FI95385C - Menetelmä Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 95385

Menetelmä Streptococcus suis -bakteerin adhesiiniproteii-nin ja sen vasta-aineen valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta FI930413 5

Tausta - Keksinnön ala

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Streptococcus suis -bakteerin adhesiini-proteiinin valmistamiseksi, jolla adhesiiniproteiinilla on 10 galaktoosilla inhiboituva hemagglutinaatioaktiivisuus, ja joka sitoutuu kyyhkyn ovomukoidiin ja joka saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen ja jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-15 Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja jolla on seuraava aminohappokoostumus :

Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia

Asx 13 2 0 Thr 8

Ser 6

Glx 26

Gly 22

Ala 17 • I 25 Vai 10

Cys 0

Met 4

Ile 11

Leu 12 30 Tyr 4 • ·· Phe 6

Ly s 16

His 7

Arg 7 35 Pro 12 2 95385 tai sen johdannaisen tai fragmentin valmistamiseksi, jolla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus. Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä mainitun adhesiiniproteii-nin tai sen johdannaisen tai fragmentin vastaisen vasta-5 aineen valmistamiseksi. Keksinnön mukaisesti valmistettua adhesiiniproteiinia, sen johdannaisia ja fragmentteja sekä niiden vasta-aineita voidaan käyttää terapeuttisesti.

S. suis -bakteerien (Lancefieldin ryhmä D) tiedetään aiheuttavan sikojen meningiittiä, pneumoniaa, art-10 riittiä ja sepsistä. S. suis -tyyppi 1 aiheuttaa pääasiassa vastasyntyneiden porsaiden septisemiaa ja meningiittiä, ja tyyppi 2 hieman vanhempien, n. 3 - 10 viikon ikäisten porsaiden meningiittiä, joka voi tarttua myös ihmiseen. Sian kasvatuksen keskittyessä ja eläintiheysten noustessa 15 tartunnat leviävät yhä helpommin ja S. suis -bakteerin aiheuttamat infektiotaudit yleistyvät. Tästä syystä diagnostiikan ja rokotteen kehittämistä pidetään erittäin tärkeänä sikojen meningiittien ja muiden vakavien infektioiden tunnistamisessa ja torjunnassa. Kyseeseen voi myös 20 tulla suunnattu ennaltaehkäisy siankasvattajilla.

Tunnettu tekniikka

Bakteerien tarttuminen kohdesolujen pintaan on ensimmäinen tapahtuma bakteeritaudin synnyssä (Beachey, E.H.

(1981) J. Infect. Dis. 143. 325-345). Bakteerien tarttu-·· 25 mistä välittää usein bakteerien pinnassa oleva proteiini, adhesiini, joka spesifisesti tarttuu solujen pinnan resep-torirakenteisiin. Näin ollen adhesiini soveltuu hyvin rokotteen kehittämiseen, koska vasta-aineet kohdistuvat spesifisesti bakteerin kannalta välttämättömään tekijään, ja 30 toisaalta spesifisyyden ansiosta vältytään haittaavilta sivuvaikutuksilta.

Adhesiineja tunnetaan monenlaisia, mutta niiden täsmällinen rakenne ja mekanismi on usein vielä selvittämättä. Ne ovat luonteeltaan proteiineja, jotka spesifises-35 ti tunnistavat kohdesolun reseptorit, jotka vuorostaan 3 95385 yleensä ovat hiilihydraattirakenteita. Bakteerien erityyp pisiä adhesiineja ja niiden tunnistamia hiilihydraattirakenteita on esitetty mm. julkaisussa Sharon, N., (1987) FEBS Letters, 217. 145-157.

5 E. coli ja monet muut gram-negatiiviset bakteerit tarttuvat lektiinien kaltaisilla bakteeriadhesiineilla isäntäsolun pinnan määrättyihin molekyyleihin. Tavallisia adhesiinien reseptoreita ovat glykolipidien ja glykopro-teiinien sokeriosat. Usein adhesiinit ovat kiinnittyneet 10 bakteerisolun pinnalla oleviin hiusmaisiin rakenteisiin fimbrioihin (pillin). Fimbrioita on monen tyyppisiä; ne vaihtelevät sekä rakenteen että sokerispesifisyyden suhteen.

Koska punasolujen pinnalla on usein bakteerien re-15 septorirakenteita, bakteerit tarttuvat näihin rakenteisiin ja agglutinoivat punasoluja in vitro-olosuhteissa. Baktee-riviljelmät saattavat ilmentää kolmea tai neljää hemagglu-tiniinia (adhesiinia), joista jokaisella on erilainen hii-lihydraattispesifisyys; täten bakteerilla on kyky tarttua 20 moniin eri solutyyppeihin.

Enterobakteereiden tutkimuksissa adheesioreaktiot on jaettu kahteen pääluokkaan: mannoosiherkkiin (MS) reaktioihin, jolloin hemagglutinaatioreaktio inhiboituu a-man-nosideilla ja mannoosiresistentteihin (MR) reaktioihin, 25 jolloin hemagglutinaatio ei ole inhiboitavissa a-mannosi- deilla. E. colin tyyppi 1 fimbria (MS-rakenne) koostuu lähes pelkästään 17 kDa:n suuruisista identtisistä osayk-siköistä. Useat MR-adhesiinit tunnistavat a-Gal(1-4)-B-Gal -rakennetta (P-spesifinen adhesiini) tai a-NeuNAc-(2-3)-30 β-Gal (S-spesifinen adhesiini) . Yleensä puhdistetut fim-briat koostuvat osayksiköistä, joiden molekyylipaino vaih-telee 15 - 22 kDa.

Adhesiiniproteiini on tavallisesti erillinen proteiini, joka on kiinnittynyt fimbrioiden päihin tai fim-35 brioiden sivuille, sitä voi olla myös kiinnittyneenä suo- 4 95385 raan bakteerin ulkomembraaniin. Joillakin bakteerikannoilla adhesiiniproteiinia on bakteerisolun pinnalla vaikka fimbriat puuttuvat. Adhesiinit saattavat tällöin muodostaa adhesiinisen kapselin bakteerin ympärille. E. colin non-5 fimbriaalisten adhesiinien koko vaihtelee 13 - 28 kDa välillä (Jann, K. ja Hoschutzky, H. (1990), Current Topics in Microbiology and Immunology 151. 55-70).

Streptokokkien tiedetään sitoutuvan erilaisiin liukoisiin proteiineihin ja glykoproteiineihin, sen sijaan 10 niiden oligosakkaridispesifisyyttä ei juurikaan tunneta. Myös spesifinen sitoutuminen epiteelisoluihin on lähes tuntematonta. Jotkut Streptococcus sancruis- ja Streptococcus mitis-kannat sitovat galaktoosia ja sialohappoa (Murray, P.A., Levine, M.J., Tabak, L.A., ja Reddy, M.S. 15 (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 390-396).

Streptococcus pneumoniaen sitoutuminen epiteelisoluihin inhiboituu GlcNAcBl-3Gal-rakenteella ja tämän bakteerin on raportoitu sitoutuvan GalNAcBl-4Gal-rakennetta sisältäviin glykolipideihin keuhkoissa (Krivan, H.C., Roberts, D.D. ja 20 Ginsburg, V. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 85, 6157-6161).

S. mitis tarttuu hampaan pintaan ja on osatekijä plakin muodostuksessa. Tästä bakteerikannasta on kyetty eristämään sialohappoa sitova adhesiini. Sialohappoa sito- ·· 25 vassa proteiinissa oli ainakin kaksi disulfidi-sidottua osayksikköä 96 kD ja 70 kD. Molemmat osayksiköt sitoivat N-asetyylineuramiinihappo-a2-3-galaktoosi-Bl-3-N-asetyyli-galaktosamiinia (Murray, P.A., Levine, M.J., Reddy, M.S., Tabak, L.A., Bergey, E.J. (1986) Infect. Immun. 53, 359- . . 30 365). S. sanquis-bakteerin galaktoosia sitovan adhesiinin « “ molekyylipainoksi saatiin noin 20 kDa ja sen isoelektrinen piste oli 8,5 - 9 (Nagata, K., Nakao, M., Shibata S., Shi-zukuishi, S., Nakamura R. ja Tsunemitsu, A. (1983) J. Pe-riodontol. 54, 163-172). Tämän lisäksi S. sanauis-baktee-35 reistä on kloonattu 36 kDa-suuruinen adhesiini-proteiini.

;i m i ami i.i i si . .

5 95385

Kloonatun adhesiinin hiilihydraattispesif isyys on tuntematon; adhesiinin tiedetään kuitenkin tarttuvan syljellä pinnoitettuun hydroksiapatiittiin pH-herkän reseptorin välityksellä (Ganeskumar, N., Song, M. ja McBride, B.C.

5 (1988) Infect. Immun. 56, 1150-1157).

S. suis on tärkeä sikojen patogeeni. Se levittäytyy porsaiden tonsilloihin tai sieraimiin ja aiheuttaa vakavia infektioita. S. suis—bakteerien kapselipolysakkarideilla ja pintaproteiineilla on esitetty olevan merkitystä pato-10 geneesissä, mutta infektion molekulaarinen mekanismi on tuntematon. S. suis-bakteerien on osoitettu sitoutuvan sialyloituihin poly-N-asetyylilaktosamiiniglykaaneihin (Liukkonen J., Haataja, S., Tikkanen, K., Kelm, S., ja Finne, J. (1992) J. Biol. Chero. 267, 21105—21111). Kuiten 15 kin useimpien S. suis-bakteerien aiheuttama hemagglutinaa-tio inhiboituu galaktoosilla, täten galaktoosia tunnistava adhesiini on todennäköisesti yleisempi S. suis-bakteerissa kuin edellä mainittu (Kuri, D., Haataja S. ja Finne, J.

(1989) Infect. Immun. 57, 384-389).

20 Adhesiineja on usein pyritty irroittamaan ja eris tämään lämpökäsittelyllä ja/tai uuttamalla. Proteus mira-bilis-bakteerin adhesiini eristettiin lämpökäsittelyllä (65 °C, 20 min, 2 M urea) ja puhdistettiin geelisuodatuk-sella (Sepharose CL-4B) (Wray, S.K., Hull, S.I., Cook, il! 25 R.G., Barrish, J. ja Hull , R.A. (1986) Infect. Immun. 54 43-49). S. mitis-bakteerin lektiini irroitettiin uuttamalla bakteerit litium-3,5-dijodosalisylaatilla ja uutteesta puhdistettiin sialohappoa sitova proteiini geelisuodatuk-sen ja affiniteettikromatografiän avulla (Murray, P.A., 30 Levine, M.J., Reddy, M.S., Tabak, L.A. ja Bergey, E.J. .! (1986) Infect. Immun. 53, 359-365) . Streptococcus—pyo- genes-bakteerin (Lancefieldin ryhmä A) sydänlihaskudok-seenja munuaissolujen tyvikalvoon tarttuva proteiini kyettiin eristämään käsittelemällä bakteereita emäksellä 35 18 h ajan (Stinson, M.W. ja Bergey E.J (1982) . Infect.

6 95385

Immun. 35, 335-342). E. colin nonfimbriaalinen adhesiini uutettiin kuumentamalla bakteerisuspensiota 65 °C lämpötilassa 30 min ajan (Goldhar, 3., Perry, R., Golecki, J.R., Hoschutzky, H., Jann B., ja Jann, K. (1987) Infect. Immun.

5 55, 1837-1842). Fimbriaalisesta E. colista erotettiin fim- briat homogenoimalla mekaanisesti ja fimbriahomogenaatista adhesiiniproteiini irroitettiin kuumennuskäsittelyllä (70 °C 1 h, 5 mM EDTA) (Moch, T., Hoschutzky, H., Hacker, J., Kröncke, K.-D ja Jann, K. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. 10 USA 84, 3462-3466). Usein adhesiiniproteiinin irroittami-sen jälkeen adhesiini on saostettu ammoniumsulfaattisaos-tuksella, minkä jälkeen adhesiinit on jatkopuhdistettu vaihtelevilla menetelmillä. Adhesiinien eristämiseksi käytetyt tavanomaiset menetelmät eivät kuitenkaan sopineet S^ 15 suis-bakteerien adhesiinien eristämiseksi.

Yhteenveto keksinnöstä

Nyt on onnistuttu eristämään ja karakterisoimaan Streptococcus suis-bakteerin adhesiiniproteiini. Keksinnön kohteena on näin ollen menetelmä adhesiiniproteiinin tai 20 sen biologisesti tai immunologisesti aktiivisen johdannai sen tai fragmentin valmistamiseksi, jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-ter-minaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1). Keksinnön mu-*- 25 kaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että S. suis-bak- teerikanta sonikoidaan ja irronnut adhesiiniproteiini esi-puhdistetaan proteiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektroforeettisesti tai kromatografisesti. Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seu-30 rannassa käytetään edullisesti kyyhkyn ovomukoidia. Kek-*· . sintö koskee myös menetelmää adhesiiniproteiinin, sen joh dannaisen tai fragmentin vastaisen vasta-aineen valmistamiseksi käyttämällä mainittua adhesiiniproteiinia, sen johdannaista tai fragmenttia immunogeeninä. Keksinnön mu-35 kaisesti valmistettua adhesiiniproteiinia, sen johdannais- [| Htt Silli II I fit 7 95385 ta tai fragmenttia voidaan käyttää rokotteena ja mainittuja vasta-aineita passiiviseen immunisaatioon.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä kuvattua adhesiiniproteiinia pystytään ir-5 roittamaan S. suis-bakteerin pinnasta sonikoimalla. Soni-koinnin jälkeen on syytä lisätä proteaasi-inhibiittoria proteolyysin estämiseksi. Sitten sonikaatti sentrifugoi-daan ja supernatantti otetaan talteen. Adhesiiniproteiinia sisältävä supernatantti on hyvä esipuhdistaa, jollain pro-10 teiinipuhdistuksessa tavanomaisella tavalla, kuten esim.

ultrafiltraatio, dialyysi, geelisuodatus, saostuminen suolalla. Edullisesti käytetään ammoniumsulfaattisaostusta ja erityisesti muita proteiineja voidaan poistaa noin 60 %.— isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella, minkä 15 jälkeen adhesiiniproteiini voidaan saostaa noin 70 insesti kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella.

Varsinainen puhdistus voidaan suorittaa elektrofo-reettisesti esim. geelielektroforeesilla tai kromatografi— sesti esim. affiniteettikromatografiällä tai immunoaffini-20 teettikromatografiällä. Edullisesti käytetään preparatii- vista natiivigeelielektroforeesia. Natiivielektroforeesil-la ymmärretään elektroforeesia ilman natriumdodekyylisul-faattia eli SDS:ää. Erityisesti käytetään jatkuva-eluutio-elektroforeesilaitetta, joka edullisesti on sylinterinmuo-25 toinen. Laitteesta kerätään fraktiot ja otetaan talteen ne proteiinifraktiot, joissa on adhesiiniaktiivisuutta.

Adhesiiniproteiinin puhdistuksen seurannassa voidaan käyttää hyväksi S. suis-bakteerin adhesiiniproteiinin biologista aktiivisuutta. Adhesiiniproteiini liittyy S.·. 30 suis-bakteerien hemagglutinaatiokykyyn, jota voidaan inhi boida tietyillä sokeriyhdisteillä, kuten galaktoosilla ja N-asetylgalaktosamiinilla tai vain galaktoosilla, milli-molaarisissa pitoisuuksissa. Tutkittaessa galaktoosispesi-fisiä adhesiiniproteiineja käytetään edullisesti sialidaa-35 sikäsiteltyjä ihmisen punasoluja. Hemagglutinaatiokokeet 8 95385 ja hemagglutinaation inhibiitiokokeet kuvataan julkaisuissa Kuri, D.N., Haataja, S. ja Finne, J. (1989) Infect. Imxnun. 57, 384-389 ja Haataja, S., Tikkanen, K., Liukkonen, J., Francois-Gerard, C. ja Finne, J., (1993) Charace-5 rization of a Novel Bacterial Adhesion Specificity of Streptococcus suis Recognizing Blood-Group P Receptor Oligosaccharides. J. Biol. Chem. 268. (painossa).

Mono- ja oligosakkaridi-inhibitiokokeilla on havaittu, että S. suis-bakteerin reseptorirakenne on Galal-10 4GalBl-4Glc. Tämä muodostaa oligosakkaridiosan P veriryhmän glykolipidien Pk-antigeenissa. Toisaalta hemagglutinaation inhibitiokokeilla ja suoralla glykoproteiinien ja neoglykoproteiinien sitoutumisella on osoitettu, että ad-hesiini tunnistaa myös P,-antigeenirakenteen, Galal-4GalBl-15 4GlcNac. Tämä on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että adhesiini sitoutuu voimakkaasti Galal-4Gal-disakkaridira-kenteeseen verrattuna al-3, al-6, a-galaktoosi-disakkari-di-johdannaisiin. Inhibitiokokeet oligosakkarideilla osoittavat, että adhesiinin sitoutumiselle oleellista on 20 terminaalinen α-galaktoosi.

Nyt on keksitty, että kyyhkyn ovomukoidi on erityisen tehokas inhibiittori. 0,06 /xg/ml kyyhkyn ovomukoidia inhiboi täysin S. suis-kannan 628 indusoiman hemagglutinaation. Kyyhkyn ovomukoidi on glykoproteiini, jonka gly- « « 25 kaaniketjujen terminaalinen sekvenssi on Galal-4GalBl- 4GlcNAc ja jota on kuvattu julkaisussa Francois-Gerard C., Gerday C. ja Beeley, J.G. (1979) Biochem. J. 117, 679-685. Tästä rakenteesta johtuu voimakas S. suis-adhesiiniprote-iinin sitoutuminen kyyhkyn ovomukoidiin ja tästä johtuen 30 kyyhkyn ovomukoidi11a on myös veriryhmä Ρ,-aktiivisuus.

Neoglykoproteiini Galal-4GalBl-4Glc-0-CETE-BSA on myös osoittautunut hemagglutinaatio-inhibitiossa erittäin voimakkaaksi inhibiittoriksi.

Adhesiiniproteiinin puhdistumista voidaan helposti 35 seurata yksinkertaisella kyyhkyn ovomukoidin sitoutumisko- il itt-t mm t.t-* 9 95385 keella. Puhdistuksen seurannassa käytettävä ovomukoidi voidaan leimata esim. radioaktiivisella merkkiaineella. Koe voi olla esim. täplätesti, jolloin adhesiiniproteiinia sisältävä näyte pipetoidaan nitroselluloosapaperille, joka 5 sitten peitetään radioaktiivisesti merkityllä kyyhkyn ovomukoidi 11a, inkuboidaan ja pestään se ja määritetään paperiin sitoutunut radioaktiivisuus. Sitoutumisen voimakkuus korreloi kannan hemagglutinaatioaktiivisuuteen.

Edullisesti adhesiiniproteiinin puhdistumista seulo rataan "western blot" -menetelmällä, jolloin näytteille suoritetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesi, minkä jälkeen proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraa-nille, jota sitten käsitellään kuten paperi yllä. S. suis-bakteerisonikaatit antavat yhden adhesiiniproteiinivyöhyk-15 keen, joka liikkuu samalla kohdalla eri kannoilla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen. Myös hemagglutinaationegatiivisilla kannoilla erottuu vyöhyke, vaikka yleensä heikommin. Syy siihen lienee adhesii-niproteiiniin liittyvä faasivariaatio ts. bakteerit saat-20 tavat ilmentää adhesiinia eri tasolla eri olosuhteissa, tai muiden pintarakenteiden kuten kapselin inhiboiva vaikutus .

Edellä kuvatulla menetelmällä voidaan valmistaa S_j_ suis-bakteerin adhesiiniproteiini, jonka molekyylipaino on '.Y. 25 noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4, N-terminaa- linen sekvenssi on Ala—Ser—Pro—Ala—Glu—Ile—Ala—Ser—Phe— Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja aminohappokoostumus on: ♦ 10 95385

Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja aminohappokoostumus on:

Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia 5 Asx =asparagiini ja/tai aspargiinihappo 13

Thr =treoniini 8

Ser =seriini 6

Glx =glutamiini(Glu) ja/tai glutamiinhappo 26 Gly =glysiini 22 10 Ala =alaniini 17

Vai =valiini 10

Cys =kysteiini 0

Met =metioniini 4

Ile =isoleusiini 11 15 Leu =leusiini 12

Tyr =tyrosiini 4

Phe =fenyylialaniini 6

Lys =lysiini 16

His =histidiini 7 20 Arg =arginiini 7

Pro =proliini 12

Edellä kuvatun biologisen aktiivisuuden lisäksi ad-hesiiniproteiinin ominaisuuksiin kuuluu edelleen se, että - 25 se on immunologisesti aktiivinen, toisin sanoen se saa ai kaan vasta-aineiden muodostuksen.

Valmistettavan adhesiiniproteiinin piiriin kuuluu näin ollen myös kuvatun proteiinin johdannaiset ja fragmentit, joilla on oleellisesti sama biologinen tai immuno-30 loginen aktiivisuus kuin kuvatulla adhesiiniproteiinilla. Johdannaisella ymmärretään proteiini, josta osa aminohapoista on korvattu, poistettu tai lisätty, mutta joka on säilyttänyt oleelliset biologiset tai immunologiset omi-naisuutensa. Korvaavat tai lisätyt aminohapot käsittävät 35 sekä proteiineissa esiintyvät aminohapot että niiden joh- ;i ib ? in li i i i iti : 11 95385 dannaiset. Mahdolliset aggregaatit lasketaan myös mainittuihin johdannaisiin. Fragmentilla ymmärretään kuvatun ad-hesiiniproteiinin osaa, joka on säilyttänyt oleelliset biologiset tai immunologiset ominaisuutensa. Johdannaiset 5 ja fragmentit voidaan valmistaa proteiinikemiassa tavanomaisella tavalla. Fragmentit valmistetaan edullisesti peptidisynteesillä esim. kiinteäfaasimenetelmällä. Keksinnön piiriin kuuluu edelleen adhesiiniproteiinin vastaisten vasta-aineiden valmistus, joihin vasta-aineisiin tässä 10 yhteydessä lasketaan myös vasta-ainefragmentit, kuten esim. Fab-fragmentit tai faageissa ekspressoidut vasta-aineiden osat, jotka sitoutuvat tässä kuvattuun adhesiini— proteiiniin, sen johdannaiseen tai fragmenttiin.

Immunologisten ominaisuutensa vuoksi keksinnön mu-15 kaisesti valmistetuilla adhesiiniproteiinilla, sen johdannaisilla ja fragmenteilla voi olla käyttöä rokotteena £L_ suis-bakteerien aihettamia tauteja vastaan. Käyttö ihmisten rokotteena voi myös olla mahdollista esim. riskiryhmille kuten siankasvattajille tai teurastamohenkilökunnal-20 le. Vasta-aineita voitaisiin ajatella käytettäväksi passiiviseen immunisointiin.

Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 25 Streptococcus suis-bakteerien kasvatus

Tutkimuksissa käytettiin seuraavia S. suis-kantoja: Hemagglutinoivat: 628, TEW/2, R75/L1, 825 ja 752 Ei-hemagglutinoivat: 3027, 1045 ja 598/T5

Kannat 628, TEW/2, R75/L1 ja 825 on kuvattu julkaisussa 30 Kuri, D.N., Haataja, S. ja Finne, J., (1989) Infect. Im- : mun. 57, 384-389. Loput kannoista saatiin Dr. J. Hommezil- ta, Regional Veterinary Investigation Laboratory, Torhout, Belgia.

Kannat säilytettiin pakastettuina Todd-Hewitt -ela-35 tusaineessa -20 °C:ssa. Bakteerit kasvatettiin anaerobi- 12 95385 sesti (Gas Pak -systeemi) tuoreilla lampaan veriagar-mal-joilla 37 °C:ssa yön yli. Bakteerit kerättiin maljoilta ja suspensoitiin fosfaattipuskuriin A (10 mM natriumfosfaat-tipuskuri, 0,15 M NaCl, pH 7,4) siten, että konsentraa-5 tioksi saatiin 109 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ml (A^^ 5,0) .

Esimerkki 2

Adhesiiniproteiinin puhdistus

Adhesiiniproteiini irroitettiin bakteerin pinnalta 10 sonikoimalla 5x15 sek. (jäähdytys jäissä 2x1 min. ja 1x2 min.) 2,5 ml:n erissä fosfaattipuskuriin A. Sonikoinnin jälkeen lisättiin proteaasi-inhibiittoria PMSF (fenyylime-tyylisulfonyylifluoridi) 2 mM:ksi konsentraatioksi. Soni-kaatit sentrifugoitiin 15 800 x g, +8 °C:ssa ja superna-15 tantit otettiin talteen. Adhesiiniproteiini esipuhdistet-tiin seoksesta fraktioivalla ammoniumsulfaattisaostuksel-la. Ammoniumsulfaattisaostukseen käytettiin 16 ml superna-tanttia. Muita proteiineja poistettiin seoksesta 60 %:-isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla ja adhesiini 20 saostettiin 70 %:isesti kyllästetyllä ammoniumsulfaatilla.

Adhesiiniproteiinia ei jäänyt merkittäviä määriä 70 %:-iseen supernatanttiin. Kylmää kylläistä ammoniumsulfaattia tiputettiin pisaroittain liuokseen (0 °C), seisotettiin 1 tunnin ajan jäähauteessa, sentrifugoitiin 15 800 x g, 20

• I

* 25 min. Sakat 70 %:n saostuksesta otettiin talteen ja liuo tettiin 16 ml:aan fosfaattipuskuria B (3,3 mM natriumfos-faattipuskuri, 0,05 M NaCl, pH 7,4). Sakat dialysoitiin yön yli +8 °C, H20:ta vastaan, lyofilisoitiin ja liuotettiin 4 ml:aan fosfaattipuskuria A. Puhdistumista seurat-30 tiin 6 %:isessa natiivissa polyakryyliamidigeelielektrofo-. reesissa radioaktiivisella jodilla merkityn kyyhkyn ovomu- koidin avulla Bio Rad -minigeelilaitteella (ks. esimerkki 3).

Varsinainen puhdistus suoritettiin Bio Rad 491 Prep 35 Cell preparatiivisen elektroforeesilaitteen avulla. Sylin- 13 95385

terinmuotoiseen geelilaitteeseen valettiin 6 %:inen natii-vi polyakryyliamidigeeli (alageelin korkeus 6 cm, ylägee-lin 2 cm). Näytteen kokonaistilavuus oli 4 ml, josta 3000 μΐ yllä valmistettua proteiiniliuosta, 920 μΐ näytepusku-5 ria (ei SDS-liuosta) ja 80 μΐ merkkiväriä BPB (bromfenoli-sininen). Ajoliuoksena oli 25 mM Tris-192 mM glysiini, pH

8,3 ja eluutiopuskurina Tris-HCl, pH 8,3. Näytteistä kerättiin 4 ml:n fraktiot, jotka analysoitiin mittaamalla fraktioiden absorbanssi kahdella eri aallonpituudella (214 10 nm ja 280 nm), minkä jälkeen näytteet ajettiin polyakryy-liamidigeelielektroforeesissa Bio Rad-minigeelilaitteella, kuten esimerkissä 3 on kuvattu. Adhesiiniproteiinia oli fraktioissa 79 - 83. Fraktiot 79 - 81 yhdistettiin, dialy-soitiin yön yli +8 °C:ssa fosfaattipuskuria B vastaan ja 15 kylmäkuivattiin. Kuivattu sakka säilytettiin myöhempiä analyysejä varten -20 °C:ssa.

Esimerkki 3

Puhdistumisen seuranta

Puhdistumisen seurannassa käytettiin hyväksi ha-20 vaintoa, että S. suis-bakteerit sitoivat voimakkaasti kyyhkyn ovomukoidia, joka siis sisältää disakkaridiraken teen galaktosyyli-ctl-4-galaktosidin. Tästä syystä kehitettiin adhesiiniproteiinin tunnistusmenetelmä merkitsemällä kyyhkyn ovomukoidi radioaktiivisesti 125l-merkkiaineella.

• 25 Radioaktiivisesti merkityn ovomukoidin sitoutumiskokeessa hemagglutinoivan S. suis 628-bakteerikannan lisäksi kont-rollikantoina käytettiin negatiivista ts. ei-hemaggluti-noivaa S. suis-kantaa 598/T5 sekä heikosti hemagglutinoi-vaa s. suis-bakteerikantaa 825 fS. suis 628-kannan hemag-30 glutinaatiotiitteri oli 64, 825-kannan tiitteri 4 ja 598/ : T5-kannan tiitteri 0) . Ovomukoidi merkittiin radioaktiivi sesti ,25I-isotoopilla iodo-Bead-menetelmällä (Pierce Chemical Co, Rockford II) valmistajan ohjetta mukaillen.

Ensi vaiheessa kehitettiin ns. täplätesti. Tässä 35 sitoutumiskokeessa kukin esimerkin 1 mukaisesti valmistet- 14 95385 tu bakteerisuspensio laimennettiin (1:1; 1:10; 1:50) fosfaattipuskuriin A. Suspensioita pipetoitiin 1 μΐ ruudute-tulle nitroselluloosapaperille, minkä jälkeen ylimääräiset sitomispaikat peitettiin inkuboimalla 1,5 h fosfaattipus-5 kurissa C (0,1 M natriumfosfaattipuskuri, 0,5 % Tween 20, 150 mM NaCl, pH 5,3). Tämän jälkeen nitroselluloosa peitettiin 125I-ovomukoidilla (6xl05 cpm, spesifinen akt. 2,5x10s cpm^g ovomukoidi) ja inkuboitiin lh, +8 °C:ssa. Membraani pestiin 3x10 min. fosfaattipuskurilla C, kuivat-10 tiin suodatinpaperien välissä ja valotettiin röntgenfil-mille -80 °C:ssa 24 h. Sitomista oli havaittavissa ainoastaan hemagglutinoivissa kannoissa jopa pienissä bakteeri-pitoisuuksissa, lisäksi sitoutumisen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen.

15 Toisessa vaiheessa edellä kuvattua menetelmää so veltaen, kehitettiin "western blot" tunnistusmenetelmä adhesiiniproteiinille polyakryyliamidigeelielektroforee-sissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227. 680-685). Käytettiin natiivia geelielektroforeesia; ilman SDS-li-20 säystä, jolloin proteiinit säilyvät natiivissa muodossaan. Esimerkin 2 mukaisesti valmistetut bakteerisonikaatit eroteltiin useissa polyakryyliamidigeelielektroforeesisystee-meissä, jotka sisälsivät eri pitoisuuksia polyakryyliami-dia (5-9 %). Lopuksi päädyttiin käyttämään 6 %. Erotta-* 25 misen jälkeen sonikaatit siirrettiin sähkövirran avulla (60 mA, 30 min) PVDFp (Millipore) membraanille (Burnette, W.N. (1981) Anal. Biochem. 112. 195-203) ja membraani merkittiin l25I-ovomukoidilla kuten yllä. Kokeissa käytettiin S. suis-kantoia hemagglutinoivia kantoja: 628, TEW/2, R75/ 30 LI, 825, 752 ja ei-hemagglutinoivia kantoja: 3027 ja 1045. Sonikaateista erottui voimakkaasti yksi proteiini-vyöhyke, joka liikkui elektroforeesissa hemagglutinoivilla bakteerikannoilla samalla kohdalla. Vyöhykkeen voimakkuus korreloi hemagglutinaatioaktiivisuuteen, mutta myös nega-35 tiivisista kannoista erottui samalla kohdalla natiivissa 15 95385 geelielektroforeesissa liikkuva vyöhyke, yleensä heikommin.

Esimerkki 4

Adhesiiniproteiinin molekyylipaino ja puhtauden 5 varmistus

Adhesiinin puhtaus varmistettiin ja elektroforeet-tisen liikkuvuuden perusteella määritettiin molekyylipaino 15 %:isessa SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227, 680-685). Kan-10 nan 628 adhesiiniproteiinia (4 μq) keitettiin 5 min. ajan 2 %:isessa SDS-liuoksessa, jossa oli joko 5 % merkaptoeta-nolia tai 2,5 mM ditiotreitolia. Puhdistetusta adhesiini-proteiinista erottui yksi vyöhyke. Molekyylipainostandar-deina käytettiin Pharmacian Low Molecular Weight Standards 15 -standardiproteiineja. Adhesiinin molekyylipainoksi saa tiin 18 000.

Esimerkki S Isoelektrinen piste

Isoelektrinen fokusointi suoritettiin Phast geeli-20 elektroforeesi-laitteella Phast isoelektristä systeemiä käyttäen (Pharmacia). Geelinä oli Phast Gel 15531 3-9 ja standardeina IEF standardi 3-10 (Pharmacia). Puhdistettua kannan 628 adhesiinia käytettiin määritykseen 0,2 Mg. Isoelektrinen fokusointigeeli värjättiin käyttäen Phast sys-25 teemin Silver IEF-Method 6. Adhesiinin isoelektriseksi pisteeksi saatiin 6,4.

Esimerkki 6 Aminohappoanalyysi

Aminohappoanalyysiä varten 7 nmol kannan 628 puh-30 distettua adhesiinia liuotettiin 100 ® M HC1—liuos ; ta. Sisäiseksi standardiksi lisättiin 60 nmol norleusii- nia. Hydrolysoitiin 110 °C:ssa, 24 h, kylmäkuivattiin ja ' analysoitiin LKB 4151 Alpha Plus Aminoacid Analyzer -lait teen avulla valmistajan ohjeen mukaan.

ie 95385

Aminohappokoostumus oli seuraava:

Aminohappo nmol aminohappoa/ __nmol proteiinia_ 1 Asx 13,2 5 2 Thr 8,1 3 Ser 5,8 4 Glx 26,4 5 Gly 22,3 6 Ala 16,9 10 7 Vai 10,3 8 Cys 0,0 9 Met 3,9 10 Ile 11,4 11 Leu 12,3 15 12 Tyr 3,9 13 Phe 6,0 14 Lys 15,9 15 His 6,6 16 Arg 6,8 20 17 Pro 12,4

Esimerkki 7

Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi 25 Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen aminohapposek venssi määritettiin Applied Biosystems 477A Pulsed Liquid Protein/Peptide Sequencer with 120A Amino Acid Analyzer -peptidisekvensaattorin avulla valmistajan ohjeen mukaan.

.· Puhdistettua adhesiinia ajettiin 6 %:iseen natiivipolyak- 30 ryyliamidigeeliin, josta adhesiini siirrettiin sähkövirran avulla PVDFp-membraanille, kuten esimerkissä 3. Membraani värjättiin Coomassie Brilliant Blue -proteiinivärillä (10 min.), ylimääräinen väri poistettiin ja proteiinivyöhyke leikattiin peptidisekvensointia varten.

17 95385

Adhesiiniproteiinin N-terminaalinen sekvenssi pystyttiin määrittämään myös sonikoitujen bakteerien superna-tanteista: Adhesiiniproteiinin liikkuvuus natiivigeeli- elektroforeesissa tunnetaan, koska adhesiiniproteiinivyö 5 hyke pystytään identifioimaan 125l-kyyhkyn ovomukoidin avulla PVDFp-membraanilta. Viidestä eri hemagglutinoivasta S. suis -kannasta (628, TEW/2, R75/L1, 825, 752) identifioitiin adhesiiniproteiinin liikkuvuus 6 %:isessa natii- vipolyakryyliamidigeelielektroforeesissa; näiden bakteeri 10 kantojen sonikaatit ajettiin elektroforeesissa ja vyöhyk keet siirrettiin PVDFp-membraanille. Tästä adhesiinivyö-hykkeet leikattiin aminohapposekvensointia varten, kuten edellä.

Saatu N-terminaalinen sekvenssi oli kaikilla kannoilla 15 sama eli:

Ala-Ser-Pro-Ala-Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1)

Esimerkki 8

Adhesiiniproteiinin vasta-aineen valmistaminen 20 Kannan 628 adhesiiniproteiinin vasta-ainetta val mistettiin Balb/c-hiirissä. Hiiret immunisoitiin joko puhtaalla adhesiinilla (10 Mg/hiiri) tai S. suis-bakteerista valmistetulla sonikaatilla (80 /xg/hiiri) . Ensimmäisessä tapauksessa adhesiini injisoitiin kaksi kertaa Freundin * . 25 täydellisessä adjuvantissa (F.C.A.) ja kerran Freundin epätäydellisessä adjuvantissa (F.I.C.A.). Jälkimmäisessä tapauksessa proteiiniseos pistettiin hiiriin kerran F.C.A.:n kanssa ja kaksi kertaa sekoitettuna F.I.C.A.:iin. Immunisointi suoritettiin subkutaanisesti. Molemmissa ta-30 pauksissa vasta-aineita muodostui adhesiiniproteiinia vas- ; taan.

Vasta-aineen muodostus tutkittiin PVDFp-membraanil-ta, johon oli siirretty S. suis-bakteereiden sonikaatti-supernatantteja (ks. esimerkki 2) . Adhesiiniproteiinin 35 vyöhyke tunnistettiin (vrt. esimerkki 3) ja vasta—aineen • · t 18 95385 muodostus S. suis-bakteerikannan 628 adhesiiniproteiinia vastaan oli voimakasta. Vasta-aine kykeni spesifisesti tunnistamaan adhesiiniproteiinin vielä laimennoksessa 1:5xl05. (Vasta-aineen epäspesifinen sitoutuminen estettiin 5 inkuboimalla membraania 1,5 h, 1,5 % maitojauhe-0,5 %

Tween 20 -liuoksessa, joka oli tehty puskuriin D (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.8). Membraani pestiin kolmesti puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Vasta-ainelaimennokset lisättiin yhden tunnin ajaksi, jonka jäl-10 keen membraani pestiin 5x puskurilla D, johon oli lisätty 0,05 % Tween 20. Membraania inkuboitiin alkaalisella fos-fataasilla merkityn hiiren vasta-aineen kanssa tunnin ajan (1:1000 laimennos), pestiin viidesti puskurilla D ja lisättiin alkaalisen fosfataasin substraattia värireaktion 15 aikaansaamiseksi (bromikloori-indolyylifosfaatti-nitrosi-nitetratsoliumi).

Aminohapposekvenssi nro 1:

Ala Ser Pro Ala Glu Ile Ala Ser Phe Ser Pro Ala Pro Leu Ala 15 10 15 iH irt i 9111! I ! 1 tl

Claims (3)

19 95385

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen Strepr i-nr.nr.cus suis -bakteerin adhesiiniproteiinin valraistamisek-5 si, jolla adhesiiniproteiinilla on galaktoosilla inhiboituva hemagglutinaatioaktiivisuus, ja joka sitoutuu kyyhkyn ovomu-koidiin ja joka saa aikaan vasta-aineiden muodostuksen ja jonka molekyylipaino on noin 18 000, isoelektrinen piste on noin 6,4 ja N-terminaalinen sekvenssi on Ala-Ser-Pro-Ala-

10 Glu-Ile-Ala-Ser-Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Leu-Ala- (sekvenssi 1) ja jolla on seuraava aminohappokoostumus: Aminohappo nmol aminohappoa/nmol proteiinia Asx 13

15 Thr 8 Ser 6 Glx 26 Gly 22 Ala ^7

20 Vai 10 Cys 0 Met 4 Ile H Leu 12 I 25 Tyr 4 Phe 6 Ly s 16 His 7 Arg 7

30 Pro 12 « * · tai sen johdannaisen tai fragmentin valmistamiseksi, jolla on sama biologinen ja immunologinen aktiivisuus, tunnettu siitä, että s. suis -bakteerikanta sonikoidaan, 35 ja irronnut adhesiiniproteiini esipuhdistetaan tavanomaisel- 95385 la tavalla, minkä jälkeen se puhdistetaan elektroforeetti-sesti tai kromatografisesti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään preparatiivista na- 5 tiivigeelielektroforeesia.

3. Menetelmä vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se muodostetaan käyttämällä immuno-geenina patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä adhesiinipro-teiinia tai sen johdannaista tai fragmenttia, jolla on sama 10 biologinen ja immunologinen aktiivisuus. « il HU;U HU Ιέ 3-St ; : ; 21 95385