FR2614424A1 - Immunodiagnostic des parasitoses dues a un protozoaire chez les mollusques - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN ANTICORPS MONOCLONAL QUI RECONNAIT SPECIFIQUEMENT UN ANTIGENE D'UN PROTOZOAIRE PARASITANT UN MOLLUSQUE. APPLICATION : IMMUNODIAGNOSTIC DES PARASITOSES DUES A UN PROTOZOAIRE CHEZ LES MOLLUSQUES.

Description

Immunodiagnostic des parasitoses dues a un protozoaire chez

les mollusques.

La présente invention concerne des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre un antigène d'un protozoaire parasitant un mollusque. Elle concerne plus particulièrement parmi ces anticcrps monoclonaux ceux qui sont dirigés contre un antigène d'un protozoaire appartenant au phyllum des Ascetospora tel que défini par LEVINE N,D. et al.((1980) A newly revised

classification of the Protozoa., 27, 37 - 58). Et parmi ces anti-

corps elle concerne plus spécialement ceux qui sont dirigés contre un antigène du protozoaire Bonamià ostreae parasite de l'espèce d'hultreplate Ostrea edulis L. Il est connu que les mollusques, notamment les mollusques marins, peuvent être parasités par un protozoaire. Plusieurs protozoaires pathogènes ont pu être identifiés,notamment parmi les genres Minchinia. Haplosporidium, et Marteilia (GRIZEL H. et al.(1974) Science et Pêches, Bull. Inst. Pêches Marit., No. 240,

7 - 30; PERKINS F.O. (1979) Mar. Fish. Rev., 41 (1 - 2), 25 - 37).

Un autre protozoaire Bonamia ostreae à l'origine d'une parasitose des parcs d'élevage d'huîtres plates français a fait l'objet, depuis sa mise en évidence (COMPS M. et al. (1980) C.R. Acad. Sc. Paris, 290, sér. D, 383-384), de nombreux travaux portant

tant sur sa structure (PICHOT Y. et al. (1980) Rev. Trav. Inst.

Pêches Marit., 43 (1), 131 - 140) que sur la situation épidémio-

logique consécutive à sa présence (TIGE G. et al. (1981) Science

et Pêche, Bull. Inst. Pêches Marit., No. 315, 13 - 20).

Ces parasitoses déciment les populations de mollusques.

Elles peuvent conduire à la disparition d'espèces. Elles ont bien entendu, lorsqu'elles concernent des mollusques d'élevage,

un impact d'ordre économique important (GRIZEL H. (1983) Cons.

Int. Explor. Mer, Gen.: 9, 30 p), surtout lorsqu'elles prennent la forme d'une épizootie endémique. C'est précisément le cas de la parasitose de l'huître Ostrea edulis L. dont l'agent étiologique est Bonamia ostreae, pour lequel il a été constaté expérimentalement qu'un seul individu pouvait provoquer la mort d'une huître à laquelle il avait été inoculé quatre mois plus tôt. Cette parasitose, après

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avoir été identifiée successivement dans différents parcs à

huîtres français, l'est maintenant dahs certains bassins ostréi-

coles de plusieurs Etats européens, notamment l'Espagne, l'Irlande, les Pays-Bas et le Royaume-Uni, et des Etats-Unis d'Amérique; ii peut également être noté que l'on suspecte à présent un proto- zoaire du genre Bonamia d'être à l'origine, en l;ouvelle-Zélande,

d'une parasitose de l'espèce d'huître plate Ostrea luteria.

L'importance des enjeux économiques liés à ces parasitoses a conduit à rechercher des mesures permettant sinon'de les éradiquer

du moins de les enrayer.

Ces mesures scnt le plus souvent d'ordre prophylaxique, lorsqu'il n'a pas été trouvé pour le mollosque concerné une race

résistante à la parasitose ou lorsque aucun traitement antipara-

sitaire ne s'est avéré efficace. Elles consistent alors essentielle-

ment à empêcher l'introduction dans les parcs d'levage sains d'animaux déjà parasites. Elles nCcessitent donc pour leur mise en oeuvre que l'on dispose d'une méthode de diagnostic performante

se caractérisant par sa commodité d'exécution et sa fiabilité.

Une telle méthode de diagnostic n'a pas été décrite. En

effet, la seule mézhode connue consiste à pratiquer des examens histo-

logiques sur les mollusques. Cette méthode est peu adaptée à une pratique courante en raison des moyens requis pour sa mise en

oeuvre et du recours nécessaire à un spécialiste pour l'interpré-

tation des résultats. Elle ne permet pas d'autre part, à proprement

parler,de quantifier le degré d'infestation des mollusques para-

sités. Un autre inconvénient important est le délai séparant

la préparation des échantillons et la disponibilité des résultats.

La demanderesse a maintenant trouvé une méthode simple

d'emploi et fiable se fondant sur l'utilisation d'anticoprs mono-

clonaux. Il lui est, en effet, apparu, étant donné que les mollusques sont incapables, face à une infestation parasitaire, de développer une réponse immunitaire à médiation humorale de type anticorps, qu'il fallait nécessairement mettre en évidence les protozoaires eux-mêmes. Or un anticorps monoclonal recnnnaissant spécifiquement un antigène d'un protozoaire constitue un moyen sir pour sa

mise en évidence.

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L'obtention d'anticorps monoclonaux reconnaissant un anti-

gène d'un protozoaire a déjà été décrite dans le cadre dc travaux portant sur des protozcaires du genre Leishmania, qui, par3si:ts de'globules blancs humains, sont d'un point de vue plyllogénétique sensiblement éloignés des protozoaires parasitant les mollusques. Mais les publications disponibles (notamment la demande de brevet internationale Wo 86/02098) ne permettent pas de surmonter les

difficultés particulières qui, liées à l'isolement et a la puri-

fication d'un protozoaire à partir de mollusques qu'il a parasités, étaient inexistantes pour les protozoaires du genre Leishmania qu'il est possible de cultiver et pour lesquels il existc des

souches pures dans diverses collections.

La demanderesse à précisement mis au point un procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux reconnaissant un antigène d'un protozoaire parasitant un mollosque en concevant un mode de purification dudit protozoaire, permettant la préparation d'une

suspension purifiée eu concentrée indispensable pour une i::-nunisa-

tion correcte d'animaux de laboratoire.

Pour la mise en oeuvre de l'invention selon ses différents aspects, par mollusque il faut entendre tout animal appartenant

à l'embranchement des mollusques qui comprend lui-même trois -

classes principales:les gastéropodes, les lamellibranches et les céphalopodes. L'invention peut concerner tout mollusque quelle que soit l'influence de l'homme sur son environnement: il peut s'agir ou non d'un mollusque d'élevage. Il suffit que ledit mollusque soit parasitE par un protozoaire. L'invention convient tout particulièrement à l'obtention d'anticorps monoclonaux pour la

détection et'la mesure de leur degré d'infestation par des proto-

zoaires appartenant au phyllum des Acetospora et notamment parmi ces protozoaires de ceux qui, tel Bonamia Ostreae, ont pour

cible les cellules sanguines du mollusque.

L'invention concerne selon un premier aspect tout anti-

corps monoclonal reconnaissant de manière spécifique un antigène

d'un protozoaire parasitant un mollusque.

Elle concerne plus particulièrement tout anticorps mono-

clonal reconnaissant de manière spécifique un antigène de

Bonamia ostreae. D'une manière préférée, elle concerne l'anti-

corps monoclonal sécrété par L'hybridome dont un échantillon d'une culture a été déposé auprès de l'"European Collecticn of Animal Cell Cultures" (ECACC, Royaume-Uni) le 23 avril 1987

et auquel ladite collection a attribué la référence-87042307.

Cet anticorps dusigné ci-après sous la référence 20B2-1B12 appartient à la classe IgG2a et a un point isoélectrique de 6,9 à 7,3. Il présente relativement à neuf autres anticorps monoclonaux sélectionnés et produits par la demanderesse d'autres

caractéristiques qui sercntprésentées ci-après dans l'exemple 4.

L'invention concerne selon un autre aspect un procédé d'obtention desdits anticorps monoclonaux. Ce procèdé comporte les étapes successives suivantes: a) préparation à partir de mollusques parasités d'une suspension purifiée du protozoaire, b) immunisation d'animaux de laboratoire à l'aide de ladite suspension, c) hybridation lymphocytaire entre les lymphocytes spléniques d'un animal et des cellules myélomateuses, d) sélection des hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal reconnaissant de manière spécifique un antigène dudit protozoaire et

e) clonage des hybridomes et production des anticorps.

La préparation d'une suspension purifiée du protozoaire fait intervenir une opération de broyage du corps des mollusques menée de telle manière que les cellules de mollusque contenant les protozoaires éclatent et que les protozoaires sont recueillis intacts après plusieurs opérations de centrifugation permettant progressivement l'élimination des cellules de mollusque et des débris cellulaires de toutes sortes contenus initialement dans le broyat. De manière à recueillir le plus de protozoaires possible, il est avantageux de soumettre au broyage le corps entier des mollusques; ce mode opératoire met à profit le rôle prépondérant que peuvent jouer, pour l'infestation d'un mollusque, ses cellules sanguines qui, le système circulatoire des mollusques n'étant

pas clos, se trouvent dispersées dans l'ensemble des tissus.

Cependant il convient d'en ôter au préalable tout organe de nature fibreuse tel que chez les mollusques de la classe des lamellibranches le muscle adducteur de la coquille bivalve. En

effet, un organe de cette nature conduirait à la formation d'agré-

gats et ferait obstacle à une homogénéisation correcte du broyat.

L'obtention d'un broyat, dans lequel les protozoaires sont préservés, implique l'utilisation d'un liquide, qualifié ci-après de liquide d'homogénéisation, maintenant autour des protozoaires un environnement protecteur. Ce liquide doit être ajouté dès la phase de broyage. De manière avantageuse on utilise de l'eau de mer dépourvue de microorganismes contaminants notamment bactériens, dont la pression osmotique a été ajustée - si elle avait une valeur inférieure - à environ 1 000 mosm à

l'aide de chlorure de sodium et additionnée d'un tensioactif.

D'une manière préférée un tensioactif neutre est utilisé. Un mono-

laurate de polyoxyéthylènesorbitane est alors avantageusement mis en oeuvre. Du monolaurate de polyoxyéthylènesorbitane 80 du type de celui commercialisé sous l'appellation Tween O80 est particulièrement adapté. Le tensioactif est ajouté à l'eau de mer à raison de 0,5 à 2% (v/v) et d'une manière préférée

à raison de 1% (v/v).

Un appareillage particulièrement bien adapté au broyage des mollusques est celui commercialisé sous la dénomination Ultra-Turrax-par la Société IKA JAUKE und KUNKEL (République Fédérale Allemande). Parmi les axes générateurs dont ce matériel

peut être équipé, celui portant la référence No. 18K est préféré.

Le broyage est avantageusement effectué en deux étapes: une homogénéisation succEdant à une première phase de lacération

du corps des mollusques.

Le broyat homogénéisé est ensuite soumis à un traitement

de clarification et de concentration des éléments particulaires.

Ce traitement comprend avantageusement une filtration suivie d'une centrifugation de la suspension des Eléments particulaires

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retenus sur le filtre et repris dans du liquide d'homogénéisation.

La filtration est destinée à permettre l'élimination des plus gros éléments particulaires. La centrifugation est destinée à permettre

l'élimination des solutés et la concentration des éléments parti-

culaires restants, en reprenant le culot de centrifugation à l'aide de liquide d'homogénéisation sous un volume inférieur au volume initial. Par exemple, la filtration est réalisée sur successivement trois toiles de nylon de maille égale à 300, 60 puis 25 pm et la

centrifugation du filtrat est conduite à 2 000 g pendant 30 minutes.

Ce premier traitement doit être suivi d'un traitement d'élimination des éléments particulaires autres que les protozoaires recherchés. Ce traitement comprend avantageusement plusieurs centrifugations différentielles, par exemple sur saccharose, et gradient ou non, se succédant de manière à éliminer progressivement selon leur taille et leur densité les éléments particulaires indésirables. Une ultime centrifugation de nature isopycnique permet, si nécessaire, d'atteindre un haut degré de purification. L'ensemble de ces purifications est réalisé selon les techniques connues de l'homme du métier. Il est possible de recueillir en définitive

jusqu'à 10 à 107 protozoaires à partir d'un mollusque parasité.

La suspension purifiée de protozoaires obtenue est mise en oeuvre pour immuniser des animaux de laboratoire. Des souris peuvent être commodément utilisées. Le schéma et le protocole d'immunisation sont établis, en tenant compte de la quantité de protozoaires recueillis, selon les critères habituels de l'homme

du métier.

L'hybridation lymphocytaire est réalisée à partir des lympho-

cytes de la rate d'une souris immunisée et de cellules myélomateuses selon la technique de base décrite par KOHLER G. et MILSTEIN C.

((1975) Nature, 256, 495-497).

La sélection des hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal reconnaissant spécifiquement un antigène du protozoaire concerné

fait appel à la détection des anticorps sécrétés par chaque hybri-

dome, par exemple à l'aide d'un test radio-immunologique. Les cellules sont ensuite clonées, par exemple selon la technique de dilution limite. L'activité anticorps de chaque clone est contr8ôlée. L'homme de l'art est en mesure de déterminer parmi les techniques connues un choix adapté à chaque cas particulier. Les hybridomes sélectionnés peuvent ensuite être congelés dans l'azote liquide. Une fois remis en culture sur plaques de culture, ils sécrètent l'anticorps que l'on peut caractériser dans les surnageants de culture. Il est également possible de préparer les anticorps à partir d'un liquide d'ascite

lorsque l'on désire obtenir une concentration élevée d'anticorps.

Ces différents modes de production sont bien connus de l'homme

du métier.

Les anticorps monoclonaux collectés peuvent bien entendu être ensuite purifiés, selon l'emploi auquel on les destine, en mettant en oeuvre une technique connue. Une technique peut avantageusement être choisiepour une utilisation des anticorps monoclonaux selon l'invention en vue du diagnostic in vitro de parasitoses. Elle consiste à soumettre la préparation d'anticorps monoclonaux à une chromatographie d'affinité en utilisant une

colonne de protéine A insolubilisée.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention constituent des outils de diagnostic d'un grand intérêt grâce à la haute spécificité qui caractérise la liaison pouvant s'établir entre un anticorps et un antigène. Ils peuvent être utilisés selon diverses techniques connues en soi de l'homme du métier. Mis en oeuvre de préférence sous forme purifiée, ils peuvent être fixés par adsorption sur un support insoluble tel que par exemple une plaque de microtitration. Ils peuvent également être couplés à un marqueur. Toutes sortes de marqueurs connus conviennent: il peut s'agir notamment d'un marqueur fluorescent, d'un isotope

radioactif ou encore d'une enzyme. De manière avantageuse, les anti-

corps monoclonaux selon l'invention, par exemple adsorbés sur un support solide ou marqués, mis à la disposition des utilisateurs, constituent l'un des composants d'un kit de diagnostic comportant les éléments essentiels à la réalisation de la détection ou du

dosage envisagé.

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L'invention concerne précisément selon un autre aspect l'utilisation desdits anticorps monoclonaux en tant qu'outils de diagnostic in vitro des parasitoses affectant les mollusques dont l'agent étiologique est ui protozoaire. Ces anticorps monoclonaux permettent, au niveau de chaque animal testé, la détection des protozoaires parasites et par un dosage la mesure de leur degré d'infestation. Elle concerne donc aussi un kit de diagnostic comportant un échantillon d'au moins une préparation

à base d'un anticorps monoclonal selon l'invention.

L'invention apporte ainsi une solution fiable à l'important problème que constitue le suivi de l'état sanitaire des mollusques qui seul permet la mise en place d'une stratégie de prophylaxie zoosanitaire. L'invention concerne selon un autre aspect les hybridomes sécréteurs d'un anticorps monoclonal reconnaissant de manière

spécifique un antigène d'un protozoaire parasitant un mollusque.

Un hybridome préféré est celui qui a été déposé à l'ECACC sous la

référence 87042307.

Dans ce qui suit des exemples de réalisation et de mise

en oeuvre des différents aspects de l'invention sont présentés.

Bien qu'ils se rapportent à des anticorps monoclonaux dirigés contre le protozoaire Bonamia ostreae il doit être compris que

l'invention ne se limite pas à ces seuls anticorps et en parti-

culier à leur obtention et à leur utilisation et concerne d'une

manière générale les anticorps monoclonaux reconnaissant un anti-

gène d'un protozoaire parasitant un mollusque et plus parti-

culièrement ceux reconnaissant un antigène d'un protozoaire

appartenant au phyllm des Acetospora.

Différents tampons, cités ci-après dans les exemples, seront désignés par commodité par une abréviation. Il s'agit des tampons: - PBS KH2PO4 10 mmol/l, NaCl 150 mmol/l, pH ajustée 7,4

- PBS1 Tampon PBS additionné, à raison de 0,1% (p/v), de sérum-

albumine bovine commercialisée par la Société SIGMA sous

la référence A 4503.

- PBS2 Tampon PBS additionné, à raison de 0,5% (p/v), de sérum-

albumine bovine (SIGMA).

- PBS3 Tampon PBS2 additionné, à raison de 0,5% (v/v), de monolaurate de polyoxyéthylènesorbitane 20 commercialisé par la Société MERCK (E.U.A.) sous la référence 822 184 et sous l'appellation Tween 20, ci-après désigné

polysorbate 20.

- PBS4 Tampon PBS additionné, à raison de 2% (p/v), de

sérum-albumine bovine (SIGMA).

- PBS5 Tampon PBS4 additionné, à raison de 0,75% (p/v), de glycine commercialisée par la Société MERCK (E.U.A.)

sous la référence 4201.

- PBS6 Tampon PBS additionné, à raison de 0,5 (v/v) de gluta-

raldéhyde commercialisé par la Société SIGMA sous la

référence G 6257.

- IF Tampon pour immunofluorescence commercialisé par la Société

DiagnosticsPasteur (FRANCE) sous la référence 74903.

- IF-EVANS Tampon IF additionné, à raison de 1/10000 (v/v), de bleu d'EVANS - TBS Tri(hydroxyméthyl)aminométhane: 10 mmol/l, NaCl 100 mmol/1,

pH ajusté à 7,4.

- TBS1 Tampon TBS additonné, à raison de 1% (v/v), de polysorbate - TBS2 Tampon TBS additonné, à raison de 0,1% (v/v), de polysorbate

20.

Des plaques de microtitration sont utilisées. Il s'agit de plaques en polystyrène commercialisées par la Société NUNC

(E.U.A.) souà la référence 2 - 69620.

Les plaques de culture mises en oeuvre sont celles commer-

cialisées par la Société FALCON (E.U.A.) sous la référence 3072.

Des filtres de nitrocellulose de 6 mm de diamètre sont placés dans les puits des plaques de microtitration. Ils sont découpés

à l'emporte-pièce à partir de filtres de nitrocellulose commer-

cialisés par la Société SCHLEICHER et SCHULL (R.F.A.) sous les

référencesBA 83/No. 401380.

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EXEMPLE

1. PREPARATION D'UNE SUSPENSION DE Bonamia Ostreae a) Broyage huîtres provenant d'un parc à huîtres du bassin de la baie de Quiberon (Morbihan FRANCE) infectées par Bonamia ostreae

sont préparées.

Les coquilles sont détachées des corps et le muscle adducteur

est découpé et éliminé.

Les 10 corps ainsi préparés sont introduits dans un bécher d'une contenance de 500 ml et dont la section présente un diamètre de 10 cm. On ajoute 300 ml d'eau de mer dont la pression osmotique a été ajustée à 1 000 mosm, filtrée sur une membrane présentant des pores ayant au maximum un diamètre

de 0,22 ym et additionnée, à raison de 1% (v/v),de mono-

-15 laurate de polyoxyéthylènesorbitane 80 commercialisé par la Société SIGNA (E.U.A.) sous l'appellation Tween 80 et sous la référence p 1754. Ce liquide d'homogénéisation est désigné,

par commodité, ci-après dans la suite du texte, par l'abré-

viation E.M.F.T..

L'axe générateur No. 18 K monté sur un matériel ULTRA-TURRAX est introduit dans le bécher puis est mis en rotation à environ 8 000 tours par minute. Quand il n'y a plus de masse tissulaire observable, la rotation est arrêtée et l'axe

générateur est déplacé hors du bécher.

Le broyat obtenu est transféré dans une série de cylindres de Potter de Thomas dont le diamètre au niveau du tube proprement dit est légèrement supérieur à celui (25 mm)

de l'axe générateur.

L'axe générateur enrotation à 8 000 tours par minute est plongé dix fois à la suite l'une de l'autre dans le broyat de l'un des cylindres. La même opération est répétée sur chacun de ces cylindres. Les contenus des différents cylindres sont regroupés. Ils constituent un broyat homogénéisé que l'on filtre sur successivement trois toiles de nylon de

maille égale à 300, 60 puis 25 ym.

Ce broyat homogénéisé et filtré contient des cellules d'huîtres intactes, des débris de telles cellules, nctamment des noyaux, certains des organismes contaminnts et les

protozoaires recherchés.

b) Centrifugations Le broyat obtenu en a est réparti dans 10 tubes. Chaque tube est soumis à une centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 8 C. Le culot Cl obtenu est remis en suspension par

homogénéisation à i'ULTRA-TURRAX dans 10 ml d'E.M.F.T.

(suspension ú1).

Chaque suspension Si est alors soumise à une centrifugation différentielle. 10 ml de la suspension SI sont déposés'à la surface de 30 ml d'une solution à 20% (p/p) de saccharose dans de I'E.M.F.T.; après centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 8 C, le culot C2 obtenu est remis en suspension dans 5 ml d'E.M.F.T. (suspension S2). Cette centrifugation différentielle a permis l'élimination de

débris de petite taille et des micro-organismes contaminants.

Chaque suspension S2, sous un volume de 5 ml, est déposée sur un gradient de densité discontinu de saccharose préparé à partir de 15 ml d'une solution à 20% (p/p) de saccharose dans de I'E.M.F.T. et de 30 ml d'une solution à 40% (p/p) de saccharose dans de i'E.M.F.T. Apres une centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 80C, on constate que les protozoaires recherchés se sont répartis à l'interface des deux solutions. Les débris cellulaires plus grands ou plus denses ont pénétré dans la fraction correspondant à une concentration en saccharose de 40%. Les fractions correspondant

à l'interface sont recueillis et rassemblées.

Les suspensions des protozoaires recherchées ainsi obtenues issues des 10 suspensions S2 sont regroupées, diluées volume à volume avec de V'E.M.F.T. et réparties dans 3 pots à centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 8 C. Les 3 culots C3 sont repris dans de l'E.M.F.T.. La suspension S3 obtenue contient sous un volume de 5 ml l'ensemble

des protozoaires recherchés issus des 10 huîtres traitées.

Cette suspension peut être utilisée telle quelle. La pour-

su{te de la purification par une centrifugation isopycnique

permet l'obtention de résultats d'une qualité accrue.

Cette dernière étape de purification est conduite en soumet-

tant la suspension S3, préalablement répartie dans 10 tubes, est déposée sur un double gradient de densité et de tonicité discontinu d'un colloïde polydispersé de silice couverte de polyvinyl pyrrolidone commercialisé sous la dénomination PERCOLL D par la Société PHARMACIA (Suede). Partant d'une solution màre de PERCOLL dont la pression osmotique a été ajustée au préalable à 1 400 mosm à l'aide de NaCl ajouté jusqu'à ce que la concentration en NaCl atteigne 0,7 mol/1, cinq solutions de PERCOLL, à 30%, 40%, 50%, 60%, et 70% (v/v) dans de l'E.M.F.T.,sont préparées. Le gradient de pression

osmotique créé ainsi est compris entre 1 100 mosm (corres-

pondant à une concentration de PERCOLL de 30%) et 1 300 mosm

(correspondant à une concentration de PERCOLL de 70%).

Apres centrifugation à 2 000 g pendant 30 minutes à 8C, les protozoaires recherchés se concentrent principalement à l'interface 60-70%. Les fractions correspondant à cette interface sont recueillieset constituent la suspension SP1. L'interface50-60% contient également des protozoaires mais ceux-ci sont en quantité moindre et associés à quelques débris. La suspension SP1 ne contient que des protozoaires, auxquels peuvent néanmoins rester accrochés des fragments de membranes de la vacuole parasitophore de la cellule d'huître, Des examens ultrastructuraux et des infections expérimentales ont confirmé qu'ils sont infectieux et que leur structure

n'a pas été altérée.

Le pool des 10 suspensions SP1 issues du traitement des 10 huîtres parasitées, recueilli sous un volume de 6 ml, contient environ 5.107 protozoaires. Ce pool peut être utilisé tel quel. Cependant,pour une application telle que l'adsorption des protozoaires à la surface d'une plaque de

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microtitration, il est nécessaire d'en éliminer le PERCOLL.

Ceci peut être obtenu en centrifugeant, à 2 000 g pendant minutes à 8 C, 12 mi de la suspension obtenue par dilution volume à vwlume de suspension SP1 dans de l'E.M.F.I., posés sur un coussin de 2 ml d'une solution à 20% (p/p) de saccharose dans de l'E.M.F.T.. Le culot repris dans 20 ml d'E.M. F.T. constitue la suspension SP2 qui est dépourvue de PERCOLL et contient environ 2,5.106 protozoaires par ml.

2. PREPARATION D'UNE SUSPENSION PURIFIEE DE HAPLOSPORIDIUM ARMORICANUM

Une suspension purifiée de spores de Haplosporidiu.. armoricanumr a été obtenue en soumettant des huîtres de l'espèce astrea edulis L. parasitées prélevées dans un gisement naturel de la région

de Thau (Hérault - FRANCE) au protocole mis en oeuvr= à l'exemple 1.

Ces spores présentant une densité légèrement supérieur. à celle des cellules de Bonamia ostreae se concentrent lors de ia centrifugation isopycnique non pas à l'interface 60--0% mais

dans le fond de la fraction 70%.

3. OBTENTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-BONAMIA OSTREAE

3.1. Hybridation lymphocytaire a) Immunisation de souris de laboratoire: 6 souris femelles de la lignée Balb/c reçoivent chacune, au temps zéro, 800 pl de la suspension SP1 obtenue à l'exemple 1 diluée au demi dans de l'adjuvant de Freund, à raison de 500 il par voie intrapéritonéale, 200 pl par

voie intraveineuse et 100 il par voie intramusculaire.

Chaque souris est ensuite soumise à sept rappels réalisés chacuh en suivant ce protocole. Le premier de ces rappels est effectué un mois après la série initiale d'injections

et les six rappels suivants se succèdent de mois en mois.

Le septième rappel est suivi un mois plus tard d'un dernier

rappel effectué en présence de prométhazine (Sigma -

référence p 4651). Les souris sont sacrifiées trois jours

après le dernier rappel.

b) Fusion: 300.10 lymphocytes B recueillis à partir de la rate d'une souris inmuniséesont mns au contact de 150.10 cellules de la lignée myélomateuse P3 x 63 Ag 8-653, en présence de polyéthylèneglycol commercialisé sous la

référence PEG 1540 par la Société RIEDEL-DE-HAEN (R.F.A.). La fusion est réalisée selon la technique décrite par

J. GODING '1980U J. Immunol. Methods, 39, 285).

La suspension cellulaire est distribuée, à raison de 10 cellules par puits, dans les puits de plaques de culture contenant chacun 10 macrophages péritonéaux de

souris. Du milieu UAT, contenant en mélange de l'hypo-

xanthine, de l'aminoptérine et la thymidine, est ajouté

h après la fusion.

3.2. Sélection des hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal reconnaissant de maniUre spécifique un antigène de Bonamia ostreae: Un mode opératoire, se fondant sur la détection par une méthode radio. immunologique indirecte d'une activité anticorps des

surnageants de culture des puits des plaques de culture vis-

à-vis d'une part d'une suspension purifiée de Bonamia ostreae et d'autre part d'un broyat préparé à partir d'une huître plate de l'espèce Ostrea edulis L. exempte de Bonamia ostreae,

est mis en oeuvre.

1 - Préparation de Rlaques de microtitration a) plaques portant des protozoaires adsorbés en surface:

Cbaque puits reçoit 50 p1 d'une solution de poly-L-

lysine à 20 pg/1l dans du tampon PBS.

Apres un contact de 30 minutes à 20 C, les plaques sont vidées par retournement et chaque puits reçoit p1 de la suspension SP2 de Bonamia ostreae obtenue à l'exemple 1, soit environ 250 000 protozoaires. Les plaques sont centifugées à 2 000 g pendant 30 minutes à 8 C. Puis 20/pl de tampon PBS6 sont versés dans chaque puits. Les plaques sont alors incubées 8 minutes

261442 4

à 20 C et lavées deux fois avec le tampon PBS. Les puits sont ensuite saturés avec 200 pl de tampon PBS5. Apres un contact de 30 minutes à 20 C, les puits sont lavés avec le tampon PBS. Enfin, les puits ayant reçu 100 Yl de tampon PBS4, les plaques sont congelées à - 20 C. b) Plaques témoins: Elles sont préparées comme indiqué ci-dessus mais la suspension SP2 est remplacée par le broyat d'une huître exempte de Bonamia ostreae. Des huîtres non parasitées originaires du gisement de Belle-Isle (Morbihan FRANCE) exempt de Bonamia ostreae ont été maintenues en élevage en laboratoire pendant 12 mois et à l'issue de cette période un contrôle histologique a été effectué afin de vérifier l'absence de Bonamia ostreae. Pour la préparation du broyat d'essai: une huître est broyée dans 500 ml d'eau de mer et le broyat est filtré sur

une toile de nylon ayant une maille de 25 pm.

2 - Test de détection Au moment de l'utilisation, les plaques de microtitration sont décongelées et lavées trois fois avec le tampon PBS. Chaque puits reçoit 50 1yl de l'un des surnageants

de culture obtenus en 1.2.B et 50 P1 de tampon PBS3.

Apres une incubation de 2 heures à 37 C, les plaques sont lavées trois fois avec une solution de lavage constituée d'une solution de NaCl 150 mmol/l additionnée de polysorbate 20 à raison de 0,5% (v/v). Un anticorps de mouton anti-immunoglobulines de souris marqué à l'iode f25, commercialisé par la Société ZYMED (E.U.A.), est dilué avec le tampon PBS3 de manière à présenter une activité de 300 000 cpm/100 p1. Il est ensuite réparti à raison de lOO1yl par puits. Apres une incubation d'une heure à 37 C, lesplaques sont lavées cinq fois avec la solution de lavage et la radioactivité de chaque

puits est mesurée.

3 - Résultats La mesure de l'activité des surnageants de culture mesurée dans les puits des plaques de microtitration permet de repérer ceux des puits de plaques de culture contenant au moins un hybridome sécrétant un anticorps monoclonal: - spécifiquement anti-Bonamia ostreae (activité anticorps de type BO),

- ou anti-huître non parasité par Bonamia ostreae (acti-

vité anticorps de type HS), - ou anti-Bonamia ostreae et anti-huître non parasitée

par Bonamia ostreae (activité anticorps de type NS).

Le tableau 1 présente à titre d'exemple des mesures effectuées à partir de trois surnageants de culture présentant une activité anticorps de type BO, HS ou NS.; la fixation non spécifique de l'anticorps de mouton antiimmunoglobulines de souris marqué à l'iode 125 a été mesurée sur des puits préparés comme indiqué ci-dessus au paragraphe 2 en y déposant toutefois non 50 y1 d'un surnageant de culture mais 50 F1 de milieu de culture neuf (milieu RPMI 1640 commercialisé par la Société GIBCO (E.U.A.)

additionné à raison de 10% (v/v) de sérum de veau foetal).

TABLEAU 1

Activité(cpm) mesurée dans les

puits des plaques de microtitra-

tion Plaques de micro- plaques de

titration avec microtitra-

protozoaires ad- tion sorbes en surface témoin type de l'activité BO 2 000 500 anticorps HS 100 10 000 du surnageant NS 4 000 8 000 ajouté aux puits Fixation non spécifique 50 400

261 4424

En définitive sur les 1 718 puits des plaques de culture testés, 703 contenaient au moins un hybridome entrant dans l'une des

trois catégories.

* 3.3. Clonage des hybridomes et production des anticorps 8 puits des plaques de culture ont été clones par la technique de dilution limite. 10 clones d'hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal spécifiquement antiBonamia ostreae ont été sélectionnés. Ces clones ont été congelés dans l'azote liquide. Les anticorps qu'ils sécrètent ont été purifiés, à partir de liquide d'ascite provenant de souris Balb/c femelles, par chromatographie d'affinité sur un gel de Sepharose Xprotéine A commercialisé par la Société PHARMACIA (Suede) selon la technique décrite par EY P.L. et

al. (1978) Immunochemistry, 15, 429-436).

4. CARACTERISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX SPECIFIQUEMENT ANTI-

BONAMIA OSTREAE

4.1. Caractérisation immunologique 1) Mode opératoire La caractérisation immunologique des différents épitopes reconnus par 10 anticorps monoclonaux sélectionnés a été effectuée par une compétition, entre l'un des anticorps marqué de manière classique à l'iode 125 et un autre de ces anticorps non marqué, pour leur fixation sur les protozoaires

adsorbés sur un filtre de nitrocellulose.

Un filtre de nitrocellulose de 6 mm de diamètre est introduit

dans chacun des puits d'une plaque de microtitration.

pl de la suspension SP1 obtenue à l'exemple 1, ou d'un broyat d'huître exempte de Bonamia ostreae sont introduits dans chaque puits. Apres une incubation de 18 heures à 37 C, chaque puits est saturé avec 200 pl d'un tampon PBS2 pendant 2heures à 377C. Les puits sont ensuite lavés trois fois

avec une solution de NaCl 150 mmol/l.

L'anticorps marqué à l'iode 125 à tester est dilué de façon que son activité soit égale à 300 000 cpm/50 p1. 50 yl de cette préparation contenant 100 ng par ml d'anticorps sont déposés dans chaque puits. On dépose ensuite 50 pl d'une préparation contenant 10 pgparml d'un autre anticorps non marqué en solution dans le tampon PBSl. Après une incubation de 3 h à 37 C, les filtres sont lavés cinq fois avec une solution de NaCl 150 mmol/l. Lorsque les épitopes reconnus par chacun des deux anticorps sont proches, on observe une extinction de la radioactivité

mesurée correspondant à l'inhibition de la fixation d'anti-

corps marqué.

2) Résultats: Les pourcentages d'inhibtion suivants d'un anticorps marqué à l'iode 125 par un anticorps non marqué ont été obtenus: Ac Marqué Ac non marqué 2E3 lOF1OG9 15C2 16G5 16G5 16F11 16Fll 20B2 20B2 1F2 2D4 2D2 2F2 2E7 3D10 2A7 2F10 lB12 3A8

2E3-1F2 - - - - - - - - - -

F1-2D4 18 63 21 10 39 39 6 17 0 ND

G9-2D2 - - - - - - - - - -

C2-2F2 12 5 0 80 12 8 0 9 O ND

16G5-2E7 20 7 4 20 81 64 13 20 1 ND

16G5-3DlO 9 3 O 16 80 66 14 7 5 ND

16F11-2A7 - - - - - - - - -

16F11-2F10 - - - - - - - - -

B2-1B12 9 3 0 5 5 3 5 1 81 81

20B2-3A8 ND ND ND ND ND ND ND ND 89 88

ND: Non déterminé -: Anticorps non immunologiquement actif Ces résultats permettent de déterminer l'existence d'au moins

quatre épitopes indépendants sur Bonamia ostreae.

Ces épitopes sont reconnus spécifiquement par les anticorps sélectionnés de la façon suivante:

EPITOPE ANTICORPS

I 20B2-1B12 et 20B2-3A8

II 15C2-2F2

III 16G5-2E7 et 16G5-3DlO IV lOFl-2D4

L'épitope IV est partiellement recouvert par l'épitope.III.

4.2. Détermination des classes et sous-classes Les classes auxquelles appartiennent les onze anticorps produits ont pu être déterminées. Ils appartiennent à la classe des IgG et plus précisément pour cinq d'entre eux à la sous-classe des IgGl pour quatre autres à la sous-classe des IgG2a et pour un

autre à la-sous-classe des IgG3.

ANTICORPS SOUS-CLASSE

2E3-1F2 IgGl lOFl-2D4 IgGl 1OG9-2D2 IgGl C2-2F2 IgG2a 16G5-2E7 IgG2a 16G53D10 IgG2a 16F11-2A7 IgGl 16F11-2F10 IgGl B2-1B12 IgG2a B2-3A8 IgG3 4.3. Détermination des points isoelectriques: Les points isoélectriques de huit anticorps ont été déterminés

en mettant en oeuvre la technique d'isofocalisation.

ANTICORPS POINT ISOELECTRIOUE

2E3-1F2 6,7 à 7,2

IOF1-2D4 6,5 à 7,0

10G9-2D2 7,5 à 8,0

C2-2F2 8,2 à 8,5

16G5-2E7 6,3 à 6,6

16F11-2A7 7,0 à 7,3

16F11-2F10 7,0 à 7,3

20B2-1B12 6,9 à 7,3

- UTILISATION DES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-BONAMIA OSTREAE

5.1. Préparation des échantillons à tester 1) Choix du tissu Bonamia ostreae parasite les cellules sanguines ou hémocytes de l'huître. Le système circulatoire de cet animal n'étant pas clos, les hémocytes se trouvent dispersés dans tous les organes.. Une étude histologique réalisée sur les différents tissus (tissus branchial, palpial, digestif et sanguin (hémolymphe)) montre que l'hémolymphe constitue un tissu de choix en raison, d'une part,de sa représentativité de l'infestation et, d'autre part, de sa facilité de prélèvement par ponction

directe dans la cavité péricardique.

2) Traitement de l'hémolymphe

L'hémolymphe après prélèvement est congelée.

Au moment de la réalisation de l'essai elle est décongelée.

Ce traitement favorise l'éclatement des cellules sanguines et la libération des protozoaires qu'elles contiennent, ces derniers devenant ainsi accessibles en plus grand nombre

aux molécules de l'anticorps monoclonal.

,2. Préparation des anticorps monoclonaux Les anticorps utilisés ci-après ont été purifiés

par chromatographie d'affinité sur protéine A insolubilisée.

Ils ont été marqués à l'aide d'un isotope radioactif selon une procédure habituelle ou d'une enzyme selon un protocole

ci-après explicité.

5.3. Essais' 1) Visualisation des protozoaires sur un frottis de coeur d'huître par une technique d'immunofluorescence indirecte L'hémolymphe d'une huître est déposée sur une lame de verre par apposition du coeur. Cette préparation est séchée à l'air et fixée à l'acétone pendant 10 minutes. Elle est alors recouverte d'une préparation de l'anticorps monoclonal, en solution, à raison de 50 pg par ml, dans du tampon IF. Apres 15 minutes d'incubation à température ambiante en chambre humide, la lame est lavée avec du tampon IF puis

recouverte d'une solution de sérum de chèvre anti-immuno-

globulines de souris conjugué à de l'isothiocyanate de fluorescéine (commercialisé par la Société DIAGNOSTICS

PASTEUR (FRANCE) dilué au 1/100 dans du tampon IF-EVANS.

Elle est ensuite incubée pendant 30 minutes à température

ambiante en chambre humide, puis lavée avec du tampon.IF.

Une lamelle de verre est déposée sur le frottis en inter-

posant entre lame et lamelle un tampon glycérine commer-

cialisé par la Société DIAGNOSTICS PASTEUR. La lame est examinée à l'aide d'un microscope à épifluorescence en utilisant de l'huile à immersion. Une réaction positive se traduit par une fluorescence verte brillante sur de petites cellules. Celles-ci sont des cellules de Bonamia ostreae. Deux temoins négatifs sont réalisés l'un en utilisant des immunoglobulines de souris non spécifiques en présence d'huître parasitées et l'autre en mettant

l'anticorps monoclonal en présence d'huîtres saines.

Cet essai a été réalisé à l'aide de chacun des 10 anti-

corps monoclonaux obtenu à l'exemple 3. Des résultats

identiques ont été constatés.

2. Dosage direct sur nitrocellulose avec un anticorps marqué à l'iode 125 Ce dosage consiste à réaliser la fixation immunologique d'un anticorps anti-Bonamia ostreae, marqué à l'iode 125, sur des cellules sanguines d'huître préalablement adsorbées

directement sur un filtre de nitrocellulose.

Un filtre de nitrocellulose de 6 mm de diamètre est intro-

duit'dans chacun des puits d'une plaque de microtitration.

>l d'hémolymphe prélevée sur une huître sont déposés sur chaque filtre. Après une incubation de 15 heures à 37 C, chaque filtre est saturé pendant 3 heures à 37 C avec 200 yl de tampon TBS1. Il est ensuite lavé trois fois

avec une solution de NaCl 100 mmol/l. 100 1l d'une prépara-

tion de l'anticorps 20B2-1B12 marqué à l'iode 125 dont

35. 2

l'activit6 a té amenée à 200 000 cpm/100O 1 par dilution

26 1 4 4 2 4

dans du tampon TBS2 sont ajoutés. Apres une incubation de 2 heures et 30 minutes à 37 C, le filtre est lavé cinq fois avec une solution de NaCl 100 mmol/l et la

radioactivité du filtre est mesurée.

Dans ces conditions, l'hémolymphe d'une huître fortement parasitée permet l'obtention d'un signal de 100 000 cpm, alors que l'hémolymphe d'une huître exempte de Bonamia

ostreae permet d'obtenir un signal de 600 cpm.

3. Dosage de t, sandwich avec un maruaZe radioactif Ce dosage consiste à capturer immunologiquement les parasites présents dans des cellules sanguines d'huître par un anticorps anti-Bonamia ostreae préalablement adsorbé sur une phase solide. Le même anticorps anti-Bonamia-ostreae marqué à l'iode 125, est ajouté de manière qu'il se fixe sur le parasite. Ce dosage est théoriquement plus spécifique

que le dosage direct car seuls les parasites pris en sand-

wich entre les deux anticorps restent présents dans les

puits de la plaque de microtitration.

a) Dosageen1--tens yl d'une préparation de l'anticorps 20B2-1B12, en solution, à raison de 20 fg par ml, dans du tampon TBS,

sont déposés dans chacun des puits d'une plaque de micro-

titration. Apres 15 heures d'incubation à 4 C, on procède

à un lavage à l'aide d'une solution de NaCl 100 mmol/l.

Les puits sont alors saturés avec 200 P1 de tampon TBS1 pendant 60 minutes à 37 C. La plaque est ensuite lavée trois fois avec une solution de NaCl 100 mmol/l. 10 p1

d'hémolymphed'unehuîtreet 90 pl d'une préparation de l'anti-

corps 20B2-1B12 marqué à l'iode 125 et dont l'activité a été amené à 250 000 cpm/90 p1 par dilution dans le tampon TBS2 sont ajoutés simultanément dans chaque puits. La plaque est centrifugée à 350 g pendant 15 minutes. Apres une incubation de 2 heures et 30 minutes à 37 C, les puits sont lavés cinq fois avec une solution de NaCl 100 mmol/1 et leur radioactivité est mesurée après solubilisation des protéines par 100 y1 de NaOH 4 mol/l et extraction avec le système Cell Harvester commercialisé sous les références

7070, 7)71 et 70QO par la société SKATRON (E.U.A.).

b) Dosage en 2 temps 100 pl d'une préparation de l'anticorps 20B2-1B12, en solution, à raison de 20 yg par ml, dans du tampon TBS,

sont déposés dans chacun des puits d'une plaque de micro-

titration. Apres 15 heures d'incubation à 4 C, on procède

à un lavage à l'aide d'une solution de NaCl 100 mmol/l.

Les pulis sont alors saturés avec 200)1 de tampon TBS1 pendant i heure à 37 C. La plaque est ensuite lavée trois fois avec une solution de NaCl 100 mmol/l. Dans chaque puits 50 pl d'hémolymphe sont déposés en rrésence de 50 pl de tampon TBS2. Les plaques sont centrifugées à 350 g

pendant 15 minutes puis incubées pendant 3 heures à 37 C.

Les puits sont alors lavés 3 fois avec 200 yl de NaCl mmol/l. 100 y1 d'une préparation de l'anticorps B2-1B12 marqué à l'iode 125 dont l'activité a été amenée à 250 000 cpm/100 p1 par dilution dans le tampon TBS2 sont ensuite incubés 1 heure à 37 C. Après cinq

lavages avec une solution de NaCl 100 mmol/l, la radio-

activité est mesurée (comme décrit ci-dessus).

Dans l'un et l'autre dosage, il est constaté que l'hémo-

lymphe d'une huître fortement parasitée permet d'obtenir un signal de 20 000 cpm alors que l'hémolymphe d'une huître exempte de Bonamia ostreae permet d'obtenir un signal

de 135 cpm.

4. Dosage direct sur nitrocellulose avec un anticorps marque à l'aide d'une enzyme

Pour ce dosage l'anticorps est utilisé couplé à une enzyme.

Le couplage est réalisé en activant de la phosphatase alcaline commercialisée sous la référence 567 752 par la société

BOEHRINGER par du 4-(p-maleimidophényl)butyrate de succinidi-

nyle commercialisé sous la référence 22315 par la Société PIERCE (E.U.A.) et en activant l'anticorps par de l'anhydride (S-acétyl) mercaptosuccinique commercialisé sous la

référence 19 732-7 par la société FLUKA (R.F.A.).

Un filtre de nitrocellulose de 6 mm de diamètre est intro-

duit dans chacun des puits d'une plaque de microtitration.

ul d':iémolyrphe d'une huître sont déposés sur chaque filtre. Après une incubation de 15 heures à 37 C, chaque filtre est saturé avec 200 1l de tampon TBS1 pendant 1 heure à 37'C. Il est ensuite lavé trois fois avec une solution de NaCI 100 mmol/l.100 pl d'une préparation de l'anticorps 20B2-1B12 marqué à la phosphatase alcaline en solution, à raison de 1 pg par ml, dans le tampon TBS2, sont ajoutés. Après une incubation d'une heure à 37 C, ie filtre est lavé cinq fois avec une solution de NaCl 100 ir.rol/l. Puis 100 p1 d'une solution de phosphate

de paranitrophényl à 1 mg par ml dans un tampon de diéthanol-

amine 100 rzol/l (pH 9,8) sont ajoutés. Apres une incubation de 30 minutes à 20 C, on ajoute enfin dans chaque puits H1l d'une solution de NaOH 1 mol/1. La réaction colorée est mesurée à 405 nm à l'aide d'un spectrophotomètre

lecteur de plaques après élimination des filtres de nitro-

cellulose. Dans ces conditions il est obtenu une densité optique mesurée à 405 nm de 1,6 à partir d'une hémolymphe d'huître moyennement parasitée, et de 0,16 à partir d'une hémolymphe

d'huître exempte de Bonamia ostreae.

On peut utiliser à la place du phosphate de paranitrophényl

un substrat précipitant tel que le phosphate de 5-bromo-

4-chloro-3- indolyl commercialisé sous la référence B 8503 par la Société SIGMA (E.U.A.) Dans ces conditions une coloration bleu foncé est obtenue avec de l'hémolymphe

d'huître parasitée.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît

spécifiquement un aÈti.gène d'un protozoaire parasitant un mollusque.

2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caractérisé en ce que le protozoaire appartient au phyllum des Acetospora.

3. Anticorps monoclonal selon la revendication 2, caractérisé

en ce que le protozoaire est Bonamia ostreae.

4. Anticorps monoclonal selon la revendication 3 sécrété

par l'hybridome déposE à i'ECACC sous la référence 87042307.

5. Procédé d'obtention d'anticorps monoclonaux selon l'une

quelconque des revendications à 4, caractérisé en ce qu'il

comporte les Etapes successives suivantes: a) préparation à partir des mollosques parasités d'une suspension purifiée du protozoaire, b) immunisation d'animaux de laboratoire-à l'aide de ladite suspension, c) hybridation lymphocytaire entre les lymphocytes spléniques d'un animal et des cellules myélomateuses, d) sélection des hybridomes sécrétant un anticorps monoclonal

reconnaissant de manière spécifique un antigène dudit proto-

zoaire, et

e) clonage des hybridomes et production des anticorps.

6. Procédé d'obtention selon la revendication 5, caractérisé en ce que la préparation d'une suspension purifiée du protozoaire implique, après avoir Été tout organe de nature fibreuse, le broyage du corps du mollusque en présence d'un liquide d'homogénéisation à base d'eau de mer additionnée de 0,5 à 2% (v/v) d'un tensioactif puis, après clarification du broyat et concentration des éléments

particulaires dudit broyat, la séparation des cellules du proto-

zoaire et des autres éléments partculaires.

7. Procédé d'obtention selon la revendication 6, caractérisé en ce que le liquide d'homogénéisation est de l'eau de mer dont la pression osmotique a été ajustée à 1 000 mosm, filtrée sur une membrane dont la porosité n'excède pas 0,22 ym et additionnée à

raison de 0,5 à 2% (v/v) d'un tensioactif neutre.

8. Procédé d'obtention selon la revendication 7, caractérisé en ce que le tensioactif est ajouté à l'eau de mer à raison de

1% (v/v).

9. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 7 et 8,

caractérisé en ce que le tensioactif est du monolaurate de polyoxyéthylènesorbitane.

10. Procédé d'obtention selon la revendication 9, caractérisé

en ce que le tensioactif est du monolaurate de polyoxyéthylènesor-

bitane 80.

11. Procédé d'obtention selon l'une quelconque des revendications

6 à 10, caractérisé en ce que la phase de séparation des cellules du protozoaire et des autres éléments particulaires du broyat

comporte plusieurs centrifugations différentielles.

12. Procédé d'obtention selon la revendication 11, caractérise en ce qu'il comporte successivement une centrifugation en saccharose sans gradient, une centrifugation en gradient de saccharose et une centrifugation en gradient d'un collolde polydispersé de silice

couverte de polyvinylpyrrolidone.

13. Procédé d'obtention selon l'une des revendications 6 à 12,

caractérisé en ce que la phase de séparation comporte en outre une

centrifugation isopycnique.

14. Hybridome caractérisé en ce qu'il sécrète un anticorps

monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.

15. Hybridome ayant les caractéristiques de l'hybridome

déposé à I'ECACC sous la référence 87042307.

16. Application d'un anticorps monoclonal selon l'une quelconque

des revendications 1 à 4 pour la détection immunologique dudit

protozoaire à partir d'un prélèvement de mollusque.

17. Application selon la revendication 16, caractérisée enoutre

en ce que le protozoaire identifié est dosé.

18. Kit de diagnostic pour une application selon l'une des

revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'il comporte un

échantillon d'au moins une préparation à base dudit anticorps monoclonal.