FR2508059A1

FR2508059A1 - Plasmid incorporating polynucleotide phosphorylase gene - and a DNA fragment of a bacterial plasmid, and bacterial strains contg. the plasmid used to prepare phosphorylase polynucleotide

Info

Publication number: FR2508059A1
Application number: FR8112310A
Authority: FR
Inventors: Claude Portier; Anne-Francoise Caroline Migot
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1981-06-23
Filing date: 1981-06-23
Publication date: 1982-12-24
Also published as: FR2508059B1

Abstract

Novel plasmid comprises at least (a) a bacterial DNA fragment carrying a structural gene of polynucleotide phosphonylase and (b) a DNA fragment of a bacterial plasmid pref. from pBr322. Pref. (a) is of mol.wt. about 1.5 Md. Pref. plasmids are pBP280 and pBP111. The plasmids are prepd. by integrating, in a bacterial plasmid, a DNA fragment carrying a pnp (polynucleotide phosphonylase) gene and a neighbouring gene conferring a particular phoenotype pref. ArgG(+) (structural gene or arginine succinate synthetase). Bacterial strains transformed by the plasmid, esp. E.coli, are claimed. The plasmids are used to prepare polynucleotide phosphonylase by fermenting a culture medium of the above transformed bacterial strains and recovering the prod. The prod. is an exonuclease used for sequential degradation of ribopolymers or for polymerising ribonucleoside-5' disphosphates.

Description

La présente invention concerne des plasmides incorporant le gène pnp, des souches bactériennes comportant ces plasmides et un procédé de production de polynucléotide phosphorylase. The present invention relates to plasmids incorporating the pnp gene, bacterial strains comprising these plasmids and a method for producing polynucleotide phosphorylase.

La polynucléotide phosphorylase est une exonucléase capable, soit de dégrader séqentiellement les ribopolymeres, soit de polymériser les ribonucléosides 5' diphosphates en polymère de très grande taille. The polynucleotide phosphorylase is an exonuclease capable of either severely degrading the ribopolymers or polymerizing the ribonucleosides 5 'diphosphates into a very large polymer.

En outre, l'enzyme à haute concentration et dans certaines conditions synthétise des oligoribonucléotides de séquence prédéterminée ; ce type d'activité catalysée in vivo reste à démontrer. In addition, the enzyme at high concentration and under certain conditions synthesizes oligoribonucleotides of predetermined sequence; this type of activity catalyzed in vivo remains to be demonstrated.

Bien que présente chez toutes les bactéries, la polynucléotide phosphorylase ne possède aucune fonction connue et aucun phénotype ne lui est rattaché.Although present in all bacteria, the polynucleotide phosphorylase has no known function and no phenotype is attached thereto.

L'intérêt présenté par cette enzyme réside dans les produits formés, essentiellement les ribopolymères et les homopolymères tels que polyA, polyU et polyG par exemple, ou hétéropolymères tels que polyAU et polyAUG par exemple, ainsi que les oligo ribonucléotides qui peuvent etre de composition variée. Ces produits sont utilises quotidiennement dans de multiples laboratoires de recherche. Pour certains d'entre eux, polyA par exemple, la demande pourrait devenir très grande car il vient d'être montré que le polka intervient comme adjuvant dans la rémission des cancers du sein. Les expérimentations actuelles exigent une production de polyA de l'ordre de la centaine de grammes. The interest presented by this enzyme lies in the products formed, essentially ribopolymers and homopolymers such as polyA, polyU and polyG for example, or heteropolymers such as polyAU and polyAUG for example, as well as oligo ribonucleotides which can be of varied composition . These products are used daily in multiple research laboratories. For some of them, polyA for example, the demand could become very large because it has just been shown that polka intervenes as an adjunct in the remission of breast cancer. Current experiments require a production of polyA of the order of one hundred grams.

Un autre domaine intéressant est constitué par la synthèse d'oligodésoxyribonucléotides à séquence définie. Il s'agit, en fait, de la synthèse de petits fragments d'ADN dont la séquence est déterminée par l'expérimentateur. De tels fragments sont extrèmement recherchés sur le "marché scientifique" car ils permettent de réaliser une multitude de constructions génétiques : en effet, grâce à eux, il est possible de joindre deux brins d'ADN coupés par différents enzymes de restriction. Another interesting area is the synthesis of defined sequence oligodeoxyribonucleotides. It is, in fact, the synthesis of small DNA fragments whose sequence is determined by the experimenter. Such fragments are extremely sought after in the "scientific market" because they make it possible to carry out a multitude of genetic constructions: indeed, thanks to them, it is possible to join two strands of DNA cut by different restriction enzymes.

Il est aussi possible d'introduire à volonté de nouveaux sites de restriction préalablement choisis, simplifiant alors considérablement les opérations de clonage.It is also possible to introduce at will new restriction sites previously chosen, thus greatly simplifying the cloning operations.

Enfin, en copiant une séquence d'ADN connue et en modifiant intentionnelle nt une paire de bases, il est possible d'obtenir une mutagénèse dirigée par intégration du fragment au sein d'une cible bien définie. Finally, by copying a known DNA sequence and intentionally modifying a base pair, it is possible to achieve mutagenic-directed mutagenesis within a well-defined target.

Actuellement, les ribopolymères sont vendus par quelques firmes (Miles, Boehringer, Choay) qui vendent également de la polynucléotide phosphorylase peu purifiée (Miles, Sigma, Boehringer) à l'exception de Choay qui vend une enzyme très pure. Currently, ribopolymers are sold by a few companies (Miles, Boehringer, Choay) that also sell poorly purified polynucleotide phosphorylase (Miles, Sigma, Boehringer) with the exception of Choay which sells a very pure enzyme.

Mais, la synthèse in vivo s'effectue en faible quantité (de l'ordre de 0,02 %) et sa purification est difficile et coûteuse car longue et d'un rendement faible. However, the in vivo synthesis takes place in a small amount (of the order of 0.02%) and its purification is difficult and expensive because of long and low yield.

Il était donc intéressant de mettre au point un procédé permettant de préparer la polynucléotide phosphorylase en quantités importantes en utilisant des mutants surproducteurs. It was therefore interesting to develop a method for preparing the polynucleotide phosphorylase in large quantities using overproducing mutants.

C'est pourquoi la présente invention concerne un plasmide, caractérisé en ce qu'il comporte au moins
- le fragment d'ADN bactérien porteur du gène structural de la polynucléotide phosphorylase et
- un fragment d'ADN d'un plasmide bactérien.This is why the present invention relates to a plasmid, characterized in that it comprises at least
the bacterial DNA fragment carrying the structural gene of the polynucleotide phosphorylase and
a DNA fragment of a bacterial plasmid.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, on utilise comme plasmide vecteur un fragment du plasmide pBR322, en outre le fragment d'ADN bacterien porteur du gène de la polynucléotide phosphorylase oui sera appelé ci-après "gène pnp" mesure de préférence environ 1,5 Md. In a preferred embodiment of the present invention, a fragment of the plasmid pBR322 is used as the vector plasmid, in addition the bacterial DNA fragment carrying the polynucleotide phosphorylase gene, which will be referred to hereinafter as the "pnp gene" preferably measure. about 1.5 billion.

L'invention concerne également un procédé de préparation d r un plasmide, caractérisé en ce que l'on intègre dans un plasmide bactérien un fragment d'ADN porteur du gène pnp et d'un gène voisin conférant un phénotype particulier. The invention also relates to a method of preparing a plasmid, characterized in that a DNA fragment carrying the pnp gene and a neighboring gene conferring a particular phenotype is integrated in a bacterial plasmid.

En effet, le gène pnp ne présentant aucun phénotype connu, il a fallu chercher à isoler un fragment de restriction assez grand pour porter, outre le gène pnp, un gène voisin permettant ainsi une sélection positive. Indeed, the pnp gene having no known phenotype, it was necessary to seek to isolate a restriction fragment large enough to carry, in addition to the pnp gene, a neighboring gene thus allowing a positive selection.

La figure l représente la localisation du gène pnp par rapport aux gène voisins sur le chromosome d'Escherichia coli. Figure 1 shows the location of the pnp gene relative to neighboring genes on the Escherichia coli chromosome.

Les distances sur le chromosome sont exprimées en minutes et les gènes représentés sont les suivants argG : gène structural de l'arginirosuccinate
synthétase, nusA : gène nécessaire à l'expression du gène N
du bactériophage A, psO : gène structural de la protéine ribosomfque S15, pnp : gène structural de la polynucléotide
phosphorylase, mtr : mutation provoquant la résistance au
5-méthyltryptophane.The distances on the chromosome are expressed in minutes and the genes represented are the following argG: structural gene of arginirosuccinate
synthetase, nusA: gene necessary for the expression of the N gene
bacteriophage A, psO: structural gene of the ribosome protein S15, pnp: structural gene of the polynucleotide
phosphorylase, mtr: mutation causing resistance to
5-methyltryptophan.

C'est le gène argG qui a été choisi car il permet de supprimer l'auxotrophie en arginine et se trouve au voisinage du gène pnp comme cela ressort de la figure 1. It is the argG gene which has been chosen because it makes it possible to suppress auxotrophy to arginine and is in the vicinity of the pnp gene as is apparent from FIG.

Afin d'isoler le fragment d'XDN porteur de ces deux.gènes, il a fallu avoir recours à un mutant obtenu par insertion dans le gène pnp du transposon Tn5 qui code pour la résistance a la kanamycine. C'est en s'appuyant sur le poids moléculaire du transposon inséré que la tactique a été définie. En effet, ce transposon possède une masse relativement élevée (3,7. 106 daltons), aisément repérable dans les systèmes d'analyse. On a donc comparé deux fragments d'ADN porteurs lu gène pnp, l'un des deux fragments portant en sus le transposon inséré dans le gène pnp. In order to isolate the XDN fragment carrying these two genes, it was necessary to resort to a mutant obtained by insertion into the pnp gene of the Tn5 transposon which encodes resistance to kanamycin. It is by relying on the molecular weight of the inserted transposon that the tactic was defined. Indeed, this transposon has a relatively high mass (3.7, 106 daltons), easily identifiable in the analysis systems. Thus, two DNA fragments carrying the pnp gene were compared, one of the two fragments carrying in addition the transposon inserted into the pnp gene.

Le découpage de ces fragments par des enzymes de restriction ne coupant pas le transposon permet de repérer aisément, par électrophorèse sur gel d'agarose, le fragment porteur du gène pnp intact (pnp+) et d'en déterminer ainsi la masse. The cutting of these fragments by restriction enzymes which do not cut the transposon makes it possible to easily identify, by agarose gel electrophoresis, the fragment carrying the intact pnp gene (pnp +) and thus to determine the mass thereof.

L'expérience permet ainsi de montrer que le gène pnp est porté par un fragment de restriction d'environ~107 daltons, assez grand pour porter également le gène argG. The experiment thus makes it possible to show that the pnp gene is carried by a restriction fragment of ~ 107 daltons, large enough to also carry the argG gene.

Dans un premier temps, on vérifie, en clonant dans un plasmide le fragment ainsi obtenu porteur du gène muté, que le gène argG est bien aussi sur ce fragment. Dans un deuxième temps, on clone directement le gène pnp en sélectionnant pour l'auxotrophie en arginine d'une souche argG. Le plasmide ainsi obtenu est isolé, sa carte de restriction établie, et un fragment plus petit sous-cloné dans un autre plasmide pBR322. Le gène pnp constitue -ainsi environ 50 % du fragment d'ADN cloné. In a first step, it is verified, by cloning in a plasmid the thus obtained fragment carrying the mutated gene, the argG gene is also on this fragment. In a second step, the pnp gene is cloned directly by selecting for the arginine auxotrophy of an argG strain. The plasmid thus obtained is isolated, its restriction map established, and a smaller fragment subcloned into another plasmid pBR322. The pnp gene thus constitutes about 50% of the cloned DNA fragment.

L'invention concerne, en outre, les souches bactériennes, en particulier d'Escherichia coli, transformées a l'aide des plasmides selon l'invention, ainsi qu'un procédé de préparation de polynucléotide -phosphorylase caractérisé en ce qu'on met en fermentation un milieu de culture par une souche transformée et en ce qu'on récupère la polynucléotide phosphorylase produite. The invention also relates to bacterial strains, in particular Escherichia coli strains, transformed with the aid of the plasmids according to the invention, and to a process for the preparation of polynucleotide phosphorylase, characterized in that fermenting a culture medium with a transformed strain and recovering the polynucleotide phosphorylase produced.

La souche Escherichia coli JC 357/pBP 111 a été déposée le 23 juin 1981 dans la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de 1'INSTITUT PASTEUR -sous le numéro I 162. Escherichia coli strain JC 357 / pBP 111 was deposited on June 23, 1981 in the INSTITUT PASTEUR National Collection of Microorganisms Culture under I 162.

Les exemples suivants sont destinés a illustrer la présente invention mais ne la limitent en aucune façon. The following examples are intended to illustrate the present invention but do not limit it in any way.

Extraction de l'ADN é-pisomal
Le procédé mis en oeuvre est adapté des procédés décrits par Thompson R, Hugues SG, Broda P (1974), Plasmid identification using specific endonucleases, Mol. Gen. Genet. 133 : 141-149 et par
Birnboim HC, Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucal. Acids Res. 7 : 1513-1523. Extraction of e-pisomal DNA
The process employed is adapted from the methods described by Thompson R, Hugues SG, Broda P (1974), Plasmid identification using specific endonucleases, Mol. Gen. Broom. 133: 141-149 and by
Birnboim HC, Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for recombinant DNA plasmid screening, Nucal. Acids Res. 7: 1513-1523.

Un litre de culture bactérienne est lysé comme cela est décrit par Thompson et centrifugé 30 mn à 24 000 tours/minute sur un rotor SW27. Le surnageant est écarté et le culot est dissous à 200C dans 7 mi de tris-HCl, 25 mM, pH 8, contenant 10 mM d'EDTA, après addition de 13 ml de soude 0,2 N contenant 1 % de SDS. Après dissolution totale, 10 ml d'acétate de sodium 3 M, pH 4,8, sont ajoutés t après précipitation pour 60 mn à 200C, le complexe de nucléoprotéine est éliminé par centrifugation durant 5 mn à 6 000 g et l'ADN épisomal est récupéré par précipitation dans l'éthanol à -200C pendant 2 heures. One liter of bacterial culture is lysed as described by Thompson and centrifuged for 30 minutes at 24,000 rpm on an SW27 rotor. The supernatant is discarded and the pellet is dissolved at 200 ° C. in 7 ml of 25 mM tris-HCl, pH 8, containing 10 mM of EDTA, after addition of 13 ml of 0.2 N sodium hydroxide containing 1% of SDS. After complete dissolution, 10 ml of 3 M sodium acetate, pH 4.8, are added after precipitation for 60 min at 200 ° C, the nucleoprotein complex is removed by centrifugation for 5 min at 6000 g and the episomal DNA is recovered by precipitation in ethanol at -200C for 2 hours.

Le culot obtenu après 30 mn de centrifugation à 4 000 g est redissous dins tris-HCl, 10 mM, pH 7,5, contenant 10 mM d'EDTA et 0,8 M NaCl puis de nouveau reprécipité avec 2 volumes d'éthanol. Cet ADN est centrifuge à l'équilibre avec un gradient de chlorure de césium contenant du bromure d'éthidium comme cela a déjà été décrit dans Thompson. Les deux bandes résultantes correspondent à 1'ADN épisomal et 1'ADN relaxé contaminé par un petit ADN chromosomique.Les bandes sont collectées et le bromure d'éthidium est éliminé par 3 à 4 extractions avec du 2-propanol.-L'ADN est alors précipité avec 4 volumes d'alcool à 70 * en 60 mn à -200C ; le précipité est centrifugé et 1'ADN est redissous dans une solution de tris-HCl, 10 mM, pH 7,5 contenant 0,1 nLM d'EDTA.The pellet obtained after centrifugation for 30 minutes at 4000 g is redissolved in tris-HCl, 10 mM, pH 7.5, containing 10 mM EDTA and 0.8 M NaCl and then reprecipitated with 2 volumes of ethanol. This DNA is centrifuged at equilibrium with a cesium chloride gradient containing ethidium bromide as already described in Thompson. The two resulting bands correspond to the episomal DNA and the relaxed DNA contaminated with a small chromosomal DNA. The bands are collected and the ethidium bromide is removed by 3-4 extractions with 2-propanol. then precipitated with 4 volumes of alcohol at 70 * in 60 minutes at -200C; the precipitate is centrifuged and the DNA is redissolved in a solution of 10 mM tris-HCl, pH 7.5 containing 0.1 nL of EDTA.

Extraction de l'ADN plasmidique
L'ADN plasmidique est obtenu par le procédé décrit par Birnboim, puis purifié lorsque cela est nécessaire par centrifugation dans un gradient de chlorure de césium comme cela a été dit précédemment.Extraction of plasmid DNA
The plasmid DNA is obtained by the method described by Birnboim, and then purified when necessary by centrifugation in a cesium chloride gradient as previously mentioned.

L'ADN ainsi obtenu est redissous dans un tris-HCl, 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM et extrait à 200C en deux foi; par un mélange 50/50 phénol/chloroforme. The DNA thus obtained is redissolved in tris-HCl, 10 mM, pH 8.0, 0.1 mM EDTA and extracted at 200C in two faiths; by a 50/50 phenol / chloroform mixture.

Après précipitation à l'éthanol, 1'ADN est séché et redissous dans 1'EDTA 1mM.After ethanol precipitation, the DNA is dried and redissolved in 1 mM EDTA.

Digestion
La digestion de 1'ADN par les endonucléases de restriction est effectuée comme cela est indiqué par le fournisseur des différentes enzymes dans des volumes variant de 10 à 20 l pendant des périodes variables. Après digestion, la réaction est stoppée par addition d'EDTA 10 mM et chauffage à 650C pendant 10 mn. Lorsque 1'ADN doit être digéré par deux enzymes, la première digestion est toujuurs conduite avec l'enzyme nécessitant la force ionique la plus faible.Digestion
Digestion of DNA by restriction endonucleases is carried out as indicated by the supplier of the different enzymes in volumes ranging from 10 to 20 l for varying periods. After digestion, the reaction is stopped by addition of 10 mM EDTA and heating at 650 ° C. for 10 minutes. When the DNA is to be digested by two enzymes, the first digestion is always conducted with the enzyme requiring the weakest ionic strength.

Electrophorèse sur gel d'agarose
L'ADN rprès découpage ou ligation est analysé sur gel d'agarose à 0,7 % dans un tri-acetate 40 mM, pE 7,7, contenant 5 mM d'acétate de sodium et 1 mM d'EDTA. L'électrophorèse est conduite à un potentiel de 1,5 V/cm pendant 18 heures. Le gel est alors fixé dans une solution de bromure d'éthidium à 1 ug par ml et les bandes d'ADN sont détectées par fluorescence sous lumière ultra-violette. Le poids moléculaire de ces bandes est déterminé par comparaison avec les distances de migration obtenues à partir de marqueurs de poids moléculaires connus.Agarose gel electrophoresis
The post-cutting or ligation DNA was analyzed on a 0.7% agarose gel in 40 mM tri-acetate, pH 7.7, containing 5 mM sodium acetate and 1 mM EDTA. Electrophoresis is conducted at a potential of 1.5 V / cm for 18 hours. The gel is then fixed in a solution of ethidium bromide at 1 μg per ml and the DNA bands are detected by fluorescence under ultraviolet light. The molecular weight of these bands is determined by comparison with the migration distances obtained from known molecular weight markers.

Ligation des fragments d'ADN
La réaction est en général conduite dans le tampon suivant (volume final 1 à 60 l) : tris-HCl 57,5 mM pH 7,6 ; MgCl2 7 mM ; NaCl 50 mM ; dithiotreitol (Calbiochem) 10 mM ; EDTA 1 mM ; ATP 0,1 mM.Ligation of DNA fragments
The reaction is generally carried out in the following buffer (final volume 1 to 60 l): 57.5 mM Tris-HCl pH 7.6; 7 mM MgCl 2; 50 mM NaCl; dithiotreitol (Calbiochem) 10 mM; EDTA 1 mM; 0.1 mM ATP.

A ce tampon on ajoute 3 à 30 g d'ADN et 1 à 2 unités de T4 AD ligase. To this buffer is added 3 to 30 g of DNA and 1 to 2 units of T4 AD ligase.

L'incubltion dure 16 heures à une température comprise entre 12 et 220C, l'avancement de la réaction est contrôlé par analyse d'une partique aliquote sur gel d'agarose. Incubation lasts 16 hours at a temperature between 12 and 220C, the progress of the reaction is controlled by analysis of an aliquot pariquet on agarose gel.

Transformation
Les transformations sont conduites selon le procédé décrit par Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. (1972)
Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria : genetic transformation of Escherichia coli by R-factor
DNA. Proc Natl. Acad. Sci., USA 69 : 2110-2114.Transformation
The transformations are carried out according to the method described by Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. (1972)
Non chromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor
DNA. Proc Natl. Acad. Sci., USA 69: 2110-2114.

Avant d'étaler les bactéries sur milieu sélectif, elles sont incubées pendant au moins 90 mn à 370C sur milieu riche (LB) tel que décrit par
Miller J.H. (1972) ; Experiments in molecular gènetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor,
New York, p. 431.Before spreading the bacteria on a selective medium, they are incubated for at least 90 minutes at 370C on rich medium (LB) as described by
Miller JH (1972); Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor,
New York, p. 431.

La concentration en antibiotiques des plaques est la suivante (g/ml)
ampicilline (Ap) 25
J . tetracycline (Tc) 10
, chloramphénicol (Cm) 25
kanamycine (Km) 50
Les procédés généraux décrits précédemment sont utilisés dans ce qui va suivre pour préparer les plasmides selon la présente invention.The antibiotic concentration of the plates is as follows (g / ml)
ampicillin (Ap) 25
J. tetracycline (Tc) 10
, chloramphenicol (Cm) 25
kanamycin (Km) 50
The general methods described above are used in the following to prepare the plasmids according to the present invention.

-Identificati-o-n des- fragments d'ADN portant les gènes pnp
+
L'ADN des épisomes JCH5 (pnp ) (Takata R (1978) Genetic studies of the ribosomal proteins in
Escherichia coli I Mapping of the genes for L21,
L27, S15 and S21 by using hybrid bacteria and overproduction of these proteins in the merodiploid strains,
Mol. Gen. Genet. 160 : 151-155) et JCP (pnp::Tn5) (Portier C (1980), Isolation of a polynucleotide phosphorylase mutant using a kanamycine resistant determinant. Mol. Gen. Genet. 178 : 343-349) sont mis à digérer avec EcoR1 qui ne coupe pas Tn5. -Identification of DNA fragments carrying pnp genes
+
JCH5 (pnp) episome DNA (Takata R (1978) Genetic studies of the ribosomal proteins in
Escherichia coli I Mapping the genes for L21,
L27, S15 and S21 by using hybrid bacteria and overproduction of these proteins in the merodiploid strains,
Mol. Gen. Broom. 160: 151-155) and JCP (pnp :: Tn5) (Portier C (1980), Isolation of a mutant polynucleotide phosphorylase using a kanamycin resistant determinant (Mol Gen. Genet 178: 343-349) are digested with EcoR1 that does not cut Tn5.

Dans ces conditions, un fragment de restriction d'environ 13,5 Md est clairement distingué dans le profil de digestion de l'épisome JCP portant Tn5 et est absent dans le profil de restriction de l'épisome
JCH5-. Toutefois, dans ce profil de restriction on distingue un fragment d'environ 10 Md. La différence de poids moléculaire peut raisonnablement correspondre à la présence dans le fragment le plus lourd des 3,8 Md de Tn5. Ainsi il est très probable que le fragment de 10 ? porte le gène pnp ainsi que le gène argG, car la distance entre argG et pnp correspond à un maximum de 5 à 7 Md.Under these conditions, a restriction fragment of approximately 13.5 Md is clearly distinguished in the digestion profile of the JCP episome bearing Tn5 and is absent in the restriction profile of the episome
JCH5-. However, in this restriction profile there is a fragment of approximately 10 Md. The molecular weight difference can reasonably correspond to the presence in the heavier fragment of 3.8 Md of Tn5. So it is very likely that the fragment of 10? carries the pnp gene as well as the argG gene, since the distance between argG and pnp corresponds to a maximum of 5 to 7 Md.

Clonage des gènes pnp::Tn5 et argG dans le vecteur pACYC184
Le plasmid pACYC184, décrit par Chang ACY,
Cohen SN (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid; J. Bacterial 134: 1141-1156, code pour les résistances au chloramphénicol et a la tétracycline. A cause de son site de restriction
EcoR1 unique placé dans le gène codant pour la résistance au chloramphénicol, pACYC184 représente un, excellent vecteur pour cloner par sélection en utilisant la résistance à la tétracycline et l'inactivation par insertion de la résistance au chloramphénicol.Le fragment EcoRl de JCP est ligaturé avec 1'ADN de pACYC184 digéré par EcoR1 puis utilisé pour transformer la souche JC1553 (argG@), on sélectionne d'abord les clones résistant à la tétracycline (Tcr). La réplication de ces clones sur une plaque contenant de la kanamycine permet d'identifier 39 clones Kmr, dont 33 sont capables de croitre sur un milieu supplémenté avec de la méthionine, de l'-histidine et de la leucine.Cloning of pnp :: Tn5 and argG genes in pACYC184 vector
The plasmid pACYC184, described by Chang ACY,
Cohen SN (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid; J. Bacterial 134: 1141-1156, code for resistance to chloramphenicol and tetracycline. Because of its restriction site
As a single EcoR1 placed in the gene coding for chloramphenicol resistance, pACYC184 represents an excellent vector for selection cloning using tetracycline resistance and chloramphenicol resistance inactivation insertion. The JCP EcoRI fragment is ligated with PACYC184 DNA digested with EcoR1 and then used to transform the JC1553 (argG @) strain, first the tetracycline resistant clones (Tcr) were first selected. The replication of these clones on a plate containing kanamycin makes it possible to identify 39 Kmr clones, of which 33 are capable of growing on a medium supplemented with methionine, histidine and leucine.

L'ensemble de ces clones est également sensible au chloramphénicol (Cms). On peut donc en déduire que ces 33 plasmides portent une insertion permettant l'expression des gènes pnp::Tn5 et argG.All of these clones are also sensitive to chloramphenicol (Cms). It can therefore be deduced that these 33 plasmids carry an insertion permitting the expression of the pnp :: Tn5 and argG genes.

Ces souches sont purifiées et l'AND et les plasmides sont extraits. These strains are purified and the DNA and plasmids are extracted.

Ces plasmides présentent le même poids moléculaire, environ 15,5 Md. Ceci est en accord avec les valeurs attendues, 13,5 Md pour le fragment EcoRI deJCP, plus de 2,65 Md pour le vecteur, c'est- -dire un total de 16,15 Md. L'un de --s plasmides pBP200 est choisi pour être utilisé dans ce qui va suivre. These plasmids have the same molecular weight, approximately 15.5 Md. This is in agreement with the expected values, 13.5 Md for the EcoRI fragment of JCP, more than 2.65 Md for the vector, ie a total of 16.15 Md. One of --s plasmids pBP200 is chosen for use in what follows.

Clonage des gènes pnp+ dans le vecteur pACYO184
Le clonage du gène sauvage pnp est conduit comme cela a été décrit précédemment avec les deux seules différences suivantes
1) la souche réceptrice est JC357 (Pnp ArgG), et
2) les transformants Tcr sont criblés pour leur caractère argG+ et leur sensibilité au chloramphénicol. Cloning of pnp + genes in pACYO184 vector
Cloning of the wild-type pnp gene is carried out as has been previously described with the only two following differences
1) the recipient strain is JC357 (Pnp ArgG), and
2) Tcr transformants are screened for their argG + character and sensitivity to chloramphenicol.

Un clone JC357/pBR280 est isolé qui présente le caractère Tcr, Cms, Arg+. A clone JC357 / pBR280 is isolated which has the character Tcr, Cms, Arg +.

Détermination de l'activité polynucléotide phosphorylase
L'activité de phosphorolyse et d'échange est mesurée sur des extraits bruts de bactéries après sonication et dialyse comme cela a été décrit dans
Portier C. (1980), Isolation of a polynucleotide phosphorylase mutant using a kanamycin resistant determinant. Mol. Gen. Genet. 178 : 343-349. La localisation de l'activité polynucléotide phosphorylase in situ dans un gel de polyacrylamide en utilisant la réaction de polymérisation a déjà été décrit dans
Thang MN, Thang DC, Léautey J. (1967), Séparation et identification de polynucléotide phosphorylase par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, CR. Acad.Determination of polynucleotide phosphorylase activity
The phosphorolysis and exchange activity is measured on crude extracts of bacteria after sonication and dialysis as described in
Portier C. (1980), Isolation of a mutant polynucleotide phosphorylase using a kanamycin resistant determinant. Mol. Gen. Broom. 178: 343-349. The localization of the polynucleotide phosphorylase activity in situ in a polyacrylamide gel using the polymerization reaction has already been described in
Thang MN, Thang DC, Léautey J. (1967), Separation and identification of polynucleotide phosphorylase by polyacrylamide gel electrophoresis, CR. Acad.

Sci., Paris 265 : 1823-1826.Sci., Paris 265: 1823-1826.

Les résultats observés avec le clone JC357/pBP280 sont- représentés au tableau I. The results observed with clone JC357 / pBP280 are shown in Table I.

L'activité spécifique de polynucléotide phosphorylase de la souche JC 357/pBP 280 est 5 à 6 fois supérieure à celle de la souche sauvage. Ainsi le plasmide pBP280 porte bien le gène pnp+. The specific activity of polynucleotide phosphorylase of strain JC 357 / pBP 280 is 5- to 6-fold higher than that of the wild-type strain. Thus the plasmid pBP280 carries the pnp + gene.

Le poids moléculaire de cet ADN est d'environ 12 Md, ce qui correspondant au poids moléculaire attendu dans ler; limites de l'erreur expérimentale. The molecular weight of this DNA is approximately 12 Md, which corresponds to the expected molecular weight in l; limits of the experimental error.

Carte de restriction de pBP280 et pBP200
Comme Tn5 est inséré dans le gène pnp de pBP200, la position approximative du gène pnp est ainsi donnée par-localisation du transposon sur le fragment d'ADN clone. Aorès une simple ou double digestion avec HindIII, BamHI et Smalt et
TABLEAU I
Activité spécifique de polynucléotide phosphorylase dans un extrait brut -de souches avec un plasmide comportant le gène pnp+

Restriction card of pBP280 and pBP200
Since Tn5 is inserted into the pnp gene of pBP200, the approximate position of the pnp gene is thus given by location of the transposon on the cloned DNA fragment. A simple or double digestion with HindIII, BamHI and Smalt and
TABLE I
Specific activity of polynucleotide phosphorylase in a crude extract of strains with a plasmid comprising the pnp + gene

<tb> <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> ( mole/mg <SEP> x <SEP> h)
<tb> <SEP> Réaction <SEP> Souches
<tb> <SEP> JC357 <SEP> JC357/pBP280 <SEP> Jc357/pBP111
<tb> phosphorolyse <SEP> - <SEP> 1,3 <SEP> 2,0
<tb> échante <SEP> 0,02 <SEP> 7,9 <SEP> 22,6
<tb> TABLEAU II
Propriétés des plasmides hybrides

<tb><SEP> Specific <SEP> activity <SEP> (mole / mg <SEP> x <SEP> h)
<tb><SEP> Reaction <SEP> Strains
<tb><SEP> JC357 <SEP> JC357 / pBP280 <SEP> Jc357 / pBP111
<tb> phosphorolysis <SEP> - <SEP> 1,3 <SEP> 2,0
<tb> Eating <SEP> 0.02 <SEP> 7.9 <SEP> 22.6
<tb> TABLE II
Properties of hybrid plasmids

<SEP> Origine <SEP> du <SEP> Site <SEP> dans
<tb> Plasmide <SEP> Phénotype <SEP> Fragment <SEP> cloné <SEP> fragment <SEP> cloné <SEP> Vecteur <SEP> le <SEP> vecteur
<tb> pBP <SEP> 280 <SEP> Arg+, <SEP> Tcr, <SEP> Cms, <SEP> Kms, <SEP> Pnp+ <SEP> EcoRI <SEP> F' <SEP> (JCH5) <SEP> pACYC <SEP> 184 <SEP> EcoRI
<tb> pBP <SEP> 200 <SEP> Arg+, <SEP> Tcr, <SEP> Cms, <SEP> Kmr, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI <SEP> F' <SEP> (JCP) <SEP> pACYC <SEP> 184 <SEP> EcoRI
<tb> pBP <SEP> 111 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp+ <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 280 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP <SEP> 202 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kmr, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 200 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP#2 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-SacII2/SacII1-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP#60 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-HpaI4/HapI3-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP#93a <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp+ <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP#61 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp+ <SEP> EcoRI-HpaI2/HpaI1-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP#C9 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-PstI5/PstI3-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI/HindIII
<tb> pBP <SEP> 22 <SEP> Aps, <SEP> Tcr, <SEP> Kms, <SEP> Pnp+ <SEP> PstI1-PstI5 <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> PstI
<tb> a) pBP#93 est formé par suppression spontanée des sites HpaI2-3 de pBP111. <SEP> Origin <SEP> of <SEP> Site <SEP> in
<tb> Plasmid <SEP> Phenotype <SEP> Fragment <SEP> cloned <SEP> fragment <SEP> cloned <SEP> Vector <SEP> the <SEP> vector
<tb> pBP <SEP> 280 <SEP> Arg +, <SEP> Tcr, <SEP> Cms, <SEP> Kms, <SEP> Pnp + <SEP> EcoRI <SEP> F '<SEP> (JCH5) <SEP> pACYC <SEP> 184 <SEP> EcoRI
<tb> pBP <SEP> 200 <SEP> Arg +, <SEP> Tcr, <SEP> Cms, <SEP> Kmr, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI <SEP> F '<SEP> (JCP) <SEP > pACYC <SEP> 184 <SEP> EcoRI
<tb> pBP <SEP> 111 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp + <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 280 <SEP> pBR <SEP> 322 <MS> EcoRI / HindIII
<tb> pBP <SEP> 202 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kmr, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 200 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP # 2 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-SacII2 / SacII1-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP > 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP # 60 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-HpaI4 / HapI3-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP > 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP # 93a <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp + <SEP> EcoRI-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP # 61 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp + <SEP> EcoRI-HpaI2 / HpaI1-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP # C9 <SEP> Apr, <SEP> Tcs, <SEP> Kms, <SEP> Pnp- <SEP> EcoRI-PstI5 / PstI3-HindIII <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP > 322 <SEP> EcoRI / HindIII
<tb> pBP <SEP> 22 <SEP> Aps, <SEP> Tcr, <SEP> Kms, <SEP> Pnp + <SEP> PstI1-PstI5 <SEP> pBP <SEP> 111 <SEP> pBR <SEP> 322 <SEP> PstI
<tb> a) pBP # 93 is formed by spontaneous deletion of the HpaI2-3 sites of pBP111.

en connaissant la position des sites de restriction dans pACYC184 et dans le transposon Tn5, il est possible de construire la carte de restriction indiquée dans la figure 2. by knowing the position of the restriction sites in pACYC184 and in the transposon Tn5, it is possible to construct the restriction map indicated in FIG.

La digestion de pBP200 avec SmaI permet de -déterminer l'orientation du transposon car Tn5 présente un seul site SmaI placé de façon asymétrique. Digestion of pBP200 with SmaI makes it possible to determine the orientation of the transposon since Tn5 has a single SmaI site placed asymmetrically.

Le transposon est ainsi localisé dans le fragment de 3 Md défini par le site EcoRl et le sint HindIII.The transposon is thus located in the 3 Md fragment defined by the EcoRI site and the HindIII site.

La position des extrémités de Tn5 peut être déduite, car la longueur est connue : une est localisée à environ 1 Md du site EcoRI et l'autre à 2 Md du site HindîlI (voir figure 2). The position of the ends of Tn5 can be deduced because the length is known: one is located at about 1 Md of the EcoRI site and the other at 2 Md of the HindIII site (see Figure 2).

Sous-clonage de-s gènes pnpe et pnp:-: Tn5 dans le plasmide pBR322
Le poids moléculaire des sous-unités de polynucléotide phosphorylase (Portier C. (1975),
Quaternary Structure of polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli : evidence of a complex between two types of polypeptide chains. Eur. J. Biochem. 55 573-582), suggérerait que les gènes nécessitent environ 1,5 Md de capacité de codage ADN. Ceci représente environ 50 * du fragment EcoR1 HindIII qui contient probablement le gène pnp intact. Ce fragment est clone dans pBR32 et de nombreux plasmides hybrides avec un poids moléculaire correspondant à 5,8 Md (2,8 Md le pBR322 + le fragment de 3 Md) sont sélectionnés. L'un d'entre eux, pBP111, possède un seul site EcoRl, HindîlI et SmaI. Ce plasmide transforme la souche JC357 avec une haute fréquence en donnant les clones Pnp+, Apr et Tcs.Subcloning of pnpe and pnp: -: Tn5 genes in plasmid pBR322
The molecular weight of the polynucleotide phosphorylase subunits (Portier C. (1975),
Quaternary structure of polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli: evidence of a complex between two types of polypeptide chains. Eur. J. Biochem. 55 573-582), suggest that the genes require about 1.5 Md of DNA coding capacity. This represents approximately 50% of the EcoRI HindIII fragment which probably contains the intact pnp gene. This fragment is cloned into pBR32 and many hybrid plasmids with a molecular weight corresponding to 5.8 Md (2.8 Md the pBR322 + 3 Md fragment) are selected. One of them, pBP111, has a single EcoRI, HindIII, and SmaI site. This plasmid transforms the JC357 strain with a high frequency giving the Pnp +, Apr and Tcs clones.

L'activité de polynucléotide phosphorylase déterminée soit par échange, soit par phosphorolyse, (résultats indiqués au tableau I) montre que l'extrait brut contient une activité de 10 à 20 fois supérieure pour JC357/pBPlll que pour la souche sauvage. Ces résultats démontrent que le gène pnp est certainement localisé dans le fragment de 3Md EcoR1-HindIII. The polynucleotide phosphorylase activity determined either by exchange or by phosphorolysis (results shown in Table I) shows that the crude extract contains an activity 10 to 20 times higher for JC357 / pBP111 than for the wild-type strain. These results demonstrate that the pnp gene is certainly located in the 3Md EcoR1-HindIII fragment.

Les génotypes des souches bactériennes utilisées et les phénotypes des plasmides de la technique- antérieure sontrappelés dans le tableau III. The genotypes of the bacterial strains used and the phenotypes of the plasmids of the prior art are listed in Table III.

Des études complémentaires par restriction de 1'ADN portant le gène pnp conduisent à des plasmides représentés schématiquement à la figure 3 et présentant des phénotypes indiqués au tableau Il. Further restriction-based studies of DNA carrying the pnp gene lead to plasmids schematically shown in Figure 3 and exhibiting phenotypes shown in Table II.

Cette étude démontre que le gène pnp est situé à gauche de HpaI3 et s'étend au-del du site PstI3. This study demonstrates that the pnp gene is located to the left of HpaI3 and extends beyond the PstI3 site.

TABLEAU III
Souches bactériennes

TABLE III
Bacterial strains

<tb> Souches <SEP> Génotype <SEP> Origine <SEP> / <SEP> référence
<tb> JC <SEP> 1553 <SEP> F- <SEP> argG6, <SEP> metB1, <SEP> his1, <SEP> leu6, <SEP> recA1, <SEP> C <SEP> G <SEP> S <SEP> C <SEP> a
<tb> <SEP> mt112, <SEP> xy17, <SEP> malA1, <SEP> gal6, <SEP> lacY1,
<tb> <SEP> rpsL104, <SEP> tonA2, <SEP> tsxl, <SEP> #R, <SEP> <SEP> #-,
<tb> <SEP> supE44
<tb> JC <SEP> 355 <SEP> F- <SEP> argG6, <SEP> metB1, <SEP> his1, <SEP> leu6, <SEP> mt12, <SEP> C <SEP> G <SEP> S <SEP> C <SEP> a
<tb> <SEP> xy17, <SEP> malA1, <SEP> gal6, <SEP> lacY1, <SEP> tonA2,
<tb> <SEP> tsxl, <SEP> #R, <SEP> <SEP> R-, <SEP> supE44
<tb> JCH5/JC <SEP> 1553 <SEP> F' <SEP> argG+/JC <SEP> 1553 <SEP> R. <SEP> Takata
<tb> JC <SEP> 3559 <SEP> rspL <SEP> dérivé <SEP> de <SEP> JC <SEP> 355
<tb> <SEP> (mutant <SEP> spontané)
<tb> JC <SEP> 3560 <SEP> pnp::Tn5 <SEP> dérivé <SEP> de <SEP> JC <SEP> 3559
<tb> <SEP> transduction <SEP> P1
<tb> JC <SEP> 357 <SEP> Dérivé <SEP> recA <SEP> de <SEP> JC <SEP> 3560
<tb> <SEP> Plasmides
<tb> <SEP> Phenotype
<tb> pACYC <SEP> 184 <SEP> Cmr, <SEP> Tcr <SEP> Chang <SEP> and <SEP> Cohen <SEP> (1978)
<tb> PBR <SEP> 322 <SEP> Apr, <SEP> Tcr <SEP> Bolivaret <SEP> al. <SEP> (1977)
<tb> a Col i Genetic Stock Center, Yale University, U.S.A. <tb> Strains <SEP> Genotype <SEP> Origin <SEP> / <SEP> reference
<tb> JC <SEP> 1553 <SEP> F- <SEP> argG6, <SEP> metB1, <SEP> his1, <SEP> leu6, <SEP> recA1, <SEP> C <SEP> G <SEP> S <SEP> C <SEP> a
<tb><SEP> mt112, <SEP> xy17, <SEP> malA1, <SEP> gal6, <SEP> lacY1,
<tb><SEP> rpsL104, <SEP> tonA2, <SEP> tsxl, <SEP>#R,<SEP><SEP># -,
<tb><SEP> supE44
<tb> JC <SEP> 355 <SEP> F- <SEP> argG6, <SEP> metB1, <SEP> his1, <SEP> leu6, <SEP> mt12, <SEP> C <SEP> G <SEP> S <SEP> C <SEP> a
<tb><SEP> xy17, <SEP> malA1, <SEP> gal6, <SEP> lacY1, <SEP> tonA2,
<tb><SEP> tsxl, <SEP>#R,<SEP><SEP> R-, <SEP> supE44
<tb> JCH5 / JC <SEP> 1553 <SEP> F '<SEP> argG + / JC <SEQ> 1553 <SEP> R. <SEP> Takata
<tb> JC <SEP> 3559 <SEP> rspL <SEP> derivative <SEP> of <SEP> JC <SEP> 355
<tb><SEP> (spontaneous <SEP> mutant)
<tb> JC <SEP> 3560 <SEP> pnp :: Tn5 <SEP> derivative <SEP> of <SEP> JC <SEP> 3559
<tb><SEP> transduction <SEP> P1
<tb> JC <SEP> 357 <SEP> Derived <SEP> recA <SEP> from <SEP> JC <SEP> 3560
<tb><SEP> Plasmids
<tb><SEP> Phenotype
<tb> pACYC <SEP> 184 <SEP> Cmr <SEP> Tcr <SEP> Chang <SEP> and <SEP> Cohen <SEP> (1978)
<tb> PBR <SEP> 322 <SEP> Apr, <SEP> Tcr <SEP> Bolivaret <SEP> al. <SEP> (1977)
<tb> Col i Genetic Stock Center, Yale University, USA

Claims

1) Plasmid, characterized in that it comprises at least:

the bacterial DNA fragment carrying the structural gene of the polynucleotide phosphorylase, and

a DNA fragment of a bacterial plasmid.

2) Plasmid according to claim 1, characterized in that the DNA fragment of a bacterial plasmid comes from pBR322.

3) Plasmid according to one of claims 1 and 2, characterized in that the bacterial DNA fragment carrying the structural gene of the polynucleotide phosphorylase measures about 1.5 Md.

-4) Plasmid according to one of claims 1 to 3, pBP 280 and pBP 111.

5) Process for the preparation of a plasmid according to one of claims 1 to 4, characterized in that it incorporates in a bacterial plasmid a fragment of ADs carrying the pnp gene and a neighboring gene conferring a particular phenotype .

argg

6) Method according to claim 5, characterized in that the particular phenotype is the phenotype

7) strains transformed with a plasmid according to one of claims 1 to 4.

8) Strains according to claim 7, characterized in that it is Escherichia coli.

9) A method for preparing polynucleotide phosphorylase by fermentation of a culture medium with a strain according to one of claims 7 and 8 and recovery of the polynucleotide phosphorylase produced.