FR2601965A1 - Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un determinant codant pour l'acetyltransferase 6'-amino-glycoside et/ou la phosphotransferase 2''-aminoglycoside son procede d'obtention et ses applications biochimiques. - Google Patents
Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un determinant codant pour l'acetyltransferase 6'-amino-glycoside et/ou la phosphotransferase 2''-aminoglycoside son procede d'obtention et ses applications biochimiques. Download PDFInfo
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Abstract
LE FRAGMENT D'ADN DE L'INVENTION COMPREND AU MOINS UNE PARTIE DU GENE AAC(6')-APH(2'') CODANT POUR UNE PROTEINE DE RESISTANCE A LA HANAMYCINE ET A LA GENTAMICINE.
Description
FRAGMENT D'ADN COMPRENANT AU MOINS UNE PARTIE D'UN
DETERMINANT CODANT POUR L'ACETYLTRANSFERASE 6'-AMINO
GLYCOSIDE ET/OU LA PHOSPHOTRANSFERASE 2"-AMINOGLYCOSIDE
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHI
MIQUES.
DETERMINANT CODANT POUR L'ACETYLTRANSFERASE 6'-AMINO
GLYCOSIDE ET/OU LA PHOSPHOTRANSFERASE 2"-AMINOGLYCOSIDE
SON PROCEDE D'OBTENTION ET SES APPLICATIONS BIOCHI
MIQUES.
L'invention est relative a un fragment d'ADN comprenant au moins une partie du déterminant de résistance codant pour l'acétyltransférase 6'-aminoglycoside et/ou la phosphotransférase 2"-aminoglycoside et à son procédé d'obtention.
Elle vise également ses applications biochimiques, en particulier pour la détection de résistance aux antibiotiques du type aminoglycoside-aminocylitol plus spécialement à la kanamycine et à la gentamicine, dans des cultures cellulaires, notamment bactériennes.
La détection d'une résistance aux antibiotiques se pose de plus en plus en clinique humaine en raison des résistances acquises par les bactéries en nombre de plus en plus important contre des antibiotiques déterminés. I1 s'avère donc nécessaire de subordonner toute thérapie avec un antibiotique déterminé à un test de détection préalable de l'existence, chez la bactérie infectant le patient à traiter, d'une résistance éventuelle à cet antibiotique. Dans le cas d'une réponse positive dans le test effectué, l'antibiotique concerné doit être écarté de toute prescription clinique.
On sait que les antibiotiques de type aminoglycoside-aminoglycol sont largement utilisés pour la prévention et le traitement d'infections dues à des microorganismes tant à Gram-négatif qu'à Grampositif.
La résistance à ces antibiotiques tant chez les bactéries à Gram-postif que celles à
Gram-négatif provient d'enzymes codées par des plasmides ou des transposons, qui modifient les antibiotiques.
Gram-négatif provient d'enzymes codées par des plasmides ou des transposons, qui modifient les antibiotiques.
On a identifié trois classes d'enzymes, à savoir : les acéyltransférases (AAC), les adénylyltransférases (AAD), et les phosphotransférases (APH).
Une seule de ces.enzymes peut modifier plusieurs antibiotiques, le mécanisme de modification étant le même pour chaque antibiotique. Une exception à cet égard est constituée, toutefois, par l'enzyme de résistance bifonctionnelle trouvée dans les souches de streptocoques (1) et de staphylocoques (2 - 4), qui modifie à la fois la gentamicine et la kanamycine.
ee enzyme de résistance bifonctionnelle possède à la fois des activités 6'-acétyltransférase, ou AAC(6')et 2"-phosphotransférase, ou APH(2"). Les tentatives effectuées à ce jour pour séparer ces deux activités par les techniques de séparation conventionnelles, n'ont pas réussi.
Le dépistage de l'existence d'une résistance possible aux aminoglycoside-aminocylitols peut être étudié par des méthodes classiques mettant en jeu i détection de la conséquence phénotypique qu'elle entraîne sur la bactérie pathogène, tant en bactériostase qu'en bactéricide, après mise en culture de l'échantillon biologique susceptible de la contenir.
La mise en oeuvre de ces techniques implique la réalisation de cultures de la flore bactérienne contenue dans le prélèvement initial et l'isolement de l'agent pathogène, ce qui nécessite du temps.
Cette durée peut alors être incompatible avec la nécessité d'intervenir rapidement dans le cas d'une urgence thérapeutique.
L'utilisation de méthodes d'hybridation entre la séquence génique responsable d'une résistance à un antibliotique chez l'agent pathogène et une sonde appropriée n'a guère été envisagée jusqu'à ce jour,bien qu à priori cette technique présente les avantages suivants - la sensibilité, avec pour corollaire une diminution voire la suppression du temps de culture bactérienne et la possibilité de travailler directement sur le produit pathologique (prélèvement), - la transposition des résultats du génotype au phénotype avec pour conséquence la suppression de l'identification bactérienne (agent pathogène).
Cependant, la banalisation de cette technique est retardée du fait - de la difficulté de travail de certains produits pathologiques, - de l'aspect paucimicrobien de certains prélèvements, notamment dans le cas de maladies sexuellement transmissibles, - enfin et surtout, de l'ignorance dans laquelle on se trouve encore de l'existence d'une éventuelle hétérogénéité génique pour un caractère de résistance donné.
L'étude par les inventeurs d'un déterminant codant pour une protéine bifonctionnelle à activité AAC (6')-APH (2"), cloné à partir de l'ADN d'un streptocoque, leur a permis d'abord de séquencer ce déterminant puis de mettre en évidence qu'en utilisant une partie au moins de la séquence nucléotidique de ce déterminant, il est possible de détecter de manière fiable la présence d'un déterminant de résistance codant pour l'AAC(6') et/ou l'APH(2"), dans des cultures cellulaires, notamment bactériennes.
L'invention a donc pour but de fournir un nouveau fragment d'ADN comportant au moins une partie d'une séquence génique codant pour une protéine à activité AAC (6') et/ou APH (2").
Elle vise également à fournir un procédé d'obtention de ce fragment d'ADN par clonage dans une bactérie.
L'invention vise, en outre, les applications biochimiques de ce nouveau fragment d'ADN, en particulier pour l'élaboration de sondes pour la dé tection de bactéries résistant aux antibiotiques de type aminoglycoside-aminocylitol par 1' intermédiaire d'AAC(6' )-APH(2"). L'invention vise également à fournir la protéine correspondant à la séquence-nucléotidique du fragment considéré et les anticorps, capables de reconnaître spécifiquement cette protéine.
Le fragment d'ADN de l'invention est ca bactérie en ce qu'il comprend au moins une partie d'un gène AAC(6')-APH(2"), codant pour une protéine à activité acétyltransférase (AAC) et/ou phosphotransférase (APK), et étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante 5'
ACCTAAAGAAAATAATAAAATTATACGATTTGCATATTCCTATACACTTTAAGACCTCATGGAAAAACAATGTTTTATTTACACTCAATAGGAATGTTAC
50 100
CTAACTATCAAGACAAAGGTTATGGTTCAAAATTATTATCTTTTATTAAGGAATATTCTAAAGAGATTGGTTGTTCTGAAATGTTTTTAATAACTGATAA
150 200
AGGTAATCCTAGACCTTGCCATGTATATGAAAAATTAGGTGGTAAAAATGATTATAAAGATGAAATAGTATATGTATATGATTATGAAAAACGTGATAAA 250 300
10 20
TAA ATG AAT ATA GTT GAA AAT GAA ATA TGT ATA AGA ACT TTA ATA GAT GAT GAT TTT CCT TTG ATG TTA AAA TGG TTA
30 40 50
ACT GAT GAA AGA GTA TTA GAA TTT TAT GGT GGT AGA GAT AAA AAA TAT ACA TTA GAA TCA TTA AAA AAA CAT TAT ACA
60 70
GAG CCT TGG GAA GAT GAA GTT TTT AGA GTA ATT ATT GAA TAT AAC AAT GTT CCT ATT GGA TAT GGA CAA ATA TAT AAA
80 90 100
ATG TAT CAT GAG TTA TAT ACT GAT TAT CAT TAT CCA AAA ACT GAT GAG ATA GTC TAT GGT ATG GAT CAA TTT ATA CGA
100 120
GAG CCA AAT TAT TGG AGT AAA GGA ATT GGT ACA AGA TAT ATT AAA TTG ATT TTT GAA TTT TTG AAA AAA GAA AGA AAT 130 140 150
GCT AAT GCA GTT ATT TTA GAC CCT CAT AAA AAT AAT CCA ACA GCA ATA AGG GCA TAC CAA AAA TCT GGT TTT AGA ATT
160 170 180
ATT GAA GAT TTG CCA GAA CAT GAA TTA CAC GAG GGC AAA AAA GAA GAT TGT TAT TTA ATG GAA TAT AGA TAT GAT GAT
190 200
AAT GCC ACA AAT GTT AAG GCA ATG AAA TAT TTA ATT GAG CAT TAC TTT GAT AAT TTC AAA GTA GAT AGT ATT GAA ATA
210 220 230
ATC GGT AGT GGT TAT CAT AGT GTG GCA TAT TTA GTT AAT AAT GAA TAC ATT TTT AAA ACA AAA TTT AGT ACT AAT AAG
240 250
AAA AAA GGT TAT GCA AAA GAA AAA GCA ATA TAT AAT TTT TTA AAT ACA AAT TTA GAA ACT AAT GTA AAA ATT CCT AAT 267 270 280
ATT GAA TAT TCG TAT ATT AGT GAT GAA TTA TCT ATA CTA GGT TAT AAA GAA ATT AAA GGA ACT TTT TTA ACA CCA GAA
290 300 310
ATT TAT TCT ACT ATG TCA GAA GAA GAA CAA AAT TTG TTA AAA GGA GAT ATT GCC AGT TTT TTA AGA CAA ATG CAC GGT
320 330
TTA GAT TAT ACA GAT ATT AGT GAA TGT ACT ATT GAT AAT AAA CAA AAT GTA TTA GAA GAG TAT ATA TTG TTG CGT GAA
310 350 360
ACT ATT TAT AAT GAT TTA ACT GAT ATA GAA AAA GAT TAT ATA GAA AGT TTT ATG GAA AGA CTA AAT GCA ACA ACA GTT
370 380
TTT GAG GGT AAA AAG TGT TTA TGC CAT AAT GAT TTT AGT TGT AAT CAT CTA TTG TTA GAT GGC AAT AAT AGA TTA ACT 390 400 410
GGA ATA ATT GAT TTT GGA GAT TCT GGA ATT ATA GAT GAA TAT TGT GAT TTT ATA TAC TTA CTT GAA GAT AGT GAA GAA
420 430 440
GAA ATA GGA ACA AAT TTT GGA GAA GAT ATA TTA AGA ATG TAT GGA AAT ATA GAT ATT GAG AAA GCA AAA GAA TAT CAA
450 460
GAT ATA GTT GAA GAA TAT TAT CCT ATT GAA ACT ATT GTT TAT GGA ATT AAA AAT ATT AAA CAG GAA TTT ATC GAA AAT
470
GGT AGA AAA GAA ATT TAT AAA AGG ACT TAT AAA GAT TGA TTATATAATATATGAAAAGCTATTATAAAAGACATTAGTATTAAATAGTTT
AAAAAAATGAAAAATAATAAAGGAAGTGAGTCAAGTCCAGACTCCTGTGTAAAATGCTATACAATGTTTTTACCATTTCTACTTATCAAAATTGATGTAT
1800 1850
TTTCTTGAAGAATAAATCCATTCATCATGTAGGTCCATAAGAACGCCTCCAATTAAGCGATTGGCTGATGTTTGATTGGGGAAGATGCGAATAATCTTTT
1900 1950
CTCTTCTGCGTACTTCTTGATTCAGTCGTTCAATTAGATTGGTACTCTTTAGTGGATTGTGGGAATTTCCTTGTACGGTATATTGAAAGGGGTCTTCGAA
2000
TCCATCATCCAATGATGGTAAGCTT 3'
3100 2120
L'expression "au moins une partie du déterminant de résistance AAC(6')-APH(2"), désigne toute séquence nucléotidique dont la structure correspond à une partie de ce gène, présentant une longueur suffisante pour reconnaître spécifiquement ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde.Cette expression désigne également toute séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.
ACCTAAAGAAAATAATAAAATTATACGATTTGCATATTCCTATACACTTTAAGACCTCATGGAAAAACAATGTTTTATTTACACTCAATAGGAATGTTAC
50 100
CTAACTATCAAGACAAAGGTTATGGTTCAAAATTATTATCTTTTATTAAGGAATATTCTAAAGAGATTGGTTGTTCTGAAATGTTTTTAATAACTGATAA
150 200
AGGTAATCCTAGACCTTGCCATGTATATGAAAAATTAGGTGGTAAAAATGATTATAAAGATGAAATAGTATATGTATATGATTATGAAAAACGTGATAAA 250 300
10 20
TAA ATG AAT ATA GTT GAA AAT GAA ATA TGT ATA AGA ACT TTA ATA GAT GAT GAT TTT CCT TTG ATG TTA AAA TGG TTA
30 40 50
ACT GAT GAA AGA GTA TTA GAA TTT TAT GGT GGT AGA GAT AAA AAA TAT ACA TTA GAA TCA TTA AAA AAA CAT TAT ACA
60 70
GAG CCT TGG GAA GAT GAA GTT TTT AGA GTA ATT ATT GAA TAT AAC AAT GTT CCT ATT GGA TAT GGA CAA ATA TAT AAA
80 90 100
ATG TAT CAT GAG TTA TAT ACT GAT TAT CAT TAT CCA AAA ACT GAT GAG ATA GTC TAT GGT ATG GAT CAA TTT ATA CGA
100 120
GAG CCA AAT TAT TGG AGT AAA GGA ATT GGT ACA AGA TAT ATT AAA TTG ATT TTT GAA TTT TTG AAA AAA GAA AGA AAT 130 140 150
GCT AAT GCA GTT ATT TTA GAC CCT CAT AAA AAT AAT CCA ACA GCA ATA AGG GCA TAC CAA AAA TCT GGT TTT AGA ATT
160 170 180
ATT GAA GAT TTG CCA GAA CAT GAA TTA CAC GAG GGC AAA AAA GAA GAT TGT TAT TTA ATG GAA TAT AGA TAT GAT GAT
190 200
AAT GCC ACA AAT GTT AAG GCA ATG AAA TAT TTA ATT GAG CAT TAC TTT GAT AAT TTC AAA GTA GAT AGT ATT GAA ATA
210 220 230
ATC GGT AGT GGT TAT CAT AGT GTG GCA TAT TTA GTT AAT AAT GAA TAC ATT TTT AAA ACA AAA TTT AGT ACT AAT AAG
240 250
AAA AAA GGT TAT GCA AAA GAA AAA GCA ATA TAT AAT TTT TTA AAT ACA AAT TTA GAA ACT AAT GTA AAA ATT CCT AAT 267 270 280
ATT GAA TAT TCG TAT ATT AGT GAT GAA TTA TCT ATA CTA GGT TAT AAA GAA ATT AAA GGA ACT TTT TTA ACA CCA GAA
290 300 310
ATT TAT TCT ACT ATG TCA GAA GAA GAA CAA AAT TTG TTA AAA GGA GAT ATT GCC AGT TTT TTA AGA CAA ATG CAC GGT
320 330
TTA GAT TAT ACA GAT ATT AGT GAA TGT ACT ATT GAT AAT AAA CAA AAT GTA TTA GAA GAG TAT ATA TTG TTG CGT GAA
310 350 360
ACT ATT TAT AAT GAT TTA ACT GAT ATA GAA AAA GAT TAT ATA GAA AGT TTT ATG GAA AGA CTA AAT GCA ACA ACA GTT
370 380
TTT GAG GGT AAA AAG TGT TTA TGC CAT AAT GAT TTT AGT TGT AAT CAT CTA TTG TTA GAT GGC AAT AAT AGA TTA ACT 390 400 410
GGA ATA ATT GAT TTT GGA GAT TCT GGA ATT ATA GAT GAA TAT TGT GAT TTT ATA TAC TTA CTT GAA GAT AGT GAA GAA
420 430 440
GAA ATA GGA ACA AAT TTT GGA GAA GAT ATA TTA AGA ATG TAT GGA AAT ATA GAT ATT GAG AAA GCA AAA GAA TAT CAA
450 460
GAT ATA GTT GAA GAA TAT TAT CCT ATT GAA ACT ATT GTT TAT GGA ATT AAA AAT ATT AAA CAG GAA TTT ATC GAA AAT
470
GGT AGA AAA GAA ATT TAT AAA AGG ACT TAT AAA GAT TGA TTATATAATATATGAAAAGCTATTATAAAAGACATTAGTATTAAATAGTTT
AAAAAAATGAAAAATAATAAAGGAAGTGAGTCAAGTCCAGACTCCTGTGTAAAATGCTATACAATGTTTTTACCATTTCTACTTATCAAAATTGATGTAT
1800 1850
TTTCTTGAAGAATAAATCCATTCATCATGTAGGTCCATAAGAACGCCTCCAATTAAGCGATTGGCTGATGTTTGATTGGGGAAGATGCGAATAATCTTTT
1900 1950
CTCTTCTGCGTACTTCTTGATTCAGTCGTTCAATTAGATTGGTACTCTTTAGTGGATTGTGGGAATTTCCTTGTACGGTATATTGAAAGGGGTCTTCGAA
2000
TCCATCATCCAATGATGGTAAGCTT 3'
3100 2120
L'expression "au moins une partie du déterminant de résistance AAC(6')-APH(2"), désigne toute séquence nucléotidique dont la structure correspond à une partie de ce gène, présentant une longueur suffisante pour reconnaître spécifiquement ce gène dans un prélèvement à l'étude, dans des essais d'hybridation mettant en jeu cette séquence en tant que sonde.Cette expression désigne également toute séquence nucléotidique hybridable avec la précédente, telle qu'obtenue par transcription enzymatique inverse de l'ARN correspondant ou encore par synthèse chimique.
Il va de soi que les bases de la séquence nucléotidique considérée peuvent être dans un ordre différent de celui trouvé dans les gènes et/ou que ces bases peuvent être, le cas échéant, substituées, dès lors qu'une sonde élaborée à partir d'une telle séquence donne une réponse caractéristique et non équivoque quant à la capacité de reconnaitre la présence du-gène AAC(6' )-APH(2").
La séquence codante du gène AAC(6')
APH(2") est caractérisée en ce-qu'elle est définie par le codon d'initiation ATG en position 304 - 306 et le codon de terminaison TGA en position 1741-1743 dans une phase ouverte de lecture (ou PLO en abrégé) de 1437 paires de base.
APH(2") est caractérisée en ce-qu'elle est définie par le codon d'initiation ATG en position 304 - 306 et le codon de terminaison TGA en position 1741-1743 dans une phase ouverte de lecture (ou PLO en abrégé) de 1437 paires de base.
Selon un autre aspect, la séquence du gène AAC(6')-APH(2") est caractérisée en ce qu'elle est présente dans le plasmide naturel pIP8OO de la souche Streotococcus faecalis-JH102, auquel il confère une résistance bifonctionnelle à la kanamycine et à la gentamicine.
Le gène AAC(6')-APH(2") est également caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de 2,4 kb environ HPaII-HincII du plasmide de streptocoque pGB3012 et un segment adjacent
HincII.
HincII.
Le gène AAC(6')-APH(2") est également caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de 1,5 kb environ AluI tel qu'obtenu à partir de pUC978 et un segment adjacent Hincîl.
L'invention vise également les segments de gène codant indépendamment pour les activités AAC et
APH, ou les paires de ces segments permettant, par hybridation selon les techniques habituelles, de mettre en évidence dans une culture cellulaire, la présence d'une séquence nucléotidique complémentaire.
APH, ou les paires de ces segments permettant, par hybridation selon les techniques habituelles, de mettre en évidence dans une culture cellulaire, la présence d'une séquence nucléotidique complémentaire.
Elle vise en particulier d'une part la région 5'du gène AAC(6')-APH(2") codant pour la seule activité activité AAC(6') qui est responsable d'une résistance à la kanamycine, et d'autre part la région 3' du gène AAC(6')-APH(2") qui code pour la seule activité APH(2") conférant un faible niveau de résistance à la kanamycine. Cette région 5' fusionnée avec la protéine lacZ et sous son contrôle exprime une résistance à la gentamicine.
L'expression de la séquence nucléotidique du déterminant de résistance AAC (6')-APH(2") selon l'invention, dans des minicellules d'E.coli selon les techniques nouvelles, conduit à une seule protéine ayant une masse moléculaire apparente M r de l'ordre de 56000 daltons1 telle que déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide -SDS.
L'estimation de 68000 daltons de M est en accord avec le M de 56850 daltons déduite de la
r séquence nucléotidique de la PLO de 1437 pb ci-dessus.
r séquence nucléotidique de la PLO de 1437 pb ci-dessus.
La séquence correspondante de 479 acide aminés est la suivante
Met Asn Ile Val Glu Asn Glu Ile Cys Ile Arg Thr Leu Ile Asp Asp Asp Phe Pro Leu Met Leu Lys Trp Leu
30 40 50
Thr Asp Glu Arg Val Leu Glu Phe Tyr Gly Gly Arg Asp Lys Lys Tyr Thr Leu Glu Ser Leu Lys Lys His Tyr Thr
60 70
Glu Pro Trp Glu Asp Glu Val Phe Arg Val Ile Ile Glu Thr Asn Asn Val Pro Ile Gly Tyr Gly Gln Ile Tyr Lys
80 90 100
Met Tyr Asp Glu Leu Tyr The Asp Tyr His Tyr Pro Lys Thr Asp Glu Ile Val Tyr Gly Met Asp Gln Phe Ile Gly
110 120
Glu Pro Asn Tyr Trp Ser Lys Gly Ile Gly Thr Arg Tyr Ile Lys Leu Ile Phe Glu Phe Leu Lys Lys Glu Arg Asn
130 140 150
Ala Asn Ala Val Ile Leu Asp Pro His Lys Asn Asn Pro Arg Ala Ile Arg Ala Tyr Gln Lys Ser Gly Phe Arg Ile
160 170 180
Ile Glu Asp Leu Pro Glu His Glu Leu His Glu Gly Lys Lys Glu Asp Cys Tyr Leu Met Glu Tyr Arg Tyr Asp Asp
190 200
@@@ @@@ Asn Val Lys Ala Met Lys Tyr Leu Ile Glu His Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Val Asp Ser Ile Glu Ile
210 220 230
Ile Gly Ser Gly Tyr Asp Ser Val Ala Tyr Leu Val Asn Asn Glu Tyr Ile Phe Lys Thr Lys Phe Ser Thr Asn Lys
240 250
Lys Lys Gly Try Ala Lys Glu Lys Ala Ile Tyr Asn Phe Leu Asn Thr Asn Leu Glu The Asn Val Lys Ile Pro Asn 260 270 280
Ile Glu Tyr Ser Tyr Ile Ser Asp Glu Leu Ser Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Ile Lys Gly Thr Phe Leu Thr Pro Glu
290 300 310
Ile Try Ser Thr Met Ser Glu Glu Glu Gln Asn Leu Leu Lys Arg Asp Ile Ala Ser Phe Leu Arg Gln Met His Gly
320 330
Leu Asp Try Thr Asp Ile Ser Glu Cys Thr Ile Asp Asn Lys Gln Asn Val Leu Glu Glu Tyr Ile Leu Leu Arg Glu
340 350 360
@@@ Ile Tyr Asn Asp Leu Thr Asp Ile Glu Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Phe Met Glu Arg Leu Asn Ala Thr Thr Val
370 380
Phe Glu Glu Lys Lys Cys Leu Cys His Asn Asp Phe Ser Cys Asn His Leu Leu Leu Asp Gly Asn Asn Arg Leu Thr 380 400 410
Gly Ile Ile Asp Phe Gly Asp Ser Gly Ile Ile Asp Glu Tyr Cys Asp Phe Ile Tyr Leu Leu Glu Asp Ser Glu Glu
420 430 440
Glu Ile Gly Thr Asn Phe Gly Glu Asp Ile Leu Arg Met Tyr Gly Asn Ile Asp Ile Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Gln
450 460
Asp Ile Val Glu Glu Tyr Tyr Pro Ile Glu Thr Ile Val Tyr Gly Ile Lys Asn Ile Lys Gln Glu Phe Ile Glu Asn
470
Gly Arg Lys Glu Ile Tyr Lys Arg Thr Tyr Lys Asp *-----------
Cette séquence d'acides aminés possède deux régions homologues de celles de protéines de résistance déjà séquencées.Il s'agit de la région
N-terminale qui contient une séquence homologue (identique ou fonctionnellement apparentée) à la chloramphénicol acétyltransférase codée par le gène cat86 de
Bacillus Pumilus qui présente une activité AAC(6') et de la région C terminale qui contient une séquence homologue de l'amino glycoside phosphotransférase codée par Streptomyces fradiae, qui présente une activité
APH(2").
Met Asn Ile Val Glu Asn Glu Ile Cys Ile Arg Thr Leu Ile Asp Asp Asp Phe Pro Leu Met Leu Lys Trp Leu
30 40 50
Thr Asp Glu Arg Val Leu Glu Phe Tyr Gly Gly Arg Asp Lys Lys Tyr Thr Leu Glu Ser Leu Lys Lys His Tyr Thr
60 70
Glu Pro Trp Glu Asp Glu Val Phe Arg Val Ile Ile Glu Thr Asn Asn Val Pro Ile Gly Tyr Gly Gln Ile Tyr Lys
80 90 100
Met Tyr Asp Glu Leu Tyr The Asp Tyr His Tyr Pro Lys Thr Asp Glu Ile Val Tyr Gly Met Asp Gln Phe Ile Gly
110 120
Glu Pro Asn Tyr Trp Ser Lys Gly Ile Gly Thr Arg Tyr Ile Lys Leu Ile Phe Glu Phe Leu Lys Lys Glu Arg Asn
130 140 150
Ala Asn Ala Val Ile Leu Asp Pro His Lys Asn Asn Pro Arg Ala Ile Arg Ala Tyr Gln Lys Ser Gly Phe Arg Ile
160 170 180
Ile Glu Asp Leu Pro Glu His Glu Leu His Glu Gly Lys Lys Glu Asp Cys Tyr Leu Met Glu Tyr Arg Tyr Asp Asp
190 200
@@@ @@@ Asn Val Lys Ala Met Lys Tyr Leu Ile Glu His Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Val Asp Ser Ile Glu Ile
210 220 230
Ile Gly Ser Gly Tyr Asp Ser Val Ala Tyr Leu Val Asn Asn Glu Tyr Ile Phe Lys Thr Lys Phe Ser Thr Asn Lys
240 250
Lys Lys Gly Try Ala Lys Glu Lys Ala Ile Tyr Asn Phe Leu Asn Thr Asn Leu Glu The Asn Val Lys Ile Pro Asn 260 270 280
Ile Glu Tyr Ser Tyr Ile Ser Asp Glu Leu Ser Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Ile Lys Gly Thr Phe Leu Thr Pro Glu
290 300 310
Ile Try Ser Thr Met Ser Glu Glu Glu Gln Asn Leu Leu Lys Arg Asp Ile Ala Ser Phe Leu Arg Gln Met His Gly
320 330
Leu Asp Try Thr Asp Ile Ser Glu Cys Thr Ile Asp Asn Lys Gln Asn Val Leu Glu Glu Tyr Ile Leu Leu Arg Glu
340 350 360
@@@ Ile Tyr Asn Asp Leu Thr Asp Ile Glu Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Phe Met Glu Arg Leu Asn Ala Thr Thr Val
370 380
Phe Glu Glu Lys Lys Cys Leu Cys His Asn Asp Phe Ser Cys Asn His Leu Leu Leu Asp Gly Asn Asn Arg Leu Thr 380 400 410
Gly Ile Ile Asp Phe Gly Asp Ser Gly Ile Ile Asp Glu Tyr Cys Asp Phe Ile Tyr Leu Leu Glu Asp Ser Glu Glu
420 430 440
Glu Ile Gly Thr Asn Phe Gly Glu Asp Ile Leu Arg Met Tyr Gly Asn Ile Asp Ile Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Gln
450 460
Asp Ile Val Glu Glu Tyr Tyr Pro Ile Glu Thr Ile Val Tyr Gly Ile Lys Asn Ile Lys Gln Glu Phe Ile Glu Asn
470
Gly Arg Lys Glu Ile Tyr Lys Arg Thr Tyr Lys Asp *-----------
Cette séquence d'acides aminés possède deux régions homologues de celles de protéines de résistance déjà séquencées.Il s'agit de la région
N-terminale qui contient une séquence homologue (identique ou fonctionnellement apparentée) à la chloramphénicol acétyltransférase codée par le gène cat86 de
Bacillus Pumilus qui présente une activité AAC(6') et de la région C terminale qui contient une séquence homologue de l'amino glycoside phosphotransférase codée par Streptomyces fradiae, qui présente une activité
APH(2").
L'invention vise également les ADN recombinants contenant les fragments d'ADN ci-dessus recombinés avec des fragments hétérologues, ainsi que les vecteurs recombinants, notamment les plasmides hybrides comportant au moins une partie du gène AAC(6')
APH(2").
APH(2").
De tels plasmides comprennent le plasmide pUC815A tel qu'obtenu par sous-clonage dans le site
SmaI de pUC8 d'un fragment AluI de 1,5 kb environ.
SmaI de pUC8 d'un fragment AluI de 1,5 kb environ.
L'invention vise en outre, en tant qu'intermédiaire, les souches bactériennes modifiées, ou transformants, caractérisées par l'insertion dans leur génome d'au moins une partie d'un fragment d'ADN tel que défini ci-dessus.
Conformément à l'invention, la séquence codante du gène AAC(6')-APH(2") est obtenue par - clonage d'un fragment de restriction HDaII - HincII de 2,4 kb environ du plasmide de streptocoque pGB3012 et d'un segment adjacent HincII, - sous-clonage d'un fragment AluI de 1,5 kb environ, sous-cloné dans le site SmaI de pUC8 pour former le plasmide pUC815A, - dégradation unidirectionnelle par BAL31 en soumettant pUC815A à une digestion par EcoRI et PstI, isolément du fragment de 1,5 kb par centrifugation sur gradient de sucrose, - autoligation du fragment de 1,5 kb environ, en présence de T4 ADN ligase ce qui conduit à des polymères de fragments de 1,5 kb environ, qui sont ensuite digérés avec Pstl pour produire des dimères de fragments de 1,5kb, liés au site EcoRI, digestion des dimères avec BAL3î, suivie d'une précipitation de l'ADN digéré par BAL31 telle qu'obtenue à l'aide de l'étha- nol, digestion par EcoRI pour produire des fragments contenant des extrémités EcoRI et BAL3î, ligation dans mp18 digéré par SmaI et EcoRI, et transformation dans
E.coli JM109.
E.coli JM109.
- utilisation du plasmide pGB3Oî3, clonage d'un fragment BspRI-MPaI de 7,8 kb environ dans pUC8 digéré par
SmaI - AccI.
SmaI - AccI.
L'invention fournit également les moyens d'obtenir les segments de gène déterminant indépendamment des activités AAC et APH, mettant ainsi en évidence l'existence de deux domaines séparés pour chaque mécanisme de résistance dans le déterminant de résistance bifonctionnel.
Pour obtenir la région du gène possèdant une homologie avec la protéine AAC, on soumet le plasmide pUC815A à une digestion avec EcoRI et ScaI, puis on ligue ce fragment avec pUC8 clivé par EcoRI Smal et on transforme dans E.coli.
Pour obtenir la région du gène possèdant une homologie avec l'activité APH(2"), on soumet le plasmide 815A à une digestion avec ScaI et PstI et ce fragment est ligué à pUC8 clivé par HincII PstI, et on transforme dans E.coli.
L'invention vise également les applications biochimiques d'au moins une partie de la séquence du gène AAC (6')-APH(2") définie ci-dessus
Ces applications comprennent l'élaboration de sondes pour la détection de la résistance à la kanamycine et à la gentamicine.
Ces applications comprennent l'élaboration de sondes pour la détection de la résistance à la kanamycine et à la gentamicine.
Le fragment d'ADN utilisé présente alors un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable.
Un tel fragment renferme au minimum environ 14 nucléotides.
Des sondes appropriées pour ce type de détection sont avantageusement marquées par un élément radio-actif ou tout autre groupe permettant sa reconnaissance à l'état hybridé avec la préparation renfermant l'ADN à étudier.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence nucléotidique de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
On peut, par exemple, mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur taches. Cette méthode comporte, après dénaturation de l'ADN préalablement obtenu à partir de bactéries provenant de selles humaines, le dépôt d'une quantité aliquote de cet ADN sur des membranes de nitrocellulose, l'hybridation de chaque membrane dans les conditions usuelles avec la sonde et la détection, de manière classique, de l'hybride formé.
On peut aussi utiliser une méthode d'hybridation sur réplique, selon la technique de Southern.
Cette méthode comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADNs engendrés après traitement de l'ADN par des enzymes de restriction, le transfert après dénaturation alcaline sur des membranes appropriées et leur hybridation avec la sonde dans les conditions usuelles.Il n'est pas toujours nécessaire de procéder à l'expression préalable de l'ADN. il suffit que l'ADN soit rendu accessible à la sonde.
L'invention fournit ainsi les moyens de détecter la présence chez les bactéries de gènes identiques au gène AAC(6')-APH(2") ou homologues, codant pour les activités enzymatiques AAC et APH, ou encore des segments de gènes déterminant l'une de ces activités.
La distribution du gène AAC(6')-APH(2") a été ainsi étudiée par dot-blot chez des souches de streptocoques et de staphylocoques.
Des résultats reproductibles ont été obtenus en utilisant comme sonde intragénique, un fragment d'ADN HDaII de 1070pub.
Ce fragment intragénique est avantageusement utilisé comme sonde pour l'étude de la dissémination de la résistance à la kanamycine et gentamicine.
Les hybridations avec l'ADN d'autres cocci à Gram-positifs permettent d'étudier la variabilité de la résistance.
L'invention vise également les applications immunologiques de la protéine codée, plus spécialement pour l'élaboration d'antisérum spécifique ainsi que d'anticorps polyclonaux et monoclonaux. Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention sont rapportés dans la description qui suit concernant le clonage du gène AAC(5')-APH(2") chez ,cli, la détermination de sa séquence nucléotidique et l'analyse des produits d'expression. Dans cette description il sera fait référence aux figures 1 à 4 - la figure 1 représentant les résultats de l'analyse des protéines codées par les plasmides recombinants pUC815A, pUC915A et pUC8 dans une souche d'E.coli produisant des minicellules.
- la figure 2, la stratégie de séquençage et une carte de restriction partielle du déterminant AAC(6')-APH(2") contenu dans un fragment de 2120 paires de base avec un site 5'AluI et un site 3'HindIII, - la figure 3, la séquence nucléotidique du gène
AAC(6')-APH(2") et des régions adjacentes, et - la figure 4, la séquence d'acide aminé de la protéine
AAC/APH, de la protéine du gène cat86 de B. Pumilus et telle du gène APH de S. fradiae.
AAC(6')-APH(2") et des régions adjacentes, et - la figure 4, la séquence d'acide aminé de la protéine
AAC/APH, de la protéine du gène cat86 de B. Pumilus et telle du gène APH de S. fradiae.
MATERIELS ET METHODES
Bactéries et milieux
On utilise la souche Streptococcus faecalis JH102 comme source du plasmide pIP800 déterminant la résistance bifonctionnelle à la gentamicine et à la kanamycine (1).
Bactéries et milieux
On utilise la souche Streptococcus faecalis JH102 comme source du plasmide pIP800 déterminant la résistance bifonctionnelle à la gentamicine et à la kanamycine (1).
Les souches de S. Sanguins contenant le déterminant de résistance bifonctionnelle cloné dans .*?GB3012 et pGB3013 ont été décrites précédemment (5).
Toutes les souches de streptocoques ont été cultivées sur une bouillon d'infusion coeur - cerveau. La souche d'E.coli Je1,09 a été utilisée comme hôte pour les expériences de transfection avec les phages M13 (6) et a été cultivée de manière routinière dans une bouillon 2xYT (7).
Détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI).
On inocule la souche JM109 de E.coli, contenant pUC8, pUC8î5A ou pUC915A dans des plaques de microdilution stériles contenant les milieux 2xYT avec des dilutions en série appropriées e gentamicine (intervalle de concentration 8-1024 ug/ml). Après quatorze heures d'incubation, on considère que la concentration la plus faible d'antibiotique qui provoque une inhibition complète de la croissance correspond à CMI.
Analyse en minicellules des protéines codées Par les
Plasmides:
On utilise la souche E.coli P678-54 pour produire des minicellules (8). Le processus de trans forî < ation du plasmide pUC8 et de ses dérivés en réalisé selon le manuel de Cold Spring Harbor (9). La purification des minicellules, le marquage des protéines codées par le plasmide et l'autoradiographie sont effectues comme décrit par Stoker et al. (10).
Plasmides:
On utilise la souche E.coli P678-54 pour produire des minicellules (8). Le processus de trans forî < ation du plasmide pUC8 et de ses dérivés en réalisé selon le manuel de Cold Spring Harbor (9). La purification des minicellules, le marquage des protéines codées par le plasmide et l'autoradiographie sont effectues comme décrit par Stoker et al. (10).
Sous-clo@sge de M13 et séquencage du nucléotide
Le déterminant de résistance bifonctionnelle à la gentamicine et à la kanamycine est obtenu tout d'abord par clonage d'un fragment de 2,4 kb HpaII- Hindi à partir du plasmide de streptocoque pGB3013.
Le déterminant de résistance bifonctionnelle à la gentamicine et à la kanamycine est obtenu tout d'abord par clonage d'un fragment de 2,4 kb HpaII- Hindi à partir du plasmide de streptocoque pGB3013.
Etant donné que ce fragment ne contient pas la séquence génomique entière du déterminant, le segment voisin Hindi est également cloné aux fins de séquençage. On procède ensuite au sous-clonage du fragment de 1,5 kb AluI dans le site SmaI de pUC8 pour former le plasmide pUC815A.
Ce plasmide est utilisé comme source de quantItés importantes du fragment de 1,5 kb qui est dégradé de manière unidirectionnelle par BAL31 selon une modification du procédé décrit par Gilmore et al.
(11).
On procède comme suit : 5 mg de pUC815 sont digérés par EcoRI et PstI, sites polylinkers adjacents au fragment cloné de 1,5 kb, et ce fragment est isolé par centrifugation avec un gradient de 10 à +0S de sucrose (12). Le fragment de 1,5 kb a été auto ligué en présence de la T4ADN ligase pour produire de longs polymères. Ces polymères sont ensuite digérés par
PstI pour produire des dimères du fragment 1,5 kb liés au site EcoRI. Les dimères sont digérés avec BAL31 et à 5 mn d'intervalle on prélève des aliquotes et l'ADN digéré par BAL31 est précipité à l'aide d'éthanol. Cet
ADN est ensuite digéré par EcoRI pour produire des fragments contenant des extrémités EcoRI et BAL31.
PstI pour produire des dimères du fragment 1,5 kb liés au site EcoRI. Les dimères sont digérés avec BAL31 et à 5 mn d'intervalle on prélève des aliquotes et l'ADN digéré par BAL31 est précipité à l'aide d'éthanol. Cet
ADN est ensuite digéré par EcoRI pour produire des fragments contenant des extrémités EcoRI et BAL31.
Cet ADN est ensuite ligué dans mp18 digéré par SmaI
EcoRI et transfecté dans E.coli JM109. On prépare l'ADN c brin des phages recombinants pour le séquençage comme décrit dans (13).
EcoRI et transfecté dans E.coli JM109. On prépare l'ADN c brin des phages recombinants pour le séquençage comme décrit dans (13).
Les réactions de séquençage sont effectuées par la technique de terminaison de chaîne de
Sanger (4) selon les procédés décrits par Amersham.
Sanger (4) selon les procédés décrits par Amersham.
Toutes les séquences sont confirmées à partir d'au moins deux clones se recouvrant et la séquence génique responsable de la résistance bifonctionnelle est entièrement déterminée sur les deux brins de l'ADN.
L'information sur la séquence est analysée par le programme de séquençage ADN/protéines de James M.
Pustell obtenu à partir de : International
Biotechnologies, Inc.
Biotechnologies, Inc.
EXEMPLE I clonage du determinant de resistance AAC (6')-APH (2") che S sanauis, determination de la seauence nucleoti diosue
A) Sous-clonage du déterminant de résistance bifonc
tionnelle
Les plasmides pGB3012 et pGB3013 de
Streptococcus sont utilisés comme source du gène déterminant la protéine bifonctionnelle 6'acétyltrans~ ferase 2"-phosphotransférase (5). On clone tout d'abord un fragment de 2,4 kb HDalI-HincII à partir de pGB3012 aux fins de séquençage. Etant donné que ce fragment ne contient pas la séquence gènique entière du déterminant et n'exprime pas d'activité, on clone également pour le séquençage le fragment voisin HincII.On utilise également comme source du déterminant de résistance bifonctionnelle le plasmide pGB3013 et un fragment de 7,8 kb BsPRI - HPaII est cloné dans pUC9 digéré par
SmaI Acci pour former le plasmide recombinant pUC978.
A) Sous-clonage du déterminant de résistance bifonc
tionnelle
Les plasmides pGB3012 et pGB3013 de
Streptococcus sont utilisés comme source du gène déterminant la protéine bifonctionnelle 6'acétyltrans~ ferase 2"-phosphotransférase (5). On clone tout d'abord un fragment de 2,4 kb HDalI-HincII à partir de pGB3012 aux fins de séquençage. Etant donné que ce fragment ne contient pas la séquence gènique entière du déterminant et n'exprime pas d'activité, on clone également pour le séquençage le fragment voisin HincII.On utilise également comme source du déterminant de résistance bifonctionnelle le plasmide pGB3013 et un fragment de 7,8 kb BsPRI - HPaII est cloné dans pUC9 digéré par
SmaI Acci pour former le plasmide recombinant pUC978.
Par transformation de ce plasmide dans E.coli, on obtient l'expression à la fois des résistances phénotypiques à la kanamycine et à la gentamicine.
On effectue ensuite un sous-clonage par introduction du fragment de 1,5 kb Alul obtenu à partir de pUCS78 dans le site SmaI de pUC9 pour former le plasmides recombinant pUC915A. L'orientation de ce frag ment t est inversée par digestion avec EcoRI, BamH1 et ligation ultérieure du fragment de 1,5 kb dans une coupure similaire de pUC8, pour former le plasmide recombinant pUC815-A.
Les plasmides recombinants contiennent le déterminant de résistance bifonctionnelle dans les deux orientions et expriment la résistance à la fois à la gentamicine et à la kanamycine dans E.coli. L'étude des concentrations minimales inhibitrices de la gentamicine pour les souches de E.coli contenant les plasmides avec le déterminant de résistance dans les deux orien taxions, montre que la souche de E.coli contenant le plasmide pUC815A présente une CMI accrue en présence d'IPTG et une CMI inférieure en présence de glucose, ce qui indique que l'expression du déterminant de résistance bifonctionnelle est sous le contrôle du promoteur du gène lacZ.
La souche de E.coli contenant le plasmide pUC915A m4intient la même CMI constante en présence soit d'IPTG soit de glucose, ce qui suggère que l'inserti on dans l'orientation opposée possède son propre promoteur qui n'est pas influencé par le promoteur du gène lacZ.
Une approche similaire du clonage du fragment AluI de 1,5 kb à partir du plasmide-naturel pIP800 dans pUC8 conduit à l'expression des deux résistances dans E.coli et l'insertion est identique à celle du plasmide pUC815A décrite ci-dessus comme le montre l'examen de la carte de restriction de la figure 2.
b) Détection Par minicellule du Produit bifonctionnel
du gène de résistance
kfin de détecter la protéine exprimée par le déterminant de résistance bifonctionnelle cloné, les protéines codées par les plasmides sont analysées en ussant le système de minicellules de E.coli (10).
du gène de résistance
kfin de détecter la protéine exprimée par le déterminant de résistance bifonctionnelle cloné, les protéines codées par les plasmides sont analysées en ussant le système de minicellules de E.coli (10).
Les minicellules contenant les plasmides pUC815A et pUC915A, sont marquées avec de la 35S-méthionine et les lysats sont soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide -SDS, suivie d'une autoradiographie.
On a rapporté sur la figure 1, l'auto radiogaphe des polypeptides marqués, synthétisés dans
E.coli contenant les plasmides suivants : puits A pUC815A, puits B : pUC915A, puits C : pUC8.
E.coli contenant les plasmides suivants : puits A pUC815A, puits B : pUC915A, puits C : pUC8.
On détermine une masse moléculaire apparente de 56000 (flèche) pour le déterminant de résistance en comparant avec les protéines suivantes albumine de sérum bovin (66200) albumine d'oeuf (4500) anhydrase carbonique (30000) inhibiteur de la trypsine de soja (20100) et lysozyme (14400).
c) Séquence nucléotidique du gène de résistance bifonc
fonctionelle
La stratégie de séquençage et la carte de restriction du gène de résistance bifonctionnelle sont données figure 2.
fonctionelle
La stratégie de séquençage et la carte de restriction du gène de résistance bifonctionnelle sont données figure 2.
La séquence du fragment entier de 1,5 kb
AluI contenant le déterminant de résistance bifonctionnelle et les régions adjacentes est déterminée par la méhode de Sanger (14) et est présentée sur la figure 3.
AluI contenant le déterminant de résistance bifonctionnelle et les régions adjacentes est déterminée par la méhode de Sanger (14) et est présentée sur la figure 3.
2120 paires de bases recouvrent un segment avec un site 5' AluI et un site 3' HindIII.
(Les flèches indiquent la direction et l'étendue de la séquence dérivée de chaque clone indépendant).
Le chevauchement des fragments produits par les digestions unidirectionnelles avec BAL31 fournit une détermination de la séquence des deux brins pour chaque région.
Une phase de lecture ouverte contenant 1437 aires de bases code pour la protéine de
ésistance bi-fonctionnelle. La protéine déduite qui commence au codon ATG en position 304-306 et s'étend jusqu'au codon de terminaison TGA en position 1741 à 1743 contient 479 acides aminés avec un poids moléculaire de 56850.
ésistance bi-fonctionnelle. La protéine déduite qui commence au codon ATG en position 304-306 et s'étend jusqu'au codon de terminaison TGA en position 1741 à 1743 contient 479 acides aminés avec un poids moléculaire de 56850.
La séquence du site de fixation au ribosome ou SFR, à savoir : AGGTGAT, est localisée six nucléides en amont du codon d'initiation de la traduction. De plus, en amont on trouve les séquences similaires à une boite Pribnow centrée à la position 40 (TRTAAAG) et un site de reconnaissance -35 de l'ARN polymérise (ATGAAA). En aval, de la région codante, on trouve une répétition inversée de 10 paires de base adjacente au codon de terminaison TGA.
EXEMPLE II
Séquence d'acides aminés et homoloqie des Protéines
Sur la figure 4, on a représenté les séquences d'acides aminés telles que déduites de la séquence nucléotidique du gène AAC(5')-APH(2") respectivement du gène cat86 de B. Pumilus et du gène APH de
S.fradiae.
Séquence d'acides aminés et homoloqie des Protéines
Sur la figure 4, on a représenté les séquences d'acides aminés telles que déduites de la séquence nucléotidique du gène AAC(5')-APH(2") respectivement du gène cat86 de B. Pumilus et du gène APH de
S.fradiae.
Les séquences d'acides aminés identiques présentant une similitude fonctionnelle sont indiqués par le signe *.
Une comparaison de la séquence d'acides aminés déduite du produit codé par les gènes de résistance avec d'autres protéines séquencées connues, montre deux homologies partielles.
Dans la région N-terminale entre les positions 96 et 223, on trouve 30 amino-acides identiques et 52 amino-acides fonctionnellement similaires a la chloramphénicol acétyltransférase exprimée par le gène cat86 de Bacillus Puy lus (15).
Dans la région C-terminale entre les positions 352 et 448, on trouve 28 amino-acides identiques et 42 amino-acides fonctionnellement similaires à la 3'-hosphotransférase-aminoglycoside exprimée par le gène de Streptomyces fradiae (16).
Bien que ces homologies soient seulement partielles,il est possible d'assigner une activité 6' acetyltransférase à la région N-terminale et une activité 2"-phosphotransférase à la région C-terminale du produit: bifonctionnel du gène de résistance.
EXEMPLE III
Sous-clonage des réions du cène codant Pour une acti vité AAC (6') ou APH (2")
Un seul site ScaI est localisé dans la séquence entre les deux régions homologues avec les protéines de l'acétyltransférase et de la phosphotransférase et rend possible le sous-clonage direct de chaque segment de gène.
Sous-clonage des réions du cène codant Pour une acti vité AAC (6') ou APH (2")
Un seul site ScaI est localisé dans la séquence entre les deux régions homologues avec les protéines de l'acétyltransférase et de la phosphotransférase et rend possible le sous-clonage direct de chaque segment de gène.
Pour obtenir la région-du gène possédant une homologie avec la protéine AAC, on soumet à une digestion le plasmide pUC815A avec EcoRI et ScaI et ce fragment est ligué à pUC8 clivé par EcoRI SmaI.
Après transformation dans E.coli, on obtient des colonies sur des plaques contenant de la kanamycine, mais non sur des plaques contenant de la gentamicine.
L'isolement ultérieur du plasmide recombinant pUC815AC confirme la présence du fragment recherché. Il est ainsi possible d'obtenir un fragment du déterminant de résistance bifonctionnelle exprimant seulement l'activité AAC(6').
Pour obtenir la région du gène possédant une homologie avec l'activité APH(2"), on fait digérer le plasmide pUC815A par ScaI et PstI et ce fragment est ligué -vec pUC8 clivé par HincII PstI. Les recombinants obtenus à partir de cette ligation, renferment une protéine fusionnée exprimant l'activité APH(2"), sous le contrôle du promoteur lacZ.
Après transformation dans E.coli, et étalement de ces clones recombinants sur des milieux de sélection soit avec de la gentamicine, soit avec de la kanamycine, on ne constate aucune expression de l'une ou l'autre des résistances phénotypiques.
La présence du fragment approprié dans le plasmide recombinant est ainsi confirmée.
Pour explorer encore la possibilité d'obtenir une région qui exprime seulement une activité ApH(2") on teste un nombre de clones contenant des déletions dans la région 5' du fragment AluI de 1,5 kb à la fois pour les activités AAC(6') et APH(2").
On utilise la ribostamycine, qui est inactivée par le AAC (6') mais non par le APH (2") pour tester l'activité AAC (6').
Un clone contenant le plasmide pUC815AP et ne comportant pas de région codant pour les 137 acides aminés en position N-terminale et approximativement Ia moitié des régions homologues à d'autres protrines AAC, possède un phénotype de résistance à la
Kanamycine et à la gentamicine et une sensibilité à la ribostamycine. On observe, ainsi que l'activité APH(2") peut exister en l'absence d'activité AAC(6').
Kanamycine et à la gentamicine et une sensibilité à la ribostamycine. On observe, ainsi que l'activité APH(2") peut exister en l'absence d'activité AAC(6').
EXEMPLE IV
Construction d'une sonde intragénique et utilisation pour la détection de la résistance à la gentamicine et à la kanamycine chez des souches de staphylocoques.
Construction d'une sonde intragénique et utilisation pour la détection de la résistance à la gentamicine et à la kanamycine chez des souches de staphylocoques.
On utilise un fragment intragénique de 1070pb obtenu par sous-clonage dans le bactériophage M13mpS en opérant comme décrit par Hu et Messing (17).Sur 479 Souches de staphylocoques/469 donnent le résultat attendu. Sept souches sont faussement positives et seu- lement trois sont faussement négatives. Ces résultats remarquables aboutissent à une corrélation de 98%.
Ce pourcentage s'élève à 99,2% dans une autre série d'essais effectués avec des souches de streptocoques.
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7 (1982) : 271-272.
Claims (11)
1. FRAGMENT D'ADN caractérisé en ce qu'il comprend au moins une partie du gène AAC(6')-APH(2"), ce gène codant pour une protéine de résistance à la kanamycine et à la gentamicine et étant inclus dans la séquence nucléotidique suivante 5'
ACCTAAAGAAAATAATAAAATTATAGGATTTGCATATTGCTATACACTTTAAGACCTGATGGAAAAACAATGTTTTATTTACACTCAATAGGAATGTTAC
50 100
CTAACTATCAAGACAAAGGTTATGGTTCAAAATTATTATCTTTTATTAAGGAATATTCTAAAGAGATTGGTTGTTCTGAAATGTTTTTAATAACTGATAA
150 200
AGGTAATCCTAGAGCTTGCCATGTATATGAAAAATTAGGTGGTAAAAATGATTATAAAGATGAAATAGTATATGTATATGATTATGAAAAAGGTGATAAA
250 300
R B S
10 70
TAA ATG AAT ATA GTT GAA AAT GAA ATA TGT ATA AGA ACT TTA ATA GAT GAT GAT TTT CCT TTG ATG TTA AAA TGG TTA
30 40 50
ACT GAT GAA AGA GTA TTA GAA TTT TAT GGT GGT AG@ GAT AAA AAA TAT ACA TTA GAA TCA TTA AAA AAA CAT TAT ACA
60 70
GAG CCT TGG GAA GAT GAA GTT TTT AGA GTA ATT ATT GAA TAT AAC AAT GTT CCT ATT GGA TAT GGA CAA ATA TAT AAA
80 90 100
ATG TAT GAT GAG TTA TAT ACT GAT TAT CAT TAT CCA AAA ACT GAT GAG ATA GTC TAT GGT ATG GAT CAA TTT ATA GGA
110 120
GAG CCA AAT TAT TGG AGT AAA GGA ATT GGT ACA AGA TAT ATT AAA TTG ATT TTT GAA TTT TTG AAA AAA GAA AGA AAT 130 140 150
GCT AAT GCA GTT ATT TTA GAC CCT CAT AAA AAT AAT CCA AGA GCA ATA AGG GCA TAC CAA AAA TCT GGT TTT AGA ATT
160 170 180
ATT GAA GAT TTG CCA GAA CAT GAA TTA CAC GAG GGC AAA AAA GAA GAT TGT TAT TTA ATG GAA TAT AGA TAT GAT GAT
190 701
AAT GCC ACA AAT GTT AAG GCA ATG AAA TAT TTA ATT GAG CAT TAC TTT GAT AAT TTC AAA GTA GAT AGT ATT GAA ATA
210 220 230
ATC GGT AGT GGT TAT GAT AGT GTG GCA TAT TTA GTT AAT AAT GAA TAC ATT TTT AAA ACA AAA TTT AGT ACT AAT AAG
240 250
AAA AAA GGT TAT GCA AAA GAA AAA GCA ATA TAT AAT TTT TTA AAT ACA AAT TTA GAA ACT AAT GTA AAA ATT CCT AAT 260 270 280
ATT GAA TAT TCG TAT ATT AGT GAT GAA TTA TCT ATA CTA GGT TAT AAA GAA ATT AAA GGA ACT TTT TTA ACA CCA GAA
290 300 310
ATT TAT TCT ACT ATG TCA GAA GAA GAA CAA AAT TTG TTA AAA CGA GAT ATT GCC AGT TTT TTA AGA CAA ATG CAG GGT
320 330
TTA GAT TAT ACA GAT ATT AGT GAA TGT ACT ATT GAT AAT AAA CAA AAT GTA TTA GAA GAG TAT ATA TTG TTG CGT GAA
340 350 360
ACT ATT TAT AAT GAT TTA ACT GAT ATA GAA AAA GAT TAT ATA GAA AGT TTT ATG GAA AGA CTA AAT GCA ACA ACA GTT
370 380
TTT GAG GGT AAA AAG TGT TTA TGC CAT AAT GAT TTT AGT TGT AAT CAT CTA TTG TTA GAT GGC AAT AAT AGA TTA ACT 330 400 410
GGA ATA ATT GAT TTT GGA GAT TCT GGA ATT ATA GAT GAA TAT TGT GAT TTT ATA TAC TTA CTT GAA GAT AGT GAA GAA
420 430 440
GAA'AITCGAAIT MI TII CGA MA GAI (TA TIA AGA AIT TAI CGA AllAIT GAI ATT GAG MA CGA MA MA TAI MA
450 460
GAT ATA GTT GAA GAA TAT TAT CCT ATT GAA ACT ATT GTT TAT GGA ATT AAA AAT ATT AAA CAG GAA TTT ATC GAA AAT
470
GGT AGA AAA GAA ATT TAT AAA AGG ACT TAT AAA GAT TGA TTATATAATATATGAAAAGCTATTATAAAAGACATTAGTATTAAATAGTTT
AAAAAAATGAAAAATAATAAAGGAAGTGAGTCAAGTCCAGACTCCTGTGTAAAATGCTATACAATGTTTTTACCATTTCTACTTATCAAAATTGATGTAT
1800 1850
TTTCTTGAAGAATAAATGCATTCATCATGTAGGTCCATAAGAACGCCTCCAATTAAGCGATTGGCTGATGTTTGATTGGGGAAGATGCGAATAATCTTTT
1900 1950
CTCTTCTGCGTACTTCTTGATTCAGTCGTTCAATTAGATTGGTACTCTTTAGTCGATTGTGGGAATTTCCTTGTACGGTATATTGAAAGGCGTCTTCGAA
2000 2050
@@@GATGCGCAAGCTT 3'
2120
2. Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence codante du gène
AAC(6')-APH(2") est définie par un codon d'initiation
ATG en position 304 - 306 et un codon de terminaison TAG en position 1741 - 1743 dans une phase de lecture ouverte de 1437 pb.
3. Fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est présent dans le plasmide naturel pIP800 de la souche S. faecalis JH102.
4. Fragment d'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est porté par un fragment d'ADN de restriction de HPaII-HincII de 2,4 kb environ du plasmide streptococcal pGB3012 et un segment adjacent
HincII.
5. Fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine de résistance à la kanamycine et à la gentamicine ayant une masse moléculaire apparente de l'ordre de 68000 daltons.
6. Protéine de résistance à la kanamycine et à la gentamicine, caractérisée en ce qu'elle possède une masse moléculaire apparente de 56850 daltons, correspondant à une séquence du type
Met Asn Ile Val Glu Asn Glu Ile Cys Ile Arg Thr Leu Ile Asp Asp Asp Phe Pro Leu Met Leu Lys Trp Leu
30 40 50
Thr Asp Glu Arg Val Leu Glu Pre Tyr Gly Gly Arg Asp Lys Lys Tyr Thr Leu Glu Ser Leu Lys Lys His Tyr Thr
60 70
Glu Pro Trp Glu Asp Glu Val Phe Arg Val Ile Ile Glu Thr Asn Asn Val Pro Ile Gly Tyr Gly Gln Ile Tyr Lys
80 90 100
Met Tyr Asp Glu Leu Tyr The Asp Tyr His Tyr Pro Lys Thr Asp Glu Ile Val Tyr Gly Met Asp Gln Phe Ile Gly
110 120
Glu Pro Asn Tyr Trp Ser Lys Gly Ile Gly Thr Arg Tyr Ile Lys Leu Ile Phe Glu Phe Leu Lys Lys Glu Arg Asn 130 140 150
Ala Asn Ala Val Ile Leu Asp Pro His Lys Asn Asn Pro Arg Ala Ile Arg Ala Tyr Gln Lys Ser Gly Phe Arg Ile
160 170 180
Ile Glu Asp Leu Pro Glu His Glu Leu His Glu Gly Lys Lys Glu Asp Cys Tyr Leu Met Glu Tyr Arg Tyr Asp Asp
190 200
Asn Ala Thr Asn Val Lys Ala Met Lys Tyr Leu Ile Glu His Tyr Phe Asp Asn Phe Lys Val Asp Ser Ile Glu Ile
210 220 230
Ile Gly Ser Gly Tyr Asp Ser Val Ala Tyr Leu Val Asn Asn Glu Tyr Ile Phe Lys Thr Lys Phe Ser Thr Asn Lys
240 250
Lys Lys Gly Try Ala Lys Glu Lys Ala Ile Try Asn Phe Leu Asn Thr @@@ Leu Glu Thr Asn Val Lys Ile Pro Asn 260 270 280
Ile Glu @@@ Ser Try Ile Ser Asp Glu Leu Ser Ile Leu Gly Tyr Lys Glu Ile Lys Gly Thr Phe Leu Thr Pro Glu
290 300 310
Ile Try Ser Thr Met Ser Glu Glu Glu Gln Asn Leu Leu Lys Arg Asp Ile Ala Ser Phe Leu Arg Gln Met His Gly
320 330
Leu Asp Try Thr Asp Ile Ser Glu Cys Thr Ile Asp Asn Lys Gln Asn Val Leu Glu Glu Tyr Ile Leu Leu Arg Glu
340 350 360
Thr Ile Tyr Asn Asp Leu Thr Asp Ile Glu Lys Asp Tyr Ile Glu Ser Phe Met Glu Arg Leu Asn Ala Thr Thr Val
370 380
Phe Glu Glu Lys Lys Cys Leu Cys His Asn Asp Phe Ser Cys Asn His Leu Leu Leu Asp Gly Asn Asn Arg Leu Thr 390 400 410
Gly Ile Ile Asp Phe Gly Asp Ser Gly Ile Ile Asp Glu Tyr Cys Asp Phe Ile Tyr Leu Leu Glu Asp Ser Glu Glu
420 430 440
Glu Ile Gly Thr Asn Phe Gly Glu Asp Ile Leu Arg Met Tyr Gly Asn Ile Asp Ile Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Gln
450 460
Asp Ile Val Glu Glu Tyr Tyr Pro Ile Glu Thr Ile Val Tyr Gly Ile Lys Asn Ile Lys Gln Glu Phe Ile Glu Asn
470
Gly Arg Lys Gly Ile Tyr Lys Arg Thr Tyr Lys Asp *--------
7. Vecteurs recombinants comportant au moins une partie du fra-gment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8. Souches bactériennes modifiées, caractérisées en ce qu'après transformation elles comportent dans leur génome au moins une partie du gène AAC(6')
APH(2").
9. Procédé d'obtention d'un fragment d'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend - le clonage d'un fragment de restriction hPaII-HincII de 2,4 kb environ du plasmide streptococcal pGB3012 et d'un segment adjacent HincII, - le sous-clonage d'un fragment AluI de 1,5 kb environ, sous-clone' dans le site SmaI de PUC8 pour former le plasmide pUC815A, - la dégradation unidirectionnelle par Bal31 en soumettant pUC815A à une digestion par EcoRI et PstI, isolément du fragment de 1,5 kb par centrifugation sur gradient de sucrose, - l'autoligation du fragment de 1,5 kb environ en présence de T4 ADN ligase, ce qui conduit à des polymères de fragments de 1,5 kb environ, qui sont ensuite digérés avec PstI pour produire des dimères de fragments de 1,5 kb, liés au site EcoRI, digestion des dimères avec BAL31, suivie d'une précipitation de l'ADN digéré par BAL31, telle qu'obtenue à l'aide de l'éthanol, digestion par EcoRI pour produire des fragments contenant des extrémités EcoRI et Bal 31, ligation dans mp18 digéré par SmaI et EcoRI, et transformation dans
E.coli JM109.
10. Application d'un fragment d'ADN selon l'ante quelconque des revendications 1 à 5, plus spé cillement d'une séquence intragénique du gène
AAC(6')-APH(2") pour l'élaboration de sondes de dé tection de la résistance à la kanamycine et à la gentamicine dans des cultures cellulaires.
11. Application selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'on utilise comme sonde intragénique un fragment d'ADN HpaII de 1070pb.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8610829A FR2601965B1 (fr) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un determinant codant pour l'acetyltransferase 6'-amino-glycoside et/ou la phosphotransferase 2''-aminoglycoside son procede d'obtention et ses applications biochimiques. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8610829A FR2601965B1 (fr) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un determinant codant pour l'acetyltransferase 6'-amino-glycoside et/ou la phosphotransferase 2''-aminoglycoside son procede d'obtention et ses applications biochimiques. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2601965A1 true FR2601965A1 (fr) | 1988-01-29 |
| FR2601965B1 FR2601965B1 (fr) | 1989-12-08 |
Family
ID=9337748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8610829A Expired FR2601965B1 (fr) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | Fragment d'adn comprenant au moins une partie d'un determinant codant pour l'acetyltransferase 6'-amino-glycoside et/ou la phosphotransferase 2''-aminoglycoside son procede d'obtention et ses applications biochimiques. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2601965B1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962768A (en) * | 1993-05-13 | 1999-10-05 | Plant Genetic Systems Nv | Marker gene |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0068740A2 (fr) * | 1981-06-22 | 1983-01-05 | Eli Lilly And Company | Vecteurs de clonage d'ADN recombinant et transformants eucaryotiques et procaryotiques de ceux-ci |
-
1986
- 1986-07-25 FR FR8610829A patent/FR2601965B1/fr not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0068740A2 (fr) * | 1981-06-22 | 1983-01-05 | Eli Lilly And Company | Vecteurs de clonage d'ADN recombinant et transformants eucaryotiques et procaryotiques de ceux-ci |
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|---|
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| THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS, vol. XXX, Suppl., Décembre 1977, pages S-286 - S-291; F. LE GOFFIC: "The resistance of S. Aureus to aminoglycoside antibiotics and pristinamycins in France in 1976-1977" * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962768A (en) * | 1993-05-13 | 1999-10-05 | Plant Genetic Systems Nv | Marker gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2601965B1 (fr) | 1989-12-08 |
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|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |