FR2693739A1 - Device for the cultivation of microorganisms. - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un dispositif pour la culture de micro-organismes dans des plaques de microtitrage (1), les cavités (2) des plaques de microtitrage (1) étant fermées par une membrane flexible (4) qui présente une bonne perméabilité à l'oxygène, de préférence un coefficient de perméation des gaz P de plus de 10- 9 cm3 (CF DESSIN DANS BOPI) culture liquides à température constante, les plaques de microtitrage 1 sont mises en mouvement de rotation dans une étuve d'incubation, sur un châssis-support monté sur un arbre. On est ainsi assuré de fortes concentrations constantes d'oxygène dans le milieu de culture et, par suite, d'une formation continue de biomasse.The invention relates to a device for culturing microorganisms in microtiter plates (1), the cavities (2) of the microtiter plates (1) being closed by a flexible membrane (4) which has good permeability to water. oxygen, preferably a coefficient of permeation of gases P of more than 10-9 cm3 (CF DRAWING IN BOPI) culture of liquids at constant temperature, the microtiter plates 1 are set in rotation in an incubation oven, on a support frame mounted on a shaft. This ensures constant high concentrations of oxygen in the culture medium and, consequently, a continuous formation of biomass.
Description
L'invention concerne un dispositif pour la culture de micro-organismesThe invention relates to a device for the cultivation of microorganisms
dans des plaques de microtitrage, les plaques de microtitrage étant fermées par des membranes qui, d'une part, empêchent le liquide de s'écouler et, d'autre part, sont perméables à l'oxygène. L'utilisation de plaques de microtitrage pour la culture de micro- organismes, permettant de tester de multiples cultures, est connue Une série de publications est consacrée à l'analyse qualitative et quantitative de micro-organismes ou de substances qui in microtiter plates, the microtiter plates being closed by membranes which, on the one hand, prevent the liquid from flowing and, on the other hand, are permeable to oxygen. The use of microtiter plates for the cultivation of microorganisms to test multiple cultures is known A series of publications is devoted to the qualitative and quantitative analysis of microorganisms or substances that
sont produites par des micro-organismes. are produced by microorganisms.
FR-A 2 556 741 décrit des plaques de microtitrage qui sont utilisées pour la détection de l'activité de substances déterminées sur des microorganismes ou des mélanges de micro-organismes, les micro- organismes se trouvant dans un milieu lyophile et la substance active étant ajoutée au milieu de culture, puis la plaque de microtitrage étant mise en incubation à une température appropriée. Des plaques de microtitrage pour des essais de sensibilité aux antibiotiques, qui sont conservées à basse température, par exemple à -70 'C, afin de maintenir la stabilité des antibiotiques, sont décrites FR-A-2 556 741 discloses microtiter plates which are used for detecting the activity of specific substances on microorganisms or mixtures of microorganisms, the microorganisms being in a lyophilic medium and the active substance being added to the culture medium, and then the microtiter plate is incubated at an appropriate temperature. Microtiter plates for antibiotic susceptibility testing, which are stored at low temperature, for example at -70 ° C, to maintain the stability of the antibiotics, are described.
par P L Kuglin Bailey et N B McGuckin dans Am J Ned. by P L Kuglin Bailey and N B McGuckin in Am J Ned.
Technol 45 ( 6), pages 517 à 522, 1979. Technol 45 (6), pp. 517-522, 1979.
Des plaques de microtitrage, également pour des essais de sensibilité aux antibiotiques, sont décrites dans DE-OS 33 36 738 Les plaques de microtitrage comportent des modules échangeables munis de cavités, les cavites pouvant recevoir des volumes détermines, par exemple de suspensions de bactéries, et présentant des ouvertures pour l'échange de gaz. Le modèle d'utilité allemand G 91 07 670 6 propose des plaques de microtitrage modifiées, ayant une structure en soi connue qui, pour la fixation de matières biologiquement significatives, contenant des groupements amino ou sulfohydrure, présente aà la surface, au moins dans la région de la cavité, un enduit transparent de polymère qui contient un grand nombre de Microtiter plates, also for antibiotic susceptibility tests, are described in German Offenlegungsschrift No. 33 36 738. The microtiter plates comprise exchangeable modules provided with cavities, the cavities being able to receive specific volumes, for example of suspensions of bacteria. and having openings for gas exchange. The German utility model G 91 07 670 6 proposes modified microtiter plates having a structure known per se which, for the fixation of biologically significant materials, containing amino or sulfohydride groups, present on the surface, at least in the cavity area, a transparent polymer coating that contains a large number of
groupements epoxy.epoxy groups.
Dans US 4 680 269, il est décrit des plaques de microtitrage dont les cavités sont recouvertes d'une In US 4,680,269, microtiter plates are described whose cavities are covered with a
couche poreuse qui est impregnée d'un composant acide. porous layer which is impregnated with an acid component.
Cette couche est en mesure de neutraliser des produits basiques gazeux, comme par exemple l'ammoniac qui est formé au cours de la croissance de cultures de bactéries On evite ainsi des erreurs dans les essais biochimiques sensibles au p E. Dans la culture de micro-organismes, il est souvent nécessaire, dans la phase de selection, d'expérimenter de très nombreuses cultures On s'efforce alors d'obtenir, dans les cultures individuelles, des densités elevees de cellules ou de fortes concentrations de biomasse, en particulier lorsque la formation d'un produit desiré du metabolisme cellulaire, par exemple d'un produit de fermentation, depend de la concentration de biomasse dans la culture Dans le cas par exemple de processus aérobies, la formation de biomasse dépend essentiellement de la quantité de l'oxygène introduit dans la culture Pour y parvenir, on utilise en règle genérale des fioles d'Erlenmeyer munies de chicanes, qui This layer is able to neutralize basic gaseous products, for example ammonia which is formed during the growth of bacteria cultures. This avoids errors in p-E-sensitive biochemical tests. In the selection phase, it is often necessary to experiment with a large number of crops. In individual crops, high densities of cells or high concentrations of biomass are required. formation of a desired product of cellular metabolism, for example of a fermentation product, depends on the concentration of biomass in the culture In the case for example of aerobic processes, the formation of biomass depends essentially on the quantity of oxygen In order to achieve this, baffled Erlenmeyer flasks with baffles are generally used.
sont mises en incubation dans des appareils agitateurs. are incubated in stirring apparatus.
Typiquement, les fioles d'agitation présentent un volume total de 100 mi et sont remplies d'environ 20 ml de milieu de culture En comparaison d'une opération miniaturisée, la préparation de multiples cultures dans des fioles d'agitation prend beaucoup de temps et consomme beaucoup de matières. Si l'on utilise des plaques de microtitrage de l'état de la technique, dans le cas notamment de processus aérobies, la biomasse est tout d'abord formée à la surface du milieu de culture dans les cavités, ce qui retarde une diffusion ultérieure d'oxygène à l'intérieur du milieu de culture Cet obstacle à la diffusion peut être surmonté en partie par une agitation, mais avec la technique usuelle d'agitation bidimensionnelle, la permeation des gaz n'est améliorée que de façon insignifiante, en raison des tensions superficielles élevées et de la concentration de la biomasse, spécifiquement plus légere, à la surface du milieu de culture. Le but fixe en conséquence de cela, à savoir améliorer la perméation des gaz en direction des cavités Typically, the shake flasks have a total volume of 100 ml and are filled with about 20 ml of culture medium. Compared with a miniaturized operation, the preparation of multiple cultures in shake flasks is time consuming and consumes a lot of materials. If microtiter plates of the state of the art are used, especially in the case of aerobic processes, the biomass is first formed on the surface of the culture medium in the cavities, which delays subsequent diffusion. The diffusion barrier can be partly overcome by agitation, but with the usual two-dimensional stirring technique, the permeation of the gases is only insignificantly improved, due in part to high surface tensions and the concentration of biomass, specifically lighter, on the surface of the culture medium. The goal therefore is to improve the permeation of gases towards cavities.
de plaques de microtitrage dans la culture de micro- of microtiter plates in the micro-culture
organismes avec, en même temps, la préparation miniaturisée des cultures, est atteint par le disositif organisms with, at the same time, the miniaturized preparation of cultures, is reached by the
selon l'invention Celui-ci sert à la culture de micro- According to the invention, it is used for the cultivation of micro-
organismes dans des plaques de microtitrage, les cavités des plaques de microtitrage étant fermées par des membranes flexibles qui présentent une bonne perméabilité à l'oxygène et empêchent en même temps l'écoulement du milieu de culture liquide qui se trouve dans les cavités Avec le dispositif représenté sur la fig 1, les plaques de microtitrage 1, pour la formation de biomasse dans les milieux de culture qui se trouvent dans les cavités 2, sont mises en mouvement à température constante en vue d'un mélange intense et, par suite, d'un enrichissement en oxygène La membrane flexible 4 est faite de préférence d'une matière plastique qui a une permeabilite & l'oxygene, exprimée par le coefficient de permeation des gaz P, de plus de cm organisms in microtiter plates, the cavities of the microtiter plates being closed by flexible membranes which have good oxygen permeability and at the same time prevent the flow of the liquid culture medium which is in the cavities With the device 1, the microtiter plates 1 for the formation of biomass in the culture media which are in the cavities 2 are set in motion at a constant temperature for intense mixing and, consequently, Oxygen enrichment The flexible membrane 4 is preferably made of a plastic material which has a permeability to oxygen, expressed by the permeation coefficient of the gases P, of more than 1 cm.
1 O-9 cm t cm s torr) et, avec une préférence particu- 1 -9 cm t cm s torr) and, with particular preference
lière, d'un polymère compose de motifs siloxane (organopolysiloxane). La plaque de microtitrage 1 selon l'invention est représentée sur la fig 1 Elle se compose d'un nombre A variable de cavités 2 Ordinairement, les cavités 2 et la plaque de base 2 a sont en une matière transparente, de préférence en matiere plastique, les cavités 2 ayant la forme de cylindres ouverts d'un côté Le nombre A des cavités 2 est compris par exemple entre 12 et 96 Après que les cavités 2 ont éte remplies du milieu de culture liquide, par exemple des micro- organismes dans une solution aqueuse de substances nutritives, les côtés ouverts des cavités, de préférence cylindriques, sont recouverts d'une membrane flexible 4 qui doit presenter une bonne perméabilité à l'oxygene La perméabilité a l'oxygène peut étre exprimée par exemple par le coefficient de permâation des gaz P, qui entre dans la loi de transport de Fick: = F t (I) d. dans laquelle N = Quantité passante du gaz P = Coefficient de permeation du gaz F = Surface de passage Ap = Différence de tension de vapeur du gaz t = Temps de passage of a polymer composed of siloxane units (organopolysiloxane). The microtiter plate 1 according to the invention is shown in FIG. 1 It consists of a variable number A of cavities 2 Ordinarily, the cavities 2 and the base plate 2 are made of a transparent material, preferably made of plastic , the cavities 2 having the form of cylinders open on one side The number A of the cavities 2 is for example between 12 and 96 After the cavities 2 have been filled with the liquid culture medium, for example microorganisms in a aqueous solution of nutrients, the open sides of the cavities, preferably cylindrical, are covered with a flexible membrane 4 which must have good oxygen permeability Oxygen permeability may be expressed for example by the permeation coefficient gases P, which enters the law of transport of Fick: = F t (I) d. where N = Pass-through quantity of gas P = Gas permeation coefficient F = Passage area Ap = Difference of gas vapor pressure t = Transit time
d = Epaisseur de la membrane 4.d = Thickness of the membrane 4.
De preférence, la membrane flexible 4 est faite d'une matière plastique qui a un coefficient de perméation du cm gaz de plus de 10-9 cm 3 t cm s torr), une préférence particuliere étant donnée aux matières plastiques qui sont résistantes a la corrosion en présence du milieu de culture (cf par exemple & cet égard Vieweg/Braun, Kunststoff-Handbuch, vol 1, pp 936 sqq, Carl Hanser, Preferably, the flexible membrane 4 is made of a plastic material which has a gas permeation coefficient of more than 10-9 cm 3 cm (torr), with particular preference given to plastics which are resistant to corrosion. corrosion in the presence of the culture medium (cf in this respect Vieweg / Braun, Kunststoff-Handbuch, vol 1, pp 936 sqq, Carl Hanser,
Munich, 1975).Munich, 1975).
Comme matiere plastique, on utilise par exemple du polystyrène, des poly(méth)acrylates, du polycarbonate, du polyéthylène ayant une masse volumique de moins de 0,94 g/cm 3, du caoutchouc styrene- butadiène et, en particulier, des organopolysiloxanes tels par exemple Examples of plastics used are polystyrene, poly (meth) acrylates, polycarbonate, polyethylene having a density of less than 0.94 g / cm 3, styrene-butadiene rubber and, in particular, organopolysiloxanes. such for example
que le diméthylpolysiloxane.than dimethylpolysiloxane.
La membrane 4 doit être suffisamment flexible pour que les petits trous qui pauvent être formés par des aiguilles d'injection en cas de réalimentation des cavités 2 individuelles en solution nutritive se referment aussitôt que l'aiguille est retirée et qu'en conséquence, il ne puisse pas s'écouler de milieu de The membrane 4 must be sufficiently flexible so that the small holes which can be formed by injection needles in case of feeding the individual cavities 2 in nutrient solution close again as soon as the needle is withdrawn and that consequently it can not flow from middle of
culture.culture.
Pour la fixation de la membrane 4, il est posé sur celle-ci une plaque de fixation 3 qui est ordinairement faite de la même matière que la plaque de base 2 a, a des dimensions supérieures d'environ 25 à 50 % à celles de la plaque de microtitrage et comporte des trous 3 a qui permettent d'alimenter les cavités 2 individuelles, au moyen d'une aiguille d'injection, en liquide nutrifif, en cultures ou en d'autres constituants du milieu de culture La plaque de fixation 3 est fixée a la plaque de base au moyen de vis 6, les etriers 5 étant utilisés pour une fixation supplémentaire de la membrane 4 et de For the attachment of the membrane 4, there is placed thereon a fixing plate 3 which is ordinarily made of the same material as the base plate 2a, has dimensions that are approximately 25 to 50% greater than those of the microtiter plate and has holes 3a which can feed the individual cavities 2, by means of an injection needle, nutrient liquid, cultures or other constituents of the culture medium The fixing plate 3 is attached to the base plate by means of screws 6, the stents 5 being used for additional fixation of the membrane 4 and
la plaque de fixation 3 sur les cavités 2. the fixing plate 3 on the cavities 2.
La plaque de microtitrage 3 ayant une telle structure est mise en mouvement dans un milieu a température constante, de sorte qu'il se produise un mélange intense des milieux de culture liquides dans les cavités 2 De préférence, on utilise, comme milieu à température constante, de l'air qui est chauffé à l'aide d'un thermostat a la température nécessaire, de préférence entre 30 et 60 C, et qui est mis en circulation dans l'étuve d'incubation L'étuve d'incubation est constituée de preférence par une boite transparente qui est faite de préférence de matiere plastique et, avec une preférence particulière, de polymethacrylate de méthyle (Plexiglas ) Les plaques de microtitrage 1 sont placées sur un châssis-support qui est monté sur un arbre entraîné par un moteur Le mélange intense du milieu de culture liquide dans les cavités 2 est obtenu par un mouvement de rotation des plaques de microtitrage The microtiter plate 3 having such a structure is set in motion in a constant temperature medium, so that an intense mixture of liquid culture media is produced in the cavities 2. Preferably, the medium is used at constant temperature. , air which is heated by means of a thermostat to the necessary temperature, preferably between 30 and 60 C, and which is circulated in the incubator incubator incubator is constituted preferably by a transparent box which is preferably made of plastic material and, with a particular preference, polymethyl methacrylate (Plexiglas) The microtiter plates 1 are placed on a support frame which is mounted on a shaft driven by an engine The intense mixture of the liquid culture medium in the cavities 2 is obtained by a rotational movement of the microtiter plates
1 autour de l'arbre.1 around the tree.
Avec le dispositif selon l'invention pour la culture de micro- organismes, des concentrations constamment élevées d'oxygene dans le milieu de culture liquide, qui se trouve dans les cavités 2, sont garanties par le mélange intense du milieu de culture et par le remplacement permanent de l'oxygene consomme à travers la membrane flexible 4 En outre, le mélange intense empêche un dépât de la biomasse à la surface du liquide de culture, ce qui est egalement une cause de retardement du transport d'oxygee et, par suite, de la formation de biomasse Pour les essais de selection, le petit volume des cavités 2 des plaques de microtitrage 1 est avantageux, car la quantité de milieu de culture est nettement réduite de ce fait En outre, la préparation de nombreuses cultures dans des fioles d'agitation prend beaucoup de temps et consomme beaucoup de matieres en comparaison de i'operation miniaturisee selon l'invention. With the device according to the invention for the culture of microorganisms, constantly high concentrations of oxygen in the liquid culture medium, which is in the cavities 2, are guaranteed by the intense mixing of the culture medium and by the permanent replacement of the oxygen consumes through the flexible membrane 4 In addition, the intense mixture prevents a deposition of the biomass on the surface of the culture liquid, which is also a cause of delay of oxygen transport and, consequently For the selection tests, the small volume of the cavities 2 of the microtiter plates 1 is advantageous because the amount of culture medium is significantly reduced thereby. In addition, the preparation of many cultures in vials This agitation takes a lot of time and consumes a lot of material in comparison with the miniaturized operation according to the invention.
L'exemple qui suit expliquera l'lnvention. The following example will explain the invention.
Les plaques de microtitrage i utilisées sont faites de polystyrene {Costar , firme Falcon) et comportent de 12 à 96 cavités 2 La membrane 4 est constituée par une feuille mince de polydimethylsiloxane reticule et presente une épaisseur de i mm La plaque de fixation 3 et la plaque de base 2 a sont des plaques de polymethacrylate de methyle de 5 mm d'epaisseur, avec des dimensions, longueur, largeur) supérieures d'environ % à calles de la plaque de microtitrage, le nombre et la disposition des trous 3 a correspondent à ceux des The microtiter plates used are made of polystyrene (Costar, Falcon firm) and comprise from 12 to 96 cavities 2 The membrane 4 consists of a thin sheet of polydimethylsiloxane reticle and has a thickness of i mm. The fixing plate 3 and the base plate 2a are polymethylmethacrylate plates 5 mm thick, with dimensions, length, width) about% to the microtiter plate, the number and arrangement of holes 3a correspond to those of
cavités 2 sur la plaque de microtitrage 1. cavities 2 on the microtiter plate 1.
L'arbre sur lequel est fixée la plaque de The tree on which is fixed the plate of
microtitrage 1 est entraîné par un moteur électrique. Microtiter 1 is driven by an electric motor.
L'étuve d'incubation est faite de polyméthacrylate de methyle transparent (Plexiglas ), la température nécessaire dans l'étuve d'incubation, qui doit être comprise entre 30 et 60 OC, de préférence entre 35 et 'C, étant réglée au moyen d'un thermostat avec The incubation oven is made of transparent polymethyl methacrylate (Plexiglas), the temperature required in the incubation oven, which must be between 30 and 60 OC, preferably between 35 and 'C, being adjusted by means of a thermostat with
circulation d'air.air circulation.
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| DK64593A (en) | 1994-01-17 |
| DK64593D0 (en) | 1993-06-04 |
| NL9300957A (en) | 1994-02-16 |
| DE9209540U1 (en) | 1992-09-24 |
| GB2269391A (en) | 1994-02-09 |
| JPH0633500U (en) | 1994-05-06 |
| FI933192A (en) | 1994-01-17 |
| CH685502A5 (en) | 1995-07-31 |
| GB9314801D0 (en) | 1993-08-25 |
| FI933192A0 (en) | 1993-07-14 |
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