

fluorophore et et fluorescent pour désigner un marqueur fluorescent) excité ( le donneur , D ) et une molécule réceptrice ( l'accepteur , A -"quencher"), qui permet la détection et la quantification en temps réel d'activités enzymatiques de réparation des lésions de l'ADN. L'utilisation de la technique FRET permet de corréler directement la quantité de dommage réparé à un signal de fluorescence, par exemple augmentation de la fluorescence proportionnelle à la quantité de dommage reconnu et éliminé. La technique de FRET permet une quantification simple, rapide et précise de l'activité enzymatique de réparation directement au sein du mélange réactionnel.

Elle permet notamment de s'affranchir des étapes lourdes, longues et fastidieuses d'analyse du milieu biologique par les méthodes d'électrophorèses, de chromatographie ou encore de mesure de masse de l'art antérieur. L'utilisation de la fluorescence rend le technique sensible, automatisable et permet de s'affranchir de la manipulation de la radioactivité. Ce point est essentiel dans le cadre du développement éventuel d'un outil de diagnostic médical.

- L'invention permet de réduire l'analyse et la quantification des activités enzymatiques de réparation de l'ADN à une simple mesure de fluorescence pouvant être réalisée en grande série à l'aide de systèmes de lecture de fluorescence de type spectrofluorimètre en format microplaques, par exemple à 96 puits ou 384 puits ou de type "lab-on-a-chip". En effet, la miniaturisation des puits réactionnels et des systèmes de lecture de fluorescence à des formats microplaques

("lab-on-a-chip") permet avantageusement un gain de sensibilité de la technique, et une application à de petits échantillon, en particulier lors de l'étude d'activités enzymatiques de réparation présentes au sein d'extraits cellulaires, de biopsies, etc.

- La miniaturisation et l'automatisation possible de la technique permet l'analyse de grandes séries d'échantillons protéiques ou cellulaires avec une grande facilité et rapidité. L'invention rend donc possible, à un coût réduit, le criblage ("screening") haut débit et l'analyse comparative et en parallèle de différentes activités de réparation. Ceci améliore la reproductibilité et la fiabilité des résultats et facilite ainsi la comparaison et la normalisation de ces derniers entre eux.

- L'utilisation avantageuse d'un substrat oligonucléotidique unique, auto-complémentaire de type épingle à cheveux ("Hairpin"), permet d'éliminer les problèmes de stoechiométrie liés à la présence en excès du fragment d'ADN complémentaire dans le cas d'un système classique double brin, pouvant générer un bruit de fond en fluorescence.

- La réalisation de la réaction enzymatique en phase homogène, substrat nucléique et enzyme tous les deux en solution, ne génère pas de biais dans les activités enzymatiques à détecter et à mesurer en comparaison avec les systèmes immobilisés sur support solide par exemple pour une réaction enzymatique effectuée en phase hétérogène entre un substrat immobilisé et une enzyme en solution.

- L'utilisation d'un substrat nucléique en solution rend l'invention plus performante et moins coûteuse en comparaison de techniques similaires réalisées en phase solide. En effet, la présente invention permet de s'affranchir des étapes de fonctionnalisation des fragments d'ADN, nécessaires à leur fixation sur le support solide. De plus, l'utilisation de systèmes immobilisés sur un support solide entraîne très souvent des limitations et des problèmes lors de l'étape de détection du signal et des limitations dans les marqueurs fluorescents utilisables (interférence du support greffé avec le processus de fluorescence à détecter.

Les substrats oligonucléotidiques de la présente invention peuvent être utilisés comme outils en recherche fondamentale, par exemple pour la détermination de la fonctionnalité et de la spécificité des enzymes de réparation, pour des tests d'activité pour la recherche de nouvelles activités de réparation au sein d'extraits cellulaires, etc.

L'invention permet d'étudier l'activité et la spécificité des enzymes ou de facteurs protéiques, purifiés ou non, et notamment de déterminer les constantes cinétiques de Michaélis-Menten des réactions enzymatiques de réparation, à savoir Vmax et Km. Elle permet en outre d'étudier l'influence de divers facteurs sur l'efficacité de la réparation, tels que l'effet d'inhibiteurs, d'effecteurs ou encore les effets de séquence, par exemple l'influence de la base complémentaire ou des bases adjacentes au dommage à réparer.

Les substrats de la présente invention peuvent être utilisés pour l'analyse et la quantification d'activités de coupure de chaînes nucléiques simples et doubles brins enzymo-induites par exemple par des enzymes de réparation, des enzymes de restriction, des nucléases, ADN N-glycosylases, AP-endonucléases, etc. ; de coupures radio-induites, par exemple par des rayons X, rayonnement y, etc. ; de coupures photo-induites, par exemple par rayonnement UV, lumière UVA et visible ; ou encore chimio-induites par exemple par des drogues antitumorales, radiomimétiques, nucléases artificielles, etc.

L'invention permet également l'étude d'activités enzymatiques présentes dans des extraits cellulaires.

En particulier, elle rend possible l'analyse des capacités de réparation de différents dommages pour une quantité limitée d'un même extrait cellulaire préparé à partir de cellules en culture ou d'un prélèvement biologique. Ceci est particulièrement important dans le cas de diagnostic de certaines pathologies et maladies génétiques.

L'invention permet en outre de mettre en évidence et d'analyser une déficience, une induction ou toute autre modulation des processus de réparation par divers agents chimiques et physiques chez certains patients au cours du vieillissement, de mutations, de certaines pathologies telles que xeroderma pigmentosum, la maladie de Cockaine, etc. ; ou encore de suivre les réponses des systèmes de réparation à certaines thérapies telles que la radiothérapie, la photothérapie, la chimiothérapie, etc.

Aussi, la présente invention se rapporte également à une trousse d'analyse d'une activité de réparation comprenant un substrat selon l'invention.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à la lumière des exemples qui suivent donné à titre illustratif et non limitatif en référence aux figures annexées.

Brève description des figures
La figure 1 est une représentation schématique du chevauchement d'un spectre de fluorescence du marqueur fluorescent (D) et d'un spectre d'absorption d'une molécule réceptrice (A) selon la présente invention (À = longueur d'onde en nm, J (À) = longueur d'onde déterminée au sens de la présente invention).

Les figures 2,3, 5 et 6 sont des représentations schématiques de différents modes de réalisation de substrats conformes à la présente invention avec des oligonucléotides ayant une structure de type double brin. Sur ces figures apparaissent également les différents mécanismes de réparation enzymatique des lésions.

Les figures 4 et 7 sont des représentations schématiques de différents modes de réalisation de substrats conformes à la présente invention avec des oligonucléotides ayant une structure à un seul brin auto-complémentaire replié en épingle à cheveux. Sur ces figures apparaissent également les différents mécanismes enzymatiques de réparation des lésions.

La figure 8 est une représentation schématique d'un substrat oligonucléotidique conforme à la présente invention ayant une structure en épingle à cheveux, correspondant aux séquences ID n l à 3 annexées. Le

marqueur est la fluorescéine, et la molécule réceptrice le dabcyl (marque de commerce). Les symboles des nucléotides sont ceux de la nomenclature internationale. Comme indiqué sur le schéma, il est possible de fixer un marqueur radioactif (y-ATp32) à l'extrémité 5'OH pour des études comparatives par électrophorèse.

La figure 9 représente un spectre d'absorption ultraviolet du substrat oligonucléotidique représenté sur la figue 8. La présence du pic à 492 nm prouve la présence et l'intégrité de la fluorescéine.

La figure 10 représente un spectre d'absorption ultraviolet du substrat oligonucléotidique

linéaire seq IDn 6, mesuré de 200 à 700 nm, La figure 11 représente un spectre de masse (mode electrospray négatif ), du substrat de la figure 8 contenant la lésion 50CH 5-hydroxycytosine, - La figure 12 représente la mesure de la fluorescence (INT = intensité de fluorescence) au cours de la réaction de réparation de la lésion uracile au sein de la séquence IDn 2 par les enzymes Ung et exoIII, - La figure 13 représente la mesure de la fluorescence au cours de la réaction de réparation de la lésion 5-hydroxycytosine au sein de la séquence IDn 3 par l'enzyme endoIII.

Liste de séquences
La séquence ID n01, est un exemple d'un oligonucléotidique simple brin témoin de la présente invention pour un repliement en une structure en

épingle à cheveux. Cette séquence comporte en position 2, du côté de l'extrémité 5', un marqueur fluorophore, et en position 38, à l'extrémité 3'une molécule réceptrice absorbant la fluorescence du marqueur fluorescent au sens de la présente invention. Elle ne comporte pas de lésion au sens de la présente invention.

Les séquences ID n02 et 3 sont des exemples de substrats oligonucléotidiques simple brin de la présente invention pour un repliement en une structure en épingle à cheveux. Ces séquences sont identiques à la séquence ID nOl, mais comportent en outre une lésion déterminée en position 7 : une cytosine désaminée (uracile) pour ID n02, et une cytosine oxydée (OHC) pour ID n03.

Les séquences ID n 4 et 5 sont des premiers exemples de deux séquences complémentaires entre elles formant un premier substrat oligonucléotidique double brin selon la présente invention. Sur ce substrat, le marqueur et la molécule réceptrice sont sur le même brin (seq IDn 4)
Les séquences ID n 6 et 7 sont des seconds exemples de deux séquences complémentaires entre elles formant un deuxième substrat oligonucléotidique double brin selon la présente invention. Sur ce substrat, le

marqueur est sur un des deux brins (seq IDn 6) et la molécule réceptrice est sur l'autre brin (seq IDn 7).

Dans les séquences IDn 4 à 7 annexées, la base modifiée formant la lésion peut être remplacée par une autre base modifiée formant une lésion.

Un premier exemple de substrat oligonucléotidique conforme à la présente invention, de structure double brin linéaire et ayant le fluorophore et la molécule "quencher"sur le même brin peut être représenté schématiquement par exemple par : 5'-Fluo-TGG ACT TCX AGC AAG AGA T (NH-Quencher) C-3' : seq IDn 4 3'-ACC TGA AGN TCG TTC TCT A G-5' : seq IDn 5 Avec : - Fluo : fluorophore accrochée par exemple par un bras espaceur à la position 51 (Fluo = Fluorescéine dans l'exemple présent) ; - NH-Quencher : molécule quencher attachée par exemple par un bras espaceur à la position 3', Quencher TAMRA (marque de commerce) dans l'exemple présent ;

- X : base modifiée formant une lésion nucléique, X = 8-oxoguanine dans l'exemple présent ; - N : nucléotide complémentaire de la base modifiée, N = cytosine dans l'exemple présent.

Un deuxième exemple de substrat oligonucléotidique conforme à la présente invention, de structure double brin linéaire et ayant le fluorophore sur un premier brin, et la molécule"quencher"sur un deuxième brin peut être représenté schématiquement par exemple par :
5'-Fluo-TGG ACT TCX AGC AAG AGA TC-3' : seq IDn 6 3'-Quencher-ACC TGA AGN TCG TTC TCT AG-5' : seq IDn 7

Avec : - Fluo : fluorophore accrochée par exemple par un bras espaceur à la position 5', Fluo = fluorescéine dans l'exemple présent ; - Quencher : molécule quencher accrochée par exemple par un bras espaceur à la position 3', Quencher = TAMRA (marque de commerce) dans l'exemple présent ; - X : base modifiée formant une lésion nucléique, X = 8-oxoguanine dans l'exemple présent ; - N : nucléotide complémentaire de la base modifiée, N = cytosine dans l'exemple présent.

EXEMPLES EXEMPLE 1 : FABRICATION D'UN SUBSTRAT OLIGONUCLEOTIDIQUE SIMPLE BRIN AUTO-COMPLEMENTAIRE DE LA PRESENTE INVENTION Les Systèmes chromatographiques utilisés au cours des analyses et purifications décrites ci-après sont les suivants :
Système (a) : CLHP analytique avec une colonne Hypersil C18 (Interchim, 5 u, 4,6 x 250 mm) en mode gradient. Eluants : TEAA (25 mM, pH = 7) et acétonitrile { (gradient linéaire de 0 à 20%

d'acétonitrile (40 min)}. Débit : 1 mL/min. Détection : UV à À = 260 nm.

Système (b) : Système semi-préparatif A avec une colonne Hypersil C18 (Interchim, 5 u, 22 x 250 mm) en mode gradient. Eluants : TEAA (25 mM, pH = 7) et acétonitrile {gradient linéaire de 0 à 20% d'acétonitrile (40 min)}. Débit : 2,5 mL/min. Détection UV à ^ : 260 nm.

Al) Fabrication d'un substrat oligonucléotidique simple auto-complémentaire en incorporant la lésion, le marqueur fluorescent (fluorophore), et la molécule réceptrice dz quencher ) au cours de la synthèse (séquences Idol, 2 et 3)
Synthèse : toutes les synthèses des oligonucléotides ont été effectuées selon la méthode phosphoramidite sur support solide [5] à l'aide d'un appareil ABI 392 (Applied Biosystems Inc., Palo Alto, CA). Les produits utilisés au cours de ces synthèses (solvants, supports, réactifs,...), les synthrons phosphoramidites à déprotection rapide (chimie"Pac"), les supports et synthons modifiés (Dabcyl, Uracile, 5hydroxycytosine, Fluorescéine) sont d'origine commerciale (GlenResearch, Sterling, VA).

Les différents synthons phosphoramidites ont été mis en solution dans l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,1 M. Le cycle de condensation utilisé est celui préconisé par le fabricant de l'appareil pour des synthèses à l'échelle 1 11mole. Une modification a été apportée au cycle de condensation au niveau du couplage des monomères phosphoramidites modifiés de type Uracile, 5-hydroxyuracile et fluorescéine dT (réf. 10-1056, GlenResearch) ; le temps de la réaction de couplage a été augmenté de 5 min. Les

synthèses, effectuées en mode trityl-OFF (retrait du groupement trityle final), ont été initiées à l'échelle 1 umole à l'aide de supports modifiés de type Dabcyl (marque de commerce) (réf. 20-5911, GlenResearch).

Le rendement de couplage moyen par étape, évalué par la mesure conductimétrique du cation DMTr+ libéré, est supérieur à 95% pour toutes les synthèses.

Déprotection et purification : les supports solides portant les chaînes oligonucléotidiques sont transférés dans des tubes Eppendorf (marque déposée) à bouchon vissé ; on ajoute 1 mL d'ammoniaque (32%) et on laisse sous agitation (vortex) à température ambiante.

Au bout de 4 h, chaque mélange brut de déprotection est transféré dans un nouveau tube Eppendorf (marque déposée), dilué avec 500 pL d'eau puis partiellement évaporé sous pression réduite à l'aide d'un appareil Speed-vac. Chaque mélange brut de synthèse est quantifié par spectrométrie UV et analysé par CLHP analytique (système (a)). Ensuite, les oligonucléotides sont purifiés par CLHP semi-préparative (système (b)) puis par électrophorèse sur gel d'acrylamide préparatif (PAGE 15%). Après dessalage sur colonne d'exclusion de type NAP25 (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala), les fractions collectées contenant les oligonucléotides sont quantifiées par spectrométrie UV. L'homogénéité de ces fractions est contrôlée par CLHP analytique (système (a)), gel d'électrophorèse (PAGE analytique) après marquage radioactif au 32p de l'extrémité 5'-OH.

Caractérisation par spectrophotométrie ultraviolet : l'analyse des oligonucléotides est effectuée par spectrophotométrie ultraviolet entre 200

et 700 nm. La présence de deux pics d'absorbance maximum à 259 nm et 492 nm, respectivement caractéristiques de l'ADN et de la fluorescéine, prouve l'intégrité de la molécule. Le spectre UV obtenu dans le cas de la séquence IDn 3 est présenté en exemple dans la figure 9.

Caractérisation par spectrométrie de masse : l'analyse des oligonucléotides est effectuée par spectrométrie de masse en mode electrospray négatif à l'aide d'un appareil de type Platform (marque de commerce) (Micromass). Typiquement, 0, 10 UA26onm de chaque oligonucléotide sont mis en solution dans 10 uL d'eau distillée. On ajoute 10 uL d'acétonitrile contenant 2% de TEA. Après agitation au vortex et centrifugation, 10 uL de chaque solution sont injectés à l'aide d'une vanne Rhéodyne (marque de commerce).

Spectrométrie de masse : - séquence IDn l (séquence sans lésion contenant la cytosine) : M = 12117,8 g. mole-1 - séquence IDn02 (séquence avec lésion uracile) : M = 12118,5 g. mole-1 - séquence IDn03 (séquence avec lésion 5hydroxycytosine) : M = 12134,5 g. mole-1.

Le spectre de masse obtenu dans le cas de la séquence IDn 3 est présenté en exemple dans la figure 11. Ce spectre de masse montre la présence de différents pics moléculaires à m/z : 577,02 ; 605, 46 ;

637, 4 ; 673, 2 ; 712, 99 ; 757, 39 ; 807, 91 ; 865, 41 ; 932,53 et 1010, 01. Ceux-ci correspondent aux différents états de charge-21,-20,-19,-18,-17,-16,-15,-14, -13 et-12 de cet oligonucléotide modifié. Cette

distribution de m/z permet de déterminer un poids moléculaire égal à M = 12134,52 Da, valeur en accord avec la masse théorique calculée).

A2) Fabrication d'un oligonucléotide simple brin autocomplémentaire en incorporant la lésion et le fluorophore au cours de sa synthèse, et la molécule

quencher après sa synthèse (séquences IDn l, IDn 2 et IDn 3)
La même méthode synthétique (méthode phosphoramidite sur support solide) que dans l'exemple Al précédent est utilisée à l'exception de la fixation de la molécule quencher qui est incorporée par couplage post-synthèse en phase liquide.

Pour se faire, la molécule quencher sous forme d'un ester activé (5 uL de Dabcyl-NHS en solution dans le DMSO à une concentration de 10 mg/ml) est mise en réaction, à 370C dans 500 uL de tampon NaHCOs/NasCOs 0,1 M, pH = 9 pendant une nuit, avec le substrat oligonucléotidique déprotégé (ADN contenant la lésion et le fluorophore, environ 10 UAseonm) contenant une fonction amine primaire réactive (fonction amine incorporée au cours de la synthèse sur support sous forme phosphoramidite).

L'oligonucléotide conjugué avec la molécule quencher est alors purifé par dessalage sur colonne d'exclusion NAP (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala) puis par CLHP en phase inverse (système (b)).

De la même façon que dans l'exemple Al précédent, la caractérisation des oligonucléotides modifiés est effectuée par spectrophotométrie ultraviolet, CLHP

analytique, électrophorèse sur gel d'acrylamide et spectrométrie de masse.

A3) Fabrication d'un oligonucléotide simple brin autocomplémentaire en incorporant la lésion et la molécule quencher au cours de sa synthèse, et le fluorophore après sa synthèse (séquences Idol, IDn 2 et IDn 3)
La même méthode synthétique (méthode phosphoramidite sur support solide) que dans l'exemple Al précédent est utilisée à l'exception de la fixation de la molécule fluorescente qui est incorporée par couplage post-synthèse en phase liquide.

Pour se faire, la molécule fluorescente sous forme d'un ester activé (5 pi de fluorescéine-NHS en solution dans le DMSO à une concentration de 10 mg/ml)

est mise en réaction, à 370C dans 500 pL de tampon NaHCOs/NasCOs 0, 1 M, pH = 9 pendant une nuit, avec le substrat oligonucléotidique déprotégé (ADN contenant la lésion et la molécule quencher, environ 10 UA260 nm) contenant une fonction amine primaire réactive (fonction amine incorporée au cours de la synthèse sur support sous la forme phosphoramidite).

L'oligonucléotide conjugué avec la fluorescéine est alors purifié par dessalage sur colonne d'exclusion NAP (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala) puis par CLHP en phase inverse (système (b)).

De la même façon que dans les exemples Al et A2 précédents, la caractérisation des oligonucléotides modifiés est effectuée par spectrophotométrie ultraviolet, CLHP analytique, électrophorèse sur gel d'acrylamide et spectrométrie de masse.

EXEMPLE II : FABRICATION D'UN SUBSTRAT OLIGONUCLEOTIDIQUE DOUBLE BRIN DE LA PRESENTE INVENTION Bl) Fabrication d'un oligonucléotide double brin de séquence n 4, en incorporant la lésion, le fluorophore et la molécule"quencher"sur le même brin (seq IDn 4) au cours de la synthèse
Synthèse : Toutes les synthèses des oligonucléotides ont été effectuées selon la méthode phosphoramidite sur support solide [5] à l'aide d'un appareil ABI 392 (Applied Biosystems Inc., Palo Alto, CA). Les produits utilisés au cours de ces synthèses (solvants, supports, réactifs,...), les synthons phosphoramidites, les supports et synthons modifiés (8oxoguanine, tétraméthylrhodamine, Fluorescéine) sont d'origine commerciale (GlenResearch, Sterling, VA).

Les différents synthons phosphoramidites ont été mis en solution dans l'acétonitrile anhydre à une concentration de 0,1 M. Le cycle de condensation utilisé est celui préconisé par le fabricant de l'appareil pour des synthèses à l'échelle 1 umole.

Une modification a été apportée au cycle de condensation au niveau du couplage des monomères phosphoramidites modifiés de type 8-oxoguanine (Ref 10- 1028, GlenResearch), Fluorescéine (Ref 10-1963, GlenResearch) et TAMRA dT (marque de commerce) (Ref 10- 1057, GlenResearch) ; le temps de la réaction de couplage a été augmenté de 5 min. Les synthèses, effectuées en mode trityl-OFF (retrait du groupement

trityle final), ont été initiées à l'échelle 1 samole à l'aide de supports cytosine.

Déprotection et purification : Les supports solides portant les chaînes oligonucléotidiques sont transférés dans des tubes Eppendorf (marque déposée) à bouchon vissé ; on ajoute 1 mL d'ammoniaque (32%) et on laisse sous agitation (vortex) à température ambiante. Au bout de 24 h, chaque mélange brut de déprotection est transféré dans un nouveau tube Eppendorf (marque déposée), dilué avec 500 uL d'eau puis partiellement évaporé sous pression réduite à l'aide d'un appareil Speed-vac. Chaque mélange brut de synthèse est quantifié par spectrométrie UV et analysé par CLHP analytique (système (a) ). Ensuite, les oligonucléotides sont purifiés par CLHP semi-préparative (système (b)) puis par électrophorèse sur gel d'acrylamide préparatif (PAGE 15%). Après dessalage sur colonne d'exclusion de type NAP25 (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala) les fractions collectées contenant les oligonucléotides sont quantifiées par spectrométrie UV. L'homogénéité de ces fractions est contrôlée par CLHP analytique (système (a) ), gel d'électrophorèse (PAGE analytique révélé par ombrage UV).

Caractérisation par spectrophotométrie Ultraviolet : l'analyse des oligonucléotides est effectuée par spectrophotométrie Ultraviolet entre 200 et 700 nm. La présence de trois pics d'absorbance maximum à 259 nm, 492 nm et 555 nm respectivement caractéristiques de l'ADN, de la fluorescéine et de la rhodamine prouve l'intégrité de la molécule.

Caractérisation par spectrométrie de masse : l'analyse des oligonucléotides est effectuée par spectrométrie de masse en mode electrospray négatif à l'aide d'un appareil de type Platform (marque de commerce) (Micromass). Typiquement, 0, 10 UA260 nm de chaque oligonucléotide sont mis en solution dans 10 uL d'eau

distillée. On ajoute 10 uL d'acétonitrile contenant 2% de TEA. Après agitation au vortex et centrifugation, 10 uL de chaque solution sont injectés à l'aide d'une vanne Rhéodyne (marque de commerce).

Spectrométrie de masse : - séquence IDn04 : séquence simple brin avec lésion 8-oxoguanine, rhodamine et fluorescéine : M = 7290 g. mole-1.

Remarque : la structure finale n04 double brin est obtenue a posteriori par hybridation de la séquence modifiée seq IDn 4 avec la séquence complémentaire seq IDn 5 non modifiée.

B2) Fabrication d'un double brin de séquence n04, contenant la lésion, le fluorophore et la molécule "quencher"sur le même brin et avec fixation de la molécule"quencher"après sa synthèse
La même méthode synthétique (méthode phosphoramidite sur support solide) que dans l'exemple Bl précèdent est utilisée à l'exception de la fixation de la molécule"quencher"qui est incorporée par couplage post-synthèse en phase liquide.

Pour se faire, la molécule quencher sous forme d'un ester activé (5 uL de TAMRA-NHS en solution dans

le DMSO à une concentration de 10 mg/mL, Molecular Probes) est mise en réaction, à 370C dans 500 uL de tampon NaHCOs/NasCO 0,1 M, pH = 9 pendant une nuit, avec le substrat oligonucléotidique déprotégé (ADN contenant la lésion et le fluorophore, environ 10 UAseonm) contenant une fonction amine primaire réactive à son extrémité 3' (fonction amine incorporée au cours de la synthèse sur support sous la forme d'un phosphoramidite dT aminé).

L'oligonucléotide conjugué avec la molécule quencher est alors purifié par dessalage sur colonne d'exclusion NAP (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala) puis par CLHP en phase inverse (système (b)).

De la même façon que dans l'exemple Bl précédent, la caractérisation de l'oligonucléotide modifié IDn 4 est effectuée par spectrophotométrie ultraviolet, CLHP analytique, électrophorèse sur gel d'acrylamide et spectrométrie de masse.

B3) Fabrication d'un oligonucléotide double brin séquence n 5, en incorporant la lésion et le fluorophore sur le brin seq IDn 6 au cours de sa synthèse et la molécule"quencher"sur le brin complémentaire seq IDn 7 au cours de sa synthèse
Synthèse : Toutes les synthèses des oligonucléotides ont été effectuées selon la méthode

phosphoramidite sur support solide [5] à l'aide d'un appareil ABI 392 (Applied Biosystems Inc., PaLo Alto, CA). Les produits utilisés au cours de ces synthèses (solvants, supports, réactifs,...), les synthons phosphoramidites, les supports et synthons modifiés (8oxoguanine, tétraméthylrhodamine, fluorescéine) sont d'origine commerciale (GlenResearch, Sterling, VA).

Une modification a été apportée au cycle de condensation au niveau du couplage des monomères phosphoramidites modifiés de type 8-oxoguanine et fluorescéine (Ref 10-1963, GlenResearch) ; le temps de la réaction de couplage a été augmenté de 5 min. Les synthèses, effectuées en mode trityl-OFF (retrait du groupement trityle final), ont été initiées à l'échelle 1 umole à l'aide d'un support de type 2'-désoxycytidine pour la séquence seq IDn 6 et de type tétraméthylrhodamine (TAMRA-CPG, Ref 20-5911, GlenResearch) pour la séquence seq IDn 7.

Déprotection et purification : Les supports solides portant les chaînes oligonucléotidiques sont transférés dans des tubes Eppendorf (marque déposée) à bouchon vissé ; on ajoute 1 mL d'ammoniaque (32%) et on laisse sous agitation (vortex) à température ambiante. Au bout de 24 h, chaque mélange brut de déprotection est transféré dans un nouveau tube Eppendorf (marque déposée), dilué avec 500 uL d'eau puis partiellement

évaporé sous pression réduite à l'aide d'un appareil Speed-vac.

Chaque mélange brut de synthèse est quantifié par spectrométrie UV et analysé par CLHP analytique (système (a)). Ensuite, les oligonucléotides sont purifiés par CLHP semi-préparative (système (b)) puis par électrophorèse sur gel d'acrylamide préparatif (PAGE 15%). Après dessalage sur colonne d'exclusion de type NAP25 (marque de commerce) (Pharmacia, Uppsala) les fractions collectées contenant les oligonucléotides sont quantifiées par spectrométrie UV. L'homogénéité de ces fractions est contrôlée par CLHP analytique (système (a)), gel d'électrophorèse (PAGE analytique révélé par ombrage UV).

De la même façon que dans l'exemple Bl précédent, la caractérisation des oligonucléotides modifiés seq IDn 6 et seq IDn 7 est effectuée par spectrophotométrie ultraviolet : la figure 10 montre la présence des pics d'absorbance de l'ADN et de la fluorescéine, respectivement à 260 nm et 495 nm. CLHP analytique, électrophorèse sur gel d'acrylamide et spectrométrie de masse ont également été utilisés.

Spectrométrie de masse : - Séquence seq IDn 6 (séquence simple brin avec

lésion 8-oxoguanine et fluorescéine) M = 6874g. mole-1. Remarque : la structure finale n 5 double brin est obtenue a posteriori par hybridation de la séquence seq IDn 6 modifiée et fluorescente avec la séquence complémentaire seq IDn 7 contenant le quencher.

EXEMPLE III : UTILISATION DE SUBSTRATS OLIGONUCLEOTIDIQUES DES EXEMPLES I ET II POUR ANALYSER L'ACTIVITE ENZYMATIQUE DE REPARATION DE LEUR LESION PAR UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE Exemple 1 : Protocole de préparation d'extraits protéiques contenant l'activité de réparation à analyser
Des extraits protéiques ont été préparés à partir de lignées cellulaires humaines HeLa et de lignées cellulaires CHO (Chinese Hamster Ovary). Les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEN supplémenté avec

100% de sérum de veau foetal, à 370C sous une atmosphère de 50% de CO2. 5x106 cellules ont alors été re-suspendues dans 0, 35ml de tampon de lyse (20mM TrisHCl ; pH 8 ; 1mM Na2EDTA, 250mM NaCl), soniqué à 4 C avec 8 pulses de 1 seconde chacun, et enfin centrifugé à 40C pendant 45 minutes à 85000 g.

Après centrifugation, le surnageant a été prélevé et des parties aliquotes utilisées pour les mesures d'activités de réparation enzymatique.

Exemple 2 : Analyse de l'activité de réparation de I'oligonucléotide de séquence IDn 2 par une enzyme purifiée de type Uracile N-Glycosylase (Ung)
0,01 UA260nm d'oligonucléotide substrat (séquence autocomplémentaire IDn 2) est placé dans 100pal d'eau, au sein d'une cuve de spectrofluorimètre à 37 C. 10ul de tampon enzymatique (250 mM Tris-HCI ; pH 7,6 ; 20mM

Na2EDTA ; 0, 5M NaCI ; et 4mg/ml BSA) sont additionnés

suivi de 1 unité d'enzyme Ung et 1 unité d'enzyme exoIII.

L'évolution de la fluorescence du mélange réactionnel est suivie entre 500 et 650nm à l'aide d'un spectrofluorimètre de type Perkin Elmer LS-50B (marque de commerce). Les résultats sont donnés sur la figure 12. L'augmentation du pic de fluorescence de la fluorescéine à 520nm est proportionnelle à la quantité de lésion excisée et de coupure de brin nucléique générée par action des enzymes de réparation.

Exemple 3 : Analyse de l'activité de réparation de l'oligonucléotide de séquence IDn 3 par une enzyme purifiée de type Endonucléase III (endo III)

0, 01 UA26onm, d'oligonucléotide substrat (séquence auto-complémentaire IDn 3) est placé dans loops d'eau, au sein d'une cuve de spectrofluorimètre à 37 C. loul de tampon enzymatique (250 mM Tris-HCI ; pH 7,6 ; 20mM Na2EDTA ; O, 5M NaCl, 4mg/ml BSA) sont additionnés suivi de lpg d'enzyme EndoIII.

L'évolution de la fluorescence du mélange réactionnel est suivie entre 500 et 650nm à l'aide d'un spectrofluorimètre de type Perkin Elmer LS-50B (marque de commerce). Les résultats sont donnés sur la figure 13. L'augmentation du pic de fluorescence de la fluorescéine à 520nm est proportionnelle à la quantité de lésion excisée et de coupure de brin nucléique générée par action l'enzyme de réparation.

Exemple 4 : Analyse de l'activité de réparation de l'oligonucléotide double brin de séquence IDn 4+5 par une enzyme purifiée de type Fapy-Glycosylase (marque de commerce) (Fpg) 0, 01 UA260nm d'oligonucléotide substrat formé par hybridation préalable de l'oligonucléotide modifié et

de son complémentaire non modifié (seq IDn 4+5) est placé dans lOOul d'eau, au sein d'une cuve de spectrofluorimètre à 37 C. lOul de tampon enzymatique (250 mM Tris-HCI ; pH 7,6 ; 20mM Na2EDTA ; 0,5M NaCl ; 4mg/ml BSA) sont additionnés suivi de lug d'enzyme Fpg.

L'évolution de la fluorescence du mélange réactionnel est suivie entre 500 et 650nm à l'aide d'un spectrofluorimètre de type Perkin Elmer L5-50B (marque de commerce). L'augmentation du pic de fluorescence de la fluorescéine à 520nm est proportionnelle à la quantité de lésion excisée et de coupure de brin nucléique générée par action l'enzyme de réparation.

Exemple 5 : Analyse de l'activité de réparation de l'oligonucléotide de séquence IDn 3 par des protéines de la réparation présentes dans un extrait cellulaire

0, 01 UA260nm d'oligonucléotide substrat (séquence auto-complémentaire seq IDn 3) est placé dans lOOul d'eau, au sein d'une cuve de spectrofluorimètre à 37 C. lOul de tampon enzymatique (250 mM Tris-HCI ; pH 7, 6 ; 20mM Na2EDTA ; 0,5M NaCl, 4mg/ml BSA) sont additionnés suivi de lug d'extrait cellulaire préalablement préparé (vide infra).

L'évolution de la fluorescence du mélange réactionnel est suivie entre 500 et 650nm à l'aide d'un

spectrofluorimètre de type Perkin Elmer L5-50B (marque de commerce). L'augmentation du pic de fluorescence de la fluorescéine à 520nm est proportionnelle à la quantité de lésion excisée et de coupure de brin nucléique générée par action des enzymes de réparation présents dans l'extrait protéique.

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Claims

REVENDICATIONS

1. Substrat oligonucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend : un oligonucléotide comprenant une zone d'appariement constituée soit de deux brins complémentaires ayant une structure de type double brin, soit d'un seul brin complémentaire avec une structure de type en épingle à cheveux, une lésion déterminée au niveau de la zone d'appariement, un marqueur émettant une énergie de fluorescence lorsqu'il est excité à une longueur d'onde définie, une molécule réceptrice absorbant l'énergie de fluorescence émise par le marqueur à ladite longueur d'onde définie, le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie étant fixés sur ledit oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que lorsque le marqueur émet de l'énergie à ladite longueur d'onde définie ladite molécule réceptrice l'absorbe de manière détectable, et de telle manière que lorsque ladite lésion déterminée est réparée au moyen d'un ou plusieurs enzyme (s) de réparation de lésions de l'ADN, ladite distance entre

1 le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie est modifiée de manière détectable.

2. Substrat oligonucléotidique selon la revendication 1, dans lequel la zone d'appariement de l'oligonucléotide a une longueur allant d'environ 10 à 100 bases azotées.

3. Substrat oligonucléotidique selon la revendication 1, dans lequel la lésion est obtenue par une oxydation, une désamination, une alkylation, une fragmentation, une contraction, une hydrolyse, ou un pontage d'une ou plusieurs bases azotées de l'oligonucléotide.

4. Substrat oligonucléotidique selon la revendication 1, dans lequel le marqueur est choisi parmi la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, et la famille des cyanures.

5. Substrat selon la revendication 1, dans lequel la molécule réceptrice est choisie parmi la rhodamine et ses dérivés, et la famille des cyanures.

6. Substrat selon la revendication 1, dans lequel le marqueur est la fluorescéine et la molécule réceptrice le dabcyl.

7. Substrat selon la revendication 1 ou 6,

comprenant une séquence choisie parmi ID n01, ID n 2, ID n03, IDn 4, IDno5, IDn 6 et IDn 7.

8. Substrat selon la revendication 1, dans lequel le marqueur fluorescent et la molécule réceptrice sont choisis de telle manière et fixés sur l'oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que l'absorption de l'énergie, émise par le marqueur, par la molécule réceptrice se fasse par un transfert d'énergie non radiatif.

9. Procédé de fabrication d'un substrat oligonucléotidique, comprenant les étapes suivantes : - synthèse d'un oligonucléotide double brin ou simple brin replié en une structure en épingle à cheveux, de manière à ce que l'oligonucléotide synthétisé présente une zone d'appariement, - incorporation d'une lésion déterminée, au cours de la synthèse de l'oligonucléotide ou après sa synthèse, au niveau de ladite zone d'appariement, fixation sur l'oligonucléotide, au cours de sa synthèse ou après sa synthèse, d'un marqueur fluorescent émettant une énergie de fluorescence lorsqu'il est excité à une longueur d'onde déterminée, et d'une molécule réceptrice absorbant l'énergie de fluorescence émise par le marqueur à ladite longueur d'onde, le marqueur émettant l'énergie de fluorescence et la molécule réceptrice qui absorbe ladite énergie étant fixés sur ledit oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que lorsque le marqueur émet de l'énergie à ladite longueur d'onde définie ladite molécule réceptrice l'absorbe de manière détectable, et de telle manière que lorsque ladite lésion déterminée est

10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'oligonucléotide est synthétisé par un technique de synthèse chimique sur support solide.

11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la lésion est incorporée réaction choisie parmi par une oxydation, une désamination, une alkylation, une fragmentation, une contraction, une hydrolyse, ou un pontage d'une ou plusieurs bases azotées de l'oligonucléotide.

12. Procédé selon la revendication 10, dans lequel la lésion est incorporée en remplaçant une ou plusieurs bases azotées normales par des bases azotées modifiées chimiquement ou par d'autre molécules qui provoquent la lésion déterminée recherchée.

13. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le marqueur est choisi parmi la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, et la famille des cyanures.

14. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la molécule réceptrice est choisie parmi la rhodamine et ses dérivés, et la famille des cyanures.

15. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le marqueur est la fluorescéine et la molécule réceptrice le dabcyl.

16. Procédé selon la revendication 9 ou 15, dans

lequel le substrat comprend une séquence choisie parmi ID n01, ID n02, ID n 3, IDn 4, IDn 5, IDn 6 et IDn 7.

17. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le marqueur fluorescent et la molécule réceptrice sont choisis de telle manière et fixés sur l'oligonucléotide à une distance l'un de l'autre telle que l'absorption de l'énergie, émise par le marqueur, par la molécule réceptrice se fasse par un transfert d'énergie non radiatif.

18. Procédé de d'analyse d'une activité enzymatique de réparation de lésions de l'ADN dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - mettre un substrat oligonucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans ledit échantillon dans des conditions permettant à l'activité enzymatique de réparation de la lésion dudit substrat de s'exprimer, - suivre l'évolution du signal de fluorescence du marqueur fluorescent à ladite longueur d'onde définie.

19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le suivi de l'évolution du signal de fluorescence est réalisé au moyen d'un spectrophotomètre ou spectrofluorimètre.

20. Trousse de d'analyse d'une activité de réparation de l'ADN comprenant un substrat selon l'une quelconque des revendication 1 à 8.