FR2482620A1 - Procede de purification de solutions contenant de la levane-saccharase - Google Patents
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- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Abstract
PROCEDE DE PURIFICATION DE SOLUTIONS DE LEVANE-SACCHARASE PERMETTANT D'OBTENIR UNE ENZYME DE HAUTE ACTIVITE SPECIFIQUE AVEC UN RENDEMENT TRES ELEVE. APRES AVOIR ACIDIFIE LE MILIEU DE FERMENTATION, ON EFFECTUE UNE CENTRIFUGATION, PUIS UNE ULTRA-FILTRATION DES SURNAGEANTS. LES ACIDES NUCLEIQUES ET LES PIGMENTS ROUGES SONT ELIMINES PAR PRECIPITATION ET LES PROTEINES SONT SEPAREES DU MILIEU PAR PERMEATION DE GEL. APPLICATION: SYNTHESE DE LEVANES A PARTIR DE SACCHAROSE.
Description
La présente invention concerne un procédé de purification de la levane saccharase.
La lévane saccharase est une fructosyl-trançférase qui permet de synthétiser un polyfructose à partir de saccharose. En particulier la ss-2-6-fructane D glucose-l- fructosyl transférase ; EC.2.4.1.10 permet d'obtenir un homo-polymère ramifié de D-fructose : la chaîne princi pale du polymere résulte de liaisonsp
entre les résidus de D-fructose et les branchements correspondent à des îiaisons/3
entre les résidus de D-fructose et les branchements correspondent à des îiaisons/3
Les applications de ce polyfructose ou lévane sont variées : entre autres, il peut être substitué à l'amidon, aux dextrane, xanthane, pulilulane ou bien être hydrolysé de façon à préparer des solutions concentrées de fructose.
DEDONDER et colt. (Bull. Soc. Chim. Biol. 45, 477-491, 1963) ont décrit une methode de purification de la lévane saccharase comportant trois étapes
1) précipitation à l'éthanol.
1) précipitation à l'éthanol.
2) précipitation au sulfate d'ammonium.
3) chromatographie sur hydroxyl-apatite.
Les activités spécifiques élevées (150 ULS/mg- de protéine) sont obtenues au détriment du rendement de la purification de l'enzyme.
L'invention vise à pallier cet inconvénient et permet de purifier des lévanes saccharases de haute activite speci- fique avec un rendement très éleve.
Le procédé de purification est caractérisé en ce qu'il comporte
a) une étape d'acidification du milieu de fer
mentation en fin de croissance bactérienne.
a) une étape d'acidification du milieu de fer
mentation en fin de croissance bactérienne.
b) une étape de centrifugation.
c) une étape d'ultrafiltration des surnageants
de fermentation.
de fermentation.
d) une etape d'éiimination des acides nucléiques
et des pigments rouges.
et des pigments rouges.
e) une étape de fractionnement des protéines.
De préférence le pH de l'étape d'acidification est ajusté à 6,0 et la centrifugation ultérieure est operée à 4"C pendant 2Q minutes à 5 000 g.
Les acides nucléiques et les pigments rouges sont pré capités par addition de sulfate de protamine.
L'invention sera mieux comprise grâce aux exemples détaillés donnés ci-après concernant la production et la purification de la lévane saccharase.
La souche bactérienne utilise pour produire la lévane saccharase est le Bacillus Subtilis C4 mutant constitutif du Bacillus Subtilis B.S.5 hyperproducteur de lévane saccharase exocellulaire.
La composition du milieu de culture est donnée dans le
Tableau 1.
Tableau 1.
Solution A
<tb> Sulfate <SEP> d'ammonium <SEP> 3,3 <SEP> gel <SEP> 1 <SEP>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> dipotassique <SEP> 12,2 <SEP> g.l <SEP>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> monopotassique <SEP> 4,1 <SEP> g.l <SEP>
<tb> Glycérol <SEP> 10 <SEP> g.1- <SEP>
<tb>
Solution B
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> dipotassique <SEP> 12,2 <SEP> g.l <SEP>
<tb> Phosphate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> monopotassique <SEP> 4,1 <SEP> g.l <SEP>
<tb> Glycérol <SEP> 10 <SEP> g.1- <SEP>
<tb>
Solution B
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,060 <SEP> g.l <SEP> 1
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> manganese <SEP> 0,017 <SEP> g.l <SEP> 1
<tb> Fer <SEP> (III) <SEP> citrate <SEP> ammoniacal <SEP> 0,022 <SEP> g.l <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Solution C
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> manganese <SEP> 0,017 <SEP> g.l <SEP> 1
<tb> Fer <SEP> (III) <SEP> citrate <SEP> ammoniacal <SEP> 0,022 <SEP> g.l <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Solution C
<tb> Antimousse <SEP> RHODORSIL <SEP> 410 <SEP> 1 <SEP> à <SEP> 2 <SEP> g.1- <SEP>
<tb>
TABLEAU 1
Afin d'éviter la précipitation des sels au cours de la stérilisation, le milieu est stérilisé en trois parties (solutions A,B,C).
<tb>
TABLEAU 1
Afin d'éviter la précipitation des sels au cours de la stérilisation, le milieu est stérilisé en trois parties (solutions A,B,C).
Les sels et l'antimousse sont ajoutés stérilement avant inoculation.
Les conditions de culture sont données dans le tableau 2.
<tb> pH <SEP> initial <SEP> 7,0
<tb> Température <SEP> 37o <SEP> C
<tb> Aération <SEP> Volume <SEP> d'air <SEP> injecté <SEP> par <SEP> volume <SEP> de
<tb> <SEP> milieu <SEP> et <SEP> par <SEP> minute <SEP> compris <SEP> entre <SEP> 0,7
<tb> <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 1.1 <SEP> 1 <SEP> mn <SEP> 1
<tb>
<tb> Température <SEP> 37o <SEP> C
<tb> Aération <SEP> Volume <SEP> d'air <SEP> injecté <SEP> par <SEP> volume <SEP> de
<tb> <SEP> milieu <SEP> et <SEP> par <SEP> minute <SEP> compris <SEP> entre <SEP> 0,7
<tb> <SEP> et <SEP> 3 <SEP> 1.1 <SEP> 1 <SEP> mn <SEP> 1
<tb>
TABLEAU 2
L'activité de la lévane saccharase est mesurée en determinant la liberation du glucose dans la réaction saccharose
lévane + glucose.
L'activité de la lévane saccharase est mesurée en determinant la liberation du glucose dans la réaction saccharose
lévane + glucose.
La synthèse des lévanes est effectuée dans les conditions données dans le tableau 3, pour un volume total de 1 ml.
Température : 370 C
x ml de solution enzymatique
y ml de tampon phosphate 0,05 M, pH 5,8 0,3ml de solution de saccharose 1 M dans du tampon
phosphate 0,5 M pH 5,8
TABLEAU 3
L'unité d'activité enzymatique (ULS) est définie comme étant la quantité de lévane saccharase qui libère 1 emole de glucose par minute dans les conditions définies dans le tableau 3.
x ml de solution enzymatique
y ml de tampon phosphate 0,05 M, pH 5,8 0,3ml de solution de saccharose 1 M dans du tampon
phosphate 0,5 M pH 5,8
TABLEAU 3
L'unité d'activité enzymatique (ULS) est définie comme étant la quantité de lévane saccharase qui libère 1 emole de glucose par minute dans les conditions définies dans le tableau 3.
L'influence des divers paramètres sur la vitesse de.
croissance bactérienne et l'activité de la levant saccharase est précisée dans le tableau 4.
<tb>
Débit <SEP> d'aération <SEP> Vitesse <SEP> d'agitation <SEP> Concentration <SEP> Taux <SEP> de <SEP> Activité
<tb> <SEP> lh-l <SEP> tr. <SEP> mn-1 <SEP> d'antimousse <SEP> croissance <SEP> ULS.m1- <SEP>
<tb> <SEP> h-1
<tb> <SEP> 350 <SEP> 700 <SEP> 0 <SEP> 0,52 <SEP> 1,85
<tb> <SEP> 380 <SEP> 700 <SEP> 1%.<SEP> 0,37 <SEP> 21,6
<tb> <SEP> 450 <SEP> 1300 <SEP> 1 <SEP> %0 <SEP> 0,56 <SEP> 21,0
<tb>
TABLEAU 4
On notera que le rôle de l'antimousse est très important puisqu'il permet d'obtenir des lévanes saccharases d'activité très élevée (21 ULS.ml -1 contre 1,85 ULS.ml 1)
La figure 1 montre que si la culture du Bacillus Subtilis est effectuée dans un milieu standard - sans antimousse l'activité de la lévane saccharase décroit très rapidement lorsque la concentration cellulaire augmente.
<tb> <SEP> lh-l <SEP> tr. <SEP> mn-1 <SEP> d'antimousse <SEP> croissance <SEP> ULS.m1- <SEP>
<tb> <SEP> h-1
<tb> <SEP> 350 <SEP> 700 <SEP> 0 <SEP> 0,52 <SEP> 1,85
<tb> <SEP> 380 <SEP> 700 <SEP> 1%.<SEP> 0,37 <SEP> 21,6
<tb> <SEP> 450 <SEP> 1300 <SEP> 1 <SEP> %0 <SEP> 0,56 <SEP> 21,0
<tb>
TABLEAU 4
On notera que le rôle de l'antimousse est très important puisqu'il permet d'obtenir des lévanes saccharases d'activité très élevée (21 ULS.ml -1 contre 1,85 ULS.ml 1)
La figure 1 montre que si la culture du Bacillus Subtilis est effectuée dans un milieu standard - sans antimousse l'activité de la lévane saccharase décroit très rapidement lorsque la concentration cellulaire augmente.
En fin de croissance bactérienne, lorsque l'activité de la levane saccharase du milieu de fermentation est maximale, le pH est ajusté à 6,0 puis le milieu est centrifugé à 40 C pendant 20 mn à 5000 g.
Les surnageants de fermentation contenant la lévane saccharase sont concentrés par ultrafiltration à 40 C dans un module SARTORIUS SM 16525 garni de cinq membranes
SM 12136 ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons.
SM 12136 ayant un seuil de coupure de 10 000 daltons.
En ultrafiltrant pendant 22 heures 9 litres de surnageant de culture contenant 11 ULS.ml on obtient 420 ml de solution ayant une activité lévane saccharase de 173 ULS.ml -1
Le rendement d'ultrafiltration en activité enzymatique est de 73,5 %.
Le rendement d'ultrafiltration en activité enzymatique est de 73,5 %.
Les solutions de lévane saccharase obtenues par ultrafiltration contiennent des acides nucléiques et des pigments rouges.
L'addition de sulfate de protamine dans du tampon phosphate 0,05 M pH 5,8 jusqu'à une concentration finale de 2 %, permet de précipiter totalement ces impuretés.
A titre d'exemple, lorsqu'on traite ainsi une solution de levant saccharase d'activite 130 ULS.ml -1, on obtient une solution purifiée d'activité 111 ULS.ml 1.
Le rendement en activité enzymatique de cette étape est donc de 90 %.
Les surnageants de filtration ultrafiltrés et purifiés contiennent des protéines que l'on élimine par perméation de gel.
On utilise à cette fin une colonne de 800 ml d'ULTROGEL
AcA 34 (I.B.F.) qui permet de chromatographier 100 ml de solution ultrafiltrée.
AcA 34 (I.B.F.) qui permet de chromatographier 100 ml de solution ultrafiltrée.
Le rendement en activité enzymatique de la perméation de gel est de 90 %.
Le tableau 5 rappelle les divers rendements des étapes du procédé de purification de la lévane saccharase selon l'invention.
<tb>
Etape <SEP> Rendement <SEP> Rendement <SEP> golbal
<tb> <SEP> % <SEP> %
<tb> Ultrafiltration <SEP> 73,5 <SEP> 73,5 <SEP>
<tb> PréciPitation <SEP> du <SEP> 90 <SEP> 66,15
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> protamine
<tb> Perméation <SEP> de <SEP> gel <SEP> 90 <SEP> 59,5
<tb>
TABLEAU 5
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une lévane saccharase d'activité spécifique de 150 ULS.mg 1 de protéine avec un rendement de 59,5 %.
<tb> <SEP> % <SEP> %
<tb> Ultrafiltration <SEP> 73,5 <SEP> 73,5 <SEP>
<tb> PréciPitation <SEP> du <SEP> 90 <SEP> 66,15
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> protamine
<tb> Perméation <SEP> de <SEP> gel <SEP> 90 <SEP> 59,5
<tb>
TABLEAU 5
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une lévane saccharase d'activité spécifique de 150 ULS.mg 1 de protéine avec un rendement de 59,5 %.
Pour memoire, il est rappelé que DEDONDER et col. n'obtenaient qu'un rendement de 15 %.
Claims (8)
1. Procedé de purification de solutions contenant de
la lévane saccharase, caractérisé en ce qu'il com
porte les étapes succesives suivantes
a) acidification du milieu de fermentation en
fin de croissance bactérienne.
station.
b) ultrafiltration des surnageants de fermen
pigments rouges.
c) élimination des acides nucléiques et des
d) fractionnement des protéines.
2. Procédé de purification de solutions contenant de
la 7evane saccharase selon la revendication 1,
caractérisé en ce que l'étape d'acidification
consiste à ajuster le pH de la solution à 6,0.
3. Procédé de purification de solutions contenant de
la lévane saccharase selon les revendications 1
et 2, caractérisé en ce que l'étape d'ultrafiltra
tion est conduite à 40 C.
4. Procédé de purification de solutions contenant de
la lévane saccharase selon l'une des revendications
1 et 3, caractérisé en ce que le dispositif d'ultra-
filtration est garni de membranes ayant un seuil de
coupure de 10 000 daltons.
5. Procedé de purification de solutions contenant de
la lévane saccharase selon la revendication 1,
caractérisé en ce que l'élimination des acides
nucleiques et des pigments rouges est réalisée
par addition de sulfate de protamine.
6. Procédé de purification de solutions contenant de
la levane saccharase selon la revendication 5,
caractérisé en ce que le sulfate de protamine est
en solution dans tampon phosphate 0,05 M à
pH 5,8.
7. Procédé de purification de solutions contenant de
la levane saccharase selon l'une quelconque des
revendications 1, 5 ou 6, caractérisé en ce que
l'addition de sulfate de protamine est opérée
jusqu'à ce que sa concentration finale soit de 2 % .
8. Procédé de purification de solutions contenant de
la lévane saccharase selon la revendication 1,
caractérisé en ce que les proteines sont fraction
nées par permation de gel.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8011079A FR2482620A1 (fr) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Procede de purification de solutions contenant de la levane-saccharase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8011079A FR2482620A1 (fr) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Procede de purification de solutions contenant de la levane-saccharase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2482620A1 true FR2482620A1 (fr) | 1981-11-20 |
| FR2482620B1 FR2482620B1 (fr) | 1984-01-20 |
Family
ID=9242081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8011079A Granted FR2482620A1 (fr) | 1980-05-19 | 1980-05-19 | Procede de purification de solutions contenant de la levane-saccharase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2482620A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4477568A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Proefstation voor Aardappelverweking-TNO en Cooperatieve Verkoop en Produktievereniging van Aardappelmeel en Derivaten AVERE B.A. | Process for the manufacture of cyclodextrin |
-
1980
- 1980-05-19 FR FR8011079A patent/FR2482620A1/fr active Granted
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CA1963 * |
| CA1964 * |
| CA1975 * |
| EXBK/78 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4477568A (en) * | 1981-09-24 | 1984-10-16 | Proefstation voor Aardappelverweking-TNO en Cooperatieve Verkoop en Produktievereniging van Aardappelmeel en Derivaten AVERE B.A. | Process for the manufacture of cyclodextrin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2482620B1 (fr) | 1984-01-20 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| CD | Change of name or company name |