FR2587721A1

FR2587721A1 - Process for preparing 2-thienylacetic acid and its derivatives by fermentation

Info

Publication number: FR2587721A1
Application number: FR8514255A
Authority: FR
Inventors: Georges Thiault; Francoise Seigle-Murandi; Regine Steiman
Original assignee: PCAS SA
Current assignee: PCAS SA
Priority date: 1985-09-26
Filing date: 1985-09-26
Publication date: 1987-03-27

Abstract

Process for preparing 2-thienylacetic acid and its derivatives, characterised in that 2-acetylthiophene is used as starting material which is oxidised, with the formation of 2-thienylglyoxylic acid and thenoic acid, by the action of micromycetes, in a fermentation operation, according to the scheme: the ketone functional group of which is then chemically reduced to produce the desired compound:

Description

La présente invention R pour.objet un procédé de préparation de l'acide 2-thieny; acétique en mettant en oeuvre une opération de fermentation. Cet acide

ou le chlorure correspondant, occupe toujours une place privilégiée sur le marché des intermédiaires-chimiques.The present invention R pour.objet a process for preparing 2-thieny acid; acetic by implementing a fermentation operation. This acid

or the corresponding chloride, still occupies a privileged place on the market of chemical intermediates.

De 1970 à nos jours1 l'Industrie Pharmaceutique s'est inscrite comme première consommatrice dë ces dérivés qui interviennent dans la synthèse de certaines céphalos porines.From 1970 to the present day1 the Pharmaceutical Industry registered as the first consumer of these derivatives which are involved in the synthesis of certain porous cephalos.

EXEMPLE

CEPHALORIPINE
On connait différents procédés de fabrication notamment le brevet FR 2 377 398 (GB 1 573 882 ) Les procédés utilisés actuellement présentent l1inconvénient de prix de revient élevés, dans un contexte économique difficile.EXAMPLE

CEPHALORIPIN
Various manufacturing methods are known, in particular the patent FR 2 377 398 (GB 1 573 882) The methods currently used have the drawback of high cost prices, in a difficult economic context.

Malheureusement, la difficulté de greffer un reste acétique sur un noyau aromatique ou hétérocyclique demeure encore, avec pour preuve la littérature qui n'indique pas à ce jour de grandes nouveautés.Unfortunately, the difficulty of grafting an acetic residue on an aromatic or heterocyclic nucleus still remains, with proof of the literature which does not indicate to this day any great novelties.

Il en résulte que ce genre de synthèse s'effectue toujours selon les canevas réactionnels qui datent quelque peu (CARMACK et SPIELMAN, 1956 , SOUTHWICK, 1970 - STEINKOPH et
WOLFRAM, 1924 - BLICKE et TSAO, 1944 - NIPPON SODA, 1977
ARNDT-EISTERT, 1949 - BLICKE et ZIENTY, 1948) ; d'où l'opportunité de tenter une aventure (aux risques calculés) dans une discipline nouvelle : la BIOTECHNOLOGIE.As a result, this kind of synthesis is always carried out according to reaction patterns which date somewhat (CARMACK and SPIELMAN, 1956, SOUTHWICK, 1970 - STEINKOPH and
WOLFRAM, 1924 - BLICKE and TSAO, 1944 - NIPPON SODA, 1977
ARNDT-EISTERT, 1949 - BLICKE and ZIENTY, 1948); hence the opportunity to try an adventure (at calculated risks) in a new discipline: BIOTECHNOLOGY.

Conformément à la présente invention, on transforme le 2-acetyl thiophène, matière première classique peu coûteuse en acide 2-thienyl glyoxylique, par action de micromycetes, selon le schéma

In accordance with the present invention, 2-acetyl thiophene, a conventional inexpensive raw material, is transformed into 2-thienyl glyoxylic acid, by the action of micromycetes, according to the scheme.

Il reste alors à réduire la fonction cétonique pour obtenir le composé cherché

Toutefqis, il serait très surprenant que les micromycetes s'appliquent à réaliser très exactement et uniquement cette réaction et l'attention se porte tout naturellement sur d'autres métabolites résultant de la biotransformation du 2-acetyl thiophéne. It then remains to reduce the ketone function to obtain the desired compound

However, it would be very surprising if the micromycetes applied themselves to carrying out this reaction very exactly and only, and attention naturally turned to other metabolites resulting from the biotransformation of 2-acetyl thiophene.

Ainsi, parmi les produits que l'on peut obtenir concurre- ment, il en est un qui présente un grand intérêt, l'acide 2-thiophène carboxylique (plus généralement désigné sous l'appellation d'acide 2-thenoique) :

ordinairement préparé par des méthodes chimique classiques (HARTOUGH et CONLEY, 1947 - SCHICK et HARTOUGH, 1948
CHALLENGER et GIBSON, 1940 - SCHLEUK et OCHS, 1915 - RINKES, 1934).Thus, among the products which can be obtained concurrently, there is one which is of great interest, 2-thiophene carboxylic acid (more generally designated under the name of 2-thenoic acid):

ordinarily prepared by conventional chemical methods (HARTOUGH and CONLEY, 1947 - SCHICK and HARTOUGH, 1948
CHALLENGER and GIBSON, 1940 - SCHLEUK and OCHS, 1915 - RINKES, 1934).

Enfin, un travail trop poussé des Microorganismes peut donner naissance à quelques dérivés secondaires, peu souhaitables tel que par exemple-l'aldehyde 2-thenoique

Finally, too much work by microorganisms can give rise to a few undesirable secondary derivatives such as, for example, 2-thenoic aldehyde.

Pour rechercher les souches les plus adaptées et les meilleures conditions de réaction, on-a d'abord procédé sur des essais en culture solide en milieu glosé avec différentes souches d'origines diverses : sol,bois pourri, produits alimentaires, dans des milieux naturels, tels que l'extrait de malt, et des milieux artificiels tels que le milieu Galzy et Slonimsky (1957) désigné ci-après GS.On rappelle la composition globale de ce milieu
Solution de sels minéraux 100 ml
- Solution d'éléments rares 1 ml
- Solution de FeCl3, 6 H20 à 200 mg/l 1 ml - Solution de vitamines 5 5 ml
Solution de mésoinositol à 4 mg/ml 5 ml
- Glucose 20 g
- Eau distillée q.s,p. 1 litre
à pH = 6 qui peut être utilisé avec ou sans glucose. La formule détaillée est bien connue de l'homme de l'art. Dans tous les cas, les essais sont effectués à une température de 22 - 24 C, avec de la lumière douze heures sur vingt quatre.To find the most suitable strains and the best reaction conditions, we first carried out tests in solid culture in glossy medium with different strains of various origins: soil, rotten wood, food products, in natural environments , such as malt extract, and artificial media such as the Galzy and Slonimsky medium (1957) designated hereafter GS. We recall the overall composition of this medium
Mineral salt solution 100 ml
- Rare element solution 1 ml
- FeCl3 solution, 6 H2O at 200 mg / l 1 ml - Vitamin 5 solution 5 ml
Mesoinositol solution 4 mg / ml 5 ml
- Glucose 20 g
- Distilled water qs, p. 1 litre
at pH = 6 which can be used with or without glucose. The detailed formula is well known to those skilled in the art. In all cases, the tests are carried out at a temperature of 22 - 24 C, with light twelve hours a day.

On a observé d'abord la faible toxicité de l'acetyl thiophène (AT) dans lesdits milieux. Des essais ont été effectués avec des-concentrations d'AT variant de 0,01 à 1 gramme par litre, et il est apparu que la meilleure concentration serait de l'ordre de 0,5 g/l. Dans 90 % des cas, on a un bon développement et on a noté une inhibition avec le genus acremonium et plusieurs levures (Lipomyces). Des développements ont même pu entre observé' en l'absence de glucose.De bons développements ont été obtenus notamment avec les souches
- Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma
- Mucor
- Basidiomycetes
- Candida, Cryptococcus, Saccharomyces
Ces souches ont alors été utilisées pour poursuivre les essais en milieu liquide à la concentration de 0,5 g/l.The low toxicity of acetyl thiophene (AT) was first observed in said media. Tests were carried out with AT concentrations varying from 0.01 to 1 gram per liter, and it appeared that the best concentration would be of the order of 0.5 g / l. In 90% of the cases, we have a good development and we noted an inhibition with the genus acremonium and several yeasts (Lipomyces). Developments have even been observed in the absence of glucose. Good developments have been obtained in particular with the strains
- Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma
- Mucor
- Basidiomycetes
- Candida, Cryptococcus, Saccharomyces
These strains were then used to continue the tests in liquid medium at the concentration of 0.5 g / l.

Des essais ont été effectués pour déterminer les paramètres à utiliser
- La valeur des cultures en milieu solide
- le milieu de culture à utiliser
- le pH
- la concentration en glucose
- le temps de fermentation avant l'addition
de 2 AT à la culture
- le temps au bout duquel la réaction est
complète ou doit être arrêtée.Tests were carried out to determine the parameters to be used
- The value of cultures in solid medium
- the culture medium to be used
- pH
- glucose concentration
- the fermentation time before addition
from 2 TA to culture
- the time after which the reaction is
complete or must be stopped.

On a essayé deux sortes de milieux 1) des milieux complexes : extrait de malt, soja, amidon 2) des milieux synthétiques : GS, Czapek-dox, acide tar
trique.We tried two kinds of media 1) complex media: malt extract, soy, starch 2) synthetic media: GS, Czapek-dox, tar acid
stick.

Les concentrations de glucose (ou saccharose) essayées ont été 0 - 5 - 10 ou 20 g/l et le pH : 4,6 - 6 ou 7.The glucose (or sucrose) concentrations tested were 0 - 5 - 10 or 20 g / l and the pH: 4.6 - 6 or 7.

Le substrat : 2 acetyl thiophène a été ajouté au début ou après quelques jours de culture, par exemple 1 - MALT
4811 8 d

2 - GALZY - Glucose 10 g/l

3 - GALZY - sans glucose

4 - CULTURE EN 2 TEMPS
GALZY - Glucose 20 g/l
4d

Substrate: 2 acetyl thiophene was added at the start or after a few days of culture, for example 1 - MALT
4811 8 d

2 - GALZY - Glucose 10 g / l

3 - GALZY - without glucose

4 - CULTURE IN 2 STAGES
GALZY - Glucose 20 g / l
4d

I - inoculation
AT - 2-acetyl tbiophene s. = echantillonage

I - inoculation
AT - 2-acetyl tbiophene s. = sampling

Avant inoculation, les champignons ont été développés sur milieu solide (malt) avec 0,01 gl; de 2-RT pour favoriser l'induction. La température était de 240 C. Le milieu était agité à la cadence de 180 RPM, et la concentration du 2-AT dans le milieu liquide était 0,5 g/l.Before inoculation, the mushrooms were developed on solid medium (malt) with 0.01 g; of 2-RT to promote induction. The temperature was 240 C. The medium was stirred at the rate of 180 RPM, and the concentration of 2-AT in the liquid medium was 0.5 g / l.

L'extraction a été faite à pH 213 avec de l'acétate d'ethyle redistillé. Les résultats ont été observés en chromatographie sur plaque (couche mince).The extraction was carried out at pH 213 with redistilled ethyl acetate. The results were observed by plate chromatography (thin layer).

La séparation complète du 2-AT et de ses métabolites a été difficile avec un seusystème de solvant. Le tableau suivant indique les distances de migration des différents métabolites dans les 6 systèmes de solvant suivants
'Solvant AT ATG Ac.T. Ald.T. Alc.T.Complete separation of 2-AT and its metabolites was difficult with a single solvent system. The following table shows the migration distances of the different metabolites in the following 6 solvent systems
'Solvent AT ATG Ac.T. Ald.T. Alc.T.

A
Chloroforme 50
Acétate d'ethyle 40 0,93 ,17 0,81 0,92 0,78 Acide acetique 10
B
Benzene 90 0,34 0 0 0,45 0,15
Chloroforme 19
C
Cyclohexane 30
Formiate d'ethyle 20 0,52 0,17 0,41 0,55 0,46
Acide formique 2
D
Cyclohexane 30
Acétate d'ethyle 20 0,66 0,30 0,64 0,61 0,53
Acide formique 2
E
Cyclohexane 30.AT
Chloroform 50
Ethyl acetate 40 0.93, 17 0.81 0.92 0.78 Acetic acid 10
B
Benzene 90 0.34 0 0 0.45 0.15
Chloroform 19
VS
Cyclohexane 30
Ethyl formate 20 0.52 0.17 0.41 0.55 0.46
Formic acid 2
D
Cyclohexane 30
Ethyl acetate 20 0.66 0.30 0.64 0.61 0.53
Formic acid 2
E
Cyclohexane 30.

Acétate d'ethyle 20 9,67 0 0,54 0,65 0,60
Acide acétique 2
F
Toluene 50
Acétate d'éthyle 45 0,77 0,36 9,73 0,80 0,69
Acide formique 5
AT = 2-acetyl thiophène
ATG = acide 2-thienyl glyoxyolique
Ac.T. = 2-thiophène carboxylique = acide Thenoique
Ald.T.= Aldehyde 2-thenoique
Alc.T. = Alcool thenylique
Après différents essais, on a choisi deux systèmes de
solvants, l'un après l'autre, dans la même direction.Ethyl acetate 20 9.67 0 0.54 0.65 0.60
Acetic acid 2
F
Toluene 50
Ethyl acetate 45 0.77 0.36 9.73 0.80 0.69
Formic acid 5
AT = 2-acetyl thiophene
ATG = 2-thienyl glyoxyolic acid
Ac.T. = 2-thiophene carboxylic = Thenoic acid
Ald.T. = Aldehyde 2-thenoique
Alc.T. = Thenyl alcohol
After different tests, we chose two
solvents, one after the other, in the same direction.

On a obtenu les résultats suivants
Solvant AT MG Ac.T. Ald.T. Alc.T. The following results were obtained
Solvent AT MG Ac.T. Ald.T. Alc.T.

I - C 0.52 0.17 0.41 0.55 0.46
2 - B 0.62 0.17 . 0.41 0.71 0.17
1 - D 0.63 0.26 0.60 0.61 0.53
2 - B 0.76.. 0.26. 0.60 0.70 .0.01
1 - F 0.74 0.34 0.68 0.80 0.69
2 - B 0.82. 0.32. .0.69. 0.79 . 0.61
I - A 0.93 0.17 0.81 0.92 " 0.78 2 -.8 0.90... .0.17... 0.85 . 0.82 . 0.68
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec l'extrait de
malt, le soja et le milieu GS. On a préféré ce dernier
parce que l'extraction et la purification des métabolites
étaient plus faciles à faire qu'avec les milieux complexes.I - C 0.52 0.17 0.41 0.55 0.46
2 - B 0.62 0.17. 0.41 0.71 0.17
1 - D 0.63 0.26 0.60 0.61 0.53
2 - B 0.76 .. 0.26. 0.60 0.70 .0.01
1 - F 0.74 0.34 0.68 0.80 0.69
2 - B 0.82. 0.32. .0.69. 0.79. 0.61
I - A 0.93 0.17 0.81 0.92 "0.78 2 -.8 0.90 ... .0.17 ... 0.85. 0.82. 0.68
The best results have been obtained with the extract of
malt, soy and GS medium. We preferred the latter
because the extraction and purification of metabolites
were easier to do than with complex media.

Le pH le plus favorable est voisin de 6. L'addition de 2-AT
doit être faite de préférence 48 heures après inoculation
avec une concentration de sucre de 5 g/l. La prise d'échan
tillon est faite 7 à 8 jours après inoculation.The most favorable pH is close to 6. The addition of 2-AT
should preferably be made 48 hours after inoculation
with a sugar concentration of 5 g / l. Taking a sample
tillon is made 7 to 8 days after inoculation.

Dans ces conditions, on a procédé alors à des essais de
selection de souche en milieu GS, à pH 6 et avec 5 g/l
de glucose.Under these conditions, tests were then carried out
strain selection in GS medium, pH 6 and with 5 g / l
glucose.

Des flacons de 250 ml contenant 50 ml de milieu ont été inoculés de champignons développés sur extrait de malt
pendant une semaine, avec 0,05 g/l de 2-AT. 250 ml flasks containing 50 ml of medium were inoculated with fungi developed on malt extract
for one week, with 0.05 g / l of 2-AT.

Au bout de trois jours en a ajouté du 2-AT pour porter la concentration à 0,5 g/l. es flacons ont. été secoués à 180 RPM à une température de 24 .C et l'on a pris les échantillons sept jours plus tard.After three days added 2-AT to bring the concentration to 0.5 g / l. the bottles have. were shaken at 180 RPM at a temperature of 24 .C and samples were taken seven days later.

L'extraction et la chromatographie ont été faites comme indiqué plus haut. La concentration de glucose a été déterminée par technique UT. Le spectre de masse et la chromatographie gaz-liquide ont été faits avec des molécules silylées; des échantillons ont été séchés et ajoutés à 100 p i de pyridine sèche et 200 pl de BSTFA (dérivé fluoré). La silylation a été faite a température ambiante pendant au moins 2 heures avant l'analyse par chromatographie gazeuse.The extraction and the chromatography were carried out as indicated above. The glucose concentration was determined by UT technique. The mass spectrum and gas-liquid chromatography were done with silylated molecules; samples were dried and added to 100 μl of dry pyridine and 200 μl of BSTFA (fluorinated derivative). The silylation was carried out at room temperature for at least 2 hours before the analysis by gas chromatography.

D'une manière générale, on a observé la formation de chlamydospores. Le poids frais varie de 2 g/l à 88 g/l suivant le champignon. On a observé aussi l'acidification du milieu.In general, the formation of chlamydospores has been observed. The fresh weight varies from 2 g / l to 88 g / l depending on the fungus. The acidification of the medium was also observed.

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau suivant Genre N sommation Production de
ou de totale ATG Ac.T. Autres
groupe souche d'AT
Aspergillus 25 4 6 2 4
Penicilllum 65 21 i2 25 5
Mucorales 31 6 - 7 2
Basidiomycetes 22 2 5 1 2
Yeasts 22 6 4 4 1
Autres 274 67 39 27 13
lotes 459 106 66 66 27
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de L'acide 2-thieny; acétique et ses dérivés, caractérisé en ce que l'on utilise comme matière de départ le 2-acétyl-thiophène que-l'on oxyde' avec formation d'acide 2-thiényl glyoxylique et d'acide thénoique par action de micromycetes, dans une opération de fermentation, selon le schéma ::

dont la fonction cétonique est ensuite réduite par voie chimique pour obtenir le composé cherché.:.

The results obtained are collated in the following table Gender N summation Production of
or total ATG Ac.T. Other
stem group of AT
Aspergillus 25 4 6 2 4
Penicilllum 65 21 i2 25 5
Mucoral 31 6 - 7 2
Basidiomycetes 22 2 5 1 2
Yeasts 22 6 4 4 1
Others 274 67 39 27 13
lots 459 106 66 66 27 1. Process for the preparation of 2-thieny acid; acetic and its derivatives, characterized in that the starting material used is 2-acetyl-thiophene which is oxidized with the formation of 2-thienyl glyoxylic acid and of thenoic acid by the action of micromycetes, in a fermentation operation, according to the scheme:

whose ketone function is then reduced chemically to obtain the desired compound.:.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fermentation est conduite en milieu liquide de
Galzy et Slonimsky avec une concentration en acetyl thiophène comprise entre 0,1 et 1 g/litre, de préférence de l'ordre de 0,5 g/litre.2. Method according to claim 1, characterized in that the fermentation is carried out in a liquid medium of
Galzy and Slonimsky with a concentration of acetyl thiophene of between 0.1 and 1 g / liter, preferably of the order of 0.5 g / liter.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le pH du milieu est voisin de 6. 3. Method according to claim 2, characterized in that the pH of the medium is close to 6.

4. Procédé selon une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que pour une phase initiale le milieu reçoit au départ une inoculation de micromycetes et d'acétylwthiophène, à une concentration de 0.01 g/litre, puis au'bout d'une période de deux à quatre jours, dans une phase secondaire, la concentration d'acétyl thiophène est portée à 0,5 g/l. 4. Method according to one of claims 2 or 3 characterized in that for an initial phase the medium initially receives an inoculation of micromycetes and acetylwthiophene, at a concentration of 0.01 g / liter, then au'bout a period of two to four days, in a secondary phase, the concentration of acetyl thiophene is brought to 0.5 g / l.

Claims

It can be concluded that cetyl Thiophene is not a very toxic substance under these experimental conditions. The production of metaboaites- (thienyl glyoxyolic acid, thenoic acid and others) was detected by thin layer chromatography. Aureobasidium Pullulans has been observed as the most active strain. This strain was the subject of a deposit at the Dutch Laboratory Centraalbureau voor Schimmelculture - Oosterstraat 1 - 3740 AG BAARN -. This mushroom is also kept at the Laboratory of Botany, Cryptogamy, Cellular and Genetic Biology, of the Research Training Unit (FR) of Pharmacy, of the Scientific and Medical University of Grenoble under the reference CMPG 374 (Mycology Pharmacy collection Grenoble). This fungus is able to consume acetyl thiphene completely and produces both TG and AC. T. The latter was identified by mass spectrum which is not possible for the ATG which is destroyed in this operation.

5. Method according to claim 4, characterized in that in the first phase the medium comprises glucose, at a concentration equal to or less than 20 g / X, and that in the secondary phase, the medium does not comprise glucose.

6. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the micromycete is chosen from the group consisting of fungi

- Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichoderma

- Mucor

- Basidiomycetes

- Candida, Cryptococcus, Saccharomyces

7. Method according to claim 6, characterized in that the micromycete is aureobasidium pullulans.