FI96277C - Menetelmä siipikarjan Campylobakteeri-infektioiden ennaltaehkäisemiseen käyttökelpoisen bakteerivalmisteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

5 96277

Menetelmä siipikarjan Campylobakteeri-infektioiden ennaltaehkäisemiseen käyttökelpoisen bakteerivalmisteen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää siipikarjaan käytettävän bakteerivalmisteen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu erityisesti estämään Campylobacter-lajien suolistoon asettuminen.

10

Siipikarja on tärkein ihmisen campylobakteeri- ja salmonellainfektioiden lähde. Campylobacter ieiunin ja Campylobacter colin rooli yleisenä ihmisen ruuansulatuselimistön sairauksien syynä on hyvin dokumentoitu. Viittees-15 sä King, E. O: "The laboratory recognition of Vibrio fetus and a closely related Vibrio isolated from cases of human vibrosis", Annals of the New York Academy of Sciences, 98:700-711, 1962 ehdotettiin kananpoikia ensisijaiseksi ihmisen infektioiden lähteeksi. Skirrow, M.B.: 20 "Campylobacter enteritis: a 'new' disease", Brit.Med.J.

2:9-11 (1977) osoitti joissakin tapauksissa yhteyden ihmisen sairauden ja farmeilla, lihakaupoissa ja kotikeit-tiöissä tapahtuvan kontaktin kananpoikiin, jotka kantoivat organismia, välillä. Tämä yhteys todistettiin myöhem-25 min eräissä epidemiologisissa tutkimuksissa, esim. Harris, N.V., Weiss, N.S. ja Nolan, C.M.: "The role of poultry and meats in the etiology of Campylobacter ieiuni coli enteritis". Am. J. of Public health 76:407-411 (198-6). On myös eräitä raportteja sairauksien puhkeamisista, 30 jolloin epidemiologisesti saastunut tai epäilty Campylobacter ioosiksen välikappale on ollut raaka, grillattu tai riittämättömästi keitetty kananpoika. WHO:n huhtikuussa . 1989 julkaiseman Newsletter nro 20 mukaan campylobaktee ri-infektioiden lukumäärä on ylittänyt salmonellainfek-35 tioiden määrän viime vuosina eräissä teollistuneissa maissa.

Eräässä Suomen Eläinlääketieteellisen laitoksen suorittamassa tutkimuksessa vahvistettiin, että todennäköinen syy 96277 2 broilerien alttiuteen salmonellan asettumiselle (kasvulle ja kiinnittymiselle) suolistoon on tavallisen suolisto-bakteerikasvuston viivästynyt kehittyminen. Tämä viivästyminen on tulos nykyaikaisen broilerikasvatuksen massa-5 ruokintamenetelmistä. Tällaisilla eläimillä on sen vuoksi alhainen vastustuskyky kehoon saapuvia eksogeenisiä bakteereja kohtaan. E. Nurmi ja M. Rantala, Nature 241: 210-211,1973 osoittivat, että normaalin aikuisen suolen sisältö annettuna äskettäin kuoriutuneille kananpoikasille 10 lisäsi niiden vastustuskykyä salmonellan asettumiselle. Perustuen tähän pioneerityöhön formuloitiin kilpailevan poissulkemisen teoria (seuraavassa CE). Bakteerivalmis-teita erityisesti salmonellainfektioiden estämiseksi on esitetty esim. julkaisuissa EP 6696, EP 33854 sekä EP 15 154478. Onnistuminen Salmonellan estämisessä broilerika- nanpojissa kilpailevan poissulkemisen avulla on rohkaissut eräitä työryhmiä ympäri maailmaa soveltamaan samaa menetelmää Campvlobacter-laiien estämiseen. Soerjadi-Lien, Snoeyenbos ja Weinack, Avian Diseases 26: 520-524 20 (1982) ja 28: 139-146 (1983) ovat ilmoittaneet, että kun 10%:ista ulostesuspensiota spesifisistä patogeenivapaista (SPF) ryhmistä, joihin oli asettunut optimaalisesti suo-jaava mikrofloora, annettiin nuorille kananpojille, niiden vastustuskyky C^. ieiunia kohtaan lisääntyi. Tämä työ-25 ryhmä ilmoitti lisäksi, että annetun mikroflooran CE-vai-kutus väheni, kun Campvlobacter-lai ien annetut annokset lisääntyivät. Toisten tutkimusten mukaan, joissa tutkittiin CE:n vaikutusta Campvlobacter-laieihin. mitään vaikutusta ei havaittu käytettäessä joko CE-flooraa, joka 30 oli saatu uloste- tai umpisuolieritteistä (Stern, Bailey ja Blankenship, Avian Diseases 22: 330-334, 1988) tai CE-flooraa, joka oli saatu terveen aikuisen umpisuolen floorasta (Shanker, Lee & Sorrel, Epidemiology and Infection 100:27-34, 1988).

Tässä keksinnössä esitetään menetelmä sellaisen bakteeri-valmisteen valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen es- 35 3 96277 tämään ihmisen patogeenisten bakteerien asettumisen siipikarjaan, käsittäen bakteereita, jotka ovat peräisin täysikasvuisesta linnusta, mikroekologisesta paikasta, jossa patogeeniset bakteerit ovat olemassa.

5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettava valmiste käsittää bakteerikasvuston, joka on erityisesti peräisin täysikasvuisen linnun umpisuolen limakalvojen floorasta ja jota voidaan käyttää estämään ihmisen patogeenisten bak-10 teerien, erityisesti Campylobakteerin asettumisen nuoriin lintuihin. Tässä ilmoitetut tulokset käsittävät C. ieiu-nin biotyyppi l:n kasvun vähenemisen broilerikananpojis-sa. Bakteerivalmiste on tehokas myös muita Campylobaktee-rilajeja vastaan sekä mahdollisesti myös muita patogeeni-15 siä bakteereja vastaan.

Keksinnössä käytettävä viljelmä on valittu samasta mikroekologisesta ympäristöstä, jossa Campylobakteeri on taipuvainen esiintymään broilerikananpoikien umpisuoles-20 sa. Erittäin tehokkaita kasvustoja saadaan viljelemällä bakteeriflooraa, joka on peräisin täysikasvuisen linnun umpisuolen seinämän limakalvolta, joko anaerobisissa tai mikroaerofiilisissä olosuhteissa, mielellään musiini-alustalla. On myös edullista valita bakteerit, joilla on 25 hyvä liikkumiskyky musiinissa.

Kokeissa käytetyt kasvustot olivat kaikki peräisin vanhemmasta, munivasta kanasta.

30 KASVUSTOJEN LUOMINEN

Umoisuolihomogenaatti (kasvusto ' Koko umpisuoli homogenisoitiin ja laimennettiin 0,1%:- 35 isella peptoni vedellä laboratoriomittakaavan kokeissa ja tavallisella juomavedellä maatilamittakaavan kokeissa.

96277 4

Kasvusto ei sisältänyt Salmonella- tai Campvlobacter-la-jeja. Testimenetelmä oli seuraavanlainen:

Salmonella: 1 %:inen puskuroitu peptoni-vesi (37 5 °C/20 h), Rappaport-Vassiliadis-alusta 41,5 °C/20 h) ja tetrationaatti-alusta (37 °C/20 h), Onöz ja brilliant-green-agarit (37 °C/20 h),

Campylobakteeri: Brucella-alusta, johon oli lisätty 10 pyruvaattia, metabisulfiittia ja fer- rorautaa (FBP) (41,5°C/20 h mikro-aerofiilisessä ilmakehässä) CCD agar (41,5 °C/44 h mikroaerofiilisessä ilmakehässä).

15

Viljelty umpisuolihomogenaatti (kasvusto B) 1 ml umpisuolihomogenaatista käytettiin ymppäämään 100 ml Brucella-alustaa, johon oli lisätty 1 g Porcine Gastric 20 Mucin (SIGMA). Musiini suspendoitiin pieninä annoksina kiehuvaan veteen ja neutraloitiin ennen lisäämistä muun elatusaineen joukkoon. Cefoperazone (Cefobis, Pfizer) lisättiin aseptisesti autoklavoinnin jälkeen lopulliseen konsentraatioonsa 32 mg/1. Inkubointia jatkettiin 48 h 25 41,5 °C:ssa mikroaerofiilisessä ilmakehässä.

Puhdas umpisuolen limakalvovilielmä (kasvusto C)

Olennainen osa kasvusto B:n liikkumattomista bakteereista 30 hylättiin puolikiinteän l0%:isen musiiniagarin avulla, jolla oli seuraava koostumus

I ' IH I l;llt I ( I «I

5 96277

Puolikiinteä 10%:inen musiiniagar:

Musiinia 10,00 g 5 Brucella alustaa 0,50 g K2HP04 0,25 g

Agaria 1,10 g

Vettä 100 ml 10 Musiini täytyy liuottaa kiehuvaan veteen ennen autoklavoimista. pH säädetään 7,2:een 0,1 N NaOHilla.

Kasvusto B siirrettiin linjaan 12 cm:n petrimaljalle, 15 joka sisälsi 33 ml puolikiinteää 10%:ista musiiniagaria.

Mikroaerofiilisen inkuboinnin jälkeen (41,5 °C/48 h/ happea 5 %, C02 15 % ja typpeä 80 %) pieni osa agarista välillä 2 ja 4 cm linjan ulkopuolelta siirrettiin 10%:isel-20 le musiinialustalle. Tämän alustan koostumus oli sama kuin musiiniagarinkin, paitsi ettei se sisältänyt cefape-razonia tai agaria. Menettelyä toistettiin, kunnes alustalla ei havaittu enää liikkumattomia bakteereita.

25 Bakteerien eristäminen

Kasvustoa C viljeltiin Brucella-agarilla ja mikroaerofii-lisessä ilmakehässä 41,5 °C:ssa 48:sta 96:een tuntiin. Liikkumiskykyiset spiraalin muotoiset organismit eristet-30 tiin.

Kasvusto B siirrettiin linjaan 12 cm:n petrimaljalle, joka sisälsi 33 ml puolikiinteää 10%lista musiiniagaria.

' Anaerobisen inkuboinnin jälkeen (41,5 °C/48 h) pieni määrä 35 agaria 2:sta 4:ään cm linjan ulkopuolelta siirrettiin 10%:iselle musiinialustalle II, jota myös inkuboitiin anaerobisessa ilmakehässä. Menettelyä jatkettiin, kunnes 96277 6 alustalla ei enää havaittu liikkumattomia bakteereita. Kolmen toistokerran jälkeen alustallla oli jäljellä enää yhdenlaatuisia bakteereita, joita merkittiin Y:llä.

5 KASVUSTOJEN ANTAMINEN

Laboratoriokokeet

Laboratoriokokeissa 60-72 vastakuoriutunutta kananpoikaa 10 jaettiin 12 ryhmään. CE-kasvustot annettiin 2x4 linnun ryhmille lintujen rehun mukana. Loput 4 ryhmää käytettiin kontrolleina, eivätkä ne saaneet CE-kasvustoa. Seuraavana päivänä annettiin C. ieiunin biotyyppiä I Penner 15 tai Penner 3/43/59 1000-3000 CFU:ta, samalla menetelmällä 15 kaikille ryhmille, paitsi kahdelle neljästä kontrolliryhmästä. Puolet linnuista tapettiin viikon kuluttua ja loput kahden viikon kuluttua. Lintujen umpisuolesta suoritettiin Campylobakteerien kvantitatiivinen tutkimus.

20 Kenttäkokeet

Kenttäkokeissa 1600-1700 kananpoikaa jaettiin 16 ryhmään, joista kahdeksan toimi testiryhminä, neljä Campylobakteerien positiivisina kontrolliryhminä ja neljä vertailuryh-25 minä. CE-kasvustot sekoitettiin kahdeksan testiryhmän ensimmäiseen juomaveteen. 4,16-5,80 log10 CFU:ta C. ieiunin biotyyppi 1 Penner 15:sta annettiin seuraavana päivänä kolmelle tartuttavalle linnulle jokaisessa häkissä, paitsi neljän vertailuryhmän häkissä. Jokaisella viikol-30 la, kasvuperiodin loppuun saakka, jokaisesta häkistä tapettiin kolmesta viiteen lintua ja umpisuolesta tutkittiin kvantitatiivisesti Campylobakteerilajit.

Brucella-alustaa, jossa oli FBT:tä (ferrosulfaattia, nat-35 riummetabisulfiittia ja natriumpyruvaattia, kaikkia 0,5 g/1) ja cefaperazonia (32 mg/1) sekä hiili-Cefaperazone-deoksikolaatti (CCD) agaria, käytettiin Campylobakteeri- 7 96277 lajien kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa tutkimuksissa. Alustoja inkuboitiin 20 h ja agareita 44 h 41,5 °C:ssa mikroaerofiilisessä ilmakehässä.

5 Tulokset

Asettumistekijä on aritmeettinen keskiarvo yksittäisten lintujen CFU:n määrän per g umpisuolen sisältöä log10-arvoista, jokaisessa testi- tai kontrolliryhmässä.

10

Sopimuksen mukaan Campylobakteerinegatiivisella (sekä kvantitatiivisessa että kvalitatiivisessa kokeessa) linnulla on laskelmissa log10-arvo 0,1.

15 Koe 1

Laboratoriokokeet

Taulukosta 1 näkyy, että kasvusto B:n mikroaerofiilinen 20 inkubointi aikaansai tehokkaammman Campylobakteerilajien kilpailevan estämisen kuin kasvusto B:n anaerobinen inkubointi .

Taulukko 1. C.ieiunin biotyypin I lämpöstabiilin serotyy-25 pin 15 vasteannos 895 CFU/kananpoika.

Asettumistekijä 1 viikko 2 viikkoa 30 Vertailu 1 5,13 7,74

Vertailu 2 5,96 8,35

Kasvusto B mikroaerofiilinen viljelmä Ryhmä 1 <2,00 <2,00 35 Ryhmä 2 <2,00 <2,00

Ryhmä 3 <2,00 <2,00

Ryhmä 4 2,34 <2,00 96277 8

Kasvusto B anaerobinen viljelmä Ryhmä 1 <2,00 3,24

Ryhmä 2 4,91 <2,00

Ryhmä 3 3,89 <2,00 5 Ryhmä 4 3,70 7,04

Koe 2

Kasvusto B puhdistettiin liikkuvuuden ja ilmakehän perus-10 teella mikroaerofiiliseen kasvustoon C ja anaerobiseen bakteerikasvustoon Y kuten edellä on kuvattu. Anaerobiset bakteerit Y eivät yksinään herättäneet CE-vaikutusta. Näiden kasvustojen yhdistelmä (1:1) toi CE-vaikutuksen takaisin, kuten on esitetty ryhmissä 3 ja 4, taulukko 2.

15

Laboratoriokokeet

Taulukko 2. C. ieiunin biotyyppi I lämpöstabiilin sero-tyypin 15 vasteannos 245 CFU/kananpoika 20 asetustekijä 1 viikko 2 viikkoa

Kontrolli 1 7,78 7,58

Kontrolli 2 8,33 8,74 25

Kasvusto Y yksin

Ryhmä 1 1,90 6,70

Ryhmä 2 6,55 8,06 30 Kasvusto Y + kasvusto C (1:1)

Ryhmä 3 1,80 <2,00

Ryhmä 4 3,22 <2,00

Kenttäkokeet 16 x 100 broilerikananpoikaa kasvatettiin normaalissa kasvatusyksikössä kuuden viikon ajan. Kahdeksan ryhmää

Il SH 1 Slit! I i « SI ; .

35 9 96277 käytettiin kilpailevan estämisen kokeeseen. Neljä ryhmää toimi negatiivisena vertailuna, joita ei ole esitetty kuviossa. Testiryhmille annettiin kahta lajia määriteltyä ’ umpisuolikasvustoa niiden ensimmäisessä juomavedessä.

5 Kasvustojen laimennos oli 1/30. Jokainen lintu sai arviolta 0,25 ml käsittelynestettä.

Neljälle testiryhmälle annettiin musiinisopeutettuja anaerobisia liikkuvia bakteereita (kasvusto Y). Loput neljä 10 ryhmää saivat yhdistettyä kasvustoa (1:1), joka sisälsi kasvustoa Y ja kasvustoa C, joka on musiinisopeutettua mikroaerofiilista kasvustoa kuten edellä on kuvattu.

36 broilerikananpoikaa infektoitiin Campylobacter ieiunin 15 biotyypillä 1, Penner serotyyppi 15 yhden päivän ikäisinä. Annos oli log10 4,16 CFU. Kolme näistä tartuttavista yksilöistä jaettiin jokaiseen ryhmään.

Jokaisesta ryhmästä tutkittiin kvantitatiivisesti kolmen 20 linnun umpisuolen sisältö Campylobakteerien suhteen CCD-agareilla viikon väliajoin. Asettumistekijä laskettiin log10-arvojen aritmeettisena keskiarvona yksittäisten lintujen CFU:n määrästä per gramma umpisuolen sisältöä jokaisessa ryhmässä. Negatiivinen kontrolli pysyi kvalita-25 tiivisesti negatiivisena Campylobakteerilajien suhteen teurastukseen saakka.

Tulokset on esitetty kuviossa 1. Voidaan havaita, että musiinisopeutetut anaerobiset liikkuvat bakteerit (kas-30 vusto Y) eivät suojanneet umpisuolta Campylobakteerila-jien asettumiselta vaikka Campylobakteerilajien baktee-' rimäärä väheni hiukan (<1 log10-yksikköä). Kasvusto Y:n ja kasvusto C:n yhdistelmä (1:1) viivästytti Campylobakteerilaj ien asettumisen alkamista kahdella viikolla. 3 vii-35 kon kuluttua infektiosta Campylobakteerilajien bakteeri-määrä oli edelleen 4 log10-yksikköä alemmalla tasolla kuin vertailuryhmissä.

Koe 3 96277 10

Umpisuolen laimennetun homogenaatin (kasvusto A) CE-vai-kutusta verrattiin määrittelemättömän anaerobisessa ilma-5 kehässä kasvaneen umpisuolikasvuston, CE-vaikutukseen.

Testattujen lintujen ja ryhmien määrät kuten myös annetun CE-kasvuston määrä lintua kohti olivat samoja kuin edellisessä kokeessakin. Neljä testiryhmää sai kasvustoa A ja neljä ryhmää määrittelemätöntä umpisuolikasvustoa, joka 10 oli kasvanut anaerobisessa ilmakehässä. Tätä kasvustoa kutsutaan 427/C:ksi. Kahdeksantoista broilerikananpoikaa infektoitiin Campylobacter ieiunin biotyypillä 1, Penner serotyyppi 15, 18 päivän ikäisenä. Annos oli log10 5,80 CFU. Jokaiseen ryhmään jaettiin kolme näistä tartuttajis-15 ta.

Kuvio 2 osoittaa, että kasvusto A (umpisuolen laimennettu homogenaatti), osoitti tehokkaampaa CE-vaikutusta.

20 Kasvusto A asettui ilmeisesti kananpoikien umpisuoleen ja esti C. ieiunin asettumisen kahdessa ryhmässä sekä vähensi asettumisastetta kahdessa ryhmässä (neljällä log,0-yk-siköllä). Kasvusto 427/C viivästytti infektion alkamista 1-2 viikolla, mutta todennäköisesti kahden viikon kulut-25 tua Campylobakteerien määrä kananpoikien umpisuolessa olisi samalla tasolla kuin vertailuryhmien umpisuolessakin (täysin asettuneita Campylobakteerilajeilla).

ii : a&.i i l i e· . .·

Claims (4)

96277

1. Förfarande för framställning av ett bakteriepreparat användbart vid profylax av Campylobakterieinfektioner, 25 kännetecknat därav, att man odlar bakterier härledda frän blindtarmens slämhinna av en fullvuxen fägel, och isole-rar de erhällna bakterierna.

1. Menetelmä siipikarjan Campylobakteeri-infektioiden ennaltaehkäisemiseen käyttökelpoisen bakteerivalmisteen 5 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään bakteereita, jotka ovat peräisin täysikasvuisen linnun umpisuolen limakalvolta, ja eristetään saadut bakteerit.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat där-30 av, att för att producera preparatet odlar man bakterierna i en mikroaerofil eller anaerob atmosfär.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että valmisteen tuottamiseksi bakteereita viljellään mikroaerofiilisessä tai anaerobisessa ilmakehässä.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat därav, att man odlar bakterierna pä ett mucinmedium. 35

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteereita viljellään musiinialustal- 15 la.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristetään spiraalin muotoisia liik-kumiskykyisiä bakteereita. 20

4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknat därav, att man isolerar spiralformade bakterier med rörelseförmäga.