FR2465002A1 - Extraits biologiques notamment de limulus, depourvus d'inhibiteurs et coagulables par une endotoxine et procede de leur preparation - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE L'INDUSTRIE BIOCHIMIQUE. POUR STANDARDISER DES EXTRAITS COAGULABLES PAR UNE ENDOTOXINE ON INACTIVE L'INHIBITEUR ENDOGENE, ON DETERMINE L'ACTIVITE COAGULASIQUE DE L'EXTRAIT ET ON INTRODUIT DES QUANTITES PROPORTIONNEES DE L'EXTRAIT DANS UN MELANGE REACTIONNEL DE DETERMINATION D'UNE ENDOTOXINE DE FACON A OBTENIR UNE VALEUR PREDETERMINEE DE L'ACTIVITE COAGULASIQUE; DANS LA PLUPART DES CAS, ON DETERMINE EGALEMENT LA CONCENTRATION EN COAGULOGENE ET SI ELLE EST INFERIEURE A UNE VALEUR PREDETERMINEE, ON AJOUTE DU COAGULOGENE A L'EXTRAIT; DE FACON AVANTAGEUSE, POUR INACTIVER L'INHIBITEUR, ON AJUSTE LE PH DE L'EXTRAIT A UNE VALEUR FORTEMENT ALCALINE, ON INCUBE ET ON REAJUSTE LE PH AU VOISINAGE DE LA NEUTRALITE. APPLICATION NOTAMMENT AUX EXTRAITS D'AMIBOCYTES DE LIMULUS.
Description
i, 2465002
EXTRAITS BIOLOGIQUES NOTAMMENT DE LIMULUS. DEPOURVUS D'INHIBITEURS ET
COAGULABLES PAR UNE ENDOTOXINE ET PROCEDURE DE LEUR PREPARATION.
La présente invention concerne des extraits biologiques et un
procédé de leur préparation.
Plus particulièrement, l'invention concerne la préparation d'ex- traits de cellules sanguines d'organismes tels que le limule, Limulus uol]yhemus. Notamment l'invention concerne un procédé amélioré pour éliminer
un inhibiteur présent dans les lysats d'amibocytes de Limulus.
Les extraits de l invention contiennent tous une enzyme, la coagu-
lase. Cette enzyme agit de concert avee un autre composant de l'extrait pour former un gel ou un caillot par contact avec une endotoxine. On appelle donc
ces extraits, extraits coagulables par une endotoxine. On les obtient généra-
lement à partir des amibocytes sanguins de Limulus polvphemus. Classiquement, on recueille les amibocytes du sang, on les lyse pour libérer les composants intracellulaires solubles dans l'eau et on centrifuge pour éliminer les débris en suspension. Une technique appropriée pour obtenir ces extraits de
Limulus est décrite dans le brevet britannique no 1 499 846. On obtient éga-
lement ces extraits à partir d'autres espèces par exemple TackvDleus tridentatus. Les extraits coagulables par une endotoxine contiennent deuxeomposants principaux qui sont responsables de la formation du caillot. Ces composants sont une coagulase et un coagalogène. Il semble que la coagulase soit activée par une endotoxine pour catalyser l'hydrolyse protéolytique du coagulogène en un fragment de protéine qui se polymérise ensuite spontanément pour former
un produit détestable. On a abondamment étudié et caractérisé la coagulase.
On peut consulter à cet égard Thai et coll., " Journal of Biological Chemis-
try" 52 (14): 4773-4776 (1977) et Solum, " Thrombosis Research" 2: 55-70
(1973).
Le coagulogène ainsi qu'un procédé pour sa purfication sont décrits
par Gaffin dans "Biorheology" 13: 273-280 (1976). Le coagulogène sert essen-
tiellement de substrat pour la coagulase activée. Il a été particulièrement utile pour 1' étalonnage de l'activité coagulasique car il comporte son propre
indicateur; les fragments hydrolysés par la coagulase forment des parti-
cules insolubles et éventuellement un caillot semi-solide sans l'intervention
d'aucun réactif additionnel.
2 2465002
La grande sensibilité à une endotoxins des extraits coagulables par uns endotoxine a été trés utilisée dans des tests de préselection des pyrogènes dans les humeurs humaines et dans des produits biologiques tels que les produits pharmaceutiques et les solutions parentérales. On a adopté divers procédés classiques utilisant de tels extraits pour effectuer des déterminations des endotoxines. Parmi ces essais figurent ceux dans lesquels on suit l'accroissement de la densité optique de l'extrait ou la formation d'un caillot gélifié après contact avec une endotoxine. Dans un exemple de détermination quantitative d'une endotoxine, on analyse la
quantité spécifique de protéine que contient le caillot.
La généralisation de l'adoption de telles déterminations à l'échelle industrielle a été gênée par les variations de sensibilité que l'on observe parmi des lots différents d'extraits de Limulus et la difficulté de corriger les variations. On a émis l'hypothèse que ces variations de l'activité étaient dues à des facteurs saisonniers, c'est-à-dire dépendent du moment de l'année o on recueille le sang de Inmulus. Au moins un composant qui est en partie responsable de cette variation a été caractérisé commrne un "inhibiteur" de la réaction de coagulation. Cette dénomination repose sur l'action apparente de l'inbibiteur car sa présence s'accompagne de diminutions de la sensibilité de la détermination d'une endotoxine. On a pensé que cet inhibiteur pouvait être une enzyme (Nachum et coll., Journal of Invertebrate Pathology" 32: 51-58 (1978)) ou une lipoprotéine qui se fixe simplement à l'endotoxine (Sullivan et coll., "Applied Microbiology" 28 (6): 1023 -1026 (1974)). Quel que soit son mode d'action, on appelle ci-après cette substance
un inhibiteur.
La publication de Sullivan et coll. précitée décrit également un procédé pour réduire l'activité de l'inbibiteur. Ce procédé consiste à agiter
des volumes égaux de solvant organique et de lysat de Limulus, puis à centri-
fuger et à récupérer la phase aqueuse. Ce procédé ne s'est pas révélé satis-
faisant car il nécessite la manipulation de réactifs toxiques ou très inflam-
mables et une séparation de phases malaisée. De plus, du solvant organique résiduel peut demeurer dans le produit de ce procédé. Même les solvants non miscibles à l'eau présentent une légère solubilité dans l'eau; dans le cas
du chloroforme, la solubilité dans l'eau à 20 0 est de 0,82 pour 100 parties.
L'effet de ce solvant résiduel sur l'échantillon à analyser peut être impré-
visible ou indésirable.
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La présence de cet inhibiteur dans des extraits que l'on consi-
dérait comme 'standardisés" a empêché en pratique que ces extraits cons-
tituent des standazb fiables. De plus, les extraits "standardisés'" connus n'ont jamais été préparés en tenant compte de façon appropriée des teneurs en coagulogène et en coagulase vraie du produit Les brevets des Etats-Unis d'Amérique nO 3 944 391 et no 4 038 147 décrivent des lysats "standardisés" typique de Limulus. On prépare ces produits par simple dosage d'un lot de
lysat avec une dilution en série d'endotoxine pour déterminer l'activité glo-
bale du lysat. La difficulté principale de cette voie d'approche est qu'elle est essentiellement passive; l'extrait n'est en aucune façon traité pour qu'on obtienne un signal prédéterminé unique, par exemple un point final
néphélométrique donné par réaction avec une concentration donnée en endo-
toxine. Ceci rend le contr8le de qualité plus diffieile car l'utilisateur doit préparer de nouvelles courbes d'éta lonnage pour chaque nouveau lot de lysat. Du point de vue commercial, il est souhaitable de fournir un lysat
provenant de divers lots, ce lysat produisant régulièrement les mêmes ré-
sultats dans une détermination d'une endotoxine lorsqu'on utilise des con-
centrations eonstantes en endotoxine, alors que les lots non traite d'ori-
gine produisent des signaux dispersés, certains supérieurs et d'autres infé-
rieurs à la1valeur prédéterminée désirée.
L'invention a poue but la production d'extraits coagulables par une endotoxine produisant un signal analytique prédéterminé reproductible par
une concentration donnée en endotoxine dans une gamme analytiquement signi-
ficative. L'invention a également pour but un procédé pour remplacer le procédé
précédemment utilisé d'inactivation de l'inhibiteur de Limulus, ne nécessi-
tant pas de réactif toxique ou dangereux, qui permet des économies de main
d'oeuvre et de matibres et qui ye laisse pas dans le produit un résidu sus-
ceptible de gêner.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront
de la description qui suite
Selon l'invention, pour supprimer l'effet de l'inhibiteur dans des
extraits de Limulus, on ajuste le pH de l'extrait au-dessus d'environ 8,5.
Lorsqu'on a obtenu le degré désiré d'inactivation de l'inhibiteur, on abaisse le pH de l'extrait traité à une valeur o la coagulase est active. L'extrait obtenu est remarquable car il ne contient pas de résidu de solvant organique
tout en étant pratiquement dépourvu d'inhibiteur.
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On peut également utiliser le procédé amélioré de l'invention pour préparer un extrait standardisé. Ce procédé peut préparer un extrait standardisé coagulable par une endotoxine, consiste à: (a) inactiver pratiquement l'inhibiteur d'un extrait naturel coagulable par une endotoxine; (b) déterminer l'activité coagulasique de l'extrait; et (c) séparer l'extrait en portions calculées de façon à ce qu'elles aient une activité coagulasique prédéterminée. Généralement, il est égalemnt souhaitable de faire en sorte que la concentration en coagulogène
1o de l'extrait soit au moins supérieure à une valeur prédéterminée.
Le produit standardisé obtenu consiste en une certaine quantité d'extrait coagulable par une endotoxine qui est pratiquement dépourvue d'inhibiteur et qui a une activité coagulasique prédéterminée. Il est également souhaitable que le volume d'extrait contienne du coagulogène
en excès par rapport à une quantité prédéterminée.
L'invention va maintenant être décrite de façon détaillée.
La découverte selon laquelle on peut détruire l'inhibiteur par
ajustement du pl est particulièrement surprenante. Levin et coll.("J.Lab.
Olin.ed.el. (6): 903-911 (1970)) ont décrit diverses tentatives pour éliminer un inhibiteur de la réaction de coagulation du lysat de Limulus
présent dans le plasma sanguin. Bien que Levin et coll. indiquent l'inae-
tivation de 1' inhibiteur par le chloroforme, la précipitation par l'acide
trichloreacétique n'a pas permis d'éliminer ou d'inactiver l'inhibiteur.
On notera incidemment que l'inhibiteur du plasma a été depuis rattaché à
2 l'inhibiteur qu'on trouve dans les extraits de Limulus (brevet des Etats -
Unis d'Amérique n 4 107 077). De plus, non seulement Levin et coll. suge gèrent qu'un acide est inefficace contre l'inhibiteur, mais d'autres auteurs ont conclu que l'acidification du lysat inactive de façon irréversible, la coagulase (Solum, 'Thrombosis Research 2: 55-70 (1973)). Ce résultat est
bien sar contraire à celui que l'on désire ici. Cependant de façon surpre-
nante, lorsqu'on élève le pH de l'extrait coagulable par une endotoxine, au lieu de l'abaisser, l'activité coagulasique est conservée tandis que
l'inhibiteur est inactivé de façon irreversible.
L'extrait coagulable par uns endotoxine qui constitue la matière première des procédés et des compositions de l'invention, peut être une
composition quelconque contenant de la coagulase. On appelle cette ompo-
sition, un extrait, car on l'obtient généralement par séparation des compo-
sants solubles des amibocytes de imulus des éléments insolubles, tels que les parois cellulaires. Néanmoins, il n'est pas indispensable d'éliminer les éléments insolubles ni même de lyser les cellules si l'on utilise une détermination de la coagulase indépendante de la formation d'un caillot ou d'une suspension de particules de coaaulogène polymérisé. De plus, il n'est pas nécessaire que l'extrait contienne du coagulogène si l'on utilise
un substrat analytique autre que le coagulogène pour suivre l'activité coa-
gulasique. Il est cependant essentiel que la matière première contienne
de la coagulase.
Ces extraits coagulables par une endotoxine contiennent généra-
lement un inhibiteur. Selon l'invention, pour supprimer l'activité de l'inhi-
biteur, on ajuste le pH dans la zone alcaline, on incube jusqu'à ce qu'on obtienne le degré désiré d'inactivation puis on abaisse le pH dans la région neutre oh la coagulase est à nouveau active. Un avantage important de ce
procédé est que généralement les ajustements du pH ne précipitent pas les élé-
ments des extraits y compris l'inhibiteur. Domcontrairement au procédé
connu qui utilise le chloroforme, il n'est pas nécessaire de séparer une por-
tion quelconque du mélange réactionnel après lVnactivation de l'inhibiteur.
Une centrifugation brève ou un stade de filtration grossière peut être souhai-
inactive
table si l'on / l'inhibiteur à un pH supérieur à 11 et si on doit uti-
liser l'extrait traité dans un procédé de détermination d'une endotoxine par néphélométrie ou mesure de la densité optique. Cependant dans la plupart des
cas, aucun traitement narticulier de l'extrait n'est nécessaire après l'inac-
tivation de l'inhibiteur par ajustement du pH. Il n'est pas nécessaire d'inaetiver l'inhibiteur à 100 %. Il est généralement satisfaisant que le lysat soit pratiquement dépourvu d'inhibiteur c'est à dire que l'inhibiteur soit inactivé au moins à 75 %. Le degré d'inactivation nécessaire dépend
de la sensibilité vis-à-vis d'une endotoxine que l'on désire et de la varia-
bilité de la teneur en inhibiteur des lots à standardiser. Donc, le degré
d'inactivation dépend des cas particuliers.
Le pH d'un lysat typique d'amibocyte de Limulus est d'environ 6,0 h 7,0. Dans l'invention on peut, pour ajuster le pH à une valeur alcaline, opérer de façon classique quelconque telle que, par exemple, par introduction
d'une solution alcaline aqueuse dans l'extrait avec agitation permanente.
Cependant, au lieu de solutions, on peut utiliser des substances basiques cristallines ou solides. L'emploi de substances basiques cristallines ou
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solides est souhaitable lorsqu'on désire ultérieurement lyophiliser l'ex-
trait car cette technique n'augmente pas le volume d'eau à éliminer.
La matière alcaline peut être organique ou minérale bien que l'on préfère des solutions aqueuses diluées d'hydroxyde de métaux alcalins tels que l'hydroxyde de sodium. Les aleYlamines constituent des exemples de substances alcalines organiques utiles. La nature particulière de la substance n'a pas d'importance; il suffit d'élever le pH sans provoquer de réactions secondaires indésirables inactivant la coagulase ou le coagulogène au point
de gêner l'emploi du lysat dans une détermination d'une endotoxine. On pré-
fère ne pas incorporer de tampon à l'extrait ou à la substance alcaline car cela accroîtrait la quantité de réactif nécessaire pour effectuer l'un
des ajustements du pH ou les deux.
Bien que la matière alcaline ne doive pas avoir d'effet nuisible sur la coagulase, l'endotoxine ou le coagulogène, si le coagulogène est présent, on peut choisir un cation qui en pratique est avantageux dans la détermination. Par exemple, on peut utiliser de l'hydroxyde de manganèse ou
de magnésium au moins comme portion de la matière alcaline, car les ions man-
ganèse ou magnésium servent également de cofacteur de la coagulase. Nalheu-
rueusement l'emploi dhydroxydes de métaux divalents utiles comme cofacteurs est limité en raison de leur faible solubilité. Dans tous les cas, on ajoute de préférence à l'extrait, avant ou pendant l'ajustement du pH alcalin, un cation divalent servant de cofacteur à la coagulase, que la composition contenant ce cation contribue ou non à 1' alcalinité. Cependant le cofacteur
n'est pas indispensable.
On incube l'extrait àun pH élevé jusqu'à ce qu'on ait obtenu le
degré désiré d'inactivation de l'inhibiteur. On préfère inactiver tout l'inhi-
biteur avant d'arrêter l'incubation. Le degré d'inactivation varie avec la durée d'incubation, la température et le pH; par exemple, plus l'incubation est longue et plus la température et le pH sont élevés, plus l'inactivation est rapide. Il est facile à l'homme de l'art d'optimaliser ces paramètres à partir d'essais simples; les conditions dépendent de la nature de chaque
lot de lysat.
On peut ajuster le pH à une valeur quelconque supérieure à environ 8,5 et généralement comprisebntre environ 8,5 et 11 et mieux entre environ 9,0 et 10,0. La coagulase et le coagulogène sont stables à ces concentrations en ions hydrogènes. Cependant comme d'autres protéines des extraits peuvent
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précipiter à un pH d'environ 11, il peut être utile de choisir un pH plus
bas et d'incuber pendant une période plus importante.
La durée d'incubation suffisante pour inactiver l'inhibiteur dépend bien s r de la quantité d'inhibiteur présente et du degré désiré d'inactivation. Généralement, 20 minutes à 4 heures suffisent; on préfère
généralement 90 minutes à pH 9 et à 4 00.
La température d'incoubation peut être comprise entre environ 0"C et la température à laquelle la coagulase est inactivée par la chaleur; on a déterminé que cette température est d'environ 600C. On doit maintenir la température entre environ 0 et 40 0C et on préfère généralement la maintenir
au voisinage de 400 par imersien du réacteur dans un bain-marie glacé.
Après l'incubation, on doit ramener le pH à une valeur à laquelle la coagulase est Rctive. Par définition, une coagulase active est une coagulase capable de se fixer de façon réversible à une endotoxine ou une coagulase capable de ze fixer à une endotoxine et, de plus, manifester cette fixation par une action eatalytique sur le coagilogène ou un autre substrat
approprié. Généralement, on entend par coagulase active, une coagulase pré-
sentant cette action catalytique. Pour effectuer de façon particulièrement appropriée le réajustement du pH, on ajoute un acide selon l'une quelconque des techniques utilisées pour élever au départ le pH. Généralement, pour réajuster le pH, on ajoute un acide aqueux dilué à l'extrait alcalin en agitant. Une concentration appropriée de l'acide est environ 0,1 N. Le pH final optimal est celui qui donne au lysat la sensibilité optimale dans une détermination d'endotoriUne Ce pE corresponi généralement au pu optimal de l'activité coagulasique d aviron 6,0 à 7,5 et de préférence de 7; ensuite
de préférence on lyophilise le lysat ou on le conserve congelé.
La substance utilisée pour abaisser le pH doit, comme la substance alcaline, ne pas nuire à la coagulase ni au coagalogène si ce dernier est présent. Généralement, des acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou lIaoide nitrique sont satisfaisants, bien que l'on
puisse également utiliser des acides organiques. On peut tamponner la sub-
stanee et en pratique il n' est pas nécessaire que le tampon soit à un pH acide mais on peut le préparer pour liatiliser au pH final désiré, par exemple à pH 7 et l'utiliser en une quantité suffisante pour abaisser le pH à cette valeur. Sinon on peut ajouter un
tampon tel que le Tris après avoir ajusté le pH à environ 7.
On peut également ajouter alors à l'extrait un cofacteur de
la coagulase constitué d'un cation divalent.
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Lorsque l'activité de l'inhibiteur d'un extrait coagulable par
une endotoxine a été pratiquement détruite, l'extrait convient à la prépa-
ration d'un extrait standardisé. On préfère inactiver l'inhibiteur par l'a-
justement du pH précédemment indiqué. Cependant, on peut utiliser tout autre procédé tel que la technique connue d'extraction par le chloroforme. Lorsque l'activité de l'inhibiteur n'a pas été détruite, les cinétiques réactionnelles
compétitives de la réaction inhibiteur-endotoxine et de la réaction coagulase -
endotoxine rendent impossible la standardisation de l'extrait dans une gamme des concentrations en endotoxine. Par exemple, si l'on détermine l'activité
coagulasique de l'extrait contenant l'inhibiteur pour une quantité d'endo-
toxine saturant la coagulase, par exemple 3 mg/ml, puis qu'on introduise dans des récipients une quantité de cet extrait telle que chaque récipient ait une
activité enzymatique prédéterminée, quelle que soit l'activité des lots d'ex-
trait d'origine, le produit contient seulement environ 8 de l'activité titrée lorsqu'on détermine des concentrations en endotoxine comprises dans la gamme de 25 à 100 pg/ml. Il semble que cette variation soit due à la déviation de lendotomine par l'inhibiteur,ce qui conduit à des teneurs apparentes en endotoxine inférieures aux teneurs réellement présentes dans 1' échantillon d'origine. Lorsque la concentration en endotoxine est si élevée que toute la coagulase présente est activée, c'est à dire la coagulase est saturée, la
déviation de l'excès d'endotoxine par l'inhibiteur n'a pas d'effet sur l'acti-
vité coagulasique. Cependant, si la coagulase doit être utilisée comme indi-
cateur de la concentration en endotoxine, l'enzyme n'est à fortiori pas saturée dans la gamme des concentrations prévues en endotoxine. Dans ce cas,
l'interférence de l'inhibiteur se manifeste nécessairement dans la détermina-
tion de l'endotoxine. De même, si on standardise l'extrait à une première teneur
d'endotoxine ne provoquant Das la saturation, puis qu'on effectue la détermina-
tion à une seconde teneur en endotoxine, un extrait avec inhibiteur donne un résultat différent de celui d'un extrait sans inhibiteur. Il semble que l'anomalie entre les résultats résulte de l'équilibre entre les cinétiques de
la coagulase et de l'inhibiteur. A la première teneur en endotoxine, l'activa-
tion de la coagulase peut être favorisée tandis qu'à la seconde teneur, l'ac-
tion de l'inhibiteur peut être favorisée.
Si le procédé de détermination envisagé repose sur une hydrolyse du coagulogène par la coagulase, l'extrait standard doit également contenir une concentration prédéterminée en coagulogène correspondant à un excès tel que
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la détermination de 1' endotoxine ne soit pas limitée par le coagulogène
dans la gamme prévue des teneurs en endotoxine. Si on standardise la coa-
gulase par simple détermination de 1' activité enzymatique à une concentration
donnée en endotoxine et que la quantité de coagulogène présente soit insuf-
fisante pour indiquer l'activité coagulasique vraie à d'autres teneurs plus
élevées en endotoxine, les résultats obtenus à ces teneurs élevées indi-
quent une teneur en endotoxine inférieure à celle réellement présente. Ce défaut peut avoir une conséquence indésirable grave dans le diagnostic d'une
bactériémie ou dans le contr8le de qualité de produits parentéraux.
On a constaté que les concentrations en coagulogène sont générale-
ment proportionnelles à l'activité coagulasique dans les extraits naturels de Limulus. Donc dans de nombreux cas, il n'est passouhaitable de faire plus
que simplement confirmer la présence d'une quantité suffisante de coagulo-
gène; dans ces cas, il n'est pas nécessaire d'ajouter du coagulogène supplé-
mentaire à l'extrait. Cependant, il est concevable que le contact accidentel
de ces extraits avec une endotoxine étrangère lors de la récolte et du trai-
tement puisse appauvrir le coagulogène et rendre ainsi nécessaire un apport de coagulogène. On doit donc déterminer que la concentration en coagulogène
est au moins égale à une valeur prédéterminée ou est en grand excès par rap-
port à cette valeur prédéterminée. La quantité prédéterminée de coagulogène dépend des concentrations en endotoxine prévues dans les échantillons à
déterminer. Si 1' on prévoit que les échantillons ne sont que faiblement con-
taminés, par une quantité de l'olrdre de 1 à 100 pg/ml, une teneur en coagu-
logène du lysat d'environ 150 P ml est généralement satisfaisante. Généra-
lement une concentration en coagulogène supérieure à 100 pg/ml de lysat permet d'utiliser le produit avec la plupart des échantillons de matières
biologiques contaminés par une endotoxine. La quantité minimale de coagu-
logène dépend des limites de détection de la détermination par la coagua-
lase de l'endotoxine et on peut espérer que des progrès ultérieurs améliore-
ront ces limites. D'autre part, la quantité maximale à utiliser n'est limitée que par la solubilité maximale du coagulogène dans les solutions
aqueuses; on pourrait théoriquement déterminer des concentrations exception-
nellement élevées en endotoxine, par exemple de 1,0 mg/ml par formation d'un
produit d'hydrolyse du coagulogène, en particulier dans le cas o ce pro-
duit s'élimine du mélange réactionnel au fur et à mesure du progrès de
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l'hydrolyse. Comme une teneur en coagulogène supérieure à 100-400 /ml n'a pas d'effet indésirable sur la détermination et que la limite inférieure de la concentration en coagulogène dépend de 1' état de l'art de la détection
des produits d'hydrolyse du coagulogène, on peut actuellement choisir libre-
ment une teneur prédéterminée particulière en coagulogène.
On peut déterminer le coagulogène selon une modification de la déter-
mination d'une endotoxine de Munford décrite dans "Analytical Biochemistry" 91: 509-515 (1978). Au lieu de déterminer l'endotoxine inconnue, comme on le fait dans ce procédé, on utilise une concentration fixée en endotoxine avec
du coagulogène marqué au 125 I, du coagulogène inconnu et de la coagulase.
Après une période d'incubation, on mesure la radio-activité du caillot comme
dans une détermination radio-immunologique compétitive classique. Une quan-
tité importante de coagulogène déplace le coagulogéne marqué de la précipi-
tation à laquelle participe la coagulase et vice versa pour des teneurs relativement plus faibles en coagulogène. Donc plus la radio-activité du caillot est élevée, plus la concentration en coagulogène est faible. On peut
rendre ce procédé quantitatif par emploi de standards de coagulogène purifié.
Si la concentration en coagulogène est inférieure à la teneur pré-
déterminée, il est nécessaire d'accroître la teneur en coagulogène de l'ex-
trait. Par exemple, on peut mélanger à l'extrait un extrait riche en coagu-
logène ou du coagulogène purifié pour obtenir l'accroissement désiré de la concentration en cosgulogène. Sinon on peut concentrer le coagulogène nar ultrafiltration. Pour préparer un extrait standardisé coagulable par une endotoxine, il est ncessaire de déterminer l'activité coagulasique. On peut pour cela utiliser l'un quelconque des procédés connus de détermination de la coagulase; on a également souvent utilisé ces procédés pour déterminer les concentrations
en endotoxine.
Cependant, on utilise ici une concentration connue, de préférence
saturante d'endotoxine, Une concentrationisaturante en endotoxine est géné-
ralement supérieure à environ 1 mg/ml et de préférence à 3 mg/ml d'endoto-
xine. On peut transformer les résultats de la détermination en unités enzy-
matiques arbitraires, car pour la standardisation, c'est l'activité enzy-
matique relative et non l'activité enzymatique absolue qui est importante.
Lorsqu'on a déterminé l'activité coagulasique de l'extrait, on introduit dans un mélange réactionnel de détermination d'une endotoxine, une quantité il 2465002 de 1'extrait calculée pour produire l'aotivité enzymatique choisie. Par exemple, on peut ajouter l'extrait traité directement au mélange réactionnel
de détermination d'une endotoxine en un volume calculé pour obtenir l'ac-
tivité prédéterminée, Comme il est plus pratique à l'analyste d'ajouter toujours un volume donné d'extrait, on peut introduire dans des récipients pour la oonservation del'extrait une quantité d'extrait calculée de façon à apporter l'activité prédéteziinée après reconstitution dans une quantité constante de solution aqueuse; un nemplissage proportionnel évite àl'utilisateur d'avoir à effect'er une reconstitution proportionnelle. On peut ensuite lyophiliser l'extrait L'invention est illustrée par les exemples non limitatifs suivants:
EXEMPLE I
On recueille séparément deux lots d'amibooytes de Limulus polvphemus et on les lyse selon le prooéRd du brevet britannique n0 1 499 846. On appelle
un des lots, lysat de récfre=e. On utilise l'autre lot comme matière pre-
mière pour la préparation d un lyset standardisé selon le procédé de l' inven-
tion. On l'appelle lot 8-113.
On détermine tout d'abord ltaotivité coagulasique des deux lots.
Dans la présente deserptionle tampon est du tampon Tris 50 mM à pH 7,5, 10 mM en Ig012. On dissout dans le tampon de l'endotoxine de E.eoli (055:B5, Difco Laboratoires). On prépare du eoaguolegne à une concentration de 8,0 mg/ ml dans du tampon selon le procédé de Solum, supra, si ce n'est que l'on proécipite le lysat brat avec du sulfate d'ammonium à 80 % de la saturation avant redissolution et on verse la solution sur une colonne de Sephadezx, on élue la colonne avec du tampon phosphate et on purifile à noueau l'éluat avec une colonne de carbo ty lct!telluloseo On mélMnge et on incube pendant 8 miugate2 0,1 ml diue sotien à 3,0 mg/ml dl'endotocie, 0,l mI de solution de coagulogène, 0,1 mI de lysat et 2,7 ml de tsmpon. Après l'incubation, on note la variation de la densité optique à 360 mm et à 37 C0 Par définition, uiunité ensymatique cozspon h une variation de 0,001 unité d' absorbance
de la densité optique à 360 m. Le lot de référence et le lot 8-113 présen-
tent respectivement une activité ensymatique de 665 et 440 unités/ml.
On distribus ns uite une portion de chaque lot de lysat dans des flacons. Pour qu'il y ait la même activité coagulasique dans chaque flacon, on y introduit respectivement 2 ml et 2,65 ml du lot de référence et du
lot 8-113. On lyoDhilise ensuite le contenu des flacons.
12 2' 55O 0 2
On inactive ensuite l'activité inhibitrice des lots selon le pro-
cédé de l'invention. On reconstitue deux flacons du lysat de référence et deux flacons du lysat à standardiser dans 2,5 ml d'eau stérile. On ajuste à 9,0 le pH d'un flacon de chaque lot avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 N et on incube à 4 C pendant 90 minutes. On abaisse ensuite le pH de chaque flacon à 7,5 par agitation avec de l'acide chlorhydrique 0,1 N à 4 C. On
ajoute à chaaue flacon 2,5 ml de tampon et on titre le lysat contre l'endo-
toxine de E. coli ci-dessus à des concentrations en endotoxine de 0,25, 50
et 100 pg/ml.
Le procédé de détermination est essentiellement celui décrit dans le brevet britannique n 1 499 846 précité. Le tableau I permet de comparer
la densité optique à 650 mm du lysat traité et du lysat témoin.
TABLEAU I
Commne le montrent ces résultats, le traitement alcalin associé à la distribution proportionnelle db'la coagulase accro t la sensibilité des lysats à l'endotoxine et supprime la variabilité observée avec le lysat naturel. Après l'ajustement du pH, le lot standard continue à présenter une activité coagulasique approximativement égale à celle de la référence, de
l'ordre de 97,9 à 99,7 % de l'activité de référence tandis que sans l'ajus-
tement, le lot 8-113 contient une activité apparente à 25, 50 et 100 pg
d'endotoxine/ml respectivement de 72,6, 73,9 et 82,3 % seulement de l'acti-
vité du lot de référence.
EXEMPLE II
* On répète le mode opératoire de l'exemple I avec le lot de réfé-
rence et un autre lot de lysat appelé lot 8-112. Comme danr l'exemple I avec le lot 8-113, l'activité coagulasique du lot 8-112 a été ajustée à la
valeur du lot de référence. Cependant dans cet exemple, on inactive l'inhbi-
biteur par une extraction au chloroforme. On mélange intimement du chloro-
Concentration Lysat dont on ajusté la ysat témoin ennent rain coagWlase et le pH Référence 8 - 113 Référence 8-113
0,826 0,812 0,683 0,562
0,577 0,565 0,486 0,359
0,362 0,361 0,285 0,207
0 0,161 0,124 0,135 0,112
Ch XA A1V 13 - i - P forme au lot de référence et au lot 8-112 dans uns proportion de 1 partie de chloroforme pour 2 parties de lysat et on incube à 4 0 pendant 60 minutes. On centrifuge les mélanges de lysat et de chloroforme pour éliminer le précipité et le chloroforme non dissous et on traite et on dose corme dans l'exemple I. Les résultats figurent dans le tableau ci-dessous.
TABLEAU II
V V. La technique d'extraction par le chloroforme produit un lysat
présentant une variation d'un essai à l'autre pour les diverses concentra-
tions en endotoxine supérieure à celle que l' on obtient avec le procédé d'ajustement du PH de l'exemple I, le lot 8-112 est plus actif de 14,4 % et 10,2 % que le lot de référence et moins actif de 7,3 % respectivement pour , 50 et 25 pg/ml d'endotoxine. Cependant cet exemple montre que l'on peut
également utiliser l'eztraction par le chloroforme pour préparer les ex-
traits standards coagulables par une endotoxine de l'invention.
Bien entendu, l'invention n'est nullement limitée aux exemples
décrits et représentés et elle est susceptible de nombreuses variantes acces-
sibles h l'homme de l'art suivant les applications envisagées et sans qu'on
s'écarte pour cela de l'esprit de l'invention.
Concentration Lysat traité par extrac- Lysat témoin en endotoxine tionchloroforwnque. (pas d'extraction) (pg/ml) référence 8 - 112 Référence 8-112
1,224 1,400 1,044 0,773
1,006 1,111 0,695 0,528
0,774 0,717 0,469 0,391
0 0,214 0,165 0,196 0,170
14 2465002
Claims (15)
1. Procédé pour inactiver l'inhibiteur contenu dans un extrait coa-
gulable par une endotoxine caractérisé en ce qu'il consiste à ajuster le pH de l'extrait au-dessus d'environ 8,5 pour inactiver l'inhibiteur puis à abaisser le pH à une valeur à laquelle la coagulase est active.
2. Procédé suivant la revendication 1 pour inactiver l'inbibiteur du lysat d'amibocytes de Limulus caractérisé en ce qu'il consiste à élever le pH du lysat à environ 8,5 à 11, incuber le lysat jusqu'à obtention du degré désiré
d'inactivation puis abaisser le pH du lysat à environ 7.
3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2 pour inactiver l'inhibiteur
contenu dans l'extrait d'amibocytes de Idmulus, caractérisé en ce qu'il con-
siste à inactiver 1' inhibiteur sans provoquer la formation d'un précipité dans l'extrait.
4. Solution aqueuse de coagulase, caractérisée en ce qu'elle est prati-
quement dépourvue d'inhibiteur et totalement dépourvue de solvant organique.
5. Solution selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle ren-
ferme du coagulogène.
6. Composition standardisée suivant l'une des revendications 4 ou 5 pour
la détermination d'une endotoxine, caractérisée en ce quélle est constituée
d'un extrait coagulable par une endotoxine ayant une activité coagulasique pré-
déterminée et pratiquement dépourvue d'inhibiteur.
7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est
sous une forme sèche.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en oe qu'elle renferme également au moins un excès de coagulog&ne par rapport à une quantité prédéterminée.
9. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 3 pour préparer un ex-
trait standardisé coagulable par une endotoxine, suivant l'une des revendi-
cations 6 à 8, caractérisé en ce qu'il consite à: a) inactiver pratiquement le comnosant inhibiteur de l'extrait; b) déterminer l'activité coagulasique de l'extrait; c) évaluer la teneur en coagulogène de l'extrait; et d) séparer l'extrait en portions calculées pour qu'elles présentent une
activité coagulasique prédéterminée.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que pour séparer l'extrait en portions on distribue des volumes de l'extrait dans des récipients de façon à ce que le contenu de chaque récipient ait une activité coagulasique prédéterminée.
2 6 5 0 0 2
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'on
lyophilise 1' extrait après 1' avoir distribué dans les récipients.
12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé
en ce qu'on évalue la teneur en coagulogène de l'extrait par détermination quantitative du coagulogène.
13. Procédé suivant 19une des revendications 9 à 12, pour pré-
parer une composition standaxdisée de lysat d'amibocytes de Limulus, carac-
térisé en ce qu'il consiste d'abord à inactiver l'inhibiteur du lysat puis
à ajuster l'activité coagulasique a une valeur prédéterminée.
14.Procédé seleon la rv3ndication 13, caractérisé en ce qu'on ajuste la teneur en coagalognm ou excès par rapport à une concentration prédéterminée.
15. Procédé celon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on
djuute la teneur en coagulogènb par addition de coagulogène.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7557979A | 1979-09-14 | 1979-09-14 |
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Patent Citations (4)
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