FR2637610A1 - Appareil et procede de traitement des cellules - Google Patents

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Abstract

Utilisation d'un dispositif de séparation à membrane pour extraire le fluide exempt de cellules d'une suspension de cellules pour préconcentrer les cellules dans la suspension avant le traitement dans une centrifugeuse.

Description

Appareil et procédé de traitement des cellules.
La présente invention concerne la concentration de cellules, par exemple de cellules qui ont été prélevées d'un patient et mises en culture puis sont
préparées pour leur réinjection au patient.
- Il est connu de prélever des cellules, par exemple des lymphocytes à partir du sang d'un patient, de les faire se développer dans un milieu de culture, de recueillir les cellules de culture et de séparer les cellules du milieu de culture et des métabolites avant de les restituer à un patient, comme cela est décrit par exemple par Muul, Linda, M., et al., "Large scale production Qf human lymphokine-activated killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal of Immunological Methods, Vol. 88 (1986), pp. 265-275; Muul, Linda, M., et al., "Development of an automated
closed system for generation of human lymphokine-
activated killer (LAK) cells for us in adoptive immunotheraphy", Journal of Immunological Methods, Vol. 101 (1987) pp. 171-181. Dans ce type de procédé on a utilisé une centrifugeuse (IBM) 2991 commercialisée par Cobe Laboratories, Inc. pour séparer les cellules de l'agent de culture et des métabolites avant de les restituer à un patient. Les cellules sont soumises à plusieurs opérations de centrifugation avec application d'une solution de rinçage entre les opérations de
centrifugation après concentration des cellules.
L'utilisation de la centrifugeuse 2991 pour concentrer et laver d'autres types de cellules est décrite dans Gilmore, M.J.M.L., et al., "A Technique for the Concentration of Nucleated Bone Marrow Cells for in vitro Manipulation or Cryopreservation Using the IBM 2991 Blood Cell Processor", Vol. 45, Vox Sang. (1983), pp. 294-302; Wooten, M.J. et al, "Use and Analysis of
Saline Washed Red Blood Cells", Vol. 16, No. 5, Trans-
fusion (1976) pp, 464-468.
De façon générale, l'invention consiste à faire passer des cellules dans une suspension à travers un dispositif de séparation à membrane dans lequel un fluide exempt de cellules traverse une membrane afin de préconcentrer les cellules avant de les concentrer
davantage dans une centrifugeuse. Ceci réduit considéra-
blement la durée de concentration nécessaire des cellules et raccourcit la durée de séjour des cellules
en centrifugeuse.
Dans des modes de réalisation préférés, on utilise des pompes pour amener la suspension de cellules dans le dispositif de séparation à membrane et pour extraire le fluide exempt de cellules du dispositif de séparation à membrane; on peut filtrer la suspension de cellules avant de la faire passer dans le dispositif de
séparation à membrane; une poche de solution d'amorça-
ge, un réservoir de suspension de cellules, et un dispositif de contrôle de la pression sont disposés en amont du dispositif de séparation à membrane; une poche réservoir de centrifugeuse est prévue entre la sortie du
dispositif de séparation à membrane et la centrifu-
geuse; une conduite de déchets sert à transporter le fluide exempt de cellules vers une pompe de déchets; et une conduite de dérivation est reliée entre la conduite de déchets et la sortie du dispositif de séparation à membrane. On comprendra mieux d'autres particularités et
avantages de l'invention à la lecture de la description
suivante d'un mode de réalisation préféré de celle-ci et
des revendications.
Le dessin représente un schéma de principe
hydraulique de l'appareil destiné à traiter une sus-
pension de cellules selon l'invention.
La figure montre un appareil désigné par la
référence numérique 10 pour le traitement des lympho-
cytes mis en culture dans les poches de culture 12. Les poches de culture 12, la poche de solution saline d'amorçage 14 et la poche de solution saline de rinçage 16 sont reliées par l'intermédiaire de la conduite 17 & la pompe péristaltique de suspension de cellules 18. Les pinces d'obturation 20, 22, 24 régulent le débit en provenance respectivement des poches de culture 12, de la poche de solution saline d'amorçage 14 et de la poche de solution saline de rinçage 16. Le capteur de pression sert à détecter la pression à la sortie de la pompe
de suspension de cellules 18.
Un filtre-tamis préliminaire 32 est relié entre la sortie de la pompe à suspension de cellules 18 et l'entrée 33 du dispositif de séparation à membrane à fibres creuses 34. Le dispositif de séparation à fibres creuses 34 est commercialisé sous la désignation de marque PAN 200 par Asahi, Japon; il consiste en des fibres creuses de membrane de polyacrylonitrile ayant une dimension permettant d'éliminer un poids moléculaire de 50 000 à 55 000. Le dispositif de séparation à membrane 34 présente une perméabilité élevée à l'eau et aux petites molécules, mais une faible perméabilité aux
protéines et particules de dimensions cellulaires.
L'entrée 33 et la sortie 35 communiquent par des distributeurs respectifs avec les parties intérieures des fibres creuses. Des orifices de perméation 42, 44 communiquent avec les régions à l'extérieur des fibres
dans l'enveloppe extérieure du dispositif 34. La con-
duite de dérivation 36 et la pince d'obturation 38 sur celle-ci sont reliées en parallèle avec le filtre tamis
préliminaire 32.
La sortie 35 du dispositif de séparation à mem-
brane 34 est reliée par l'intermédiaire de la conduite
37 à l'entrée de la poche réservoir de centrifugeuse 40.
L'orifice de perméation 42 est bloqué, et l'orifice de perméation 44 est relié par la conduite de déchets 46 à la poche de déchets 48. Le capteur de pression 50 sert à détecter la pression dans la conduite 46. La pompe de
déchets 52 est montée sur la conduite 46 pour la com-
mande de pompage à destination de la poche de déchets 48. La conduite de dérivation 54 est montée entre la sortie 35 du dispositif de séparation à membrane 34 et la conduite de déchets 46. La pince d'obturation 56 sert à réguler le débit en provenance de l'orifice de perméation 44 et la pince d'obturation 58 sert à réguler le débit à travers la conduite 54. La sortie de la poche du réservoir de centrifugeuse 40 est reliée à la poche de recueil de centrifugeuse 60, située à l'intérieur du bol de rotation 64 de la centrifugeuse 67 (centrifugeuse 2991 commercialisée par Cobe Laboratories, Inc, non représentée) par la conduite d'écoulement 62. La conduite de lavage 66 sert à relier une source en
variante de liquide à la poche de recueil de centrifu-
geuse 60, et la conduite de surnageant 68 sert à amener
le surnageant à la poche de déchets 48.
Dans le fonctionnement, les lymphocytes qui ont été prélevés d'un patient sont mis en culture dans les
poches 12, par exemple pendant trois ou quatre jours.
Lorsque la culture est achevée, on utilise l'appareil 10 pour traiter les cellules de culture avant de les
restituer au patient.
On ouvre la pince d'obturation 22 et l'on pompe la solution dans la poche de solution saline d'amorçage 14 par la pompe 18, le filtre 32, la conduite 36 et les
parties intérieures des fibres creuses dans le disposi-
tif 34 pour amorcer le circuit et pour rincer le glycérol du dispositif de séparation 34. On ferme les pinces d'obturation 59 et 44 pour que la solution d'amorçage s'écoule par les conduites 54, 46 vers la poche de déchets 48; à ce moment, le tube 46 n'est pas chargé dans la pompe 52. Pendant une partie de l'amorçage, la pince d'obturation 56 est ouverte et la pince d'obturation 58 est fermée pour amorcer le volume
dans le séparateur 34 à l'extérieur des fibres creuses.
Apres avoir amorcé le circuit, la conduite 46 est chargée dans la pompe 52, la pince d'obturation 22 est fermée et la pince d'obturation 20 est ouverte pour que les cellules de culture en suspension dans les poches 12 puissent être pompées par l'intermédiaire du circuit en passant par la pompe 18. La pince d'obturation 58 est fermée et la pince d'obturation 59 est ouverte. Avant ce moment, la solution d'amorçage dans le circuit s'écoule
par les conduites 54 et 46 dans la poche de déchets 48.
Après ce moment, la suspension de cellules concentrées provenant du dispositif de séparation à membrane 34 s'écoule dans la poche réservoir de centrifugeuse 40 et
de là dans la poche 60 et la centrifugeuse 64.
La pompe de suspension de cellules 18 amène la suspension de cellules dans le dispositif de séparation à membrane 34, et la pompe de déchets 52 extrait le fluide exempt de cellules par les membranes à fibres creuses et l'amène dans la poche de déchets 48. La différence dans les débits de pompage entre la pompe de suspension de cellules 18 et la pompe de déchets 52 est égale au débit d'amenée de la suspension de cellules
concentrées à la poche réservoir de centrifugeuse 40.
Pour une meilleure efficacité, ce débit est approxima-
tivement égal au débit du fluide de traitement dans la centrifugeuse 67. Le traitement dans la poche de centrifugeuse 60 implique la concentration des cellules de culture intéressantes et le déversement.du surnageant par la conduite 68. Le filtre 32 peut être utilisé pour extraire les agglutinats cellulaires susceptibles d'obstruer le dispositif à fibres creuses 34. La conduite de dérivation 36 est utilisée si l'on ne se sert pas du filtre 32 ou dans le cas o celui-ci est obstrué. En aval de la pompe de suspension de cellules 18 la pression est contrôlée par un capteur de pression et sur la conduite de déchets 46 par un capteur de,
pression 50.
Après avoir vidé les poches de suspension de cellules 12, on ouvre la pince d'obturation 24 et l'on ferme la pince d'obturation 20 pour que la solution saline de rinçage s'écoule à partir de la poche 16 tandis que les pompes 18, 52 continuent à fonctionner pour concentrer la suspension de cellules se trouvant toujours dans le circuit et pour l'amener dans la poche réservoir de centrifugeuse 60. Les pompes continuent à fonctionner jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de solution saline de rinçage ait traversé le dispositif à fibres creuses 34. Lorsque les cellules et la solution saline de rinçage ont été amenées dans la poche de centrifigugeuse 60 et y ont été concentrées de nouveau, on applique la solution de lavage en provenance de la conduite de lavage 66 pour enlever les agents et métabolites des cellules recueillies dans la poche 60 selon les procédures habituelles. Les cellules sont alors remises en suspension et restituées au patient
toujours selon les procédures habituelles.
L'étape de concentration préliminaire dans le séparateur 34 raccourcit considérablement le temps nécessaire au recueil et diminue également la durée de
séjour des cellules recueillies en centrifugeuse.
D'autres modes de réalisation de l'invention se
situent dans la portée des revendications ci-annexées.
On peut utiliser d'autres dispositifs de séparation à membrane. Par exemple, il existe dans le commerce des dispositifs ayant des dimensions de pores maximales plus grandes, Jusqu'à 0,5 micron. En général, les lymphocytes
ont des diamètres supérieurs à 10 microns. Ces disposi-
tifs ne retiennent pas les protéines, contrairement au
dispositif PAN 200 décrit ci-dessus.

Claims (7)

REVENDICATIONS
1. Appareil destiné à traiter les cellules dans une suspension de cellules, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif de séparation à membrane prévu pour recevoir la suspension de cellules, le dispositif comprenant une membrane laissant passer le fluide exempt de cellules, mais non les cellules, ce dispositif comportant une sortie pour une suspension concentrée de cellules, et une centrifugeuse en aval du dispositif de
séparation prévue pour recevoir la suspension concen-
trée de cellules provenant de cette sortie.
2. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus des pompes pour réguler le débit de la suspension de cellules à travers le dispositif de séparation sur un côté d'une membrane et le débit du fluide exempt de cellules de l'autre côté de la membrane de façon à permettre le passage du fluide
exempt de cellules à travers celle-ci.
3. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un filtre en amont d'une entrée du dispositif de séparation à membrane -pour filtrer cette suspension de cellules avant son passage
dans le dispositif de séparation à membrane.
4. Appareil selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une conduite de dérivation autour du filtre et une pince d'obturation sur celui-ci pour bloquer sélectivement l'écoulement à travers la
conduite de dérivation.
5. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une poche de solution d'amorçage raccordée à l'entrée du dispositif de
séparation à membrane.
6. Appareil selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un réservoir de suspension de cellules en amont du dispositif de séparation à membrane.
7. Appareil selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend de plus un capteur de pression en
amont du dispositif de séparation à membrane.
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