FR2538701A1 - Preparation a activite collagenolytique ayant une activite elevee et compositions pharmaceutiques la contenant - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE COMPOSITION PHARMACEUTIQUE CONTENANT EN ASSOCIATION AVEC UN VEHICULE PHARMACEUTIQUE UNE COLLAGENASE DE HAUTE ACTIVITE SPECIFIQUE ET SUSCEPTIBLE D'ETRE INHIBEE AU MOINS PARTIELLEMENT PAR LA MYOSINE. ELLE EST UTILISABLE POUR LE TRAITEMENT DE PATHOLOGIES SE MANIFESTANT PAR UNE ALTERATION INCONTROLEE DES STRUCTURES RICHES EN COLLAGENE CHEZ L'HOMME OU L'ANIMAL.

Description

PREPARATION A ACTIVITE COLLAGENOLYTIQUE AYANT UNE ACTIVITE
ELEVEE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA CONTENANT.

L'invention est relative à une préparation à activité collagénolytique, plus particulièrement à des com positions -pharmaceutiques renfermant cette préparation, en association avec un véhicule pharmaceutique, notamment pour l'utilisation dans le traitement de pathologies se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène, chez 1 homme ou 11 animal.

Plusieurs types de micro-organismes producteurs d'une enzyme collagénolytique ou "collagénase" ont déjà été décrits dans la littérature. I1 est cependant souvent difficile de controler les teneurs de ces préparations en constituants actifs, ces préparations pouvant d'ailleurs n'etre pas exemptes dsun certain nombre de constituants toxiques, par exemple des neurotoxines qui les rendent impropres à l'usage dans des compositions à destination pharmaceutique.

L'invention a pour but de fournir une composition pharmaceutique permettant une détersion enzymatique sélective à l'égard de structures collagéniques pathogènes, lorsqu'elle est appliquée à des lésions se manifestant par une altération incontrôlée de collagène. Elle a encore pour but la réalisation de compositions dans lesquelles les proportionsrelatives des principaux constituants de la préparation collagénolytique sont équilibrées selon des proportions prédéterminées en fonction de la qualité du résultat thérapeutique recherché.

La composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée par une dose efficace d'une collagénase de haute activité spécifique reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle
X est un résidu d'acide aminé naturel lié à l'extrémité
N-terminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-glycyl et en ce quten outre elle est inhibée au moins partiellement par la myosine.

Une collagénase préférée entrant dans la composition pharmaceutique selon l'invention est constituée par celle qui peut être obtenue à partir de cultures de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, dont les caractéristiques taxonomiques principales seront rappelées plus loin, ou de tous micro-organismes dérivés de celui-ci ou capables comme celui-ci de produire une telle collagénase.Plus généralement encore font partie des collagénases susceptibles d'être mises en oeuvre dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, celles qui sont capables de réagir avec des anticorps sélectifs préparés contre la collagénase dite "collagénase d!Achromobacter" répertoriée sous le nO EC. 3.4.24.8 dans Enzyme Nomenclature
Edition IUPAC-IUB (1978). Cette collagénase est obtenue à partir de la souche de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus qui a été déposée à la Collection Nationale de
Culture de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M.) sous le nO 1-029.

Cette collagénase se distingue d'autres collagénases connues par sa haute activité spécifique. Celle-ci peut atteindre 2 unités microkatal/mg (ukat/mg) de protéine. Elle a été décrite, par exemple, dans l'article intitulé "Subunit structure of Achromobacter Collagenase", de V. KEIL-DLOUHA et B. KEIL, paru dans Biochim. Biophys.

Acta 522, 218-228 (1978).

On pourra encore se référer, en ce qui concerne la caractérisation chimique de cette enzyme ainsi que du micro-organisme producteur, aux articles intitulés "Chemicål characterization and study of the autodigestio of pure collagenase from Achromobacter iophagus" de
Vera KEIL-DLOUHA, paru dans Biochimica et Biophysica Acta, 429 (1976) 239-251, et somme newly characterized collagenases from procaryotes and lower eucaryotes de Borivoj
KEIL, paru dans Molecular & Cellular Biochemistry,
January 26, 1979, volume 23, nr. 2.

L'invention concerne plus particulièrement des compositions pharmaceutiques contenant des doses exprimées par l'activité de la collagénase, rapportées au poids total de la composition, au moins égales - à O,05 pkat/g de la composition pharma
ceutique pour les émulsions, pommades, poudres ou toutes
compositions non vraiment liquides, au sens habituelle
ment donné à cette expression, et - à 0,05 pkat/ml de la composition pharmaceutique pour les
solutions constituées en vue de l'usage topique.

Des pommades préférées selon l'invention contiennent notamment de 0,1 à 2, de préférence de 0,5 à 1 ukat de collagénase par gramme de pommade.

Des solutions pour applications topiques préSé- rées conformes à l'invention contiennent de 0,1 à 2, de préférence 0,5 S 1 ukat de collagénase par ml de solution.

Des compositions avantageuses selon l'invention contiennent en outre, d'une part, des protéases neutres et, d'autre part, des endonucléases
De préférence, les proportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0n350 ukat de collagénase ne dépassent pas 200 unités caséinolytiques pour les protéases et 500 unités nucléasiques pour les endonucléases.

Des compositions appropriées à la mise en oeuvre de l'invention contiennent les trois types de constituants, de préférence dans des proportions relatives correspondant - à au moins 0,350 kat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de
leur teneur en protéases neutres et - à 30 à 500 unités nucléasiques, en ce qui concerne les
endonucléases.

Dans des compositions davantage préférees encore, les proportions relatives les unes vis-à-vis des autres des susdits constituants correspondent respectivement à des ac- tivités - d'au moins 0,350 ukat en ce qui concerne la collagénase, - de 20 à 50 unités caséinolytiques en ce qui concerne les
protéases neutres et - de 30 à 60 unités nucléasiques, en ce qui concerne les
endonucléases.

L'utilisation des compositions selon l'invention dans le traitement de lésions du genre sus-indiqué (par exemple des brûlures, ulcères, escarres, escarres dures ou blanches à base de collagène, chéloïdes, telles que celles produites après des interventions chirurgieales) se révèle particulièrement bénéfique.

Dans son action thérapeutique, la composition selon l'invention, ci-après dénommée "Achromase1,, décompose préférentiellement le collagène du tissu conjonctif. Elle ne s'attaque pas à la masse musculaire, en particulier aux myofibrilles des muscles, son composé collagénolytique étant inhibé par la myosine du muscle.

Simultanément, l'action de ltAchromase est caractérisée par la production, à partir de substrats macromolécu laires de la nécrose, de fragments qui ont une action chémotactique sur les éléments du sang ; c'est par cette action chémotactique qu'en particulier les macrophages et les leucocytes s'accumulent à la périphérie de la zone d'action de l'Achromase. Cette accumulation des éléments du sang est favorable au processus de régénération tissulaire (par exemple, dans les ulcères, dans les tissus endommagés par des brûlures).

Une autre caractéristique de l'action de l'Achromase à l'égard de tissus altérés à caractère nécrotique est qu'elle s'arrete au niveau des tissus vivants. L'action de l'Achromase s'arrête après avoir décomposé les tissus morts à la limite des tissus vivants. Elle ne provoque pas, par l'action de ses composés protéolytiques,de lésions du tissu vivant.Ces effets se produisent particulièrement grâce aux systèmes d'inhibition qui existent dans les tissus vivants, notamment aux trois systèmes mettant en jeu 10) des inhibiteurs de la collagénase de nature polypep
tidique, présents dans le tissu non endommagé, 20) la myosine présente dans les tissus musculaires, et 30) des inhibiteurs non spécifiques de la collagénase et
des protéases, en particulier de la a2-macroglobu-
line, présents dans la cireulation sanguine.

Il est à cet égard important de souligner que pour etre efficaces les compositions pharmaceutiques doivent avoir une activité collaténolytique élevee, présentant notamment les ordres de grandeurs qui ont été indiqués plus haut. Il s'est en fait avéré que, contrairement à ce que l'on pouvait craindre, la sélectivité de l'action de la préparation collagénolytique de l'invention à l'égard des seuls tissus nécrosés ou, d'une façon plus générale, de tout tissu non saint n'était pas affectee même à des doses élevées de collagénase. En effet les barrières naturelles que présentent les tissus sains contre l'action de la collagénase ou les régulateurs de l'activité de celle-ci qu ils contiennent se révèlent parfaitement efficaces contre ce qui pouvait a priori être considéré comme un "surdosage" de l'enzyme.

Les protéases neutres, qui forment le second constituant actif de l'Achromase, complètent l'action de la collagénase en dégradant davantage encore les fragments du substrat moléculaire collagénolytique initial. Lorsque la préparation mise en oeuvre dans la composition-pharmaceutique selon l'invention est originaire de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus, lesdites protéases sont dépourvues de constituants indésirables.

Enfin le troisième constituant-de l'Achromase, essentiellement formé d'endonucléases, contribue à la destruction de 11 AD susceptible d'être libéré par les cellules à ltoccasion du processus infectieux, donc du pus dont l'ADN libéré forme une partie importante.

La- composition pharmaceutique selon l'invention joue donc un rôle essentiel au niveau de la destruction des déchets tissulaires qui tendent à s'accumuler dans la région des lésions du genre en question, cette destruction (détersion) devant nécessairement précéder le début de la cicatrisation naturelle ou induite, par exemple par greffe.

L'invention concerne encore un procédé de production d'une préparation active conforme à l'invention, contenant plus particulièrement les trois types de constituants qui ont été envisagés ci-dessus. Ce procédé met plus parti culièrement en oeuvre la bactérie aérobie Vibrio alginolXti- cus chemovar iophagus.Ce procédé consiste à cultiver ce micro-organisme dans des conditions en soi connues et à induire également de façon en soi connue la production de collagénase par l'addition au milieu de culture dgun inducteur approprié, plus particulièrement de collagène ou de fragments de collagène ayant un poids moléculaire encore suffisant pour former une structure secondaire caractéris tique des chaînes hélicodales de collagène, à poursuivre cette culture jusqu'après induction dans le milieu de culture d'une production desdites protéases neutres, la culture pouvant être interrompue quand les proportions relatives de collagénase et de protéinase ont atteint des valeurs désirées comprises dans les intervalles respectifs susindiqués, la préparation active pouvant ensuite être récupérée par des techniques en soi connues à partir du milieu de culture. En particulier, on peut, après élimination des cellules, précipiter les protéines hors du surnageant avec une concentration suffisante de sulfate d'ammonium pouvant par exemple atteindre 60 % du taux de saturation en ce sel de la solution. Le précipite remis en suspension peut être dialysé contre de l'eau distillée pour éliminer les ions entraînés au cours de la précipitation, avant d'être finalement lyophilisé. En variante, le principe actif peut être purifié par ultrafiltration.

Pour doser les différents constituants de la composition, on peut avoir recours aux techniques décrites ci-après qui mettent en oeuvre les substrats, les réactifs et les méthodes de calcul également mentionnés ci auprès.

I DOSAGE DE LA.COLIAGENASE (Wünsch E. et Heidrich H. G.

(1963) Z. für Physiol. Chem 333, 149-151)
SUBSTRAT
Le substrat utilisé est du 4-phénylazo-benzyloxy- carbonyl-L-Pro-Leu-Gly-L-Pro-D-Arg. HCl (PZ-PLGPR)-, commercialisé par la Société Flua.

REACTIFS
Les réactifs mis en oeuvre sont les suivants
A. Tampon
le tampon est constitué à partir des trois solutions suivantes
- solution Al : effectuée à l'aide de 160 mM de véronal (sel de sodium de l'acide 5,5-diéthylbarbiturique) et 143 mM d'acétate de sodium, 3 H20
- solution A2 : HCl 1N
- solution A3 : WaCl à 8,5 % le tampon est obtenu en mélangeant 200 ml de solution Al avec 80 ml de solution A3, et en ajustant le pH à 8,5 avec la solution A2 ; on complète à 1 1 en ajoutant de l'eau et on additionne CaCl2, 2 H20 pour obtenir une concentration finale de 4 mM.-
B. Solution de substrat
elle est obtenue en dissolvant 10 mg de PZ
PLGPR dans 100 l de méthanol ; on ajoute du tampon pour compléter à 10 ml et la solution de substrat ainsi obtenue reste stable une semaine.

C. Echantillon de collagénase
l'échantillon de collagénase est obtenu en conservant 1 mg de solution dans 1 ml de tampon ; à laide d'échantillons d'activité spécifique inconnue, on dilue selon les lectures préliminaires ; les dilutions optimales doivent donner les valeurs colorimétriques de la densité optique à 320 nm (voir ci-dessous) dans la gamme de 0,1
à 1,0.

D. Acide citrique
il s'agit d'une solution à 0,5 % dans l'eau.

E. Acétate d'éthyle.

TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit
1 on préchauffe la solution B à 37 c
2 on mélange 0,1 ml de solution de collagénase
(correctement diluee) avec 0,4 ml de solution B préchauffée et on laisse incuber pendant 15 mn à 37 C
3 on additionne 1 ml de solution D et on mélange
40 on additionne 5 ml d'acétate d'éthyle et on mélange vigoureusement
5 on enlève ensuite la couche organique supérieure et on sèche en additionnant Na2SO4 anhydre
60 on mesure la densité optique à 320 nm par rapport à celle d'un témoin obtenu dans les mêmes conditions que l'échantillon étudié, selon la procédure indiquée sous les points 1 à 5, si ce n'est qu'on utilise du tampon à la place du substrat (solution B).

METHODE DE CALCUL 1 unité Wünsch-Heidrich = densité optique a 320 nm (relative à 0,1 ml d'échantillon)
0,044
Activité spécifique de l'échantillon exprimée en katals = 0,2525 x densité optique à 320 nm en nkat/mg
mg 1,0 kat = 90 000 unités de WH
Le coefficient est déduit de la courbe d'étalonnates obtenue avec le produit qui découpe le peptide (PZ
Pro-Leu) (composé B commercialisé par Fluka).

Il DOSAGE DES PROTEASES (Laskowski M. (1955) Methods in enzymology II, 32 ; Kunitz M. (1947) J. Gen. Physiol. 30, 291)
SUBSTRAT
Le substrat utilisé est de la caséine pour usage biochimique (commercialisé par Merck, sous le n 2 244).

REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants
- solution A
elle est constituée par
Aa : acide borique 0,2 M (12,4 gal 000 ml)
Ab : borax 0,05 M (19,05 g/l 000 ml) pour obtenir la solution A, on ajuste 100 ml de solution Aa à pH 7,6 à l'aide de solution Ab (environ 4 ml)
- solution B
-on met en suspension 1 g de caséine dans 100 ml de solution A ; on chauffe dans un bain d'eau à 100 c jus qu'a' dissolution totale (environ 15 mn) ; la solution opalescente ainsi obtenue peut être conservée pendant une semaine à 4 C
- solution C
acide trichîoroacétique à 5 S dans l'eau.

ECHANTILLON DE PROTEINASE
La dilution des échantillons contenant la protéinase doit être ajustée selon le dosage préliminaire jusqu'à un équivalent de 2-10 g de trypsine/mî.

TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit
1 on prépare les tubes (tubes de plastique
Vidal 11 x 70), en nombre correspondant au double du nombre d'échantillons, afin qu'à chaque échantillon corresponde son propre témoin
2 on fait pré-incuber 0,5 ml de solution B dans chaque tube, pendant 5 mn, à 37 C ;
3 à chaque tube d'échantillon", on ajoute 0,5 ml d'échantillon ; on fait incuber 20 mn à 37 C sous agitation ; on additionne 1,5 ml de solution C
4 à chaque tube témoin, on additionne 1,5 ml de solution C ; on fait incuber 5 mn à 37 C et on ajoute 5 ml d'échantillon
5 on laisse tous les tubes à 4 C, toute la nuit
6 on centrifuge pendant 10 mn à 8 000 tr/mn à température ambiante
7 on lit la densité optique à 280 (DO280) du surnageant de l'échantillon vis-à-vís du témoin correspondant.

CALCUL
1 Courbe d'étalonnages
on dilue une solution stockée de trypsine pure (0,1 mg/ml d'HCl 10- M) pour obtenir des concentrations finales de 1,2,4,6,8 pg de trypsine par ml ; on effectue ensuite les étapes 1 à 7 mentionnées dans le paragraphe précédent.

2 Une unité d'activité correspond à 1 g de trypsine ; une unité d'activité spécifique correspond à 1 psg de trypsine par mg de protéine.

III DOSAGE DE LA DEOXYRIBONUCLEASE (Kunitz M. (1950) J
Gen. Physiol. 33,349-363)
REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants
- déoxyribonucléase I (commercialisée par
BOEHRINGER) de qualité II (2 000 U/mg)
- acide déoxyribonucléique (commercialisée par
BOEHRINGER) à 3 ml/10 mg.

TAMPON
Le tampon est constitué. comme suit 100 mM de Tris. HCl ; 4 mM de MgSO4; 7 H20 ; 1,8 mM de
CaCl2. 2 H2O ; on ajuste à pH 7,5 avec de l'acide chlorhydrique.

SOLUTIONS
- Enzyme standard : on dissout 1 mg de déoxyribonucléase I dans 1 ml de tampon.

- Substrat : on dilue 150 l dans 50 ml de tampon.

TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit:
1 on ajuste au 0 l'absorbance à 260 nm de 3 ml de solution de substrat
2 on ajoute 100 pl de l'enzyme standard et on mélange
3 on enregistre la variation d'absorbance pendant 10 mn
4 on détermine le rapport #A260 (variation d'absorbance à 260 nm)/mn
5 on recommence les étapes 1 à 4 avec une solution de substrat frais et un échantillon d'enzyme inconnu et on détermine la valeur #A260/mn.

CALCUL mg/ml = densité optique à 280 mn (DO280) x 0,9
Unités par mg de protéine = ##### # # ### # #
IV DOSAGE DES PROTEINES (Lowry H. O., Roseborough N. J. et
Randall R. J. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265)
REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants
- solution A : NaCO3 à 2 % dans NAOH 0,1 M
- solution B : Na à 2 %, tartrate de potassium
- solution C : CuSO4 à 1 %
- solution D : 1 ml de solution B + 1 mi de solution C ; on dilue à 100 ml avec la solution A
- solution E : réactif de foline dilué à 1/1.

COURBE D'ETALONNAGES
1 On prépare la solution de protéine de référence de 1 mg de sérum albumine bovine (BSA, commercialisée par Sigma) dans 2 m dieau
2 on prépare une série de dilutions de solution de référence de 10 à 80 l à un volume final de 400 l dans l'eau ;
3 on ajoute 2 ml de solution D, on mélange et on laisse 10 mn à la température du laboratoire
on additionne 200 l de solution E ; on laisse incuber à l'obscurité à 50 C pendant 10 mn
5 on lit la densité optique à 750 nM vis-à-vis du témoin (eau au lieu de la solution de BSA utilisée dans l'étape 2") ; on construit ainsi la courbe d'étalonnages.

DOSAGE
On traite l'échantillon inconnu à différentes dilutions (volume final 400 ri, étape 2").

CALCULS
On exprime le contenu protéique de l'échantillon inconnu comme équivalent en poids de sérum albumine bovine (BSA) de référence.

D'autres caractéristiques de l'invention appa raîtront encore au cours de la description qui suit des conditions de culture de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus. Référence sera falte aux figures dans lesquelles - la fig. 1 contient des courbes représentatives des con
centrations relatives de différentes enzymes dont les
productions sont induites à l'occasion de la culture de
la susdite bactérie en fonction du temps 3 - la fig. 2 comprend des courbes comparatives visant à
mettre en évidence le caractère inhibiteur de la myosine
vis-à-vis de la collagénase.

La souche Vibrio alginolyticus chemovar iophagus (I-029) est aérobie - anaérobie facultatif - et se présente sous forme de bâtonnets gram négatif de 2-2,5 pm de long et de 1-1,5 vm de large, mobiles au moyen de flagelles polaires simples. Elle forme des colonies rondés et jaunes de 2-3 mm de diamètre, après incubation à 300C pendant une nuit sur un milieu de thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS).

Elle présente une réponse positive dans les tests suivants : oxydase de cytochrome, réaction de Voges
Proskauer, production d'indole, décarboxylase de lysine, gélatinase (test de pellicule), estérase de imagent mouillant commercialisé sous la désignation TWEEN 80, réductase de tétrathionate, réduction de nitrate, production d'acide à partir de glucose, maltose, mannitol, sucrose, tréhalose, mannose et glycérol, utilisation de citrate (Simmons).

Elle est sensible à l'action des antibiotiques aminoglycosidiques, au chloramphénicol, aux tétracyclines, à la colistine, à la rifampicine, aux sulfonamides, à l'acide nalixide, à la nitrofurantoîne et à l'agent vibriostatique 0/129 dans le test du disque, mais elle résiste à la tri- méthoprime.

Elle donne une réponse négative dans les tests suivants : réaction au rouge de méthyle, dihydrolase d'arginine, uréase, phénylalanine déaminase, test ONPG, production d'H2S (agar fer Kligler), production de gaz de glucose, production d'acide à partir de glose, d'arabinose, d'adonitol, de rhamnose, de sorbose, de sorbitol, de dulcitol, de lactose, d'inositol, de salicine, de raffinose, de mellibiose, d'a-méthylglucoside, de mucate.

Elle n'utilise pas le malonate.

La souche I-029 est très halophile avec une croissance optimale qui se produit dans du chlorure de sodium à 13 % et une tolérance apparente au chlorure de sodium à 15 %. Elle est également pleinement résistante a l'am- picilline, à la carbénicilline, en partie à la céphalotine. Elle présente des réactions positives dans les tests à la décarboxylase ornithine et dans les tests de fermentation de cellobiose.

CONDITIONS DE CULTURE
Les cellules sont cultivées sous agitation et aération forcée (1,4 atmosphères) à 300C dans un milieu contenant Tris.HCl 0,1 M, NaCl 034 M, 2 mM de CaCl2, à pH 7, contenant soit des acides casaminés à 2,5 % (DiSco
Labs., Detroit, Mich.). Deux heures après le début de la culture, on ajoute au milieu la composition commercialisée sous la désignation ASF (fragments de peptide de collagène de peau de veau ; poids moléculaire moyen 7000,
ROUSSELOT S.A., France) pour obtenir une eoncentration de 1,5 % en poids. Pour es contrôles de croissance, la turbidité est mesurée par lvabsorbance par cm 1 600 nm dans des échantillons extraits à une heure d t intervalle.

PRODUCTION DE COLLAGENASE, DE PROTEINASE ET DE NUCLEASE
La souche produit de la protéinase caséinoly- tique de la nucléase extra-cellulaire et, dès que ltASF- a été ajouté, de la collagénase. Le niveau d'activité de la collagénase stélève alors jusquBà atteindre 60 nkat/ml.

Les courbes de la fig 1 sont représentatives en ce qui concerne - la courbe a, de la croissance cellulaire, - la courbe b, de l'activité de-la collagénase, - la courbe c, de l'activité de la protéinase caséino
lytique et - la courbe d, de l'activité de la nucléase, en fonction du temps.

La culture est de préférence interrompue, lorsque l'activité de la collaténase passe par un maximum-, notamment au bout de 5 heures dans le cas représenté.

La collagénase est concentrée et récupérée à partir de ce milieu. Elle peut être davantage purifiée comme -décrit dans les ouvrages de KEIL-DLOUHA, V. 19769 "Chemical characterization and study of the autodigestion of pure collagenase from Achromobacter iophagus,
Biochem. Biophys. Acta, 429, 239-305 et de LECROISEY A., V. KEIL DLOUHA, D.R..WOODS, D. PERRIN et B. KEIL, 1975, "Purification, stability and inhibition of the collagenase from Achromobacter iophagus, FEBS Letters 59, 167-172.

Une préparation type diAchromase contient 0,312 mg de protéine (poids sec) par mg du produit total. Elle se caractérise par les activités relatives suivantes, par mg de poids sec de protéine - collagénase : 0,54 kat - protéases : 145 unités caséinolytiques - endonucléases : 477 unités nucléasiques
Les préparations de collagénase obtenues pré- sentent, outre leur activité collagénolytique susindiquée, la caractéristique d'être inhibées par la myosine, laquelle joue le rôle d'un inhibiteur non compétitif pour la collagénase. Cette propriété peut être mise en oeuvre en ayant recours à la technique mettant en jeu l'étude cinétique de l'effet de la myosine sur l'ac- tivité de la collagénase vis-à-vis du collagène.

La dégradation du collagène par la collagénase est suivie par le dosage de l'hydroxyproline libérée après hydrolyse des fragments de collagène solubilisés par la digestion.

L?hydroxyprolne étant un acide aminé spécifique du collagène, les autres protéines contenues dans le mélange réactionnel n'interfèrent pas lors du dosage.

Le mélange ci-dessous est incubé au sein d'un tampon Tris, HCl 0,02 M, NaCl 0,23 M, CaCl2 5.10- M, pH 7,4 pendant une heure à 370C collagène musculaire en fibre de 5 à 30 mg, - collagénase à 0,1 mg/ml dans du CaCl2 10 4 1 mî, - tampon d'incubation ou - suspension de myosine à 5 mg/ml dans ce même tampon
5 ml.

Après incubation, le mélange réactionnel est centrifugé 5 minutes à 12.000 g. 0,5 ml de surnageant sont hydrolysés une nuit à 110 C avec 0,5 ml d'HCl 12 N. Les échantillons sont ensuite évaporés sous vide et repris par un volume d'eau tel que le dosage de l'hydroxyproline soit rendu possible.

Le résultat d'un tel essai avec une collagénase titrant 0,098 pkat/ml est illustré par les courbes de la fig. 2, dans laquelle la courbe e est représentative des variations du rapport 1/v (v représentant le nombre de moles de collagène digérés par heure à 370 C) en fonction du rapport 1/s (s représentant le nombre de molesde collagène mis en oeuvre), mis en présence de la cqllagénase, en l'absence de myosine (interprétation selon
LINWEAVER BURK).

La courbe f est représentative de l'évolution de la digestion des mêmes préparations respectivement en présence de 5 mg de myosine.

L'examen de ces courbes fait apparaître les effets.très significatifs de l'inhibition de l'activité des préparations de collagénase considérés vis-à-vis du collagène.

La collagénase mise en oeuvre selon l'invention est dépourvue de toute toxicité. Ceci peut etre montré par l'étude des doses léthales effectuée sur la souris selon la méthode de J.T . LICHTFIELD et F.W. WILCOXON.

Les DL-50 mesurées avec une préparation injectée par voie intraveineuse à activité collagénolytique selon l'invention, titrant 0,17 pkat/mg de protéine, ont été les suivantes - 8,58 mg par kg de souris, ce qui correspond à - 1,46 ukat par kg de souris, lorsque l'on rapporte cette
dose léthale aux unités d t activité collagénoly
tique de la préparation.

La remarquable activité collagénolytique des préparations selon l'invention a été démontrée dans les tests pharmacologiques in vivo indiqués ci-après
Ces tests ont consisté dans le traitement avec une préparation contenant la collagénase selon l'invention de brûlures prealablement effectuées sur la peau de porcs, par application d'eau à la température de 80 C, en plu sieurs points du dos de ces animaux pendant 15 secondes (6 lésions sur le côté droit et 6 lésions sur le côté gauche des porcs). L'épiderme mort est alors enlevé des surfaces ébouillantées et les lésions ont été exposées à l'air pendant 48 heures. Chaque lésion avait un diamètre de l'ordre de 3,8 cm.Les essais effectués avec la pommade contenant la collagénase ont été doublés d'essais effectués avec une pommade analogue, mais qui était dépourvue de collagénase, cette pommade ayant été utilisée à titre de témoin.

Les compositions de ces pommades étaient les sui vantes
Pour la pommade témoin - alcool polyoxyéthylénique ......................... 13 g - huile de vaseline ................................. 20 g - eau * 100 g - hydroxyle de sodium.pour régler le pH à 7.

La pommade contenant la collagénase contient les mêmes excipientsn et 0,25 ukat de collagénase par g de pommade.

La pommade contenant la collagénase a été appliquée sur les lésions du côté droit des porcs, la pommade témoin sur celles du côté gauche.

Les applications de pommade ont été répétées respectivement 3 jours, 4 jours, 6 jours et 13 jours après la réalisation des brûlures.

On a fait les observations suivantes 6 jours et 13 jours après la réalisation des brûlures
Etat des brûlures 6 jours plus tard
La profondeur de la brûlure et l'épaisseur du tissu qui a survécu sont approximativement les mêmes dans les brûlures traitées par la pommade et celles ayant reçu la composition témoin.

Dans les brûlures traitées avec la pommade témoin, on constate la présence d'escarres contenant des fibres intactes de collagène sur les 6 brûlures. Les brûlures traitées avec la pommade contenant la collagénase selon l'invention n'en comportent aucune.

On constate la présence de cellules inflammatoires infiltrées dans la partie supérieure du derme sur les 6 brûlures traitées par la pommade à'la collagénase. La même observation ne peut être faite que sur 3 brûlures témoins. L'afflux de cellules inflammatoires témoigne d'un processus de cicatrisation plus avancé que dans les brûlures où ces infiltrations ngont pas eu lieu.

On ne constate cependant que peu de différences au niveau de la réparation de épiderme et.du tissu conjonctif, entre les brûlures traitées et les brûlures témoins,-sauf~que cette réparation paraît un peu plus avancée dans le cas des brûlures traitées.

Etat des brûlures 13 iours plus tard.

On constate chez les animaux traités que les brûlures sont.recouvertes d'une mince pellicule de tissu dégradé. Du tissu conjonctif nouveau s'est développé sur la totalité de la surface des brûlures, immédiatement sous cette pellicule ainsi que plus en profondeur, dans le derme. L'épiderme s'est développé sous la forme d'un tissu de granulation à partir des bords des lésions2 immédiatement sous la pellicule de tissu déradé.

On constate dans les lésions traitées que la partie collagène des escarres a été dissoute par la collagénase, de sorte que la régénération du tissu conjonctif a pu se développer en surface2 dans des conditions analogues à celles qui sont observées dans Te cas de blessures par coupures. L'épiderme formé peut migrer sur la surface de ce tissu de granulation.

On constate au contraire que les brûlures témoins sont recouvertes d'escarres profondes de collagène compact qui adhère au tissu et le recouvre. Il s'est formé du tissu conjonctif nouveau seulement sous la nouvelle couche épiderme qui s'est formée sur les seuls bords des brûlures. L'épiderme a migré à partir des bords de la lésion, à travers le derme sous les escarres susdites, séparant ainsi celles-ci du tissu profond. Donc les sources d'épidermes nouveaux ne se constatent qu'au bord des lésions, ce qui requérait une greffe chirurgicale d'épiderme pour assurer la cicatrisation complète de ces lésions.

L'un des avantages de la pommade contenant la collagénase réside dans le fait que le traitement enzymatique réalisé automatiquement un équilibre correct entre les tissus nécrotiques et les tissus viables, équilibre quVil serait difficile de recréer par la voie chirurgicale.

Les préparations pharmaceutiques selon leinvention peuvent se présenter sous toutes les formes susceptibles d'être mises en oeuvre par application ester ne : émulsions, notamment telles que pommade et crèmes, ou solutions ou pulvérisations (aérosols ou poudres), la collagénase étant dans chaque préparation associée à des excipients conformes selon le cas à chacune desdites formes. Dans le cas de solutions pour l'application topique, on aura recours avantageusement à une mise en solution de la collagénase dans un milieu isotonique, de préférence un tampon physiologiquement acceptable de pH 7-8,5, et de préférence stérile.

Les préparations de collagénase sous forme de solutions au sein d'un véhicule stérile injectable peuvent être administrées par la voie sous-cutanée, à proximité des plaies à traiter ou des chéloldes. On peut également envisager l'utilisation de ces solutions injectables, pour les administrations profondes, notamment en vue de la destruction de l'accumulation pathologique du collagène dans les tissus, comme par exemple dans les disques intervertébraux.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont donc applicables à tous types de lésions se manifestant par une altération incontrôlée des structurnes riches en collagène. A titre dVexemple de lésions qui peuvent être traitées, on citera les brûlures, ulcères, escarres, les escarres dures ou blanches à base de collagène, chéloldes, telles que celles produites après des interventions chirurgicales, nécroses5 en particulier dans le cas des décubitus ou des ulcères.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être appliquées à titre préventif, notamment préalablement à des interventions chirurgicales visant à réaliser des greffes plastiques ou autres, ou à des interventions de ehirurgie esthétique5 et d'une façon générale à toutes blessures de la peau.

Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réalisation qui ont été plus spécialement envisagés ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1 - Composition pharmaceutique, notamment pour l'utilisation dans le traitement de pathologies se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène chez l'homme ou l'animal, cette composition contenant,en association avec un véhicule pharmaceutique,une collagénase de haute activité spécifique reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique

X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acide aminé naturel lié à l'extrémité N-terminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-glycyl et en ce qu'en outre elle est inhibée au moins partiellement par la myosine.

2 - Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la collagénase est issue de cultures de Vibrio alginolyticus chemovar iophagus.

3 - Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que la collagénase est issue de la souche déposée à la C.N.C.M. sous le nO I-029.

4 - Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient des doses exprimées par l'activité de la collagénase, rapportées au poids total de la composition, au moins égales - à 0,05 pkat/g de la composition pharmaceutique pour les

émulsions, pommades, poudres ou toutes compositions non

vraiment liquides, au sens habituellement donné à cette

expression, et - à 0,05 pkat/ml de la composition pharmaceutique-pour les

solutions constituées en vue de llusage topique.

5 - Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,1 à 2, de préférence 0,5 à 1 pkat/g d'émulsions, pommades, poudres ou compositions non vraiment liquides ou de 0,1 à 2, de préférence de 0,5 à 1 pkat de collagénase par ml de solution.

6 - Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce quelle contient également des protéases et des endonucléases, les proportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0,350 kat de collagénase ne dépassant pas 200 unités caséinolytiques pour les protéases et 500 unités nucléasiques pour les endonucléases

7 - Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle contient les trois susdits constituants dans des proportions relatives eorrespondant -. à au moins 0X350 ukat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de

leur teneur en protéases neutres et - d-30 à 500 unités nucléasiques, en ce qui concerne les

endonucléases.

8 - Composition selon la revendication 7, caractérisée par des proportions relatives des susdits constituants correspondant respectivement à des activités - d'au moins 0,350 kat en ce qui concerne la collagénase9 - de 20 à 50 unités caséinolytiques en ce qui concerne les

protéases neutres et - de 30 à 60 unités nucléasiques, en ce qui concerne les

endonucléases