FR2747395A1 - Procede de primoculture in vitro de cellules epitheliales gastro-intestinales, composition cellulaire obtenue notamment par la mise en oeuvre du procede et applications de ladite composition en tant que systeme de production - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de primoculture in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales, une composition cellulaire obtenue notamment par la mise en oeuvre du procédé et les applications de ladite composition en tant que système de production et de modèle d'étude. Le procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'incubation transitoire desdites cellules isolées dans un milieu d'incubation se présentant sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 - 100 muM] pour provoquer une adhérence rapide et en masse desdites cellules isolées à un support quelconque en contact avec ledit milieu d'incubation. Application à la culture de cellules épithéliales gastro-intestinales.

Description

La présente invention concerne un procédé de primoculture in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées de mammifères, une composition cellulaire à base desdites cellules et un système de production de molécules bioactives et/ou d'ARNm incluant une telle composition ainsi qu'un modèle d'étude constitué de ladite composition.

L'épithélium intestinal, et plus généralement gastrointestinal, est un ensemble complexe de cellules spécialisées dans la digestion et l'absorption du bol alimentaire. Ses propriétés de sécrétion de mucus en font la première ligne de défense de la muqueuse intestinale ou gastrique. Enfin, cet épithélium constitue une extraordinaire source de peptides bioactifs, la plupart d'entre eux étant des découvertes très récentes, par exemple des peptides à activité anti-bactérienne, des peptides impliqués dans l'auto-réparation de la muqueuse ou des peptides régulant les sécrétions épithéliales et enfin des agents régulateurs du système immunitaire local. Pour cette raison, le développement de modèles in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales normales revêt une importance fondamentale. Des efforts ont donc été réalisés pour tenter de maintenir en culture primaire des populations pures de cellules épithéliales gastrointestinales.

Les méthodes décrites jusqu'ici étaient essentiellement fondées sur la reconstitution de matrices extra-cellulaires et/ou l'utilisation de milieux définis supplémentés par diverses protéines et facteurs de croissance. Certains auteurs sont même allés jusqu la reconstitution in vitro de la structure tridimensionnelle de la crypte intestinale sur "feeder-layer" endothélial. Cependant, toutes ces méthodes se sont révélées inopérantes en pratique du fait du très faible taux d'adhérence et donc de viabilité des cellules en culture, de l'absence de reproductibilité des résultats, de la trop grande complexité des méthodes mises en oeuvre et de l'absence de maintien des fonctions différenciées desdites cellules.

Pour pallier ces problèmes apparaissant comme insurmontables, de nombreux biologistes se sont tournés vers l'utilisation de lignées cancéreuses humaines ou la transformation de cellules animales pour étudier la régulation de différentes fonctions spécialisées épithéliales. Un tel exemple de lignées est décrit dans le brevet FR-A-2.634.784. Mais il s'agit d'une approche très imparfaite qui ne saurait se substituer à l'utilisation de cellules normales.

Les inventeurs ont constaté que, pour obtenir un taux de survie correct des cellules tout en assurant le maintien de leurs fonctions spécialisées, il est nécessaire d'induire une adhérence des cellules à un support de culture qui peut être quelconque. Pour garantir une bonne reproductibilité, l'adhérence doit être réalisée dans des conditions telles qu'on obtienne un très fort taux d'adhérence de cellules, de préférence fraîchement isolées, au support et ceci dans un temps très court. A l'inverse, les inventeurs ont constaté que l'absence d'adhérence des cellules, à un support entraîne la mort rapide desdites cellules.

Un premier but de l'invention est donc de proposer un procédé de culture in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées qui permet de les faire adhérer, de préférence rapidement et en masse, à un support quelconque pour assurer leur survie.

Un autre but de l'invention est de proposer un milieu d'incubation desdites cellules simple à fabriquer et apte à induire une adhérence rapide et en masse des cellules épithéliales gastro-intestinales à un support quelconque, ce milieu permettant en outre d'obtenir des populations pures de cellules épithéliales gastro-intestinales ayant adhéré au support.

Un autre but de la présente invention est de proposer une composition cellulaire d'un nouveau type dont les cellules, du fait de leur adhérence à un support, peuvent par la suite être maintenues en culture dans de bonnes conditions pendant une durée allant jusqu'à plusieurs jours.

Un autre but de l'invention est de fournir un système de production par l'épithélium de molécules biologiquement actives et/ou d'ARN codant pour ces molécules, ces molécules pouvant constituer des molécules nouvelles et inventives.

Un autre but de la présente invention est encore de proposer un modèle d'étude in vitro de cellules épithéliales intestinales qui permet, du fait de l'incorporation dans ce dit modèle d'une population pure de cellules épithéliales intestinales normales, une étude in vitro desdites cellules, du mode de régulation de leur prolifération et de leur différenciation, de l'expression de leurs fonctions spécialisées et du métabolisme et de la toxicité de substances diverses qui peuvent être ingérées notamment de médicaments et d'aliments dans des conditions proches de celles qui seraient obtenues dans le cas d'études in vivo.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de primoculture in vitro de cellules épithéliales gastrointestinales isolées de mammifères, en particulier de l'homme adulte, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'incubation transitoire desdites cellules isolées dans un milieu d'incubation se présentant sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 - 100 1JMj, pour provoquer une adhérence rapide et en masse desdites cellules isolées à un support quelconque en contact avec ledit milieu d'incubation.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, les cellules, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, sont cultivées dans un milieu de culture dont la concentration calcique est progressivement augmentée jusqu'à une valeur prédéterminée apte à assurer la survie des cellules et à maintenir leurs fonctions spécialisées.

L'invention concerne également un milieu d'incubation de cellules épithéliales intestinales isolées de mammifères, en particulier de l'homme adulte, notamment pour la mise en oeuvre d'un procédé de culture, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une solution dont les constituants, notamment des sels, sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mMl, de préférence [0 - 100 HM], pour provoquer l'adhérence en masse des cellules incubées dans ledit milieu à un support quelconque en contact avec ledit milieu d'incubation.

L'invention a également pour objet une composition cellulaire d'un nouveau type, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une population pure de cellules épithéliales gastro-intestinales adhérant à un support, l'adhérence audit support ayant été obtenue par incubation transitoire de primoculture de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées de mammifères dans un milieu d'incubation se présentant sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution du milieu d'incubation est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 - 100 MJ.

Lorsqu'elle est cultivée dans des milieux de culture appropriés, cette composition cellulaire peut être utilisée d'une part comme système de production in vitro par l'épithélium gastro-intestinal de molécules biologiquement actives telles que les facteurs de croissance, les facteurs de réparation et/ou les ARNm codant pour lesdites molécules, d'autre part comme modèle d'étude in vitro du comportement des cellules épithéliales intestinales notamment dans des domaines tels que la pharmacotoxicologie, l'immunologie, en particulier pour l'aide à la fabrication de vaccins, et la thérapie génique.

L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'un exemple de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels
la figure 1 représente, sous forme graphique,
l'influence de la composition, en particulier de la
concentration en cations, des milieux d'incubation
sur l'adhérence de cellules ;
la figure 2 représente, sous forme graphique, un
test comparatif de l'efficacité d'induction de
l'adhérence des cellules à un support de trois
milieux d'incubation différents et
la figure 3 est une courbe qui représente, au cours
du temps, la quantité d'Interleukine-8 sécrétée par
les cellules épithéliales intestinales humaines
normales traitées ou non par un agent pathogène.

Le procédé de primoculture in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales ou, en d'autres termes, le procédé de culture in vitro de cellules primaires épithéliales gastro-intestinales, objet de l'invention, se décompose en quatre étapes dont seules les étapes 2 et 3 sont caractéristiques de la présente invention.

L'étape 1 consiste à obtenir des suspensions de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées de mammifères, en particulier de l'homme adulte. Le choix de cellules humaines adultes est préféré en raison de la destination de ces cellules (études de pharmacotoxicologie, études immunologiques, etc.). Cette étape nécessite un prélèvement d'organe ou de fragment d'organe sur le mammifère et, dans le cas de l'homme, une pièce de résection obtenue au cours d'une intervention chirurgicale. L'isolement des cellules épithéliales gastro-intestinales est réalisé à partir dudit organe ou fragment d'organe prélevé. Cette étape 1 met en oeuvre des protocoles classiques largement décrits dans la littérature.

L'étape 2 se caractérise par l'ensemencement des suspensions cellulaires obtenues dans l'étape 1 dans un milieu d'incubation caractéristique de l'invention. Ce milieu d'incubation permet aux cellules d'adhérer ou d'attacher en masse et de manière rapide à un support.

Cette étape d'adhérence est indispensable pour maintenir en vie lesdites cellules et maintenir leurs fonctions essentielles.

L'étape 3 consiste à remettre en culture lesdites cellules ayant ainsi adhéré à leur support dans un milieu de culture dont on augmente progressivement la concentration calcique pour permettre aux cellules de survivre dans des conditions permettant le maintien de leurs fonctions spécialisées.

Cette caractéristique est importante pour permettre une étude ultérieure du comportement desdites cellules. Le milieu de culture à la base de cette étape 3 peut être un milieu de culture dit standard utilisé pour la culture de cellules.

L'étape 4 consiste à modifier le milieu de culture éventuellement par addition d'éléments ou à remplacer ce milieu de culture par un autre milieu de culture pour permettre soit la production intra ou extra-cellulaire par les cellules de molécules biologiquement actives particulières, soit pour la réalisation de tests du comportement desdites cellules à l'égard d'éléments introduits dans lesdits milieux de culture ou directement dans la cellule. Cette étape 4 peut consister en la reprise de tests déjà réalisés par exemple sur des lignées cellulaires épithéliales gastro-intestinales transformées pour vérifier les résultats qui avaient été obtenus avec de telles lignées cellulaires.

I1 va à présent être décrit en détail les étapes 1 à 4 de ce procédé. Les cellules primaires ou cellules de première explantation, nécessaires à la mise en oeuvre de l'invention, sont obtenues à partir d'organes ou de fragments d'organes du système gastro-intestinal, tels que l'intestin grêle, le côlon, l'estomac, prélevés sur des mammifères. Ces organes ou fragments d'organes sont prélevés sur des mammifères. Plus particulièrement, chez l'homme adulte, le prélèvement est réalisé sur pièce de résection chirurgicale en muqueuse saine à distance d'une tumeur.

Le prélèvement de muqueuse et l'isolement de cellules épithéliales gastro-intestinales à partir d'une telle pièce sont des techniques de dissociation non enzygmatiques bien connues, notamment décrites par Ahnen et coll. (Am. J.

Physiol. 254, G 610-G 621 - 1988). Le protocole opératoire décrit ci-dessous est donc cité uniquement à titre d'exemple.

Après ouverture et rinçage de la pièce de colectomie, des fragments de muqueuse sont prélevés et placés immédiatement dans une solution PBS (fabriquée par GIBCO-BRL) exempte de calcium et de magnésium mais contenant des antibiotiques et du citrate de sodium (27 mM). Ces fragments sont rincés deux fois dans cette solution appelée solution 1. La solution 1 supplémentée en EDTA 1 mM est injectée sous l'épithélium, puis la muqueuse est totalement immergée dans cette solution. L'incubation est faite sur plateau oscillant pendant 20 mn à température ambiante. Ceci favorise la dissociation de l'épithélium du reste de la muqueuse. La muqueuse est ensuite grattée délicatement avec le bord mousse d'une lame de scalpel. La suspension cellulaire est filtrée sur une toile à "bluter" de porosité voisine de 250 Hm. Le filtrat est centrifugé à 1300 tour/mn pendant 10 mn. Le surnageant est éliminé et le culot cellulaire obtenu est débarrassé des hématies par aspiration douce avec une pipette Pasteur. Ce culot cellulaire est à nouveau lavé avec un milieu qui, de préférence, est le milieu d'incubation qui sera décrit ciaprès. Ce lavage est suivi d'une nouvelle centrifugation.

Le surnageant est à nouveau éliminé. Le culot de centrifugation ainsi obtenu est constitué de cellules épithéliales gastro-intestinales dites primaires. Ces cellules peuvent présenter un très faible taux de contamination par des cellules non épithéliales.

Le culot cellulaire ainsi obtenu permet la mise en oeuvre de l'étape 2 appelée étape d'adhérence des cellules à un support qui est l'étape caractéristique de la présente invention. Le culot cellulaire obtenu est remis en suspension dans un milieu d'incubation, lui-même placé en contact avec un support quelconque. Par support quelconque, il faut entendre tout support classiquement utilisé pour la culture cellulaire. Ainsi, à titre d'exemple, la suspension cellulaire peut être répartie soit dans des boîtes de
Pétri, soit dans des puits de plaques de culture multipuits (plaque 96 puits fabriquée par Nunc ou Falcon), soit dans des flacons de culture en verre ou en plastique. On note ici l'un des premiers intérêts de ce procédé. En effet, il n'est pas nécessaire de faire subir au support un prétraitement par des protéines d'adhérence ou par du sérum contrairement aux procédés de culture mis en oeuvre jusqu'à maintenant. Il n'est pas non plus nécessaire d'adjoindre à cet ensemencement la présence d'autres cellules.

Les cellules sont laissées à incuber environ 30 mn à 37"C dans une étuve à C02. Ce temps est le temps moyen nécessaire pour une adhérence maximale des cellules au support. Toutefois, en fonction de la qualité des cellules du culot cellulaire utilisé, on constate que l'on peut incuber lesdites cellules isolées dans ledit milieu d'incubation pendant une période de temps prédéterminée généralement comprise dans la plage [5 - 60 minutes pour obtenir un rendement d'adhérence des cellules au support qui peut être proche de 100 %. Dans certains cas, l'adhérence est extrêmement rapide et ne nécessite que 5 à 10 mn d'incubation dans ledit milieu. Dans d'autres cas, elle nécessite plusieurs dizaines de minutes pour permettre l'obtention d'un rendement d'adhérence permettant une mise en oeuvre optimale des étapes ultérieures du procédé. Les valeurs de rendements obtenues varient entre 60 et 100 % avec une moyenne de 90 t 8 %. Dans tous les cas, cependant, cette étape d'incubation est une étape transitoire qui sert à la transition entre l'étape de prélèvement et d'obtention du culot de cellules et l'étape de mise en culture.

Plusieurs milieux d'incubation présentant tous les mêmes caractéristiques peuvent être utilisés dans cette étape 2.

Le milieu d'incubation doit, dans tous les cas, se présenter sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mMl, de préférence [0 - 100 HM] pour provoquer une adhérence rapide et en masse desdites cellules isolées au support en contact avec ledit milieu d'incubation. Le milieu d'incubation préféré est un milieu à pH et osmolarité contrôlés qui se présente sous forme d'une solution comprenant au moins un élément nutritif et un ou plusieurs sels choisis de manière telle qu'au moins l'un des cations est présent dans la solution à une concentration au moins égale à 50 % de la concentration cationique finale de ladite solution. Les inventeurs pensent que cette caractéristique de milieu de culture permet d'induire un état de dépolarisation membranaire des cellules qui favorise l'adhérence de ces dernières au support. Ainsi, à titre d'exemple, ce milieu d'incubation comprend au moins, outre un élément nutritif, tel que du glucose et/ou de la créatine et éventuellement un anti-oxydant, tel que de la taurine, au moins un ou plusieurs sels, tels que des sels à base de potassium ou de sodium, le ou lesdits sels étant choisis de la manière décrite ci-dessus.

Un exemple de composition préférée dudit milieu d'incubation peut être tel que suit
KCl : 30-90 mM
K-glutamate : 1-10 mM
KH2PO4 : 10-50 mM
MgSO4 : 1-10 mM CaCl2 : 0-0,1 mM
EGTA : 0-1 mM créatine : 1-10 mM taurine : 1-30 mM glucose : 5-30 mM
Hepes : 10 mM pH ajusté à 7,2 avec KOH.

Ce milieu sera appelé milieu induisant l'adhérence (M.I.A.) (KCl). Dans ce cas, le cation potassium constitue l'espèce cationique prédominante.

On peut également imaginer une composition du milieu d'incubation telle que suit NaCl : 30-90 mM
Na-glutamate : 1-10 mM
NaH2PO4 : 10-50 mM
MgSO4 : 1-10 mM CaCl2 : 0-0,1 mM
EGTA : 0-1 mM créatine : 1-10 mM taurine : 1-30 mM glucose : 5-30 mM
Hepes : 10 mM pH ajusté à 7,2 avec KOH.

Ce milieu sera appelé milieu induisant l'adhérence -1 (M.I.A.-1) (NaCi > . Dans ce cas, le cation sodium constitue l'espèce cationique prédominante.

On peut également utiliser un milieu d'incubation dont la composition est telle que suit
KCl : 15 - 45 mM NaCl : 15 - 45 mM
KH2PO4 : 10 - 50 mM
MgSO4 : 1-10 mM CaCl2 : 0-0,1 mM
EGTA : 0-1 mM créatine : 1-10 mM taurine : 1-30 mM glucose : 5-30 mM
Hepes : 10 mM pH ajusté à 7,2 avec KOH.

Ce milieu sera appelé milieu induisant l'adhérence -2 (M.I.A.-2)(KCl/NaCl).

La figure 1 montre l'efficacité de ces milieux pour provoquer une adhérence des cellules à leur support. Ce graphique a été établi à partir de cellules épithéliales coliques humaines normales qui ont été ensemencées à densité égale en plaques 6 puits (Costar) dans les milieux
M.I.A. (KCl), M.I.A.-1 (NaCi), M.I.A.-2 (KCl/NaCl) et laissées à incuber pendant 30 mn. Après incubation, les cellules non adhérentes ont été éliminées par lavage et les cellules adhérentes ont été quantifiées par dosage de l'ADN dans les puits par la Méthode de Burton modifiée par Taylor et Coll. (Journal of Steroid biochemistry 20 (1984) 10831088). On constate ainsi que la composition monocationique du milieu d'incubation induit un rendement d'adhérence plus élevé des cellules à leur support.

Une autre expérience résumée sous forme de graphique (figure 2) a été réalisé de manière à tester l'efficacité de différents milieux d'incubation sur l'adhérence des cellules épithéliales gastro-intestinales y compris des milieux de culture standard. Ainsi, des cellules épithéliales coliques humaines normales ont été ensemencées à densité égale en plaques 6 puits (Costar) dans les milieux suivants : DMEM (milieu de culture standard fabriqué par Gibco-BRL), Spinner-MEM (milieu de culture standard sans calcium fabriqué par Gibco-BRL) et le milieu
M.I.A. (KCl) tel que décrit ci-dessus. Après incubation de 30 mn, les cellules non adhérentes ont été éliminées par lavage et les cellules adhérentes ont été quantifiées par dosage d'ADN dans les puits de manière analogue à ce qui a été décrit ci-dessus. La figure 2 démontre clairement que le milieu M.I.A. (KCl) est particulièrement efficace en terme d'adhérence des cellules à leur support. Le milieu
DMEM ne permet pas quant à lui de mettre en oeuvre les étapes ultérieures en raison de la faible concentration des cellules adhérant à leur support. En effet, cette faible adhérence induit une faible reproductibilité du système. Le milieu Spinner-MEM exempt de calcium pourrait être éventuellement utilisé comme milieu d'incubation.

Les cellules ainsi obtenues peuvent, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, être mises en culture dans un milieu de culture apte à assurer la survie des cellules et à maintenir leurs fonctions spécialisées. En effet, si cette incubation devait être prolongée pendant une période de temps supérieure à celle précisée ci-dessus, on constaterait rapidement un taux de mortalité élevé desdites cellules. Il est donc nécessaire, une fois l'adhérence des cellules à leur support réalisée, de remplacer le milieu d'incubation par un milieu de culture approprié. Les inventeurs ont constaté également que, si les cellules, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, sont cultivées dans un milieu de culture dont la concentration extracellulaire calcique est élevée, la mortalité des cellules est très élevée. On a constaté également que, si l'adhérence avait été réalisée dans de mauvaises conditions, par exemple, avec un milieu d'incubation tel que le milieu Spinner ou le milieu DMEM, ces cellules ne retrouvent pas, par la suite, lorsqu'elles sont placées en culture dans un milieu de culture approprié, l'ensemble de leurs fonctions. De ce fait, une étude complète de ces cellules n'est pas possible. En conséquence, pour obtenir des cellules en culture dont les caractéristiques sont les plus proches des cellules gastro-intestinales normales in vivo, ces cellules, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, sont cultivées dans un milieu de culture dont la concentration extra-cellulaire calcique est progressivement augmentée jusqu'à une valeur prédéterminée apte à assurer la survie des cellules et à maintenir leurs fonctions spécialisées.

Ainsi, à titre d'exemple, une fois l'adhérence des cellules obtenue, le milieu M.I.A. (KCl) peut être éliminé et remplacé par un milieu de culture, appelé milieu A, dont la base est le milieu Spinner-MEM (fabriqué par GIBCO-BRL) contenant en sus 0,08 mM CaCl2 + insuline (5.10 M) + transferrine (10 Hg/ml) + EGF (facteur de croissance épithéliale) (5ng/ml). Après incubation de 30 mn à 37 C en étuve à CO2, un tiers du volume de ce milieu est enlevé et remplacé par le milieu DMEM (fabriqué par GIBCO-BRL), en maintenant constante la concentration en insuline, EGF et transferrine. Le but de ces changements successifs est d'augmenter progressivement la concentration calcique de la solution jusqu'à une concentration extra-cellulaire calcique finale d'environ 1 mM. Bien évidemment, cette concentration extra-cellulaire calcique finale peut être supérieure à cette valeur. La concentration calcique extracellulaire, dans la plupart des milieux de culture, est de l'ordre de 1,8 mM.

En général, le milieu de culture apte à la survie desdites cellules est un milieu dont la base nutritive comprend, outre des éléments nutritifs et un ou plusieurs sels, au moins de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou le facteur de croissance épithéliale E.G.F. et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques. La composition de ce milieu peut varier à l'infini en fonction de la destination des cellules ainsi cultivées. La composition cellulaire ainsi obtenue est constituée d'une population pure de cellules épithéliales gastro-intestinales adhérant à un support.

Ce procédé de culture présente donc à la fois l'avantage de permettre la survie dans de bonnes conditions d'un grand nombre de cellules épithéliales gastro-intestinales mais, en outre, d'obtenir une population pure de ces cellules. Ce qui pourra faciliter la mise en oeuvre de l'étape 4. Les cellules ainsi cultivées peuvent être maintenues dans le milieu de culture pendant plusieurs jours et elles peuvent se prêter à diverses manipulations qui font l'objet de l'étape 4.

L'étape 4 peut se présenter sous des formes diverses et variées fonction des choix de l'utilisateur. En effet, l'utilisateur peut décider d'utiliser la composition cellulaire constituée d'une population pure de cellules épithéliales gastro-intestinales adhérant à un support et cultivées dans un ou plusieurs milieux de culture appropriés en tant que système de production in vitro par l'épithélium gastro-intestinal de molécules biologiquement actives et/ou d'ARNm. Par molécules biologiquement actives, on entend notamment les facteurs de croissance et les facteurs de réparation. En effet, comme cela a déjà été précisé ci-dessus, l'épithélium constitue une extraordinaire source de peptides bioactifs, tels que par exemple des peptides à activité anti-bactérienne (défensines), des peptides impliqués dans l'auto-réparation de la muqueuse (TGFss, peptides à structure en trèfle), des peptides régulant les sécrétions épithéliales (guanyline) et enfin des agents régulateurs du système immunitaire local (cytokines). La composition cellulaire peut donc être utilisée en tant que système de production de ces molécules de manière à permettre l'extraction desdites molécules ainsi produites dans le milieu de culture et leur purification ultérieure. Il est donc ainsi possible, grâce à cette composition cellulaire, de mettre en oeuvre un procédé d'obtention de molécules biologiquement actives qui se caractérise par une culture de ladite composition cellulaire dans un milieu de culture approprié, tel que le milieu décrit ci-dessus, pendant un temps approprié, puis à extraire lesdites molécules du milieu de culture et à les purifier.

Cette même application peut également permettre l'obtention d'ARNm qui sont extraits desdites cellules. Un tel procédé d'obtention d'ARNm spécifiques de l'épithélium intestinal se caractérise par une étape de culture de la composition cellulaire dans un milieu approprié puis par une étape d'extraction desdits ARN des cellules par des techniques bien connues.

Ainsi, à titre d'exemple, la figure 3 illustre la production de cytokine (Interleukine-8) par des cellules épithéliales intestinales humaines normales obtenues conformément aux étapes 1 à 3 décrites ci-dessus, ces dites cellules épithéliales ayant été cultivées dans un milieu de culture tel que le milieu A décrit ci-dessus en présence (courbe 1) ou en l'absence (courbe 2) d'un agent pathogène.

L'agent pathogène introduit dans ce milieu de culture a permis d'induire une production d'Interleukine-8 significativement supérieure à celle de cellules non traitées.

Il apparaît donc désormais possible de produire de nouvelles molécules à partir de la composition cellulaire, objet de l'invention, en adaptant les milieux de culture à chaque molécule devant être produite.

Cette composition cellulaire, cultivée dans un ou plusieurs milieux de culture appropriés, peut également être utilisée pour la réalisation de modèle d'étude in vitro du comportement des cellules épithéliales intestinales, notamment dans le domaine de la pharmacotoxicologie, de l'immunologie, en particulier pour l'aide à la fabrication de vaccins, et de la thérapie génique.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé de primoculture in vitro de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées de mammifères, en particulier de l'homme adulte, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape d'incubation transitoire desdites cellules isolées dans un milieu d'incubation se présentant sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 - 100 HM] pour provoquer une adhérence rapide et en masse desdites cellules isolées à un support quelconque en contact avec ledit milieu d'incubation.

2. Procédé de primoculture selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, sont cultivées dans un milieu de culture dont la concentration calcique est progressivement augmentée jusqu'à une valeur prédéterminée apte à assurer la survie des cellules et à maintenir leurs fonctions spécialisées.

3. Procédé de primoculture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on incube lesdites cellules isolées dans ledit milieu d'incubation pendant une période de temps prédéterminée comprise dans la plage [5 - 60] minutes pour obtenir un rendement d'adhérence des cellules au support qui peut être proche de 100 %.

4. Procédé de primoculture selon l'une des revendications 1 et 3, caractérisé en ce que le milieu d'incubation à pH et osmolarité contrôlées se présente sous forme d'une solution comprenant au moins un élément nutritif et un ou plusieurs sels choisis de manière telle qu'au moins l'un des cations est présent dans la solution à une concentration au moins égale à 50 % de la concentration cationique finale de ladite solution.

5. Milieu d'incubation de cellules épithéliales intestinales isolées de mammifères, en particulier de l'homme adulte, notamment pour la mise en oeuvre d'un procédé de culture selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 100 HM], pour provoquer l'adhérence en masse des cellules incubées dans ledit milieu à un support quelconque en contact avec ledit milieu d'incubation.

6. Milieu d'incubation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il se présente sous forme d'une solution comprenant au moins, outre un élément nutritif, tel que du glucose et/ou de la créatine, et éventuellement un anti-oxydant, tel que de la taurine, au moins un ou plusieurs sels, le ou lesdits sels étant choisis de manière telle qu'au moins l'un des cations est présent dans la solution à une concentration au moins égale à 50 % de la concentration cationique finale de ladite solution.

7. Milieu d'incubation selon l'une des revendications 5 et 6, caractérisé en ce qu'il présente la composition suivante KC1 : 30-90 mM

K-glutamate : 1-10 mM

KH2PO4 : 10-50 mM

MgSO4 : 1-10 mM

CaCl2 : 0-0,1 mM

EGTA : 0-1 mM créatine : 1-10 mM taurine : 1-30 mM glucose : 5-30 mM

Hepes : 10 mM pH ajusté à 7,2 avec KOH.

8. Composition cellulaire d'un nouveau type obtenue en particulier par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée d'une population pure de cellules épithéliales gastro-intestinales adhérant à un support, l'adhérence audit support ayant été obtenue par incubation transitoire de primoculture de cellules épithéliales gastro-intestinales isolées de mammifères dans un milieu d'incubation se présentant sous forme d'une solution dont les constituants sont choisis de manière telle que la concentration calcique finale de la solution du milieu d'incubation est comprise dans la plage [0 - 1 mM], de préférence [0 - 100 HM].

9. Composition cellulaire d'un nouveau type selon la revendication 8, caractérisée en ce que les cellules, une fois qu'elles ont adhéré à leur support, sont cultivées dans un milieu de culture se présentant sous forme d'une solution dont la concentration calcique est progressivement augmentée jusqu'à une valeur prédéterminée apte à assurer la survie des cellules et à maintenir leurs fonctions spécialisées.

10. Composition cellulaire d'un nouveau type selon l'une des revendications 8 et 9, caractérisée en ce que le milieu de culture, apte à la survie desdites cellules, est un milieu dont la base nutritive comprend, outre des éléments nutritifs et un ou plusieurs sels, au moins de l'insuline et/ou de la transferrine et/ou de la toxine cholérique et/ou le facteur de croissance épithéliale E.G.F. et/ou des extraits hypophysaires et/ou de la dexaméthasone et/ou du sélénium et/ou des albumines sériques.

11. Système de production in vitro par l'épithélium gastrointestinal de molécules biologiquement actives, telles que les facteurs de croissance, les facteurs de réparation, et/ou d'ARNm codant pour lesdites molécules, caractérisé en ce qu'il est constitué par une composition cellulaire selon la revendication 8 cultivée dans un ou plusieurs milieux de culture appropriés, les molécules biologiquement actives étant extraites du milieu de culture dans lequel est placée ladite composition cellulaire avant d'être purifiées tandis que les ARN messagers sont extraits des cellules.

12. Modèle d'étude in vitro du comportement des cellules épithéliales intestinales notamment dans des domaines tels que la pharmacotoxicologie, l'immunologie, en particulier pour l'aide à la fabrication de vaccins, et la thérapie génique, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une composition cellulaire selon la revendication 8 cultivée dans un ou plusieurs milieux de culture appropriés.