FR2550094A1 - Compositions de vaccins conditionnees pour la vaccination de sujets immunitairement non naifs contre un agent pathogene determine et contenant un haptene comportant lui-meme un site antigenique caracteristique dudit agent pathogene ou un oligomere de cet haptene - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE COMPOSITION DE VACCIN CONTRE UN AGENT PATHOGENE DETERMINE, CONTENANT UN HAPTENE SYNTHETIQUE POSSEDANT LUI-MEME UN SITE ANTIGENIQUE CARACTERISTIQUE DUDIT AGENT PATHOGENE OU UN OLIGOMERE DE CET HAPTENE. ELLE EST CONDITIONNEE A UN DOSAGE D'HAPTENE PROPRE A REIMMUNISER UN SUJET IMMUNITAIREMENT NON NAIF CONTRE LEDIT AGENT PATHOGENE, EN ASSOCIATION AVEC UN VEHICULE PHYSIOLOGIQUEMENT ACCEPTABLE.

Description

Compositions de vaccins conditionnées pour la vaccination de sujets

immunitairement non naïfs contre un agent pathogène déterminé et contenant un haptène comportant lui-même un site antigènique caractéristique dudit agent pathogène

ou un oligomère de cet haptène.

___________________________________________________________L'invention est relative à une composition de vaccins conditionnée pour la vaccination de sujets immunitairement non naïfs contre un agent pathogène déterminé et contenant un haptène comportant lui-même un site antigènique caractéristique dudit agent pathogène.

On sait qu'un certain nombre de vaccins synthétiques ont déjà été proposés ou même réalisés.

D'une façon générale il a déjà été proposé de substituer à des antigènes naturels utilisés en vaccination humaine 10 ou vétérinaire des antigènes de synthèse possédant des éléments de structure en commun avec ces antigènes naturels ou "natifs" Ces éléments de structure contiennent un général un site antigénique ou "épitope" de l'antigène naturel Par exemple cet antigène synthétique contient 15 un peptide possédant une séquence commune avec l'antigène naturel ou "natif", lorsque celui-ci consiste enune

protéine; ou il peut consister en un oligosaccharide lorsque l'antigène naturel possède une structure polvsaccharidiaue.

Cependant, sauf exception, ces peptides ou oligosaccha20 rides de synthèse, qui sont effectivement susceptibles d'être reco Dnus par des anticorps à l'égard de l'antigène naturel, ne présentent eux-mêmes,in vivo,qu'une

activité immunogène extrêmement faible, voire non décelable par les techniques immunologiques courantes En 25 d'autres termes,ils se comportent comme des haptènes.

Cette dernière expression sera effectivement utilisée dans ce qui suit pour désigner tout produit de synthèse, tel qu'il a été défini plus haut, qui en particulier

comporte au moins un épitope caractéristique d'un antigène naturel.

Diverses méthodes ont été proposées dans la 5 littérature pour renforcer cette immunogénicité La méthode la plus courante consiste à associer l'haptène avec des adjuvants immunologiques, tels que les dérivés

connus sous la désignation de "muramyl-peptides".

Il a également été proposé de les "oligoméri10 ser" Cette dernière opération entraîne en effet dans

certains cas un accroissement du pouvoir immunogène.

Enfin, une méthode couramment étudiée consiste dans la conjugaison de l'haptène ou du polymère de

l'haptène avec une molécule porteuse physiologiquement 15 acceptable et de poids moléculaire suffisamment élevé.

Cette conjugaison peut effectivement conduire à un accroissement sensible de l'immunogénicité susceptible

d'être induite in vivo.

L'utilisation de telles molécules porteuses, telles que l'anatoxine tétanique ou l'anatoxine diphtérique, est'cependant difficile, dans la mesure o elles présentent souvent elles-mêmes des propriétés immunogènes importantes Elles ne semblent pas devoir être utilisables pour des vaccinations répétées, et ce d'au25 tant plus que l'on observe même dans certains cas une

immunosuppression irréversible.

L'ensemble de ces constatations doit cependant s'inscrire dans le contexte réel des essais

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d'immunisation pratiqués jusqu'à ce jour avec de tels vaccins synthétiques En effet, ces essais ont en général été réalisés sur des animaux immunitairement "naifs", en ce

que ceux-ci n'avaient jamais auparavant été exposés, que 5 ce soit de façon naturelle ou non, à l'antigène naturel.

L'invention découle de la découverte que les haptènes ou oligomères d'haptènes étaient en fait capables, lorsqu'ils étaient conditionnés à un dosage approprié, d'assurer une ré-immunisation d'un sujet contre l'antigène naturel, lorsque le sujet avait déjà auparavant été exposé à l'antigène naturel, en d'autres termes

que le sujet n'était plus immunitairement naïf.

L'invention concerne par conséquent une composition de vaccin contre un agent pathogène déterminé 15 contenant un haptène synthétique possédant lui-même un site antigènique caractéristique dudit agent pathogène ou encore un oligomère de cet haptène, qui est plus particulièrement caractériséeen ce qu'elle est conditionnée à un dosage d'haptène propre à ré-immuniser un sujet 20 immunitairement non naïf contre ledit agent pathogène, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable La situation évoquée dans ce qui précède se présente notamment dans le cas de vaccinations de rappel On observe alors que la dose nécessaire d'haptène pour obtenir la réimmunisation du sujet qui avait déjà auparavant été soumis à l'action de l'agent pathogène ou de l'antigène naturel vaccinant, est sans commune mesure avec la dose qui en théorie serait nécessaire pour 30 conférer au sujet un niveau d'immunité semblable en vaccination primaire Une telle comparaison théorique ne peut d'ailleurs jouer que dans l'hypothèse o l'haptène pourrait être considérée comme présentant un niveau immunogène effectif minimum Au contraire, dans le cas 35 d'une vaccination secondaire, les résultats auxquels l'invention conduit,semblent devoir être interprétés comme signifiant qu'il suffit, pour recréer dans un organisme les conditions d'une protection contre un antigène auquel il avait déjà été exposé, d'administrer un principe ne comportantau'unepartie des caractéristiques intervenant dans la constitution de la réaction immuni5 taire initiale contre cet antigène Cette opération semble s'étendre à toutes les situations possibles d'exposition antérieure d'un sujet à un antigène, que celui-ci se soit présenté sous sa forme pathogène ou au contraire sous

une forme compatible avec la vaccination à caractère thé10 rapeutique contre cet antigène.

L'invention doit permettre de remédier au moins en partie à de nombreuses difficultés rencontrées au cours des vaccinations avec les vaccins naturels courants On sait en effet que les risques qui peuvent 15 s'attacher à une vaccination apparaissent davantage au niveau de ce qui pourrait être qualifié dans tous les cas d'une"vaccination secondaire" La réaction contre une -vaccination primaire est souvent assez faible Par contre les réactions parasites, par exemple des allergies qui 20 peuvent être dangereuses, se manifestent souvent à

l'occasion d'une vaccination secondaire.

L'invention permet donc d'envisager la combinaison chez des sujets immunitairement naïfs, de la vaccination primaire efficace avec un vaccin classique 25 tels que ceux utilisés effectivement jusqu'à ce jour (ou avec unantiqène naturel au sens utilisé dans la présente

description), et la vaccination secondaire dans des

conditions qui peuvent alors être beaucoup mieux contrôlées, avec un haptène correspondant à cet antigène.

L'invention permet ainsi d'éviter l'utilisation des molécules porteuses ou "carriers" dont l'utilisation paraissait nécessaire dans tous les cas à la plupart des auteurs Outre les phénomènes toxiques qui pouvaient être engendrés par ces molécules porteuses, 35 on pouvait également observer le renforcement des caractéristiques antigèniques propres des conjugués dont on

pouvait réaliser ou concevoir la fabrication.

Dans le cas d'une vaccination secondaire de

rappel, il est inutile d'utiliser un adjuvant immunologique de vaccin.

En rapport avec ce qui précède, l'invention concerne donc également la combinaison nouvelle, notamment sous forme de nécessaire ou "kit" en vue de réaliser un cycle complet de vaccinations: d'une dose de vaccin naturel pour une première injec10 tion et d'au moins une dose pour au moins une vaccination de rappel,

d'un haptène contenant un site antigénique caractéristique du principe actif du vaccin naturel ou de l'agent 15 pathogène en question, ou d'un oligomère de cet haptène.

L'invention s'applique également dès que l'on suspecte que le sujet à vacciner a déjà été exposé à l'agent pathogène, même en l'absence d'une première vaccination effective On sait que lorsque de telles 20 situations se présentent, la mise en oeuvre des techniques classiques de vaccination, avec un vaccin "naturel", peut engendrer des effets secondaires nuisibles, en raison de la réaction immunitaire trop violente

susceptible de se manifester ou d'effets secondaires, 25 par exemple du type allergique.

Pour faire face à une telle éventualité, l'invention propose également une composition, notamment sous forme de nécessaire ou "kit", pour au moins une vaccination contre un agent pathogène déterminé, conte30 nant, en combinaison: au moins une dose pour au moins une vaccination de rappel, d'un haptène contenant un site antigénique caractéristique de l'agent pathogène déterminé susdit ou d'un principe de vaccin naturel actif contre cet 35 agent pathogène, des moyens de prélèvement d'un échantillon de sang ou de sérum du sujet à vacciner, les éléments ou réactifs ou les deux à la fois, nécessaires à la réalisation sur cet échantillon de sang ou de sérum, d'un diagnostic in vitro de vérification de la non-naïveté immunitaire du sujet à vacciner à

l'égard dudit agent pathogène.

Par exemple, les éléments et réactifs nécessaires à la réalisation sur l'échantillon de sang ou 10 de plasma du sujet à vacciner, comprennent une microplaque et les réactifs nécessaires à la réalisation

des titrages comparatifs des taux d'anticorps respectivement contenus dans l'échantillon de sang.

Avantageusement, les titrages comparatifs sus15 indiqués sont effectués par une méthode du type ELISA.

En particulier, cette méthode comprendra les étapes suivantes standardisables selon l'antigène naturel considéré: incubation de dilutions croissantes du sérum à étu20 dier et du sérum témoin dans les puits d'une microplaque, r 1 evêtus du principe actif du vaccin naturel, pendant une durée permettant une réaction optimum (le sérum à étudier contenant, le cas échéant, des anticorps ci-après dénommés "premiers anticorps" 30 contre le principe actif de vaccin), réaction, après lavage poussé de la micro-plaque avec un tampon adéquat, des anticorps éventuellement fixés dans les puits avec une deuxième catégorie d'anticorps dirigés contre les premiers, les anticorps de la se35 conde catégorie étant marqués, de préférence par une enzyme choisie de préférence parmi celles dont l'action à l'égard du substrat approprié se manifeste par une variation d'absorbance des solutions de ce substrat, pour une longueur d'ondes appropriée, un dosage des taux relatifs d'anticorps de la seconde catégorie fixés dans les puits relatifs à l'échantillon à étudier et dans ceux relatifs au témoin et comparaison des taux mesurés, notamment des absor5 bances mesurées à l'aide d'un photomètre, dans les puits correspondant respectivement aux échantillons à

étudier et à l'échantillon témoin.

La détermination des seuils qui sont à retenir pour l'appréciation du caractère naif ou non du sujet à étudier, selon les résultats des mesures comparatives sus-indiquées, pourra être appréciée par le spécialiste

eu égard à la nature de l'agent pathogène concerné.

A titre d'indications non limitatives, on pourra considérer que le sujet étudié n'était pas immunitaire15 ment naif lorsque les densités optiques mesurées à l'occasion de la mise en oeuvre de la technique précédente et sur des sérums dilués au 1/100 étaient au moins supérieures à trois fois la densité optique optimum mesurée dans les mêmes conditions sur un sérum normal à 20 la même dilution En particulier, on considérera que le sujet étudié n'était pas immunitairement naïf lorsque la densité optique mesurée sur un sérum provenant de ce sujet est au moins égale à trois fois la densité optique mesurée sur un sérum provenant d'un individu 25 "normal" ou immunitairement naif, lorsque l'on met en oeuvre la technique comprenant les étapes successives suivantes: dépôt de 0,5 à 2 ug de l'antigène concerné dans les puits de la plaque, et addition de dilutions appro30 priées, d'une part, du sérum à étudier et, d'autre part, du sérum normal de comparaison,(sauf lorsque les valeurs de densités optiques correspondantes ont été prédéterminées et sont disponibles, par exemple par l'intermédiaire d'abaques), incubation de la plaque pendant le temps nécessaire à la réaction, notamment pendant deux heures à 37 C, lavages de la plaque avec les solvants appropriés pour éliminer les protéines ou immunoglobulines non fixées, mise en contact de la plaque avec des anticorps marqués à la péroxydase, ces anticorps appartenant à la susdite seconde catégorie et, après les lavages appro priés de la plaque, mise en contact de la plaque avec une solution de mg de O-phénylène-diamine à titre de substrat, dans 100 ml d'une solution tampon citrate 0,05 M/phosphate, p H 5, et contenant 20 pl d'eau oxygénée à 130 volumes, interruption du contact au bout de la durée nécessaire 15 à la réaction, notamment de 5 à 30 minutes selon la nature de l'antigène utilisé, par addition d'acide sulfurique, réalisation des mesures de densité optique et comparaison des résultats à ceux obtenus dans les mêmes condi20 tions sur des sérums normaux témoins (ou à des valeurs prédéterminées). L'invention peut être mise en oeuvre avec tout haptène susceptible d'être reconnu par un anticorps préalablement formé à l'égard d'un antigène vaccinant naturel 25 et possédant au moins un épitope en commun avec cet haptène Ces haptènes peuvent être exclusivement peptidiques ou non exclusivement peptidiques A cet égard, l'haptène consiste par exemple en une structure osidique de poids moléculaire réduit, pouvant être constituée d'un mono30 saccharide ou de plusieurs monosaccharides liés entre eux, par exemple par une liaison de type glycosidique Ces oligosacchardies peuvent être soit linéaires, soit ramifiés Ils peuvent appartenir à la famille des hexoses ou des pentoses; ils peuvent être neutres ou aminés, être un acide uronique ou un acide sialique ou appartenir à cette série Ils peuvent porter des substituants usuellement contenus dans les structures naturelles, tels que acétyle, sulfate ou phosphate Ces indications sont données à titre d'exemple mais ne sont pas limitatives et l'on envisage d'une manière générale tous les haptènes peptidiques et osidiques dont on retrouve les équivalents à l'intérieur de la structure d'un antigène de masse moléculaire élevée, que cet haptène soit inclus dans la

chaîne ou qu'il figure en position terminale.

D'une façon générale, les haptènes sus15 ceptibles d'être mis en oeuvre soit tels quels, soit à l'état d'oligomères pour la constitution de doses de vaccins utilisables pour une immunisation secondaire, ont en commun un élément de structure, dans les conditions qui ont été évoquées ci-dessus, par exemple avec des principes actifs extraits de microorganismes infectieux ou les microorganismes infectieux eux-mêmes (vaccins atténués ou tués) Plus particulièrement, les haptènes susceptibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention peuvent avoir en commun des éléments de structure avec des constituants de ces agents pathogènes (tels que bactéries, virus,parasites, rickettsies, protozoaires, etc) A titre d'exemplessupplémentaires,on mentionnera les haptènes ayant des éléments de structure en commun avec des protéines antigéniques appartenant aux enveloppes des virus de l'hé30 patite virale B, de la grippe, des virus herpétiques, ou encore des protéines de parois bactériennes, par exemple streptococciques, etc Au titre des haptènes ayant des éléments de structure communs avec des antigènes non exclusivement peptidiques ou non peptidiques, on peut 35 mentionner des oligosaccharides De façon plus générale on peut aussi se reporter aux indications

fournies dans la demande de brevet européen N 3833.

L'invention concerne donc plus particulièrement, au titre des combinaisons déjà définies plus haut, des nécessaires ou "kit" comprenant, pour une vaccination primaire, des principes actifs extraits des microorganismes infectieux correspondants ou les microorganismes infectieux eux-mêmes (vaccins atténués ou tués) et, pour au moins une vaccination secondaire, l'haptène ou l'oli10 gomère de l'haptène correspondant ou encore l'un et

l'autre dans le cas o l'on envisage plusieurs administrations de rappel.

Parmi les haptènes qui présentent un grand intérêt dans le cadre de l'application selon l'invention 15 on mentionne ceux qui portent un épitope de l'antigène de surface (H Bs) du virus de l'hépatite B On peut se référer par exemple aux peptides décrits dans la demande de brevet européen N 44 710 de la SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION (invention Lerner et coll) On peut 20 également encore mentionner la publication toute récente de John L GERIN et coll (Proc Natl Acad Sci U S A vol 80 pp 2 365 2 369 Avr 1983), en ce qui concerne les peptides éventuellement porteurs d'un épitope caractéristique de l'antigène H Bs On peut également 25 avoir recours au peptide contenant au plus 30 résidus aminoacide et caractérisé en ce qu'il contient la séquence Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val X Pro Leu Ile Pro Gly Ser Y Thr Thr Ser Thr 30 Gly Z X dans laquelle X est cystéyle, aminobutyryle, alanyle ou séryle Y est séryle ou thréonyle et

Z est prolyle ou séryle.

Avantageusement X est un groupe cystéyle.

Les différents représentants de cette classe de peptides peuvent être synthétisés par toute technique en soi connue, par exemple selon la technique décrite par R D MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid Phase peptide synthesis" (Jo Am Chem Soc,45,2 1495 2 154) On citera en outre des peptides synthétiques du genre de ceux décrits par E H B EACHEY et al qui sont susceptibles, lorsque couplés avec un muramyl-peptide, de former des anticorps actifs contre la protéine M de la

surface de Streptococcus pyogenes Cette protéine est désignée 10 plus loin, dans l'exemple II, sous l'abréviation "M 24 ".

On peut également se référer aux séquences peptidiques définies dans le brevet américain n 4 284 537, plus particulièrement celles définies sous les abréviations CB 6 et CB 7 Dans l'exemple II ci-après l'haptène mis en 15 oeuvre est constitué par le peptide S-CB 7, lequel contient également un site antigènique de la protéine M 24 La séquence peptidique de S-CB 7 est la suivante:

Asn-Phe-Ser-Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-LysIle-Lys-Thr-Leu-Glu-Ala-Glu-Lys-AlaAla20 Leu-Ala-Ala-Arg-Lys-Ala-Asp-Leu-Glu-LysAla-Leu-Glu-Gly-Ala-Met.

On peut encore avoir recours à l'un des haptènes suivants: Ala-Ala-LeuAla-Ala-Arg-Lys-Ala-Asp-Leu-Glu-Lys-Gly25 Gly-Glyou Lys-Ala-Asp-Leu-GluLvs-Ala-Leu-Glu-Glv-Ala-Met ou Asn-Phe-Ser-Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-LysIle-LysThr-Leu-Glu-Ala-Glu-Lys-Ala-AlaLeu-Ala-Ala-ArgA titre d'haptènes sacchar 4 diques ou osidiques on mentionnera par exemple lepolysaccharide C du Streptococcus C, l'acide cellobiuronique (Pneumo type III), tel que décrit par W.F GOEBEL, "J Exp Medicine", 1939, p 353-363, ou

l'acide para-aminophényle-cellobiuronique.

Avantageusement la vaccination secondaire est conduite avec des oligomères hydrosolubles des hap5 tènes monomères sus-indiqués.

Sans qu'une telle indication chiffrée puisse être considérée comme limitative, on mentionnera

néanmoins que ces oligomères peuvent éventuellement contenir de 2 à 10 unités monomères.

On peut avoir recours, pour réaliser l'oligomérisation, à toute technique de polymérisation couramment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisation étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère contenant le nombre de motifs monomères requis pour l'acquisition de l'immunogénicité désirée. Une méthode préférée de l'oligomérisation ou de polymérisation du monomère consiste dans la réaction

de celui-ci avec un agent de réticulation tel que le 20 glutaraldéhyde.

On peut également avoir recours à d'autres méthodes d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à cellesmettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par l'intermédiaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine ou d'autres groupes

réactifs, par exemple -SH,en présence d'agents de couplage homo ou hétéro bifonctionnels.

Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la descrip30 tion qui suit d'exemples préférés de mise en oeuvre de l'invention.

Exemple I

Immunisation secondaire avec un peptide contenant un épitope de l'antigène H Bs a) Synthèse du peptide de formule (dit "peptide 99-121 ")

à__ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

Asp Tvr -Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile l 10 Pro GI) Ser Ser Thr Thr Ser lhr Gly Pro Cys La synthèse est réalisée selon la technique en phase solide de Merrifield,au moyen d'un synthétiseur automatisé de type BECKMANN 990 B. La chaîne peptidique est préparée à partir du premier acide aminé C-terminal, fixé de manière covalente sur un polymère de styrène et divinylbenzène (pouvant également être de type polyamide) par une liaison de type ester benzylique (résine chlorométhylée) 10 ou amide (résine benzhydrylamine) Les acides aminés suivants, vers la partie N terminale sont ajoutés successivement par répétition du cycle d'opérations figurant au tableau 1 Les étapes principales en sont: I) Une déprotection du groupe Boc (tertio15 butyloxycarbonyle, utilisé pour protéger les fonctions -aminées) au moyen d'acide trifluoroacétique (TFA) en

solution dans CH 2,C 12.

2) Une neutralisation des fonctions -aminées au moyen de diisopropylamine (D I E A) en 20 solution dans CH 2 C 12 3) Un couplage réalisé par activation des fonctions carboxyliques des acides aminés à introduire au moyen de dicyclohexyl-carbodiimide ou en préparant des esters activés (d'orthonitrophénol, par

exemple) Les différents réactifs de couplage sont ajoutés en excès ( 3 à 6 fois) par rapport à la charge de résine.

En fin de couplage, on vérifie l'absence de fonction amine libre sur la résine au moyen du test à la ninhydrine En cas de réaction positive, le couplage est 30 répété.

Au cours de la synthèse les fonctions réactives portées par les chaînes latérales des aminoacides sont protégées au moyen des groupes figurant au

tableau 2.

En fin de synthèse, le peptide est libéré de la résine et de ses groupes protecteurs par traitement durant 1 heure au moyen d'acide fluorhydrique anhydre

contenant 10 % d'anisole (V/V/).

Seul le groupe acétamidométhyle (acm) 10 protégeant la cystéine reste intact à l'issue de ce traitement.

Le peptide est alors réduit au moyen de dithiothréitol dans un tampon à p H 8,puis purifié par gelfiltration et chromatographie de Partition en phase 15 inversée.

Son identité est contrôlée par analyse d'acides aminés après hydrolyse acide et son homogénéité par chromatographie sur couche mince de silice dans 3

systèmes solvants différents ainsi que par chromatogra20 phie liquide haute pression en phase inverse.

TABLEAU I

Protocole de synthèse Volume pour Nombre Réactif 1 g de résine d'opérations Temps CH 2 C 12 15 ml x 3 2 mn

TFA CH C 1

2 2 13 ml x 1 1 mn

( 4/6)

TFA CH 2 C 12

( 2/3) 13 ml x 1 30 mn

( 2/3)

CH 2 Cl 2 CH 2 c 2 13 ml x 5 2 mn

DIEA CH 2 C 12

( 1/20) 15 ml x 3 2 mn CH Ci 2 15 ml x 5 2 mn

C 2 C 12

couplage 15 ml x 1 90 mn CH Ci 15 ml x 5 2 mn

2 2

Groupes protecteurs des chaînes latérales

15 20

TABLEAU II

Acide aminé Position Groupe protecteur Asp 99 Ester benzylioue T'r I 00 O -dichlorobenzyle Cys I 07 S -acétamidcmnéthyle Ser II 3 II 4 II 7 O benzyle Thr Il S II 6 II 8 O benzyle Cys 121 S p M&hoxybenzvle b) Obtention d'une réponse secondaire par le peptide 99-121 (Tableau I) après immunisation Les souris ( 15) ont reçu par la voie sous-cutanée au jour 1, l'antigène naturel avec Ai(OH)3 utilisé en tant qu'adjuvant Après 1 mois, chaque lot 30 initial est divisé en trois (a) 5 souris ne reçoivent rien, (b) 5 souris reçoivent un rappel d'antigène naturel et

(c) 5 autres l'antigène synthétique.

Les sérums sont recueillis après 8 jours. 35 Les sérums sont titrés par hémagglutina-

tion passive Les chiffres indiquent la plus grande dilution de sérum capable d'agglutiner les globules humains sensibilisés à l'antigène H Bs (Centre National

de Transfusion sanguine).

Les résultats qui figurent dans le tableau III qui suit,font clairement apparaître le pouvoir de "rappel" qu'exerce le peptide synthétique à l'égard de l'immunogénicité sanguine, à la suite de

l'immunisation primaire réalisée avec un antigène H Bs 10 naturel.

TABLEAU III

20 I/munisation Titres anticorps Primaire Secondaire anti-H Bs J 1 J 30 au jour 38 (a) 512 H Bs 1 pg + AL( O H)3 40 pg (b) H Bs 1 g 8192 (c) ( 99121) 100 >g 2048

Exemple II

Vaccination avec un oligomère du peptide

SCB-7 contre des infections à streptocoques.

a) Préparation de l'oligomère mg du susdit peptide dissous dans une solution de bicarbonate de sodium 0,1 M ( 3 ml) sont mélan30 gés avec une solution aqueuse de 250 g de glutaraldéhyde/ litre pour obtenir une concentration finale de 0,1 % en glutaraldéhyde La réaction s'effectue à température ambiante, à l'obscurité et sous agitation On laisse la réaction se poursuivre pendant 3 jours L'oligomère formé 35 est ensuite dialysé contre un tampon approprié, tel que

le PBS.

C'est cet oligomère qui est utilisé dans la séquence de vaccination qui suit Il est désigné sous

l'expression "oligo-SCB-7 ".

b) Immunisation secondaire contre des infections à streptocoques avec SCB7 et l'oligo-SCB. Deux groupes de quatre souris reçoivent au jour 0 et au jour 60 une injection primaire de 10 microgrammes de la protéine M-24 L'un des groupes reçoit ensuite au 10 jour 115, puis au jour 200, les doses indiquées dans le tableau du peptide SCB-7 et de l'oligo SCB-7 Dans tous les cas, l'agent immunogène est administré sous forme d'une solution dans le solvant PBS, en l'absence de tout adjuvant. Les animaux de l'autre groupe reçoivent au jour 115 et au jour 200 la solution de PBS, dépourvue

d'agent immunogène.

Les taux d'anticorps anti-SCB-7 et anti-M-24 respectivement indiqués dans chacun des animaux du groupe 20 effectivement traité sont indiqués dans le tableau IV ciaprès Les moyennes des titres d'anticorps obtenus avec

le groupe témoin sont également indiquées dans le tableau.

Les titres d'anticorps ont été mesurés par une technique dérivée de la méthode ELISA réalisée dans les 25 conditions expérimentales décrites par AUDIBERT, F et

Coll, Proc Natl Acad Sci USA, 79, 5042-5046.

En particulier, des doses de la protéine M-24 et du peptide SCB-7 ont été déposées dans chacun des puits d'une plaque de micro-titrage NUNC, à raison de 0,4 micro30 grammes de protéine 24 et de 2 microgrammes du peptide SCB-7, selon les cas La plaque a été mise en incubation pendant 2 heures 37 C Après 5 lavages avec une solution tampon, les plaques ont été remises à incuber pendant une heure avec un sérum contenant des immunoglobulines de chèvre anti-mouton marquées à la péroxydase Après lavage

poussé des plaques, on a ajouté dans les puits une solution de substrat (O-phénylène-diamine) dans un tampon citrate 5 0,05 M/phosphate, p H 5 ( 50 mg de substrat/100 ml de tampon) et 20 pi d'une solution d'eau oxygénée à 130 volumes. On a laissé la réaction se produire pendant 10 minutes en ce qui concerne

les essais effectués dans les puits dans lesquels avait été déposée la protéine M-24 et pendant

7 minutes en ce qui concerne ceux des puits dans lesquels avait été déposé le peptide SCB-7 Les réactions ont été interrompues par addition d'acide sulfurique à 12,5 %.

Les absorbances d'une radiation à 492 nm ont ensuite été lues dans un lecteur ELISA du type 'Titerteck multiskan", 15 commercialisé par "Flow Laboratories" Des essais semblables ont été réalisés avec un sérum de souris normal à

titre de témoin négatif.

Les titres en anticorps mesurés au jour 100,

c'est-à-dire avant la première des injections secondaires 20 sont très faibles, comme il résulte du tableau IV.

Au contraire, on observe au jour 225, donc apresla deuxième injection secondaire de l'oligo SCB-7,des réponses immunogènes toutes significatives à l'égard tant du peptide SCB-7 que de l'oligo SCB-7 Ces résultats sont 25 naturellement à rapprocher de ceux obtenus dans les animaux témoins, dont les titres moyens mesurés au jour 225

ont également été indiqués dans le tableau.

Ces résultats sont particulièrement intéressants, dans la mesure o ils ont été obtenus par administration des 30 antigènes au sein d'une solution saline en l'absence de

tout adjuvant Ils permettent en outre d'envisager la vaccination efficace de l'homme contre des infections à streptocoques directement avec l'oligopeptide, dans la mesure o dans la plupart des cas les patients humains concernés ne 35 sont en général plus naïfs du point de vue immunitaire.

Dans la plupart des cas, ils ont soit déjà subi une vaccination, soit déjà été exposés à une infection aux streptocoques.

TABLEAU IV

Immunisation Titres anticorps Primaire Secondaire(l) Secondaire( 2) au jour 125 au jour 225 J O et J 60 J 115 J 200 Anti-SCB-7 Anti M-24 AntiSCB-7 Anti-M-24 o M-24 SCB-7 Oligo SCB-7 M-24 ( 10 pg) SCB-7 ( 50 Pg) Oligo SCB-7 ( 50 ig) < 160 < 160 45 000 37 000

< 160 < 160 40 000 35 000

< 160 < 160 8 000 3 800

< 160 < 160 4 500 2 000

M-24 ( 10 lg) < 160 < 160 < 200 < 200 ut o 4 > Les anticorps obtenus après rappel par l'oligo SCB-7 sont protecteurs; ceci a été montré dans le test

d'opsonophagocytose décrit par BEACHEY et Coll,JEM, 1979, 150, 862) Les sérums expérimentaux ont permis la phagocy5 tose des streptocoques de type homologue par les neutrophyles humains.

Les oligopeptides portant un site antigénique de la protéine M-24 (ou le site antigénique contenu dans SCB-7) paraissent d'autant plus favorables qu'ils parais10 sent en outre dépourvus des effets secondaires susceptibles d'être induits chez les sujets traités par la protéine M-24, surtout lorsque celle-ci est utilisée en immunisation secondaire Ces effets secondaires sont susceptibles de se manifester sous la forme d'une pathologie cardiaque En 15 particulier, des sérums provenant des animaux traités comme il a été indiqué plus haut ne réagissent pas avec des sections de coeur humain dans le test d'histo-immunofluorescence décrit par BEACHEY et Coll, J Exp Med,

Ed 1977, 145, page 1469.

D'une façon générale, l'invention concerne donc toute composition pharmaceutique conditionnée dans les conditions sus-définies (ou tout nécessaire ou "kit" la contenant), plus particulièrement caractérisée en ce que le principe immunogène est constitué par un peptide contenant, d'une part, au plus 35 acides aminés et, d'autre part, le site antigénique caractéristique de SCB-7 I 1 va de soi que certains des acides aminés contenus dans les séquences concernées peuvent être substitués par d'autres, dans la mesure o ces substitutions n'entraînent pas d'altération 30 significative de la nature immunogénique du principe actif, c'est-à-dire de sa capacité à réimmuniser un sujet qui avait auparavant déjà été exposé à des streptocoques Par exemple, chaque acide aminé peut être remplacé par des acides

aminés isofonctionnels ou isostériques.

EXIEMPLE III

Vaccinations avec un oligomère de l'acide cellobiuronique contre les infections à pneumocoques.

L'acide cellobiuronique est un dissacharide 5 qui représente l'élément de base du polysaccharide spécifique du pneumocoque de type III L'oligomère a été préparé à partir de l'acide para-aminophényl cellobiuronique (PAP-Bcellobiuronide). Le PAP-a-cellobiuronide (PM d'environ 450) 10 a été dissous dans du bicarbonate O,1 M ( 1 mg/ml de solution de bicarbonate) On a ajouté à la solution 2 p 1 de glutaraldéhyde à 25 % et on a laissé 24 heures sous

agitation à la température du laboratoire 4 pil de glutaraldéhyde ont encore été ajoutés 48 heures plus tard et le 15 p H a été ajusté à 7 par HC 1.

Comme dans les cas précédents, il a été constaté,dans des essais d'immunisation effectués sur des souris Swiss, que l'administration de l'oligomère

ainsi obtenu,en immunisation secondaire,(chez des souris 20 qui avaient subi une immunisation primaire avec le polysaccharide naturel spécifique du pneumocoque III) a nrovoque un eitet de rappel important de la protection antérieurement acquise contre le pneumocoque III.

D'une façon générale, l'invention concerne 25 par conséquent des compositions pharmaceutiques conditionnées dans les conditions susindiquées,avantageusement constituées par des solutions, suspensions ou liposomes injectables, contenant une dose efficace d'au moins un peptide synthétique vaccinant, ou de préférence d'un 30 oligomère de ce peptide De préférence, ces solutions, suspensions ou formesliposome sont réalisées dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée De préférence, les doses unitaires sont de

l'ordre de 50 pg à 5 mg, avantageusement de 100 pg à 1 mg.

L'invention concerne plus particulièrement de

telles suspensions, solutions ou formes liposome conditionnées pour l'usage en immunisation secondaire et aptes à être administrées par injections intradermiques, intra5 musculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarification.

Elle concerne également des compositions pharmaceutiques ainsi conditionnées administrables par voie orale. En conséquence, elle concerne des compositions 10 pharmaceutiques dans lesquelles le peptide et/ou l'oligomère est associé à des excipients solides pharmaceutiquement acceptables, ou liquides, adaptés à la constitution

de formes orales.

Avantageusement, les compositions vaccinales se15 lon l'invention contiennent en outre un véhicule, tel que la polyvinyl-pyrrolidone, facilitant l'administration du vaccin A la place de la polyvinylpyrrolidone, on peut utiliser tout autre type d'adjuvant au sens classique que l'on donnait autrefois à cette expression, c'est-à-dire 20 d'une substance permettant l'absorption plus aisée d'un médicament ou facilitant son action dans l'organisme A titre d'exemples d'autres adjuvants de ce dernier type,

on mentionnera encore la carboxyméthylcellulose, les hydroxydes et phosphates d'aluminium ou tous autres adju25 vants de ce type, bien connus de l'homme de l'art.

I 1 va naturellement également de soi que les doses qui ont été également indiquées ci-dessus à titre d'exemple peuvent être utilisées dans les nécessaires ou "kits" dont

il a été question plus haut.

Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés; elle en embrasse au

contraire toutes les variantes.

Claims (1)

REVENDICATIONS 1 Composition de vaccin contre un agent pathogène déterminé, contenant un haptène synthétique possédant lui-même un site antigènique caractéristique dudit agent pathogène ou un oligomère de cet haptène, caractérisée en ce qu'elle 5 est conditionnée à un dosage d'haptène propre à réimmuniser un sujet inimunitairement non naïf contre ledit agent pathogène, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable. 2 Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est conditionnée pour une vaccination de rappel contre le susdit agent pathogène. 3 Composition selon la revendication 1, ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est dépourvue de tout adjuvant immunologique. 4 Composition selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'haptène synthétique consiste en un peptide portant un site antigénique de l'antigène H Bs. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le peptide présente la formule 20 Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val X ProLeu Ile -Prq Gly Ser Y Thr Thr Ser ThrGly Z X dans laquelle X est cystéyle, aminobutyryle, alanyle ou séryle 25 Y est séryle ou thréonyle et Z est prolyle ou séryle. 6 Composition selon l'une quelconque des revendications i à 3,caractérisée en ce que l'haptène est constitué par un peptide comportant au plus 35 30 résidus aminoacide et contenant un site antigénique de la protéine M de Streptococcus Pyogenes. 7 Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que l'haptène contient un site antigènique de souche pathogène de pneumocoque. 8 Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'haptène est constitué par un oligomère de l'acide p-aminophényl cellobiuronique. 9 Composition, notamment sous forme de nécessaire ou "kit" pour une vaccination contre un agent pathogène'determiné, comprenant, en combinaison: une dose d'un vaccin naturel contre ledit agent pathogène, pour une première injection ou injection primaire, au moins une dose pour au mojns une vaccination de rappel, d'un haptène contenant un site antigénique caractéristique dudit vaccin naturel ou agent pathogène,ou 15 d'un oligomère de cet haptène. Composition, notamment sous forme de nécessaire ou "kit" pour au moins une vaccination contre un agent pathogène déterminé contenant, en combinaison, au moins une dose pour au moins une vaccination de rappel d'un haptène contenant un site antigénique caractéristique de l'agent pathogène déterminé susdit, ou caractristique-du vaccin naturel actif contre cet agent pathogène, des moyens de prélèvement d'un échantillon de sang ou 25 de sérum du sujet à vacciner, les éléments ou réactifs ou les deux à la fois, nécessaires à la réalisation sur cet échantillon de sang ou de sérum, d'un diagnostic in vitro de vérification de la non-nalveté immunitaire du sujet à vacciner à l'égard 30 dudit agent pathogène. 11 Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que les éléments et réactifs nécessaires à la réalisation sur l'échantillon de sang ou de sérum du sujet à vacciner, comprennent une microplaque et les 35 réactifs nécessaires à la réalisation de titrages comparatifs des taux d'anticorps respectivement contenus dans l'échantillon de sang ou de sérum du sujet à vacciner et dans un échantillon de sang ou sérum témoin provenant d'un sujet nalf sur le plan immunitaire, à l'égard de l'agent pathogène en question,, lesdits titrages d'anti5 corps étant effectués contre ledit agent pathogène ou contre le vaccin naturel correspondant. 12 Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le dosage d'haptène est de l'ordre de 50 microgrammes à 5 milligrammes, de préférence de 100 microgrammes à

1 milligramme, ladite composition étant destinée à l'administration par la voie orale.

Compositions de vaccins conditionnées pour la vaccination de sujets immunitairement non naifs contre un agent pathogène déterminé et contenant un haptène comportant luimême un site antigénique caractéristique dudit agent pathogène ou un oligomère de cet haptène.

ABREGE

L'invention concerne une composition de vaccin contre un agent pathogène déterminé, contenant un haptène synthétique possédant lui-même un site antigénique caractéristique dudit agent pathogène ou un oligomère de cet haptène Elle est conditionnée à un dosage d'haptène propre à réimmuniser un sujet immunitairement non naïf contre ledit agent pathogène, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.

(pas de dessin)