CA1232542A - Preparation a activite collagenolytique ayant une activite elevee et compositions pharmaceutiques la contenant - Google Patents
Preparation a activite collagenolytique ayant une activite elevee et compositions pharmaceutiques la contenantInfo
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- CA1232542A CA1232542A CA000528915A CA528915A CA1232542A CA 1232542 A CA1232542 A CA 1232542A CA 000528915 A CA000528915 A CA 000528915A CA 528915 A CA528915 A CA 528915A CA 1232542 A CA1232542 A CA 1232542A
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Abstract
PREPARATION A ACTIVITE COLLAGENOLYTIQUE AYANT UNE ACTIVITE ELEVEE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA CONTENANT. L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant en association avec un véhicule pharmaceutique une collagénase de haute activité spécifique et susceptible d'être inhibée au moins partiellement par la myosine. Elle est utilisable pour le traitement de pathologies se, manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène chez l'homme ou l'animal. Pas de dessin.
Description
~Z3~
PREPARATION A ACTIVITE COLLAGENOLYTIQUE AYANT UNE
ACTIVITE ELEVEE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA
CONTENANT
La présente demande est une divisionnaire de la demande N.S. 444,763, déposée le 5 janvier 1984, R.J. WEILL et al., demandeurs.
L'invention est relative à une préparation à
~ activité collagénolyti~ue, plus particulièrement à des compositions phaxmaceutiques renfermant cette prépara-tion, en association avec une véhicule pharmaceutique, notamment pour l'utilisation dans le traitement de pa-thologies se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène, chez l'homme ou l'animal.
Plusieurs types de micro-organismes produc-teurs d'une enzyme collagénolytique ou "collagénase" ont déjà été décrits dans la littérature. Il e~t cependant souvent difficile de contrôler les teneurs de ces préparations en constituants actifs, ces préparations pouvant d'ailleurs n'être pas exemptes d'un certain nombre de constituants toxiques, par exemple des neurotoxines, qui les rendent impropres à l'usage dans des compositions à destination pharmaceutique.
L'invention a pour but de fournir une composi-tion pharmaceutique permettant une détersion enzymatique sélective à l'égard de structures collagéniques patho-; gènes, lorsqu'elle est appliquée à des lésions se mani-festant par une altération incontrôlée de collagène.
Elle a encore pour but la réalisation de compositions dans lesquelles les proportions relatives des principaux constituants de la préparation collagénolytique sont équilibrées selon des proportions prédéterminées en fonction de la qualité du résultat thérapeutique recher-ché.
' ~,~
.. ......
. .
~32~
La composition pharmaceutique selon l'inven-tion est caractérisée par une dose eff.icace d'une colla-génase de haute activité spéci~ique reconnaissant spéci-fiquement une sequence peptidique X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acide aminé naturel lié
à l'extré~ité N-terminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-glycyl et en ce qu'en outre elle est inhibée au moins paxtiellement par la myosine.
Une collagénase préférée entrant dans la com-position pharmaceutique selon l'invention est constituée par celle qui peut être obtenue à partir de cultures de Vibrio al~inolYticus chemovar io~ha~us, dont les carac-téristiques taxonomiques principales seront rappeléesplus loin, ou de tous micxo-organismes dérivés de celui-ci ou capables comme celui-ci de produire une telle collagénase. Plus généralement encore font partie des collagénases susceptibles d'etre mises en oeuvre dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, celles qui sont capables de réagir avec des anticorps sélectifs préparés contre la collagénase dite ; "collagénase d'Achromobacter" répertoriée sous le n~ EC.
3.4.24.8 dans "Enzyme Nomenclature Edition IUPAC-IUB
(1978). Cette colla~énase est obtenue à partir de la souche de Vibrio alqinolYticus chemovar ioPhaqus qui a i été déposée à la Collection Nationale de Culture de ~icro-Organismes de l' INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M. ) sous le n- I-029.
Cette collagénase se distingue d'autres colla-génases connues par sa haute acti~ité specifi~ue.
; Celle-ci peut atteindre 2 unités microkatal/mg (~kat/mg) de protéine. Elle a été décrite, par exemple, dans l'article intitulé "Subunit structure of Achromobacter Collagenase", de V. KEIL-DLOVHA et ~. KEIL, paru dans Biochim. ~iophys. Acta 522, 218-228 (1978).
~ "~
Z~
On pourra encore se référer, en ce qui con--cerne la caractérisation chimique de cette enzyme ainsi que du micro-organisme producteur, aux articles intitu-lés Vera REIL-DLOUHA, paru dans ~3iochimica et Biophysica Acta, 429 (1976) 239-251, et "Some newly characterized collagenases from procaryotes and lower eucaryotes" de Borivoj KEIL, paru dans Molecular & Cellular Biochemistry, January 26, 1979, volume 23, nr. 2.
L'invention concerne pl-us particulièrement des compositions pharmaceutiques contenant des doses expri-mées par l'activité de la colla~énase, rapportées au poids total de la composition, au moins égales :
- à 0,05 ~kat/g de la composition pharmaceutique pour les emulsions, pommades poudres, ou toutes compositions non vraiment ].iquides, au sens habituellement donné à
cette expression et, - à 0,05 ~kat/ml de la composition pharmaceutique pour les solutions constituées en vue de l'usage topique.
Des pommades préférées selon l'invention con-tiennent notamment de 0,1 à 2, de préférence de 0,5 à 1 ~kat de collagenase par gramme de pommade.
Des solutions pour applications topiques pré-fé~ées conforme à l'invention contiennent de 0,1 à 2, de ; 25 préférence de 0,5 à 1 ~kat de collagénase par ml de solution.
Des compositions avantageuses selon l'inven-tion contiennent en outre, d'une part, des protéases neutres et, d'autre part, des endonucléases.
De préférence, les pxoportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0,350 ~Xat de collagénase ne depassent pas 200 unités caséinolytiques pour les protéases et 500 unités nucléasiques pour les endonllcléases.
Des compositions appropriées à la mise en oeuvre de l'invention contiennent les trois types de ,1 constituants, de preférence dans des proportions relatives correspondant :
- à au moins 0,3S0 ~kat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de leur teneur en protéases neutres et - à 30 à 500 unltés nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases.
Dans des compositions davantage préférées encore, les proportions relatives les unes vis-à-vis des autres des susdits constituants correspondent respecti-vement à des activités :
- d'au moins 0,350 ~kat en ce qui cancerne la collagénase, ~ de 20 à 50 unités caséinolytiques en ce qui concerne les protéases neutres et - de 30 à 60 unités nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases.
L'utilisation des compositions selon l'inven-tion dans le traitement de lésions du genre sus-indiqué
(par exemple des brûlures, ulcères, escarres, escarres dures ou blanches à base de collagène, chélo;des, telles que celles produites après des interventions chirurgica-les) se révele particulièrement bénéfique.
~ans son action thérapeutique, la composition selon l'invention décompose préférentiellement le colla-gène du tissu conjonctif. Elle ne s'attaque pas à la masse musculaire, en particulier aux myofibrilles des muscles, son composé collagénolytique étant inhibé par la myosine du muscle. La composition selon l'invention sera quelquefois, ci-après, dénommée UAchromase'' notam-ment lorsqu'elle contient des protéases et des endonu-cléases, notamment dans les proportions sus-indiquées, en sus de la collagénase.
Simultanément, l'action de l'Achromase est caractérisée pas la production, à partir de susbstrats .
~2~'Z~
macromoléculaires de la nécrose, de fragments qui ont une action chémotactique sur les éléments du sang;
c'est par cette action chémotactique qu'en particulier les macrophages et les leucocytes s'accumulent à la périphérie de la zone d'action de l'Achromase. Cette accumulation des éléments du sang est favorable au processus de régénération tissulaire (par exemple, dans les ulcères, dans les tissus endommagés par des b~ûlures) Une autre caractéristique de l'action de l'Achromase à l'égard de tissus altérés à caractère nécrotique est qu'elle s'arrête au niveau des tissus vivants. L'action de l'Achromase 5 ' arrête après avoir : 15 décomposé les tissus morts à la limite des tissus vi-; vants. Elle ne provoque pas, par l'action de ses compo-sés protéolytiques, de lésions du tissu vivant. Ces effets se produisent particulièrement grâce aux systèmes d'inhibition qui existent dans les tissus vivants, no-; 20 tamment aux trois systèmes mettant en jeu :
1~) des inhibiteurs de la collagénase de nature polypep-tidique, présents dans le tissu non endommagé,
PREPARATION A ACTIVITE COLLAGENOLYTIQUE AYANT UNE
ACTIVITE ELEVEE ET COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LA
CONTENANT
La présente demande est une divisionnaire de la demande N.S. 444,763, déposée le 5 janvier 1984, R.J. WEILL et al., demandeurs.
L'invention est relative à une préparation à
~ activité collagénolyti~ue, plus particulièrement à des compositions phaxmaceutiques renfermant cette prépara-tion, en association avec une véhicule pharmaceutique, notamment pour l'utilisation dans le traitement de pa-thologies se manifestant par une altération incontrôlée des structures riches en collagène, chez l'homme ou l'animal.
Plusieurs types de micro-organismes produc-teurs d'une enzyme collagénolytique ou "collagénase" ont déjà été décrits dans la littérature. Il e~t cependant souvent difficile de contrôler les teneurs de ces préparations en constituants actifs, ces préparations pouvant d'ailleurs n'être pas exemptes d'un certain nombre de constituants toxiques, par exemple des neurotoxines, qui les rendent impropres à l'usage dans des compositions à destination pharmaceutique.
L'invention a pour but de fournir une composi-tion pharmaceutique permettant une détersion enzymatique sélective à l'égard de structures collagéniques patho-; gènes, lorsqu'elle est appliquée à des lésions se mani-festant par une altération incontrôlée de collagène.
Elle a encore pour but la réalisation de compositions dans lesquelles les proportions relatives des principaux constituants de la préparation collagénolytique sont équilibrées selon des proportions prédéterminées en fonction de la qualité du résultat thérapeutique recher-ché.
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La composition pharmaceutique selon l'inven-tion est caractérisée par une dose eff.icace d'une colla-génase de haute activité spéci~ique reconnaissant spéci-fiquement une sequence peptidique X-glycyl-L-prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acide aminé naturel lié
à l'extré~ité N-terminale du résidu glycyle, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-glycyl et en ce qu'en outre elle est inhibée au moins paxtiellement par la myosine.
Une collagénase préférée entrant dans la com-position pharmaceutique selon l'invention est constituée par celle qui peut être obtenue à partir de cultures de Vibrio al~inolYticus chemovar io~ha~us, dont les carac-téristiques taxonomiques principales seront rappeléesplus loin, ou de tous micxo-organismes dérivés de celui-ci ou capables comme celui-ci de produire une telle collagénase. Plus généralement encore font partie des collagénases susceptibles d'etre mises en oeuvre dans les compositions pharmaceutiques selon l'invention, celles qui sont capables de réagir avec des anticorps sélectifs préparés contre la collagénase dite ; "collagénase d'Achromobacter" répertoriée sous le n~ EC.
3.4.24.8 dans "Enzyme Nomenclature Edition IUPAC-IUB
(1978). Cette colla~énase est obtenue à partir de la souche de Vibrio alqinolYticus chemovar ioPhaqus qui a i été déposée à la Collection Nationale de Culture de ~icro-Organismes de l' INSTITUT PASTEUR (C.N.C.M. ) sous le n- I-029.
Cette collagénase se distingue d'autres colla-génases connues par sa haute acti~ité specifi~ue.
; Celle-ci peut atteindre 2 unités microkatal/mg (~kat/mg) de protéine. Elle a été décrite, par exemple, dans l'article intitulé "Subunit structure of Achromobacter Collagenase", de V. KEIL-DLOVHA et ~. KEIL, paru dans Biochim. ~iophys. Acta 522, 218-228 (1978).
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On pourra encore se référer, en ce qui con--cerne la caractérisation chimique de cette enzyme ainsi que du micro-organisme producteur, aux articles intitu-lés Vera REIL-DLOUHA, paru dans ~3iochimica et Biophysica Acta, 429 (1976) 239-251, et "Some newly characterized collagenases from procaryotes and lower eucaryotes" de Borivoj KEIL, paru dans Molecular & Cellular Biochemistry, January 26, 1979, volume 23, nr. 2.
L'invention concerne pl-us particulièrement des compositions pharmaceutiques contenant des doses expri-mées par l'activité de la colla~énase, rapportées au poids total de la composition, au moins égales :
- à 0,05 ~kat/g de la composition pharmaceutique pour les emulsions, pommades poudres, ou toutes compositions non vraiment ].iquides, au sens habituellement donné à
cette expression et, - à 0,05 ~kat/ml de la composition pharmaceutique pour les solutions constituées en vue de l'usage topique.
Des pommades préférées selon l'invention con-tiennent notamment de 0,1 à 2, de préférence de 0,5 à 1 ~kat de collagenase par gramme de pommade.
Des solutions pour applications topiques pré-fé~ées conforme à l'invention contiennent de 0,1 à 2, de ; 25 préférence de 0,5 à 1 ~kat de collagénase par ml de solution.
Des compositions avantageuses selon l'inven-tion contiennent en outre, d'une part, des protéases neutres et, d'autre part, des endonucléases.
De préférence, les pxoportions de protéases et d'endonucléases rapportées à 0,350 ~Xat de collagénase ne depassent pas 200 unités caséinolytiques pour les protéases et 500 unités nucléasiques pour les endonllcléases.
Des compositions appropriées à la mise en oeuvre de l'invention contiennent les trois types de ,1 constituants, de preférence dans des proportions relatives correspondant :
- à au moins 0,3S0 ~kat de collagénase, - à de 20 à 200 unités caséinolytiques pour ce qui est de leur teneur en protéases neutres et - à 30 à 500 unltés nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases.
Dans des compositions davantage préférées encore, les proportions relatives les unes vis-à-vis des autres des susdits constituants correspondent respecti-vement à des activités :
- d'au moins 0,350 ~kat en ce qui cancerne la collagénase, ~ de 20 à 50 unités caséinolytiques en ce qui concerne les protéases neutres et - de 30 à 60 unités nucléasiques, en ce qui concerne les endonucléases.
L'utilisation des compositions selon l'inven-tion dans le traitement de lésions du genre sus-indiqué
(par exemple des brûlures, ulcères, escarres, escarres dures ou blanches à base de collagène, chélo;des, telles que celles produites après des interventions chirurgica-les) se révele particulièrement bénéfique.
~ans son action thérapeutique, la composition selon l'invention décompose préférentiellement le colla-gène du tissu conjonctif. Elle ne s'attaque pas à la masse musculaire, en particulier aux myofibrilles des muscles, son composé collagénolytique étant inhibé par la myosine du muscle. La composition selon l'invention sera quelquefois, ci-après, dénommée UAchromase'' notam-ment lorsqu'elle contient des protéases et des endonu-cléases, notamment dans les proportions sus-indiquées, en sus de la collagénase.
Simultanément, l'action de l'Achromase est caractérisée pas la production, à partir de susbstrats .
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macromoléculaires de la nécrose, de fragments qui ont une action chémotactique sur les éléments du sang;
c'est par cette action chémotactique qu'en particulier les macrophages et les leucocytes s'accumulent à la périphérie de la zone d'action de l'Achromase. Cette accumulation des éléments du sang est favorable au processus de régénération tissulaire (par exemple, dans les ulcères, dans les tissus endommagés par des b~ûlures) Une autre caractéristique de l'action de l'Achromase à l'égard de tissus altérés à caractère nécrotique est qu'elle s'arrête au niveau des tissus vivants. L'action de l'Achromase 5 ' arrête après avoir : 15 décomposé les tissus morts à la limite des tissus vi-; vants. Elle ne provoque pas, par l'action de ses compo-sés protéolytiques, de lésions du tissu vivant. Ces effets se produisent particulièrement grâce aux systèmes d'inhibition qui existent dans les tissus vivants, no-; 20 tamment aux trois systèmes mettant en jeu :
1~) des inhibiteurs de la collagénase de nature polypep-tidique, présents dans le tissu non endommagé,
2-) la myosine présente dans les tissus musculaires et
3 ) des inhibiteurs non spécifiques de la collagénase et des protéases, en particulier de la ~2-macroglobuline, présents dans la circulation sanguine.
Il est à cet ~gard important de souligner que pour être e$ficaces les compositions pharmaceutiques doivent avoir une activité collagénolytique élevée, ~ 30 présentant notamment les ordres de grandeurs qui ont été
; indiqués plus haut. Il s'est en fait avéré que, contrai-rement à ce que l'on pouvait craindre, la sélectivité de l'action de la préparation collagénolytique de l'inven-tion à l'égard des seuls tissus nécrosés our d'une façon plus générale, de tout tissu non sain, n'était pas ; af~ectée même ~ des doses élevées de collagénase. En ~?
~;325i~2 effet les barri~res naturelles que présentent les tissus sains contre l'action de la collagénase ou les régula-teurs de l'activité de celle-ci qu'ils contiennent se révèlent parfaitement efficaces contre ce qui pouvait a priori être considéré comme un "surdosage" de l'enzyme.
Les protéases neùtres, qui foxment le second constituant actif de l'Achromase, complètent l'action de la collagénase en dégradant davantage encore les frag-ments du substrat moléculaire collagénolytique initial.
Lorsque la préparation mise en oeuvre dans la composi-tion pharmaceutique selon l'in~ention est originaire de Vibrio alqinolYticus chemovar ioPhaqus, lesdit~s pro-; téases sont dépourvues de constituants indésirables.
Enfin le troisième constituant de l'Achromase, essentiellement formé d'endonucléases, contribue à la destruction de l'ADN susceptible d'être libére par les cellules ~ l'occasion du processus infectieux, donc du pus dont l'ADN libéré forme une partie importante.
De préférence, les protéases et les endonu-cléases associées à la collagénase sont issus des mêmes micro-organismes, et sont obtenues simultanément avec la collagénase dans les milieux de culture du micro-organisme.
Les conditions dans lesquelles les proportions mutuelles de ces constituants peuvent être réglées sont exposées plus loin.
L'invention concerne encore des compositlons collagénolytiques préférées dans lesquelles la susdite collagénase est associée avec les préparations efficaces d'hydrolysat de collagène, notamment d'hydrolysat enzy-matique du collagène.
Essentiellement ces hydrolysats sont consti-tués de fragments de collagène, par exemple issus de peaux de veaux constitués par des molécules peptidiques dont les poids moléculaires moyens sont inférieurs à
:~23~S~
10.000 daltons, notamment cornpris entre 6.000 et 8.000 daltons. Ces hydrolysats peuvent encore etre caractéri-sés par certains de leurs amino-acides constitutifs plus ; 5 particulièrement par la présence d'hydroxy-proline. Par exemple un hydrolysat de collagène caractéristique com-porte les acides aminés suivants (originaires du colla-gène) dans les proportions suivantes :
- glycine : 33 ~~0 - proline : 8,4 ~~0 - hydroxyproline : 11,4 ~~O
Ces hydrolysats de collagène peuvent etre ob-tenus par tout procédé de fragmentation approprié du collagénase dénaturé ou non. Le terme "hydrolysat" n'est pas limité à des produits obtenus par hydrolyse chimique ou enzymatique du collagène dénaturé ou non. Les hydro-lysats du genre en question sont par exemple obtenus par atomisation de gélatine.
; Il est à remarquer que ces hydrolysats de col-lagène sont de même nature que les produits résultant de la dégradation du collagène fib~eux ou nécrotique conte-nu dans les plaies et que les compositions collagénoly-tiques selon l'invention visent à hydrolyser.
Il a été constaté que l'addition à la collagé-nase de l'invention de proportions substantielles d'hy-drolysat de collagène tel que mentionne plus haut se manisfeste par un accroissement de l'activité curative des compositions selon l'invention.
Un autre avantage très important de l'addition de ces ~ydrolysats de collagène aux compositions de col-lagénase selon l'invention réside dans l'accroissement important de la stabilité au stockage des compositions collagénolytiques selon l'invention. Cet accroissement de stabilité se manifeste avec une ampleur particulière à l'occasion de la lyophilisation de préparations de '~J~j 31 ;~3Z5~
collagénase conforme à l'invention. Il sera donc parti-culièrement intéressant d'associer ces hydrolysats de collagène, très solubles a froid, aux préparations de collagénase dans la phase terminale de la préparation de ces dernieres. En particulier, ces hydrolysats de colla-gène pourront être ajoutés directement aux solutions de collagénase obtenues à partir des milieux de culture du micro-organisme producteur, notamment après les ultra-filtrations et les opérations de purification supplémen-taires requises des solutions obtenues, poux éliminer les constituants insolubles et solubles indésirables contenus dans les milieux de culture éliminés, mais avant la lyophilisation finale des préparations de collagène obtenues.
Des compositions pharmaceutiques préférées de l'invention contiennent les hydrolysats de collagène et la collagénase à raison de 1 à 25 mg, de préférence 2 à
mg d'hydrolysat de collagène pour 1 mg de collagéna-se~ On peut encore exprimer des rapports préférés de lafacon suivante. Les compositions préférées contiennent de 1 à 2S, notamment de 2 à 10, par exemple 5 mg d'hy-drolysat de collagène par microtal de collagène.
Il va sans dire que ces intervalles de pro-portions s'appliquent indistinctement au cas où le col-lagène est associé ou au cas où il n'est pas associé aux protéases et endonucléases sus-indiquées.
La composition pharmaceutique selon l'inven-tion joue donc un rôle essentiel au niveau de la des-truction des déchets tissulaires qui tendent à s'accu-muler dans la région des lésions du qenre en question, cette destruction tdétersion) devant nécessairement pré-céder le début de la cicatrisation naturelle ou induite, par exemple par greffe.
L'invention concerne encore un procédé de . . .
~3Z~
production d'une préparation active conforme à l'inven-tion, contenant plus particulièrement les trois types de constituants qui ont été en-risagés ci-dessus. Ce procédé
met plus particulièrement en oeuvre la bactérie aérobie Vibrio 319L___1YtiCUS chemovar i~hL9Y~- Ce procédé con-siste à cultiver ce micro-organisme dans des conditions en soi connues et à induire également de facon en soi connue la production de collagénase par l'addition au milieu de culture d'un inducteur approprié, plus parti-culièrement de collagène ou de'fragments de collagèna ayant un poids moléculaire encore suffisant pour ~ormer une structure secondaire caractéristique des chaînes hélicoidales de collagène, à poursuivre cette culture jusqu'après induction dans le milieu de culture d'une production desdites protéases neutres, la culture pouvant etre interrompue quand les proportions relatives de collagénase et de protéinase ont atteint des valeurs désirées comprises dans les intervalles respectifs sus-indiqués, la préparation active pouvant ensuite êtrerécupérée par des techniques en soi connues à partir du milieu de culture. En particulier, on peut, après élimi-~ nation des cellules, précipiter les protéines hors du ; surnageant avec une concentration suffisante de sulfate ; 25 d'ammonium pouvant par exemple atteindre 60 % du taux de saturation en ce sel de la solution. Le précipité remis en suspension peut être dialysé contre de l'eau distil--lée pour éliminer les ions entrainés au cours de la precipitation, avant d'etre finalement lyophilisé. En ; 30 variante, le principe actif peut être purifié par ultra-filtration.
Dans ce qui précède, c'est en jouant sur la durée de la culture que l'on a proposé de régler les proportions relatives de collagénase ou de protéase (ou ,. .
~ ~ .
~Z3Z~2 protéinase). Il peut également être envisagé de complé-ter la collagénase avec des protéinases et des endonu-cléases d'origine extérieure, ou au contraire de retirer l'excédent de protéinase et d'endonucléase pour le cas où cette solution pourrait être purifiée, eu égard au ;rendement accru en collagénase que l'on pourrait atten-dxe d'une prolongation de la durée de la culture.
Cette dernière opération pouxra être mise en oeuvre en mettant à profit les masses moléculaires très différentes de la collagénase et des protéinases : en particulier ces masses moléculaires sont supérieures à
30.000 pour la collagénase et inférieures à 30.000 pour les protéases, de sorte que leur séparation est aisée, par exemple sur des membranes ultra-filtrantes appro-priées. En particulier, le milieu de culture obtenu après l'interruption de la culture et la séparation des bactéries, peut faire l'objet de trois ultra-~iltrations successives : la première en vue d'éliminer les bacté-ries résiduelles et pour obtenir un liquide clair conte-nant la collagénase et les protéases, la seconde sur une ~-membrane ultra-filtrante séparant les protéines -des poids moléculaires supérieurs, à 30.000, particulière-ment les collagénases et la troisième sur une membrane :25 filtrante permettant de séparer les poids moléculaires supérieurs à 10.000, ce qui permet de récupérer les protéases. La collagénase et les protéases peuvent alors ensuite etre remélangées aux proportions voulues.
Conformément à la caractéristique supplémen-taire déjà mentionnée plus haut de l'invention il estavantageux, avant la récupération de la colla~énase et, le cas échéant des protéases et des endonucléases, éventuellement davantage purifiées, notamment par lyo-philisation de leurs solutions d'ajouter au préalable à
celles-ci des hydrolysats de collagène, de préférence dans les proportions qui ont ~té indiquées. En d'autres ~3Z~
termes, ce sont ces solutions complétées par les hydro-lysats de collagène, qui sont ensuite soumises à
lyophilisation.
L'addition de ces hydrolysats de collagène à
une collagénase en solution avant sa récupération à
partir de cette solution, peut dont également s'analyser comme représentant l'étape essentielle d'un pro~édé
visant à stabiliser ladite collagénase. Ce procédé de stabilisation est donc caractérisé par l'étape que constitue la lyophilisation de la solution contenant la collagénase, en présence des susdits hydrolysats de collagène, pris de préférence dans les proportions re-latives qui ont été indiquées plus haut vis-à-vis de la collagénase.
Pour doser les différents constituants de la composit:Lon, on peut avoir recours aux t~chniques décri-tes ci-après ~ui mettent en oeuvre les substrats, les réactifs et les méthodes de calcul également mentionnés ci-après.
I- DOSAGE DE LA COLLAGENASE (Wunsch E. et Heidrich H. G.
(1963) Z. fur Physiol. Chem. 333, 149-151) ~ SUBSTR~T
; Le substrats utilisé est du 4-phénylazo-benzyloxy-carbonyl-L-Pro-Leu Gly-L-Pro-D-Arg. HCl (PZ-PLGPR~, commercialisé par la Société Fluka.
REACTIFS
Les réactifs mis en oeuvre sont les suivants :
A. Tampon :
le tampon est constitué à partir des trois solutions suivantes :
- solution A1 : effectuée à l'aide de 160 mM
de véronal (sel de sodium de l'acide 5,5-diéthylbarbitu-ri~ue) et 143 mM d'acétate de sodium, 3 H20 ;
- solution A2 : HCl lN ;
- solution A3 : NaCl à 8,5 ~0 ;
~ .
~ 2~
le tampon est obtenu en mélangeant 200 ml de solution A1 avec 80 ml de solution A3, et en ajustant le pH ~ 8,5 avec la solution A2 ; on complète à 1 1 en ajoutant de l'eau et on additionne CaC12, 2 H20 pour o~tenir une concentration finale de 4 mM.
: B. Solution de substrat :
:~ elle est obtenue en dissolvant 10 mg de PZ-PLGPR dans iOO ~1 de méthanol ; on ajoute du tampon pour compléter à 10 ml et la solution de substrat ainsi obte-nue reste stable une semaine.
C. Echantillon de collagénase :
l'échantillon de collagénase est obtenu en conservant 1 mg de solution dans 1 ml de tampon j à
l'aide d'échantillons d'activité spécifique inconnue, on dilue selon les lectures préliminaires ; les dilutions optimales doivent donner les valeurs colorimétriques de la densité optique à 320 nm (~oir ci-dessous) dans la gamme de 0,1 à 1,0.
D. Acide citrique :
il s'agit d'une solution à 0,5 % dans l'eau.
- E. Acétate d'ethyle.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
1- on préchauffe la solution B à 37'C ;
2~ on mélange 0,1 ml de solution de collagéna-se (correctement diluée) avec 0,4 ml d~ solution B
préchauffée et on laisse incuber pendant 15 mn à 37'C ;
3~ on additionne 1 ml de solution D et on .~ 30 mélange ;
Il est à cet ~gard important de souligner que pour être e$ficaces les compositions pharmaceutiques doivent avoir une activité collagénolytique élevée, ~ 30 présentant notamment les ordres de grandeurs qui ont été
; indiqués plus haut. Il s'est en fait avéré que, contrai-rement à ce que l'on pouvait craindre, la sélectivité de l'action de la préparation collagénolytique de l'inven-tion à l'égard des seuls tissus nécrosés our d'une façon plus générale, de tout tissu non sain, n'était pas ; af~ectée même ~ des doses élevées de collagénase. En ~?
~;325i~2 effet les barri~res naturelles que présentent les tissus sains contre l'action de la collagénase ou les régula-teurs de l'activité de celle-ci qu'ils contiennent se révèlent parfaitement efficaces contre ce qui pouvait a priori être considéré comme un "surdosage" de l'enzyme.
Les protéases neùtres, qui foxment le second constituant actif de l'Achromase, complètent l'action de la collagénase en dégradant davantage encore les frag-ments du substrat moléculaire collagénolytique initial.
Lorsque la préparation mise en oeuvre dans la composi-tion pharmaceutique selon l'in~ention est originaire de Vibrio alqinolYticus chemovar ioPhaqus, lesdit~s pro-; téases sont dépourvues de constituants indésirables.
Enfin le troisième constituant de l'Achromase, essentiellement formé d'endonucléases, contribue à la destruction de l'ADN susceptible d'être libére par les cellules ~ l'occasion du processus infectieux, donc du pus dont l'ADN libéré forme une partie importante.
De préférence, les protéases et les endonu-cléases associées à la collagénase sont issus des mêmes micro-organismes, et sont obtenues simultanément avec la collagénase dans les milieux de culture du micro-organisme.
Les conditions dans lesquelles les proportions mutuelles de ces constituants peuvent être réglées sont exposées plus loin.
L'invention concerne encore des compositlons collagénolytiques préférées dans lesquelles la susdite collagénase est associée avec les préparations efficaces d'hydrolysat de collagène, notamment d'hydrolysat enzy-matique du collagène.
Essentiellement ces hydrolysats sont consti-tués de fragments de collagène, par exemple issus de peaux de veaux constitués par des molécules peptidiques dont les poids moléculaires moyens sont inférieurs à
:~23~S~
10.000 daltons, notamment cornpris entre 6.000 et 8.000 daltons. Ces hydrolysats peuvent encore etre caractéri-sés par certains de leurs amino-acides constitutifs plus ; 5 particulièrement par la présence d'hydroxy-proline. Par exemple un hydrolysat de collagène caractéristique com-porte les acides aminés suivants (originaires du colla-gène) dans les proportions suivantes :
- glycine : 33 ~~0 - proline : 8,4 ~~0 - hydroxyproline : 11,4 ~~O
Ces hydrolysats de collagène peuvent etre ob-tenus par tout procédé de fragmentation approprié du collagénase dénaturé ou non. Le terme "hydrolysat" n'est pas limité à des produits obtenus par hydrolyse chimique ou enzymatique du collagène dénaturé ou non. Les hydro-lysats du genre en question sont par exemple obtenus par atomisation de gélatine.
; Il est à remarquer que ces hydrolysats de col-lagène sont de même nature que les produits résultant de la dégradation du collagène fib~eux ou nécrotique conte-nu dans les plaies et que les compositions collagénoly-tiques selon l'invention visent à hydrolyser.
Il a été constaté que l'addition à la collagé-nase de l'invention de proportions substantielles d'hy-drolysat de collagène tel que mentionne plus haut se manisfeste par un accroissement de l'activité curative des compositions selon l'invention.
Un autre avantage très important de l'addition de ces ~ydrolysats de collagène aux compositions de col-lagénase selon l'invention réside dans l'accroissement important de la stabilité au stockage des compositions collagénolytiques selon l'invention. Cet accroissement de stabilité se manifeste avec une ampleur particulière à l'occasion de la lyophilisation de préparations de '~J~j 31 ;~3Z5~
collagénase conforme à l'invention. Il sera donc parti-culièrement intéressant d'associer ces hydrolysats de collagène, très solubles a froid, aux préparations de collagénase dans la phase terminale de la préparation de ces dernieres. En particulier, ces hydrolysats de colla-gène pourront être ajoutés directement aux solutions de collagénase obtenues à partir des milieux de culture du micro-organisme producteur, notamment après les ultra-filtrations et les opérations de purification supplémen-taires requises des solutions obtenues, poux éliminer les constituants insolubles et solubles indésirables contenus dans les milieux de culture éliminés, mais avant la lyophilisation finale des préparations de collagène obtenues.
Des compositions pharmaceutiques préférées de l'invention contiennent les hydrolysats de collagène et la collagénase à raison de 1 à 25 mg, de préférence 2 à
mg d'hydrolysat de collagène pour 1 mg de collagéna-se~ On peut encore exprimer des rapports préférés de lafacon suivante. Les compositions préférées contiennent de 1 à 2S, notamment de 2 à 10, par exemple 5 mg d'hy-drolysat de collagène par microtal de collagène.
Il va sans dire que ces intervalles de pro-portions s'appliquent indistinctement au cas où le col-lagène est associé ou au cas où il n'est pas associé aux protéases et endonucléases sus-indiquées.
La composition pharmaceutique selon l'inven-tion joue donc un rôle essentiel au niveau de la des-truction des déchets tissulaires qui tendent à s'accu-muler dans la région des lésions du qenre en question, cette destruction tdétersion) devant nécessairement pré-céder le début de la cicatrisation naturelle ou induite, par exemple par greffe.
L'invention concerne encore un procédé de . . .
~3Z~
production d'une préparation active conforme à l'inven-tion, contenant plus particulièrement les trois types de constituants qui ont été en-risagés ci-dessus. Ce procédé
met plus particulièrement en oeuvre la bactérie aérobie Vibrio 319L___1YtiCUS chemovar i~hL9Y~- Ce procédé con-siste à cultiver ce micro-organisme dans des conditions en soi connues et à induire également de facon en soi connue la production de collagénase par l'addition au milieu de culture d'un inducteur approprié, plus parti-culièrement de collagène ou de'fragments de collagèna ayant un poids moléculaire encore suffisant pour ~ormer une structure secondaire caractéristique des chaînes hélicoidales de collagène, à poursuivre cette culture jusqu'après induction dans le milieu de culture d'une production desdites protéases neutres, la culture pouvant etre interrompue quand les proportions relatives de collagénase et de protéinase ont atteint des valeurs désirées comprises dans les intervalles respectifs sus-indiqués, la préparation active pouvant ensuite êtrerécupérée par des techniques en soi connues à partir du milieu de culture. En particulier, on peut, après élimi-~ nation des cellules, précipiter les protéines hors du ; surnageant avec une concentration suffisante de sulfate ; 25 d'ammonium pouvant par exemple atteindre 60 % du taux de saturation en ce sel de la solution. Le précipité remis en suspension peut être dialysé contre de l'eau distil--lée pour éliminer les ions entrainés au cours de la precipitation, avant d'etre finalement lyophilisé. En ; 30 variante, le principe actif peut être purifié par ultra-filtration.
Dans ce qui précède, c'est en jouant sur la durée de la culture que l'on a proposé de régler les proportions relatives de collagénase ou de protéase (ou ,. .
~ ~ .
~Z3Z~2 protéinase). Il peut également être envisagé de complé-ter la collagénase avec des protéinases et des endonu-cléases d'origine extérieure, ou au contraire de retirer l'excédent de protéinase et d'endonucléase pour le cas où cette solution pourrait être purifiée, eu égard au ;rendement accru en collagénase que l'on pourrait atten-dxe d'une prolongation de la durée de la culture.
Cette dernière opération pouxra être mise en oeuvre en mettant à profit les masses moléculaires très différentes de la collagénase et des protéinases : en particulier ces masses moléculaires sont supérieures à
30.000 pour la collagénase et inférieures à 30.000 pour les protéases, de sorte que leur séparation est aisée, par exemple sur des membranes ultra-filtrantes appro-priées. En particulier, le milieu de culture obtenu après l'interruption de la culture et la séparation des bactéries, peut faire l'objet de trois ultra-~iltrations successives : la première en vue d'éliminer les bacté-ries résiduelles et pour obtenir un liquide clair conte-nant la collagénase et les protéases, la seconde sur une ~-membrane ultra-filtrante séparant les protéines -des poids moléculaires supérieurs, à 30.000, particulière-ment les collagénases et la troisième sur une membrane :25 filtrante permettant de séparer les poids moléculaires supérieurs à 10.000, ce qui permet de récupérer les protéases. La collagénase et les protéases peuvent alors ensuite etre remélangées aux proportions voulues.
Conformément à la caractéristique supplémen-taire déjà mentionnée plus haut de l'invention il estavantageux, avant la récupération de la colla~énase et, le cas échéant des protéases et des endonucléases, éventuellement davantage purifiées, notamment par lyo-philisation de leurs solutions d'ajouter au préalable à
celles-ci des hydrolysats de collagène, de préférence dans les proportions qui ont ~té indiquées. En d'autres ~3Z~
termes, ce sont ces solutions complétées par les hydro-lysats de collagène, qui sont ensuite soumises à
lyophilisation.
L'addition de ces hydrolysats de collagène à
une collagénase en solution avant sa récupération à
partir de cette solution, peut dont également s'analyser comme représentant l'étape essentielle d'un pro~édé
visant à stabiliser ladite collagénase. Ce procédé de stabilisation est donc caractérisé par l'étape que constitue la lyophilisation de la solution contenant la collagénase, en présence des susdits hydrolysats de collagène, pris de préférence dans les proportions re-latives qui ont été indiquées plus haut vis-à-vis de la collagénase.
Pour doser les différents constituants de la composit:Lon, on peut avoir recours aux t~chniques décri-tes ci-après ~ui mettent en oeuvre les substrats, les réactifs et les méthodes de calcul également mentionnés ci-après.
I- DOSAGE DE LA COLLAGENASE (Wunsch E. et Heidrich H. G.
(1963) Z. fur Physiol. Chem. 333, 149-151) ~ SUBSTR~T
; Le substrats utilisé est du 4-phénylazo-benzyloxy-carbonyl-L-Pro-Leu Gly-L-Pro-D-Arg. HCl (PZ-PLGPR~, commercialisé par la Société Fluka.
REACTIFS
Les réactifs mis en oeuvre sont les suivants :
A. Tampon :
le tampon est constitué à partir des trois solutions suivantes :
- solution A1 : effectuée à l'aide de 160 mM
de véronal (sel de sodium de l'acide 5,5-diéthylbarbitu-ri~ue) et 143 mM d'acétate de sodium, 3 H20 ;
- solution A2 : HCl lN ;
- solution A3 : NaCl à 8,5 ~0 ;
~ .
~ 2~
le tampon est obtenu en mélangeant 200 ml de solution A1 avec 80 ml de solution A3, et en ajustant le pH ~ 8,5 avec la solution A2 ; on complète à 1 1 en ajoutant de l'eau et on additionne CaC12, 2 H20 pour o~tenir une concentration finale de 4 mM.
: B. Solution de substrat :
:~ elle est obtenue en dissolvant 10 mg de PZ-PLGPR dans iOO ~1 de méthanol ; on ajoute du tampon pour compléter à 10 ml et la solution de substrat ainsi obte-nue reste stable une semaine.
C. Echantillon de collagénase :
l'échantillon de collagénase est obtenu en conservant 1 mg de solution dans 1 ml de tampon j à
l'aide d'échantillons d'activité spécifique inconnue, on dilue selon les lectures préliminaires ; les dilutions optimales doivent donner les valeurs colorimétriques de la densité optique à 320 nm (~oir ci-dessous) dans la gamme de 0,1 à 1,0.
D. Acide citrique :
il s'agit d'une solution à 0,5 % dans l'eau.
- E. Acétate d'ethyle.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
1- on préchauffe la solution B à 37'C ;
2~ on mélange 0,1 ml de solution de collagéna-se (correctement diluée) avec 0,4 ml d~ solution B
préchauffée et on laisse incuber pendant 15 mn à 37'C ;
3~ on additionne 1 ml de solution D et on .~ 30 mélange ;
4- on additionne 5 ml d'acétate d'éthyle et on mélange vigoureusement ;
5- on enlève ensuite la couche organique supé-rieure et on sèche en additionnant Na2S04 anhydre ;
6- on mesure la densité optique à 320 nm par ~3,'Z~2 rapport a celle d'un témoin obtenu dans les mêmes condi-tions que l'échantillon étudié, selon la procédure indi-quéé sous les points 1 à 5, si ce n'est qu'on utilise du tampon à la p~ce du substrat (solution B).
~ETHODE DE CALCUL
1 unité Wunsch-~eidrich =
Densité optique à 320 nm (relative à 0,1 ml d'échantillon) ; 10 0,044 Activité spécifique de l'échantillon 0,2525 x densité optique à 320 nm exprimée en katals =-- ~ -- en nXat/mg ~g 1,0 ~kat = ~0 000 unités de WH
Le coefficient est déduit de la courbe d'étalonnages obtenue avec le produit qui découpe le peptide ~PZ-Pro-Leu) ~composé B commercialisé par Fluka).
II DOSAGE DES PROTEASES ~Laskowski M. ~1955) Methods in enzymology II, 32 ; Kunitz M. (1947) J. Gen. Physiol.
30, 291).
SUBSTRAT
Le substrat utilisé est de la caséine pour usage biochimique ~commercialisé par Merck, sous le n~ 2 244).
REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- solution A :
elle est constituée par :
Aa : acide bori~ue 0,2 M ~12,4 g/1 000 ml) ;
Ab : borax 0,05 ~ ~19,05 g/1 000 ml~ ;
~ pour obtenir la solution A, on ajuste 100 ml de solution ;~ Aa à pH 7,6 à l'aide de solution Ab ~environ 4 ml) ;
- solution B :
on met en suspension 1 g de caséine dans ~ r 32~
100 ml de solution A ; on chauf~e dans un bain d'eau a 100'C' jusqu'à dissolution totale (environ 15 mn) ; la solution opalescente alnsi obtenue peut être conservée pendant une semaine à 4~C ;
- solution C :
acide trichloroacétique à 5 ~ dans l'eau.
ECHANTILLON DE PROTEINASE
La dilution des échantillons contenant la protéinase doit être a~ustée selon le dosage préliminai-re jusqu'à un équivalent de 2-10 ~g de trypsine/ml.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
~ 1- on prépare les tubes (tubes de plastique Vida 11 x 70), en nombre correspondant au double du nombre d'échantillons, afin qu'à chaque échantillon corresponde son propre témoin ;
2' on fait pré-incuber 0,5 ml de solution B
dans chaque tube, pendant 5 mn, à 37-C ;
3- à chaque tube "d'échantillon", on ajoute 0,5 ml d'échantillon ; on fait incuber 20 mn à 37-C sous agitation ; on additionne 1,5 ml de solution C ;
4~ à chaque tu~e témoin, on additionne 1,5 ml de solution C ; on fait incuber 5 mn à 37-C et on ajoute 5 ml d'échantillon ;
5- on laisse tous les tubes à 4-C, toute la nuit ;
6- on centrifuge pendant 10 mn à 8 000 tr/mn à
température ambiante ;
~ETHODE DE CALCUL
1 unité Wunsch-~eidrich =
Densité optique à 320 nm (relative à 0,1 ml d'échantillon) ; 10 0,044 Activité spécifique de l'échantillon 0,2525 x densité optique à 320 nm exprimée en katals =-- ~ -- en nXat/mg ~g 1,0 ~kat = ~0 000 unités de WH
Le coefficient est déduit de la courbe d'étalonnages obtenue avec le produit qui découpe le peptide ~PZ-Pro-Leu) ~composé B commercialisé par Fluka).
II DOSAGE DES PROTEASES ~Laskowski M. ~1955) Methods in enzymology II, 32 ; Kunitz M. (1947) J. Gen. Physiol.
30, 291).
SUBSTRAT
Le substrat utilisé est de la caséine pour usage biochimique ~commercialisé par Merck, sous le n~ 2 244).
REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- solution A :
elle est constituée par :
Aa : acide bori~ue 0,2 M ~12,4 g/1 000 ml) ;
Ab : borax 0,05 ~ ~19,05 g/1 000 ml~ ;
~ pour obtenir la solution A, on ajuste 100 ml de solution ;~ Aa à pH 7,6 à l'aide de solution Ab ~environ 4 ml) ;
- solution B :
on met en suspension 1 g de caséine dans ~ r 32~
100 ml de solution A ; on chauf~e dans un bain d'eau a 100'C' jusqu'à dissolution totale (environ 15 mn) ; la solution opalescente alnsi obtenue peut être conservée pendant une semaine à 4~C ;
- solution C :
acide trichloroacétique à 5 ~ dans l'eau.
ECHANTILLON DE PROTEINASE
La dilution des échantillons contenant la protéinase doit être a~ustée selon le dosage préliminai-re jusqu'à un équivalent de 2-10 ~g de trypsine/ml.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
~ 1- on prépare les tubes (tubes de plastique Vida 11 x 70), en nombre correspondant au double du nombre d'échantillons, afin qu'à chaque échantillon corresponde son propre témoin ;
2' on fait pré-incuber 0,5 ml de solution B
dans chaque tube, pendant 5 mn, à 37-C ;
3- à chaque tube "d'échantillon", on ajoute 0,5 ml d'échantillon ; on fait incuber 20 mn à 37-C sous agitation ; on additionne 1,5 ml de solution C ;
4~ à chaque tu~e témoin, on additionne 1,5 ml de solution C ; on fait incuber 5 mn à 37-C et on ajoute 5 ml d'échantillon ;
5- on laisse tous les tubes à 4-C, toute la nuit ;
6- on centrifuge pendant 10 mn à 8 000 tr/mn à
température ambiante ;
7- on lit la densité optique à 280 (D0280) du surnageant de l'échantillon vis-à-vis du témoin correspondant.
CALCUL
1' Courbe d'étalonnages :
on di1ue une solution stockée de trypsine pure (0,1 mg/ml d'HCl 10 3 M) pour obtenir des concentrations : ~ ' :,i' !
~3~
finales de 1, 2, 4, 6, 8 ~g de trypsine par ml ; on ef-fectue ensuite les étapes 1 à 7 mentionnées dans le paragraphe précédent.
2~ Vne unité d'activité correspond à 1 ~g de trypsine ; une unité d'activité spécifique correspond à
1 ~g de trypsine par mg de protéine.
III DOSAGE DE LA DEOXYRIBONUCLEASE (Kunitz M. ~1950) J.
Gen. Physiol. 33, 3g9-363) REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- déoxyribonucléase I (commercialisée par BOEHRINGER) de qualité II (2 000 U/mg) ;
- acide déoxyribonucléique (commercialisée par BOEHRINGER) à 3 ml/10 mg.
TAMPON
Le tampon est constitué comme suit :
; 100 mM de Tris. HCl ; 4 mM de MgS04 ; 7 ~2~ i 1,8 mM de CaC12. 2 H20 ; on ajuste à pH 7,5 avec de l'acide chlo-rhY~rique.
SOLUTIONS
- Enzyme standard : on dissout 1 mg de déoxy-ribonucléase I dans 1 ml de tampon.
- Substrat : on clilue 150 ~1 dans 50 ml de ; 25 tampon.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
1- on ajuste au O l'absorbance à 260 nm de 3 ml de solution de substrat ;
2' on ajoute 100 ~1 de l'enzyme standard et on mélange ;
3- on enregistre la variation d'absorbance pendant 10 mn ;
4- on détermine le rapport ~A2~0 (variation d'absorbance à 260 nm)/mn ;
5~ on recommence les étapes 1 à 4 avec une ,. ~
~23~
solution de substrat frais et un échantillon d'enzyme inconnu et on détermine la valeur ~A260/mn.
CALCUL
m~/ml 3 densité optique à 280 mn (D0280) x 0,9 ; unités par mg ~A/mn x 1 000 x 6 de protéine mg d'enzyme utilisée IV DOSAGE DES PROTEINES (Lowry H.O., Roseborough N.J. et Randall R.J. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265) REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- solution A : Na2C03 à 2 % dans NaOH 0,1 M ;
- solution B : Na à 2 ~~0, tartrate de potassium ;
- solution C : CuS04 à 1 ~ ;
- solution D : 1 ml de solution B + 1 ml de solution C ; on dilue à 100 ml avec la solution A ;
solution E : réactif de foline dilué à 1/l.
~ COURBE D'ETALONNAGES
:~ 1- on prépare la solution de protéine de réfé-rence de 1 mg de sérum albumine bovine (BSA, commercia-:~ 25 lis~e par Sigma~ dans 2 ml d'eau ;
2- on prépare une série de dilutions de solu-tion de référence de 10 à 80 ~l à un volume final de 400 ~l dans l'eau ;
3~ on ajoute 2 ml de solution D, on mélange et on laissa 10 mn à la température du laboratoire ;
4- on additionne 200 ~l de solution E ; on laisse incuber à l'obscurité à 50-C pendant 10 mn ;
5- on lit la densité optique à 750 nM vis-à-vis du t~moin ~eau au lieu de la solution de BSA utili-sée dans l'étape 2-) ; on construit ainsi la courbe ~'étalonnages.
.., j~
~25~
DOSAGE
On traite l'échantillon inconnu à differentes dilutions (volume final 400 ~l, étape 2-~.
CALCULS
On exprime le contenu protéique de l'échantil-lon inconnu comme équi~alent en poids de sérum albumine bovine (BSA) de référence.
D'autres caractéristiques de l'invention appa-raîtront encore au cours de la description qui suit desconditions de culture de Vibrio al~inolyticus chemovar ioPhaqus. Référence sera faite aux figures dans les-quelles :
- la fig. 1 contient des courbes représentatives des concentratlons relatives de différentes enzymes dont les productions sont induites a l'occasion de la culture de la susdite bactérie en fonction du temps ;
- la fig. 2 comprend des courbes comparatives visant à
~;mettre en évidence le caractère inhibiteur de la myosine vis-à-vis de la collagénase.
La souche Vibrio alqinolyticus chemovar ioPhaqus (I-02g) est aérobie - anaérobie facultatif - et se présente sous forme de bâtonnets gram négati~ de 2-2,5 ~m de long et de 1-1,5 ~m de large, mobiles au ~'25 moyen de flagelles polaires simples. Elle forme dss colonies rondes et jaunes de 2-3 mm de diamètre, après incubation à 30'C pendant une nuit sur un milieu de ;thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS).
Elle présente une réponse positive dans les tests sui~ants : oxydase de cytochrome, réaction de Voges-Proskauer, production d'indole, decarboxylase de lysine, gélatinase (test de pellicule), estérase de l'agent ~ouillant commercialisé sous la désignation TWEEN 8d~ réductase de tétrathionate, réduction de nitrate, production d'acide à partir de glucose, maltose, mannitol, sucrose, tréhalose, mannose et '~,1 - . , .
~'~3Z~Z
glycérol, utilisation de citrate ~Simmons). Elle est sensible à l'action des antibiotiques aminoglycosidi-ques, au chloramphénicol, aux tétracyclines, à la colistine, à la rifampicine, aux sulfonamides, à l'acide ; nalixide, à la nitrofurantoine et à l'agent vibriosta tique 0/129 dans le test du disque, mais elle résiste à
la triméthoprime.
Elle donne une réponse négative dans les tests suivants : réaction au rouge de méthyle, dihydrolase d'arginine, uréase, phénylalanine déaminase, test ONPG, productio~ d'H2S (agar fer ~ligler), production de gaz de glucose, production d'acide à partir de xylose, d'arabinose, d'adonitol, de rhamnose, de sorbose, de sOrbitol~ de dulcitol, de lactose, d'inositol, de salicine, de raffinose, de mellibiose, d'a-méthylgluco-side, de mucate. Elle n'utilise pas le malonate.
La souche I-029 est très halophile avec une croissance optimale qui se produit dans du chlorure de sodium à 13 ~'O et une tolérance apparente au chlorure de sodium à 15 %. Elle est également pleinement résistante ~- à l'ampicilline, à la carbénicilline, en partie à la cé-phalotine. Elle présente des réactions positives dans les tests à la décarboxylase ornithine et dans les tests de fermentation de cellobiose.
CONDITIONS DE CULTURE
Les cellules sont cultivées sous agitation et aération forcée (1,4 atmosphères) à 30 C dans un milieu contenant Tris. HCl 0,1 M, NaCl 0,4 M, 2 mM de CaCl2, à
pH 7, contenant soit des acides casaminés à 2,5 ~~O tDifco Labs., Detroit, Mich.). Deux heures après le début de la culture, on ajoute au milieu la composition commerciali-sée sous la désignation ASF ~fragments de peptide de collag~ne de peau de veau ; poids moléculaire moyen . . .
.
~z~
7000, ROUSSELOT S.A., France) pour obtenir une concen-tration de 1,5 % en polds. Pour les contrôles de crois-sance, la turbidité est mesurée par l'absorbance par cm-1 a 600 nm dans échantillons extraits à une heure d'intervalle.
PRODUCTION DE CGLLAGENASE, DE PROTEINASE ET DE NUCLEASE
La souche produit de la protéinase caséinolytique de la nucléase extra-cellulaire et, dès ~ue l'ASF a été ajouté, de la collagénase. Le niveau d'activité de la col].agénase s'élève alors jusqu'à
atteindre 60 nkatlml.
les courbes de la fig. 1 sont représentatives en ce qu.i concerne:
- la courbe a, de la croissance cellulaire, - la courbe b, de l'activité de la collagénase, - la courbe c, de l'activité de la protéinase caséinolytique et - la courbe d, de l'activité de la nucléase, en fonction du temps.
La culture est de préférence interrompue, lorsque l'activité de la collaténase passe par un m~xi-mum, notamment au bout de 5 heures dans le cas représen-té. La collagénase est concentrée et récupérée à partir de ce milieu. Elle peut être davantage purifiée comme comme décrit dans les ouvrages de KEIL-DLO~HA, V. 1976, "Chemical characterization and study of the autodige~-tion of pure collagenase from Achromobacter ioPhaqus ~iochem. Biphys. Acta, 429, 239-305 et de LECROISEY A., V. KEIL-DLOUHA, D.R. WOODS, D. PERRIN et B. KEIL, 1975, "Purification, stability and inhibition of the collage-nase from Achromobacter ioPhaq~, FE~S Letters 59, 167-172.
l~ne préparation type d'Ach.romase contient 0,312 mg de protéine (poids sec) par mg du produit t~tal. Elle se caractérise par les activités relatives r ~232~
suivantes, par mg de po.ids sec de protéine:
- collagénase : 0,554 ~kat - protéases : 145 unités caséinolytiques - endonucléases: 477 unités nucléasiques Stabilisation de l'activité collaqénolYtique L'introduction dans une solution de collagé-nase d'hydrolysat de collagène a pour effet de stabili-ser l'activité collagénol~tique lorsque la préparation est lyophilisée. Les effets de cette stabilisation, exprimés en pourcentages de préservation de l'activité
enzymatique d'une préparation de collagénase, avant et après lyophilisation, ont été appréciés dans des essais dans lesquels on a mis en oeuvre des proportions varia-bles d'hydrolysat de collagene vis-à-vis d'une dose déterminée de collagénase. L'hydrolysat de collagène util.isé était cèlui commercialisé en France sous la dé-signation ASF par les Etablissements Rousselot S.A. Il . s'agissait d'une gélatine atomisée soluble à froid dans ~: 20 l'eau.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après pour les proportions relatives d'Achromase et d'ASF qui résultent de la colonne de gauche du tableau.
ACTIVITE ENZYMATIOUE EN ~
_~ _ __ _ 3 ~vant l~ophilisation Apr~s lyc 1 : O 100 50 1 : 1 100 6~
1 : 5 100 96,6 1 : 10 100 94 1 : 25 100 78 .
7~
Il résulte de l'examen de ce tableau que:
- la lyophilisation d'une solution d'Achromase, en l'absence d'ASF entraîne une perte de 50 ~~0 de l'activité
collagénolytique et -- l'addition d'AS~ réduit sensiblement les pertes d'activité.
Des résultats particulièrement favorables sont observés pour des proportions de 2 à 10 parties en poids d'ASF par rappoxt à une partie du poids d'Achromase.
Pour la proportion de 5 parties d'ASF pour une partie d'Achromase on constate une préservation quasi totale de l'activité enzymatique de la solution initiale.
A la préservation de l'activité enzymatique au cours de la lyophilisation, s'ajoute encore la remarqua-ble stabilité qui peut être conférée par les hydrolysats de collagène aux prépaxations de collagénase lyophili-sée, à l'occasion de leur stockage. Il a ainsi été cons-taté que la perte d'activité collagénolytique, en %, à
la tempéxature de 4-C, était de 25 % pour une collagé-nase exempte d'hydrolysat de collagène au bout de 7 mois. Au terme du meme délai. et à la meme température l'activ.ité collagénolytique de préparations de collagé-nase contenant de 1 à 10 parties en poids d'hydrolysat de collagène pour une partie en poids de collagénase était conservée à 100 ~~0.
les mêmes effets de stabilité réalisés à la température de 20 C au lieu de 4~C ont conduit au bout de 7 mois à une perte d'activité de 30 % pour la prépa-ration de collagénase exempte d'hydrolysats collagéno-lytiques et de 5 % seulement pour des préparations con-tenant les mêmes proportions d'h~drolysat collagénolyti-que que ci-dessus.
Des stabilisations semblables ont été obser-vées sur d'autres types de préparations à base de :, f ~ ~
:L~23;~
22collagénase (ou d'Achromase), notamment lorsque celles-ci se présentent sous des formes pretes à l'emploi, telles que cel]es dont il sera question plus loin.
Propriétés bioloqiques Les préparations de collagénase obtenues pré-sentent, outre leur activité collagénolytique sus-indiquée, la caractéristique d'être inhibées par la ~' myosine, laquelle joue le rôle d'un inhibiteur non com-pétitif pour la collagénase. Cette propriété peut être -~ mise en oeuvre en ayant recours à la technique mettant ,; en jeu l'étude cinétique de l'effet de la myosine sur l'activité de la collagénase vis-à-vis du collagène.
La dégradation du collagène par la collagénase est suivie par le dosage de l'hydroxyproline libérée après hydrolyse des fragments de collagène solubilisés par la digestion.
L'hydroxyproline étant un acide aminé spéci-fique du collagène, les autres protéines contenues dans le mélange réactionnel n'interfèrent pas lors du dosage.
Le mélange ci-dessous est incubé au sein d'un tampon Tris, HCl, 0,02 M, NaCl 0,23 M, caC12 5.10 3M, pH
7,4 pendant une heure à 37-C:
- collagène musculaire en fibre de 5 à 30 mg, ~ collagénase à 0,1 my/ml dans du CaC12 10 4: 1 ml, - tampon d'incubation ou - suspension de myosine à 5 mg/ml dans ce même tampon :
5 ml.
Après incubation, le mélange réactionnel est centrifugé 5 minutes à 12.000 g 0,5 ml de surnageant sont hydrolyses une nuit à 110'C avec 0,5 ml d'HCl 12 N.
Les échantillons sont ensuite évaporés sous vide et repris par un volume d'eau tel que le dosage de l'hydro-xyproline soit rendu possible.
3j Le résultat d'un tel essai avec une collagé-nase titrant 0,098 ~kat~ml est illustré par les courbes ~32~
de la fig. 2, d~ns laquelle la courbe e est représenta tive des variations du rapport 1/v (v représentant le nombre de moles de collagene digérés par heure à 37~C) en fonction du rapport 1/s ~s représentant le nombre de moles de collagène mis en oeuvre), mis en présence de la collagénase, en l'absence de myosine (interprétation selon LINWEAVER BURK).
La courbe f est représentative de l'évolution de la digestion des mêmes préparations respectivement en présence de ~ mg de myosine.
L'examen de ces courbes fait apparaitre les effets très significatifs de l'inhibition de l'activité
des préparations de collagénase considérés vis-à-vis du collagène.
La collagénase mise en oeuvre selon l'inven-tion est dépourvue de toute toxicité. Ceci peut être montré par l'étude des doses léthales effectuée sur la souris selon la méthode de J.T. LICHTFIEL~ et F.W.
WILCOXON.
Les DL-50 mesurées avec une préparation injec-tée par voie intraveineuse à activité collagénolytique selon l'invention, titrant 0,17 ~kat/mg de protéine, ont été le5 suivantes:
~ 8,58 mg par kg de souris, ce qui correspond à
- 1,46 ~at par kg de souris, lorsque l'on rapporte catte dose léthale aux unités d'activité collagénolytique de la préparation.
La remar~uable activité collagénolytique des preparations selon l'invention a été démontrée dans les tests pharmacologiques ln vivo indiqués ci-après.
Ces tests ont consisté dans le traitement avec une préparation contenant la collagénase selon l'inven-tion de brulures préalablement effectuées sur la peau de porcs, par application d'eau à la température de 80-C, en plusieurs points du dos de ces animaux pendant 15 ;
,, , . .
i~ Z
2~
secondes (6 lésions sur le côté droit et 6 lésions sur le côté gauche des porcs). L'épiderme mort est alors enlevé des surfaces ébouillantées et les lésions ont été
exposées à l'air pendant 48 heures. Chaque lésion avait un diamètre de l'ordre de 3,3 cm. Les essais effectués avec la pommade contenant la collagénase ont été doublés d'essais effectués avec une pommade analogue, mais qui était dépourvue de collagénase, cette pommade ayant été
utilisée à titre de témoin.
Les compositions de ces pommades étaient les suivantes :
Pour la pommade témoin :
- alcool polyoxyéthylénique ...................... 13 g 15 ~ huile de vaseline~ ............................. 20 g - eau ........................................... 100 g - hydroxyle de sodium pour régler le pH à 7.
La pommade contenant la collagénase contient les memes excipients, et 0,25 ~kat de collagénase par g de pommade~
La pommade contenant la collagénase a été
appliquée sur les lésions du côté droit des porcs, la pommade témoin sur celles du côté gauche.
Les applications de pommade ont été répétées 25 respectivement 3 jours, 4 jours, 6 jours et 13 jours ; après la réalisation des brûlures.
On a fait les observations suivantes 6 jours et 13 jours après la r~alisation des brûlures:
Etat des brûlures 6 iours PlUS tard :
La pro~ondeur de la brûlure et l'épaisseur du tissu qui a survécu sont approximativement les mêmes dans les brûlures traitées par la pommade et celles ayant reçu la composition temoin.
Dans les brûlures traitées avec la pommade témoin, on constate la présence d'escarres contenant des fibres intactes de collagène sur les 6 brûlures. Les 32~
~ 5 brûlures traitées avec la pommade contenant la collagé-nase selon l'invention n'en comportent aucune.
On constate la présence de cellules inflamma-toires infiltrées dans la partie supérleure du derme surles 6 brûlures traitées par la pommade à la collagénase.
La même observation ne peut être faite que sur 3 brûlures témoins. L'afflux de cellules inflammatoires témoigne d'un processus de cicatrisation plus avancé que dans les brûlures où ces infiltrations n'ont pas eu 1 i~u .
On ne constate cependant que peu de différen-ces au niveau de la réparation de l'épiderme et du tissu conjonctif entre les brûlures traitées et les brûlures témoins, sauf que cette réparation paraît un peu plus avancée dans le cas des brûlures traitées L'état des brûlures 13 iours plus tard On constate chez les animaux traités que les brûlures sont recouvertes d'une mince pellicule de tissu dégradé. Du tissu conjonctif nouveau s'est développé sur la totalité de la surface des brûlures, immédiatement sous cette pellicule ainsi que plus en profondeur, dans le derme. L'épiderme s'est développé sous la forme d'un tissu de granulation à partir des bords des lésions, immédiatement sous la pellicule de tissu dégradé.
On constate dans les lésions traitées que la partie collagène des escarres a été dissoute par la col-lagénase, de sorte que la régénération du tissu conjonc-tif a pu se développer en surface, dans des conditions analogues à celles qui sont observées dans le cas de blessures par coupures. L'épiderme formé peut migrer sur la surface de ce tissu de granulation.
On constate au contraire que les brûlures té-moins sont recouvertes d'escarres profondes de collagène compact qui adhère au tissu et le recouvre. Il s'est forme du tissu conjonctif nouveau seulement sous la ~' ~3~
nouvelle couche d'épiderme qui s'est formée sur les seuls bords des brulures. I,'épiderme a migr~ à partir des bords de la lésion, à travers le derme, sous les escarres susdites, séparant ainsi celles-ci du tissu profond. Donc les sources d'épidermes nouveaux ne se constatent qu'au bord des lésions, ce qui requérait une greffe chirurgical~ d'epiderme pour assurer la cicatri-sation complète de ces lésions.
L'un des avantages de la pommade contenant la colla~énase réside dans le fait que le traitement enzy-matique réalise automatiquement un équilibre correct entre les tissus nécrotiques et les tissus viables, équilibre ~u'il serait difficile de recréer par la voie chirurgicale.
Les préparations pharmaceutiques selon l'in-vention peuvent se présenter sous toutes les formes sus-ceptibles d'être mises en oeuvre par application exter-ne: gels, émulsions, notamment telles que pommades et crèmes, ou solutions ou formes pulvérisables (aérosols ~ en poudre)/ la collagénase étant dans chaque préparation '~ associée à des excipients conformes selon le cas à
chacune desdites formes. Dans le cas de solutions pour l'application topique, on aura recours avantageusement à
une mise en solution de la collagénase dans un milieu isotonique, de préférence un tampon physiologiquement acceptable de pH 7-8,5, et de préférence stérile.
Les préparations de collagénase sous forme de - solutions au sein d'un véhicllle stérile injectable peuvent être administrées par la voie sous-cutanéel à
proximité des plaies à traiter ou des chélo;des. On peut également en~isager l'utilisation de ces solutions in-jectables, pour les administrations profondes, notamment en vue de la destruction de l'accumulation pathologique du collagène dans les tissus, comme par exemple dans les disques intexvertébraux.
~'~3Z.~
Les compositions pharmaceutiques selon l'in-vention sont donc applicables à tous types de lésions se manifestant par une altération incontrôlée des structu-res riches en collagène. A titre d'exemple de lésions qui peuvent être traitées, on citera les brûlures, ulcères, escarres, les escarres dures ou blanches à base de colla~ène, chéloides, telles ~ue celles produites après des interventions chirurgicales, nécroses, en particulier dans le cas des décubitus ou des ulcères.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être appliquées à titre préventif, notamment préalablement à des interventions chirur-gicales ~isant à réaliser des greffes plastiques ou autres, ou à des interventions de chirurgie esthétique, et d'une façon genérale à toutes blessures de la peau.
Les solutions de collagénase selon l'invention peuvent aussi être appliquées au traitement des caries dentaires. On sait en effet que la pulpe dentaire est essentiellement constituée de collagène calcifié com-pact, la carie dentaire se manifestant par une fissura-tion ou un perçage de la dent, par lequel s'échappe le calcium. La trame décalcifiée de collagène qui subsiste devient alors poreuse et ris~ue de de~enir le siège d'une infection bactérienne.
Par introduction d'une solution concentrée de collagénase con~orme à l'invention dans cette trame, on induit la dissolution du collagène poreux qui peut alors être éliminé par rinçage. I.'action de la collagénase s'interrompt d'elle-même au niveau du collagène calcifié
sain.
La solution de collagénase utilisée, tamponnée à pH 7-8,5, notamment au borate, contient de pxéférence au moins 1 ~kat de collagénase par ml de solution. A
cette concentration et a fortiori pour des concentra-tions plus élevées, le collagène poreux est rapidement ~,rl ~L2~
dissous.
Après rincage et désinfection, la dent traitée peut être refermée en mettant en oeuvre des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les traces résiduelles possibles de collagénase retenues dans la dent sont progressivement inhibées par le pH acide dominant qui se réinstalle au coeur de la dent.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement aux cas qui ont été envisagés dans ce qui précède. Elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles où les propriétés stabili-santes des hydrolysats de collagène sont mises en oeuvre à l'égard de toutes autres collagénases susceptibles d'être mises en oeuvre dans la constitution de composi-tions pharmaceutiques, dès lors que ces collagénases présentent à la fois les activités sélectives qui ont été définies dans ce qui précède et l'innocuité désira-ble aux doses suffisantes auxquelles l'activité colla-génolytique sélective est susceptible de se manifester.
A ce titre l'invention concerne toute association d'une collagénase répondant aux conditions qui précèdent, quelle que soit la source, notamment les cultures de micxoorganismes à partir desquelles elle a été obtenue, en association avec des hydrolysats de collagène. Ces compositions associant les deux types de principes, notamment dans des proportions équivalentes aux inter-valles de proportions préférés qui ont été indiqués, constituent des équivalents des associations plus parti-culièrement revendiquées dans certaines des revendica-tions qui suivent.
De la même façon les revendications plus par-ticulièrement relatives aux procédés de stabilisation d'une collagénase et plus particulièrement de l'Achromase, notamment par lyophilisation de leurs , . ~
~3~
solutions en présence d'hydrolysats de collagène éten-dent leurs effets à la stabilisation de toute forme de collagénase, notamment a l'occasion des lyophilisations de leurs solutions, dès lors que serait mis en oeuvre de la même manière des hydrolysats de collagène, en parti-culier dans les intervalles de proportions relatives définis plus haut.
CALCUL
1' Courbe d'étalonnages :
on di1ue une solution stockée de trypsine pure (0,1 mg/ml d'HCl 10 3 M) pour obtenir des concentrations : ~ ' :,i' !
~3~
finales de 1, 2, 4, 6, 8 ~g de trypsine par ml ; on ef-fectue ensuite les étapes 1 à 7 mentionnées dans le paragraphe précédent.
2~ Vne unité d'activité correspond à 1 ~g de trypsine ; une unité d'activité spécifique correspond à
1 ~g de trypsine par mg de protéine.
III DOSAGE DE LA DEOXYRIBONUCLEASE (Kunitz M. ~1950) J.
Gen. Physiol. 33, 3g9-363) REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- déoxyribonucléase I (commercialisée par BOEHRINGER) de qualité II (2 000 U/mg) ;
- acide déoxyribonucléique (commercialisée par BOEHRINGER) à 3 ml/10 mg.
TAMPON
Le tampon est constitué comme suit :
; 100 mM de Tris. HCl ; 4 mM de MgS04 ; 7 ~2~ i 1,8 mM de CaC12. 2 H20 ; on ajuste à pH 7,5 avec de l'acide chlo-rhY~rique.
SOLUTIONS
- Enzyme standard : on dissout 1 mg de déoxy-ribonucléase I dans 1 ml de tampon.
- Substrat : on clilue 150 ~1 dans 50 ml de ; 25 tampon.
TECHNIQUE DE DOSAGE
Elle se déroule comme suit :
1- on ajuste au O l'absorbance à 260 nm de 3 ml de solution de substrat ;
2' on ajoute 100 ~1 de l'enzyme standard et on mélange ;
3- on enregistre la variation d'absorbance pendant 10 mn ;
4- on détermine le rapport ~A2~0 (variation d'absorbance à 260 nm)/mn ;
5~ on recommence les étapes 1 à 4 avec une ,. ~
~23~
solution de substrat frais et un échantillon d'enzyme inconnu et on détermine la valeur ~A260/mn.
CALCUL
m~/ml 3 densité optique à 280 mn (D0280) x 0,9 ; unités par mg ~A/mn x 1 000 x 6 de protéine mg d'enzyme utilisée IV DOSAGE DES PROTEINES (Lowry H.O., Roseborough N.J. et Randall R.J. (1951), J. Biol. Chem. 193, 265) REACTIFS
Les réactifs utilisés sont les suivants :
- solution A : Na2C03 à 2 % dans NaOH 0,1 M ;
- solution B : Na à 2 ~~0, tartrate de potassium ;
- solution C : CuS04 à 1 ~ ;
- solution D : 1 ml de solution B + 1 ml de solution C ; on dilue à 100 ml avec la solution A ;
solution E : réactif de foline dilué à 1/l.
~ COURBE D'ETALONNAGES
:~ 1- on prépare la solution de protéine de réfé-rence de 1 mg de sérum albumine bovine (BSA, commercia-:~ 25 lis~e par Sigma~ dans 2 ml d'eau ;
2- on prépare une série de dilutions de solu-tion de référence de 10 à 80 ~l à un volume final de 400 ~l dans l'eau ;
3~ on ajoute 2 ml de solution D, on mélange et on laissa 10 mn à la température du laboratoire ;
4- on additionne 200 ~l de solution E ; on laisse incuber à l'obscurité à 50-C pendant 10 mn ;
5- on lit la densité optique à 750 nM vis-à-vis du t~moin ~eau au lieu de la solution de BSA utili-sée dans l'étape 2-) ; on construit ainsi la courbe ~'étalonnages.
.., j~
~25~
DOSAGE
On traite l'échantillon inconnu à differentes dilutions (volume final 400 ~l, étape 2-~.
CALCULS
On exprime le contenu protéique de l'échantil-lon inconnu comme équi~alent en poids de sérum albumine bovine (BSA) de référence.
D'autres caractéristiques de l'invention appa-raîtront encore au cours de la description qui suit desconditions de culture de Vibrio al~inolyticus chemovar ioPhaqus. Référence sera faite aux figures dans les-quelles :
- la fig. 1 contient des courbes représentatives des concentratlons relatives de différentes enzymes dont les productions sont induites a l'occasion de la culture de la susdite bactérie en fonction du temps ;
- la fig. 2 comprend des courbes comparatives visant à
~;mettre en évidence le caractère inhibiteur de la myosine vis-à-vis de la collagénase.
La souche Vibrio alqinolyticus chemovar ioPhaqus (I-02g) est aérobie - anaérobie facultatif - et se présente sous forme de bâtonnets gram négati~ de 2-2,5 ~m de long et de 1-1,5 ~m de large, mobiles au ~'25 moyen de flagelles polaires simples. Elle forme dss colonies rondes et jaunes de 2-3 mm de diamètre, après incubation à 30'C pendant une nuit sur un milieu de ;thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS).
Elle présente une réponse positive dans les tests sui~ants : oxydase de cytochrome, réaction de Voges-Proskauer, production d'indole, decarboxylase de lysine, gélatinase (test de pellicule), estérase de l'agent ~ouillant commercialisé sous la désignation TWEEN 8d~ réductase de tétrathionate, réduction de nitrate, production d'acide à partir de glucose, maltose, mannitol, sucrose, tréhalose, mannose et '~,1 - . , .
~'~3Z~Z
glycérol, utilisation de citrate ~Simmons). Elle est sensible à l'action des antibiotiques aminoglycosidi-ques, au chloramphénicol, aux tétracyclines, à la colistine, à la rifampicine, aux sulfonamides, à l'acide ; nalixide, à la nitrofurantoine et à l'agent vibriosta tique 0/129 dans le test du disque, mais elle résiste à
la triméthoprime.
Elle donne une réponse négative dans les tests suivants : réaction au rouge de méthyle, dihydrolase d'arginine, uréase, phénylalanine déaminase, test ONPG, productio~ d'H2S (agar fer ~ligler), production de gaz de glucose, production d'acide à partir de xylose, d'arabinose, d'adonitol, de rhamnose, de sorbose, de sOrbitol~ de dulcitol, de lactose, d'inositol, de salicine, de raffinose, de mellibiose, d'a-méthylgluco-side, de mucate. Elle n'utilise pas le malonate.
La souche I-029 est très halophile avec une croissance optimale qui se produit dans du chlorure de sodium à 13 ~'O et une tolérance apparente au chlorure de sodium à 15 %. Elle est également pleinement résistante ~- à l'ampicilline, à la carbénicilline, en partie à la cé-phalotine. Elle présente des réactions positives dans les tests à la décarboxylase ornithine et dans les tests de fermentation de cellobiose.
CONDITIONS DE CULTURE
Les cellules sont cultivées sous agitation et aération forcée (1,4 atmosphères) à 30 C dans un milieu contenant Tris. HCl 0,1 M, NaCl 0,4 M, 2 mM de CaCl2, à
pH 7, contenant soit des acides casaminés à 2,5 ~~O tDifco Labs., Detroit, Mich.). Deux heures après le début de la culture, on ajoute au milieu la composition commerciali-sée sous la désignation ASF ~fragments de peptide de collag~ne de peau de veau ; poids moléculaire moyen . . .
.
~z~
7000, ROUSSELOT S.A., France) pour obtenir une concen-tration de 1,5 % en polds. Pour les contrôles de crois-sance, la turbidité est mesurée par l'absorbance par cm-1 a 600 nm dans échantillons extraits à une heure d'intervalle.
PRODUCTION DE CGLLAGENASE, DE PROTEINASE ET DE NUCLEASE
La souche produit de la protéinase caséinolytique de la nucléase extra-cellulaire et, dès ~ue l'ASF a été ajouté, de la collagénase. Le niveau d'activité de la col].agénase s'élève alors jusqu'à
atteindre 60 nkatlml.
les courbes de la fig. 1 sont représentatives en ce qu.i concerne:
- la courbe a, de la croissance cellulaire, - la courbe b, de l'activité de la collagénase, - la courbe c, de l'activité de la protéinase caséinolytique et - la courbe d, de l'activité de la nucléase, en fonction du temps.
La culture est de préférence interrompue, lorsque l'activité de la collaténase passe par un m~xi-mum, notamment au bout de 5 heures dans le cas représen-té. La collagénase est concentrée et récupérée à partir de ce milieu. Elle peut être davantage purifiée comme comme décrit dans les ouvrages de KEIL-DLO~HA, V. 1976, "Chemical characterization and study of the autodige~-tion of pure collagenase from Achromobacter ioPhaqus ~iochem. Biphys. Acta, 429, 239-305 et de LECROISEY A., V. KEIL-DLOUHA, D.R. WOODS, D. PERRIN et B. KEIL, 1975, "Purification, stability and inhibition of the collage-nase from Achromobacter ioPhaq~, FE~S Letters 59, 167-172.
l~ne préparation type d'Ach.romase contient 0,312 mg de protéine (poids sec) par mg du produit t~tal. Elle se caractérise par les activités relatives r ~232~
suivantes, par mg de po.ids sec de protéine:
- collagénase : 0,554 ~kat - protéases : 145 unités caséinolytiques - endonucléases: 477 unités nucléasiques Stabilisation de l'activité collaqénolYtique L'introduction dans une solution de collagé-nase d'hydrolysat de collagène a pour effet de stabili-ser l'activité collagénol~tique lorsque la préparation est lyophilisée. Les effets de cette stabilisation, exprimés en pourcentages de préservation de l'activité
enzymatique d'une préparation de collagénase, avant et après lyophilisation, ont été appréciés dans des essais dans lesquels on a mis en oeuvre des proportions varia-bles d'hydrolysat de collagene vis-à-vis d'une dose déterminée de collagénase. L'hydrolysat de collagène util.isé était cèlui commercialisé en France sous la dé-signation ASF par les Etablissements Rousselot S.A. Il . s'agissait d'une gélatine atomisée soluble à froid dans ~: 20 l'eau.
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau ci-après pour les proportions relatives d'Achromase et d'ASF qui résultent de la colonne de gauche du tableau.
ACTIVITE ENZYMATIOUE EN ~
_~ _ __ _ 3 ~vant l~ophilisation Apr~s lyc 1 : O 100 50 1 : 1 100 6~
1 : 5 100 96,6 1 : 10 100 94 1 : 25 100 78 .
7~
Il résulte de l'examen de ce tableau que:
- la lyophilisation d'une solution d'Achromase, en l'absence d'ASF entraîne une perte de 50 ~~0 de l'activité
collagénolytique et -- l'addition d'AS~ réduit sensiblement les pertes d'activité.
Des résultats particulièrement favorables sont observés pour des proportions de 2 à 10 parties en poids d'ASF par rappoxt à une partie du poids d'Achromase.
Pour la proportion de 5 parties d'ASF pour une partie d'Achromase on constate une préservation quasi totale de l'activité enzymatique de la solution initiale.
A la préservation de l'activité enzymatique au cours de la lyophilisation, s'ajoute encore la remarqua-ble stabilité qui peut être conférée par les hydrolysats de collagène aux prépaxations de collagénase lyophili-sée, à l'occasion de leur stockage. Il a ainsi été cons-taté que la perte d'activité collagénolytique, en %, à
la tempéxature de 4-C, était de 25 % pour une collagé-nase exempte d'hydrolysat de collagène au bout de 7 mois. Au terme du meme délai. et à la meme température l'activ.ité collagénolytique de préparations de collagé-nase contenant de 1 à 10 parties en poids d'hydrolysat de collagène pour une partie en poids de collagénase était conservée à 100 ~~0.
les mêmes effets de stabilité réalisés à la température de 20 C au lieu de 4~C ont conduit au bout de 7 mois à une perte d'activité de 30 % pour la prépa-ration de collagénase exempte d'hydrolysats collagéno-lytiques et de 5 % seulement pour des préparations con-tenant les mêmes proportions d'h~drolysat collagénolyti-que que ci-dessus.
Des stabilisations semblables ont été obser-vées sur d'autres types de préparations à base de :, f ~ ~
:L~23;~
22collagénase (ou d'Achromase), notamment lorsque celles-ci se présentent sous des formes pretes à l'emploi, telles que cel]es dont il sera question plus loin.
Propriétés bioloqiques Les préparations de collagénase obtenues pré-sentent, outre leur activité collagénolytique sus-indiquée, la caractéristique d'être inhibées par la ~' myosine, laquelle joue le rôle d'un inhibiteur non com-pétitif pour la collagénase. Cette propriété peut être -~ mise en oeuvre en ayant recours à la technique mettant ,; en jeu l'étude cinétique de l'effet de la myosine sur l'activité de la collagénase vis-à-vis du collagène.
La dégradation du collagène par la collagénase est suivie par le dosage de l'hydroxyproline libérée après hydrolyse des fragments de collagène solubilisés par la digestion.
L'hydroxyproline étant un acide aminé spéci-fique du collagène, les autres protéines contenues dans le mélange réactionnel n'interfèrent pas lors du dosage.
Le mélange ci-dessous est incubé au sein d'un tampon Tris, HCl, 0,02 M, NaCl 0,23 M, caC12 5.10 3M, pH
7,4 pendant une heure à 37-C:
- collagène musculaire en fibre de 5 à 30 mg, ~ collagénase à 0,1 my/ml dans du CaC12 10 4: 1 ml, - tampon d'incubation ou - suspension de myosine à 5 mg/ml dans ce même tampon :
5 ml.
Après incubation, le mélange réactionnel est centrifugé 5 minutes à 12.000 g 0,5 ml de surnageant sont hydrolyses une nuit à 110'C avec 0,5 ml d'HCl 12 N.
Les échantillons sont ensuite évaporés sous vide et repris par un volume d'eau tel que le dosage de l'hydro-xyproline soit rendu possible.
3j Le résultat d'un tel essai avec une collagé-nase titrant 0,098 ~kat~ml est illustré par les courbes ~32~
de la fig. 2, d~ns laquelle la courbe e est représenta tive des variations du rapport 1/v (v représentant le nombre de moles de collagene digérés par heure à 37~C) en fonction du rapport 1/s ~s représentant le nombre de moles de collagène mis en oeuvre), mis en présence de la collagénase, en l'absence de myosine (interprétation selon LINWEAVER BURK).
La courbe f est représentative de l'évolution de la digestion des mêmes préparations respectivement en présence de ~ mg de myosine.
L'examen de ces courbes fait apparaitre les effets très significatifs de l'inhibition de l'activité
des préparations de collagénase considérés vis-à-vis du collagène.
La collagénase mise en oeuvre selon l'inven-tion est dépourvue de toute toxicité. Ceci peut être montré par l'étude des doses léthales effectuée sur la souris selon la méthode de J.T. LICHTFIEL~ et F.W.
WILCOXON.
Les DL-50 mesurées avec une préparation injec-tée par voie intraveineuse à activité collagénolytique selon l'invention, titrant 0,17 ~kat/mg de protéine, ont été le5 suivantes:
~ 8,58 mg par kg de souris, ce qui correspond à
- 1,46 ~at par kg de souris, lorsque l'on rapporte catte dose léthale aux unités d'activité collagénolytique de la préparation.
La remar~uable activité collagénolytique des preparations selon l'invention a été démontrée dans les tests pharmacologiques ln vivo indiqués ci-après.
Ces tests ont consisté dans le traitement avec une préparation contenant la collagénase selon l'inven-tion de brulures préalablement effectuées sur la peau de porcs, par application d'eau à la température de 80-C, en plusieurs points du dos de ces animaux pendant 15 ;
,, , . .
i~ Z
2~
secondes (6 lésions sur le côté droit et 6 lésions sur le côté gauche des porcs). L'épiderme mort est alors enlevé des surfaces ébouillantées et les lésions ont été
exposées à l'air pendant 48 heures. Chaque lésion avait un diamètre de l'ordre de 3,3 cm. Les essais effectués avec la pommade contenant la collagénase ont été doublés d'essais effectués avec une pommade analogue, mais qui était dépourvue de collagénase, cette pommade ayant été
utilisée à titre de témoin.
Les compositions de ces pommades étaient les suivantes :
Pour la pommade témoin :
- alcool polyoxyéthylénique ...................... 13 g 15 ~ huile de vaseline~ ............................. 20 g - eau ........................................... 100 g - hydroxyle de sodium pour régler le pH à 7.
La pommade contenant la collagénase contient les memes excipients, et 0,25 ~kat de collagénase par g de pommade~
La pommade contenant la collagénase a été
appliquée sur les lésions du côté droit des porcs, la pommade témoin sur celles du côté gauche.
Les applications de pommade ont été répétées 25 respectivement 3 jours, 4 jours, 6 jours et 13 jours ; après la réalisation des brûlures.
On a fait les observations suivantes 6 jours et 13 jours après la r~alisation des brûlures:
Etat des brûlures 6 iours PlUS tard :
La pro~ondeur de la brûlure et l'épaisseur du tissu qui a survécu sont approximativement les mêmes dans les brûlures traitées par la pommade et celles ayant reçu la composition temoin.
Dans les brûlures traitées avec la pommade témoin, on constate la présence d'escarres contenant des fibres intactes de collagène sur les 6 brûlures. Les 32~
~ 5 brûlures traitées avec la pommade contenant la collagé-nase selon l'invention n'en comportent aucune.
On constate la présence de cellules inflamma-toires infiltrées dans la partie supérleure du derme surles 6 brûlures traitées par la pommade à la collagénase.
La même observation ne peut être faite que sur 3 brûlures témoins. L'afflux de cellules inflammatoires témoigne d'un processus de cicatrisation plus avancé que dans les brûlures où ces infiltrations n'ont pas eu 1 i~u .
On ne constate cependant que peu de différen-ces au niveau de la réparation de l'épiderme et du tissu conjonctif entre les brûlures traitées et les brûlures témoins, sauf que cette réparation paraît un peu plus avancée dans le cas des brûlures traitées L'état des brûlures 13 iours plus tard On constate chez les animaux traités que les brûlures sont recouvertes d'une mince pellicule de tissu dégradé. Du tissu conjonctif nouveau s'est développé sur la totalité de la surface des brûlures, immédiatement sous cette pellicule ainsi que plus en profondeur, dans le derme. L'épiderme s'est développé sous la forme d'un tissu de granulation à partir des bords des lésions, immédiatement sous la pellicule de tissu dégradé.
On constate dans les lésions traitées que la partie collagène des escarres a été dissoute par la col-lagénase, de sorte que la régénération du tissu conjonc-tif a pu se développer en surface, dans des conditions analogues à celles qui sont observées dans le cas de blessures par coupures. L'épiderme formé peut migrer sur la surface de ce tissu de granulation.
On constate au contraire que les brûlures té-moins sont recouvertes d'escarres profondes de collagène compact qui adhère au tissu et le recouvre. Il s'est forme du tissu conjonctif nouveau seulement sous la ~' ~3~
nouvelle couche d'épiderme qui s'est formée sur les seuls bords des brulures. I,'épiderme a migr~ à partir des bords de la lésion, à travers le derme, sous les escarres susdites, séparant ainsi celles-ci du tissu profond. Donc les sources d'épidermes nouveaux ne se constatent qu'au bord des lésions, ce qui requérait une greffe chirurgical~ d'epiderme pour assurer la cicatri-sation complète de ces lésions.
L'un des avantages de la pommade contenant la colla~énase réside dans le fait que le traitement enzy-matique réalise automatiquement un équilibre correct entre les tissus nécrotiques et les tissus viables, équilibre ~u'il serait difficile de recréer par la voie chirurgicale.
Les préparations pharmaceutiques selon l'in-vention peuvent se présenter sous toutes les formes sus-ceptibles d'être mises en oeuvre par application exter-ne: gels, émulsions, notamment telles que pommades et crèmes, ou solutions ou formes pulvérisables (aérosols ~ en poudre)/ la collagénase étant dans chaque préparation '~ associée à des excipients conformes selon le cas à
chacune desdites formes. Dans le cas de solutions pour l'application topique, on aura recours avantageusement à
une mise en solution de la collagénase dans un milieu isotonique, de préférence un tampon physiologiquement acceptable de pH 7-8,5, et de préférence stérile.
Les préparations de collagénase sous forme de - solutions au sein d'un véhicllle stérile injectable peuvent être administrées par la voie sous-cutanéel à
proximité des plaies à traiter ou des chélo;des. On peut également en~isager l'utilisation de ces solutions in-jectables, pour les administrations profondes, notamment en vue de la destruction de l'accumulation pathologique du collagène dans les tissus, comme par exemple dans les disques intexvertébraux.
~'~3Z.~
Les compositions pharmaceutiques selon l'in-vention sont donc applicables à tous types de lésions se manifestant par une altération incontrôlée des structu-res riches en collagène. A titre d'exemple de lésions qui peuvent être traitées, on citera les brûlures, ulcères, escarres, les escarres dures ou blanches à base de colla~ène, chéloides, telles ~ue celles produites après des interventions chirurgicales, nécroses, en particulier dans le cas des décubitus ou des ulcères.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également être appliquées à titre préventif, notamment préalablement à des interventions chirur-gicales ~isant à réaliser des greffes plastiques ou autres, ou à des interventions de chirurgie esthétique, et d'une façon genérale à toutes blessures de la peau.
Les solutions de collagénase selon l'invention peuvent aussi être appliquées au traitement des caries dentaires. On sait en effet que la pulpe dentaire est essentiellement constituée de collagène calcifié com-pact, la carie dentaire se manifestant par une fissura-tion ou un perçage de la dent, par lequel s'échappe le calcium. La trame décalcifiée de collagène qui subsiste devient alors poreuse et ris~ue de de~enir le siège d'une infection bactérienne.
Par introduction d'une solution concentrée de collagénase con~orme à l'invention dans cette trame, on induit la dissolution du collagène poreux qui peut alors être éliminé par rinçage. I.'action de la collagénase s'interrompt d'elle-même au niveau du collagène calcifié
sain.
La solution de collagénase utilisée, tamponnée à pH 7-8,5, notamment au borate, contient de pxéférence au moins 1 ~kat de collagénase par ml de solution. A
cette concentration et a fortiori pour des concentra-tions plus élevées, le collagène poreux est rapidement ~,rl ~L2~
dissous.
Après rincage et désinfection, la dent traitée peut être refermée en mettant en oeuvre des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les traces résiduelles possibles de collagénase retenues dans la dent sont progressivement inhibées par le pH acide dominant qui se réinstalle au coeur de la dent.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement aux cas qui ont été envisagés dans ce qui précède. Elle en embrasse au contraire toutes les variantes, notamment celles où les propriétés stabili-santes des hydrolysats de collagène sont mises en oeuvre à l'égard de toutes autres collagénases susceptibles d'être mises en oeuvre dans la constitution de composi-tions pharmaceutiques, dès lors que ces collagénases présentent à la fois les activités sélectives qui ont été définies dans ce qui précède et l'innocuité désira-ble aux doses suffisantes auxquelles l'activité colla-génolytique sélective est susceptible de se manifester.
A ce titre l'invention concerne toute association d'une collagénase répondant aux conditions qui précèdent, quelle que soit la source, notamment les cultures de micxoorganismes à partir desquelles elle a été obtenue, en association avec des hydrolysats de collagène. Ces compositions associant les deux types de principes, notamment dans des proportions équivalentes aux inter-valles de proportions préférés qui ont été indiqués, constituent des équivalents des associations plus parti-culièrement revendiquées dans certaines des revendica-tions qui suivent.
De la même façon les revendications plus par-ticulièrement relatives aux procédés de stabilisation d'une collagénase et plus particulièrement de l'Achromase, notamment par lyophilisation de leurs , . ~
~3~
solutions en présence d'hydrolysats de collagène éten-dent leurs effets à la stabilisation de toute forme de collagénase, notamment a l'occasion des lyophilisations de leurs solutions, dès lors que serait mis en oeuvre de la même manière des hydrolysats de collagène, en parti-culier dans les intervalles de proportions relatives définis plus haut.
Claims (7)
1. Composition lyophylisée et stabilisée à base d'une collagénase caractérisée en ce qu'elle contient une collagénase reconnaissant spécifiquement une séquence peptidique X-Glycyl L-Prolyl, dans laquelle X est un résidu d'acides aminés naturels liés à l'extrémité N-Terminale du résidu Glycyl, séquence qu'elle coupe spécifiquement au niveau de la liaison X-Glycyl et étant en outre inhibée au moins partiellement par la myosine, ladite collagénase étant en association avec de l'hydrolysat de collagène à raison de 1 à 25 parties en poids d'hydrolysat de collagène par partie en poids de collagénase.
2. Composition, selon la revendication 1, lyophylisée et stabilisée à base d'une collagénase, caractérisée en ce que la collagénase est issue de culture de Vibrio alginolyticus Chemovar lophagus.
3. Composition, selon la revendication 1, lyophylisée et stabilisée selon la revendication 1 à base d'une collagénase, caractérisée en ce que la collagénase est issue de la souche déposée à la C.N.C.M. sous le No. 1-029.
4. Composition, selon les revendications 1 à 3 lyophylisée et stabilisée à base d'une collagénase, caractérisée en ce qu'elle contient 2 à 10 parties en poids d'hydrolysat de collagène par partie en poids de collagénase.
5. Procédé pour l'obtention de la composition de la revendication 1, caractérisé par le fait que la lyophylisation de ladite solution est réalisée en présence de proportions efficaces d'hydrolysat de collagène préalablement introduit dans la solution.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les proportions d'hydrolysat collagénolytique préalablement introduit dans la solution vis-à-vis de sa teneur en collagénase sont de 1 à 25 parties en poids d'hydrolysat collagénolytique vis-à-vis d'une partie en poids de collagénase.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les proportions d'hydrolysat collagénolytique préalablement introduit dans la solution vis-à-vis de sa teneur en collagénase sont de 2 à 10 parties en poids d'hydrolysat collagénolytique vis-à-vis d'une partie en poids de collagénase.
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