FR2712511A1 - Cartouche pour la préparation d'acides nucléiques purifiés. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une cartouche pour la préparation d'acides nucléiques purifiés obtenus à partir d'un échantillon de cellules, cette cartouche comprenant un tube filtrant (12) disposé à l'intérieur d'un tube de dialyse (10), les extrémités de ces tubes étant pincées et aplaties par montage dans des embouts d'extrémité (14, 16) réunis entre eux par des montants rigides (18), ces embouts étant conçus pour être reliés à des moyens d'introduction et de sortie de produits tels qu'un échantillon de cellules, des produits de réaction et des produits de rinçage.
Description
CARTOUCHE POUR LA PRHPARATION D'ACIDES N(JCLHIOUHS
PURIFIES
L'invention concerne une cartouche pour l'extraction et la purification d'acides nucléiques, notamment d'ADN génomique, à partir d'un échantillon de sang, d'un échantillon de cellules de tissu ou de cellules de culture.
PURIFIES
L'invention concerne une cartouche pour l'extraction et la purification d'acides nucléiques, notamment d'ADN génomique, à partir d'un échantillon de sang, d'un échantillon de cellules de tissu ou de cellules de culture.
Par la Demande Internationale W093/01312, on connaît déjà une cartouche de ce type qui représente une avance notable sur les dispositifs concurrents par sa simplicité d'emploi, son efficacité, sa fiabilité et ses conditions économiques de fabrication et de mise en oeuvre.
La cartouche décrite dans cette Demande antérieure comprend un cadre plat sur les deux faces duquel sont collées des membranes de dialyse délimitant entre elles une enceinte de dialyse. Un filtre plan de rétention des noyaux de cellules est monté dans le cadre entre les membranes, et des moyens sont prévus pour faire circuler entre les membranes un échantillon de cellules lysées, des produits de lavage et de rinçage des noyaux retenus par le filtre, et des produits de lyse des noyaux et de dégradation des protéines. Les acides nucléiques libérés dans l'enceinte sont purifiés par dialyse. Pour certaines cellules, l'ensemble des opérations de lyse des cellules, lyse des noyaux, dégradation des protéines et autres contaminants, et dialyse peut se faire directement dans l'enceinte.
Cette cartouche permet d'automatiser les opérations d'extraction et de purification des acides nucléiques, opérations qui ont lieu dans la cartouche et sans manipulation de celle-ci.
La présente invention a pour objet des perfectionnements à cette cartouche, visant à simplifier sa structure et sa fabrication, à réduire son coût et à améliorer son fonctionnement, ses performances et sa fiabilité.
Elle propose à cet effet une cartouche pour la préparation d'acides nucléiques purifiés, comprenant une enceinte de dialyse, des moyens d'introduction dans cette enceinte d'un échantillon de cellules et de produits de réaction, des moyens de sortie des produits de réaction et des acides nucléiques purifiés, et un filtre de rétention des noyaux des cellules, ce filtre étant disposé dans l'enceinte de dialyse, caractérisée en ce que le filtre et l'enceinte de dialyse sont constitués par un tube souple filtrant et un tube souple de dialyse placés l'un dans l'autre, le tube filtrant étant ouvert à une extrémité et fermé à l'autre, le tube de dialyse étant ouvert à ses deux extrémités, ces tubes étant aplatis au voisinage de leurs extrémités ouvertes par pincement élastique dans des embouts de matière élastomère ou analogue destinés à recevoir les moyens précités d'introduction et de sortie.
La structure tubulaire du filtre et de l'enceinte de dialyse a pour avantage de permettre une purge totale du système par dépression, la dépression ayant pour effet d'aplatir sur eux-mêmes le tube filtrant et le tube de dialyse sans laisser subsister de volumes internes résiduels. De plus, l'enceinte de dialyse ne contient aucun corps étranger à l'exception du tube filtrant, ce qui réduit les risques de contamination ou de pollution.
Selon une autre caractéristique de l'invention, le tube filtrant et le tube de dialyse ont sensiblement la même longueur, le tube filtrant étant fermé au voisinage d'une de ses extrémités par une ligne transversale de soudure.
Le montage de la cartouche selon l'invention en est simplifié. Par ailleurs, le tube de dialyse, qui est par nature relativement fragile, peut alors être supporté à ses extrémités montées dans les embouts, par le tube filtrant qui a une résistance mécanique supérieure.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, chaque embout comprend un corps creux de matière élastomère du type auto-obturable après perçage, ce corps comportant une fente de passage des extrémités du tube filtrant et du tube de dialyse et étant rempli d'une matière d'étanchéité telle qu'un silicone.
Chaque embout comprend une bague cylindrique extérieure en matière rigide, et des moyens de liaison rigide sont prévus entre les bagues des embouts. Chaque bague cylindrique est formée de deux coquilles semicylindriques placées face à face et assemblées par exemple par encliquetage et/ou au moyen d'un joint annulaire d'étanchéité enfilé sur les coquilles.
Pour éviter tout risque de détérioration du tube filtrant et du tube de dialyse à leurs extrémités montées dans les embouts, les moyens précités d'introduction et de sortie comprennent des aiguilles creuses à extrémité fermée arrondie et à trous d'injection latéraux, qui sont introduites dans les embouts par perçage de ces derniers et que l'on fait passer dans les extrémités aplaties et pincées du tube filtrant et du tube de dialyse.
De façon générale, la cartouche selon l'invention est destinée à être placée dans un tube ou un logement relié à des moyens de circulation d'un liquide de dialyse.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaitront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels
la figure 1 représente schématiquement ' une cartouche selon l'invention;
la figure 2 représente schématiquement un tube dans lequel cette cartouche est destinée à être montée;
les figures 3 et 4 sont des vues schématiques du tube filtrant et du tube de dialyse;
la figure 5 illustre schématiquement une phase du montage d'une cartouche selon l'invention;
la figure 6 est une vue schématique en perspective d'un corps creux.
la figure 1 représente schématiquement ' une cartouche selon l'invention;
la figure 2 représente schématiquement un tube dans lequel cette cartouche est destinée à être montée;
les figures 3 et 4 sont des vues schématiques du tube filtrant et du tube de dialyse;
la figure 5 illustre schématiquement une phase du montage d'une cartouche selon l'invention;
la figure 6 est une vue schématique en perspective d'un corps creux.
La cartouche selon l'invention représentée en figure 1 comprend essentiellement un tube cylindrique souple 10 de dialyse à l'intérieur duquel se trouve un tube cylindrique souple 12 filtrant, réalisé en une matière microporeuse ayant une propriété de rétention des noyaux des cellules, et des embouts d'extrémités 14, 16 qui sont reliés rigidement entre eux par des montants 18 extérieurs au tube de dialyse 10 et dans lesquels sont montés les extrémités du tube de dialyse 10 et du tube filtrant 12.
Le tube de dialyse 10 est ouvert à ses deux extrémités, tandis que le tube filtrant 12 est ouvert à son extrémité supérieure et fermé à son extrémité inférieure par exemple par une ligne transversale 20 de soudure étanche. Par ailleurs, le tube de dialyse 10 et le tube filtrant 12 sont, au voisinage de leurs extrémités, pincés et aplatis de façon élastique à leur entrée dans les embouts 14 et 16, comme indiqué en 22, les extrémités proprement dites de ces tubes allant ensuite en s'évasant à l'intérieur des embouts 14 et 16 comme on peut le voir sur le dessin.
Des conduits borgnes axiaux 24 sont formés dans les embouts 14 et 16 depuis leur extrémité extérieure et s'étendent en direction des extrémités évasées et ouvertes des tubes 10 et 12.
Au moins un joint torique d'étanchéité 26 est monté sur la -surface cylindrique de chaque embout et l'embout supérieur 14 comporte une tête élargie 28.
Une telle cartouche est destinée à être utilisée dans un tube ou un logement cylindrique 30 tel que celui représenté en figure 2, dont le diamètre interne correspond sensiblement au diamètre externe des embouts 14 et 16 ou de leurs joints toriques 26. Ainsi, la cartouche peut être montée de façon étanche à l'intérieur du tube 30 grâce à ses embouts 14, 16 qui obturent à étanchéité les extrémités supérieure et inférieure du tube, la tête 28 de l'embout 14 étant appliquée sur l'extrémité supérieure du tube 30.
Ce dernier comprend deux conduits radiaux 32, 34 décalés en hauteur et formés de façon à déboucher à l'intérieur du tube 30 entre les embouts 14 et 16 de la cartouche, ces conduits radiaux étant destinés à être reliés à des moyens 36, 38 d'amenée et de sortie de liquide de dialyse, ainsi qu'à des moyens de mise en pression ou dépression de la cartouche.
On se réfère maintenant aux figures 3 à 6 pour décrire de façon plus détaillée la structure et le montage d'un mode de réalisation préféré de la cartouche selon l'invention.
Le tube filtrant 12 est représenté en figure 3 et est constitué d'un film cylindrique d'une matière microporeuse apte à la rétention des noyaux des cellules, cette matière microporeuse étant par exemple un tissu de polyester ayant une épaisseur de l'ordre de 0,1 millimètre et une porosité de l'ordre du micron. Un tel tissu filtrant est disponible dans le commerce.
On ferme ce tube 12 au voisinage de son extrémité inférieure par une ligne transversale 20 de soudure étanche et on pratique deux ouvertures 40 dans le tube immédiatement en dessous de cette ligne de soudure. De plus, on forme d'autres trous 42, dont le rôle sera expliqué par la suite, dans le tube 12 au voisinage immédiat de ses extrémités.
Le tube de dialyse 10 représenté en figure 4 a sensiblement la même longueur que le tube filtrant 12 et un diamètre légèrement supérieur à celui du tube filtrant. Le tube de dialyse 10 est ouvert à ses deux extré mités, comme déjà indiqué, et comporte des trous 44 au voisinage immédiat de ses extrémités, ces trous 44 correspondant aux trous 42 du tube filtrant 12.
Ce tube de dialyse 10 est réalisé par exemple en un film de nylon ayant une épaisseur de l'ordre de 0,1 millimètre et une porosité de l'ordre de 0,1 pin.
Pour fixer les idées, on indiquera à titre d'exemple uniquement que les tubes 10 et 12 peuvent avoir une longueur de l'ordre de 50 mm, le tube filtrant 12 ayant un diamètre de l'ordre de 5 mm et le tube de dialyse 10 un diamètre de l'ordre de 6,5 mm.
Le tube filtrant 12 est placé à l'intérieur du tube de dialyse 10 et les extrémités de ces tubes sont montées dans les embouts 14 et 16 de la façon qui va être décrite en référence à la figure 5.
Chaque embout 14, 16 comprend un corps creux 46, 48 de forme générale cylindrique, réalisé en une matière élastomère du type auto-obturable après perçage, telle qu'un * bromobutyl e " . Chaque corps creux 46,48 est formé avec le conduit borgne 24 précité et le corps creux supérieur 46 comporte la tête élargie 28 précitée.
Les extrémités en regard de ces corps creux comprennent chacune une fente allongée très étroite de passage des extrémités des tubes 10 et 12, cette fente étant délimitée par deux lèvres 50 orientées l'une vers l'autre et appliquées l'une sur l'autre, la largeur de la fente ainsi formée étant sensiblement nulle. La paroi interne de chaque corps creux opposée à cette fente peut comprendre une saillie 52 à section triangulaire, qui est orientée vers la fente et qui s'engage au moins partiellement dans les extrémités des tubes 10 et 12 pour les ouvrir et les évaser légèrement.
Comme on le voit mieux en figure 6, la paroi cylindrique de chaque corps creux 46, 48 est constituée par des bras qui délimitent de larges ouvertures latérales 54, donnant de la souplesse aux lèvres 50. Les ou vertures sont obturées ultérieurement par une matière d'étanchéité.
Chaque corps creux 46, 48 est enserré dans deux coquilles semi-cylindriques 56, réalisées par exemple en matière plastique rigide et venant de moulage avec les montants 18 précités dont chacun relie une coquille 56 d'un embout à une coquille 56 de l'autre embout. Les deux coquilles semi-cylindriques 56 de chaque embout sont assemblées l'une à l'autre par exemple par des moyens d'encliquetage élastique tels que ceux représentés en 58 et 60, et/ou au moyen des joints toriques 26 qui sont enfilés sur ces coquilles et engagés dans des gorges annulaires prévues à cet effet. Lorsque les coquilles 56 sont ainsi assemblées l'une à l'autre, elles entourent le corps creux 46, 48 à la façon d'un moule. On peut alors par l'intermédiaire d'une aiguille creuse introduite dans le conduit 24 de chaque corps creux et traversant le fond de celui-ci, injecter dans chaque corps creux une matière d'étanchéité telle qu'un silicone par exemple, qui est relativement mou et qui adhère bien aux extrémités des tubes 10 et 12 et aux parois du corps creux 46 ou 48. Les orifices 42 et 44 formés au voisinage immédiat des extrémités des tubes 10 et 12 facilitent le passage de la matière injectée et le remplissage des corps creux par cette matière.
Les extrémités ouvertes des tubes 10 et 12 sont ainsi complètement noyées dans cette matière d'étanchéité.
La cartouche selon l'invention est utilisée de la façon suivant
elle est montée à étanchéité dans le tube ou le logement cylindrique 30 de la figure 2 par enfoncement jusqu'à ce que la tête élargie 28 de l'embout supérieur 14 vienne s'appliquer sur l'extrémité supérieure du tube ou du logement cylindrique 30. On peut alors introduire une aiguille creuse d'injection dans le conduit borgne 24 de chaque embout et percer la matière de l'embout jusqu'à faire déboucher l'extrémité de l'aiguille à l'intérieur du tube filtrant 12. Pour éviter de détériorer le tube filtrant ou le tube de dialyse, on utilise avantageusement une aiguille à extrémité fermée et arrondie, comprenant des orifices latéraux d'injection.
elle est montée à étanchéité dans le tube ou le logement cylindrique 30 de la figure 2 par enfoncement jusqu'à ce que la tête élargie 28 de l'embout supérieur 14 vienne s'appliquer sur l'extrémité supérieure du tube ou du logement cylindrique 30. On peut alors introduire une aiguille creuse d'injection dans le conduit borgne 24 de chaque embout et percer la matière de l'embout jusqu'à faire déboucher l'extrémité de l'aiguille à l'intérieur du tube filtrant 12. Pour éviter de détériorer le tube filtrant ou le tube de dialyse, on utilise avantageusement une aiguille à extrémité fermée et arrondie, comprenant des orifices latéraux d'injection.
L'aiguille montée dans l'embout supérieur 14 peut être reliée à des récipients divers contenant notamment un échantillon de cellules, des produits de lyse des cellules et des noyaux des cellules, des produits de dégradation des protéines, des produits de rinçage.
L'introduction de ces produits à l'intérieur du tube filtrant 12 peut se faire par mise en pression des récipients ou par liaison de l'aiguille de l'embout inférieur 16 à une source de dépression.
On peut réaliser une purge ou une vidange complète du tube filtrant 12 et du tube de dialyse 10 en obturant l'aiguille de l'embout supérieur ou en retirant cette aiguille, la matière du corps creux 46 étant autoobturable, et en connectant l'aiguille de l'embout inférieur à une source de dépression, ce qui a pour effet d'aplatir complètement sur eux-mêmes le tube filtrant 12 et le tube de dialyse 10, en ne laissant subsister aucun volume résiduel à l'intérieur de ces tubes.
Les trous ou orifices 40 formés dans le tube filtrant 12 immédiatement en dessous de la ligne de soudure étanche 20, permettent aux produits contenus entre le tube filtrant 12 et le tube de dialyse 10 d'être évacués au moyen de l'aiguille de l'embout inférieur 16.
De façon générale, la cartouche selon l'invention peut être utilisée de la même façon que celle décrite dans la Demande Internationale WO93/01312 précitée, dont le contenu est incorporé ici par référence, et les procédés décrits dans cette Demande Internationale peuvent être utilisés pour la cartouche selon l'invention.
Brièvement, ces procédés consistent notamment à introduire un échantillon de cellules et un produit de lyse dans le tube filtrant 12, puis à évacuer ce mélange par aspiration, les noyaux des cellules étant retenus par le tube 12, à effectuer des rinçages, puis à injecter dans le tube 12 des produits de lyse des noyaux et de dégradation des protéines, à effectuer une dialyse dans le tube ou logement 30, et à extraire l'ADN du tube de dialyse 10 par aspiration.
Avantageusement, la simplicité de la structure de la cartouche selon l'invention et de sa fabrication permettent d'en faire un produit jetable, qui n'est utilisé qu'une seule fois.
Claims (8)
1. Cartouche pour la préparation d'acides nucléiques purifiés, comprenant une enceinte de dialyse (10), des moyens d'introduction dans cette enceinte d'un échantillon de cellules et de produits de réaction, des moyens de sortie des produits de réaction et des acides nucléiques purifiés et un filtre de rétention des noyaux des cellules, ce filtre étant disposé dans l'enceinte de dialyse (10), caractérisée en ce que le filtre et l'enceinte de dialyse sont constitués par un tube souple filtrant (12) et un tube souple de dialyse (10) placés l'un dans l'autre, le tube filtrant (12) étant ouvert à une extrémité et fermé à l'autre, le tube de dialyse (10) étant ouvert à ses deux extrémités, ces tubes étant aplatis au voisinage de leurs extrémités ouvertes par pincement élastique dans des embouts (14, 16) de matière élastomère ou analogue destinées à recevoir les moyens précités d'introduction et de sortie.
2. Cartouche selon la revendication 1, caractérisée en ce que les extrémités du tube filtrant (12) et du tube de dialyse (10) sont évasées et noyées dans une matière élastomère d'étanchéité.
3. Cartouche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le tube filtrant (12) et le tube de dialyse (10) ont sensiblement la même longueur, le tube filtrant (12) étant fermé au voisinage d'une de ses extrémités par une ligne transversale (20) de soudure.
4. Cartouche selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque embout comprend un corps creux (46, 48) de matière élastomère du type auto-obturable après perçage, ce corps comportant une fente de passage des extrémités du tube filtrant (12) et du tube de dialyse (10) et étant rempli d'une matière d'étanchéité telle qu'un silicone.
5. Cartouche selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque embout com prend une bague cylindrique extérieure (56) en matière rigide et des moyens (18) de liaison rigide sont prévus entre les bagues des embouts.
6. Cartouche selon la revendication 5, caractérisée en ce que chaque bague cylindrique est formée de deux coquilles (56) semi-cylindriques placées face à face et assemblées par encliquetage et/ou au moyen d'un joint annulaire d'étanchéité (26) enfilé sur les coquilles.
7. Cartouche selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que les moyens d'introduction et de sortie comprennent des aiguilles creuses à extrémité fermée arrondie et à trous d'injection latéraux, qui sont introduites à travers les embouts (14, 16) dans les extrémités aplaties et pincées du tube filtrant (12) et du tube de dialyse (10).
8. Cartouche selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est destinée à être disposée dans un tube (30) relié à des moyens (36, 38) de circulation d'un liquide de dialyse.
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