FI92843C - Uusi menetelmä optisesti aktiivisten glyserolijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

92843

UUSI MENETELMÄ OPTISESTI AKTIIVISTEN GLYSEROLIJOHDANNAISTEN VALMISTAMISEKSI - NY METOD FÖR FRAMSTÄLLNING AV OPTISKT AKTIVA GLYCEROLDERIVAT

Keksinnön kohteena on uusi menetelmä optisesti aktiivisten 1-monoasyyliglyseroli- tai 1,2-diasyyliglyseroli-johdannaisten valmistamiseksi.

Keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut optisesti 5 aktiiviset glyserolijohdannaiset ovat käyttökelpoisia lähtöaineina tärkeiden optisesti aktiivisten glyserofosfolipidien valmistuksessa. Nämä optisesti aktiiviset glyserolijohdannaiset ovat edelleen käyttökelpoisia lähtöaineina terapeuttisesti arvokkaiden 10 PAF-tekijoiden sekä β-salpaajien valmistamiseksi.

Fosfolipidit käsittävät laajan ryhmän yhdisteitä, joista tärkeimmät ovat L-fosfatidihapon johdannaisia, jotka ovat fosfoglyseridejä ja joita myös kutsutaan glyserofosf olipideiksi . L-fosfatidihapon kaava on

15 H2COOCR

R'COO^H ^ (A) n2l-o—I>-OH 0'

L-fosfatidihapon fosfaattiesterit, joilla on yleinen kaava 20 HO

/\J/\ I <B> RO^ \|/ N0P0R" 1 0' R'0 25 jossa R ja R' ovat asyyliryhmiä ja R'' aminosubstituoitu alkyyliryhmä, ovat tärkeitä fosfolipidejä.

Glyserofosfolipidit esiintyvät luonnossa ja ne ovat tärkeitä komponentteja elävien organismien solujen 2 92843 membraaneissa. Glyserofosfolipidimolekyylit ovat amfipaattisia, eli niillä on pitkien hiilivetyketjujen muodostama lipofiilinen osa ja dipolaarisen, fosfaattiryhmän muodostama hydrofiilinen osa.

5 Glyserofosfolipidit muodostavat tietyissä liuoksissa vesikkeleitä, joiden seinämä koostuu glyserofosfolipidien kaksoiskerroksesta siten, että molempien molekyyli-kerroksien lipofiiliset hiilivetyketjut suuntautuvat seinämän sisään, kun taas molekyylien hydrofiiliset ryhmät 10 suuntautuvat seinämän kumpaankin pintaan. Tällainen kaksoiskerros pystyy selektiivisesti säätämään erityyppisten aineiden läpimenoa seinämästä. Liposomit, joita käytetään esimerkiksi erityyppisten lääkeaineiden vapauttamisessa, koostuvat yhdestä tai useammasta 15 glyserofosfolipidien muodostamasta kaksoiskerroksesta.

Jotta glyserofosfolipidi pystyy muodostamaan toivottuja kaksoiskerroksia on tärkeää, että molekyyli on siihen sopiva stereoisomeeri. Luonnossa esiintyvät glysero-fosfolipidit ovat juuri puhtaita stereoisomeerejä, eivät 20 rasemaatteja.

Eräs tärkeä luonnossa eli ihmisen basofiilisoluissa esiintyvä glyserofosfolipidi on verihiutaleita aktivoiva tekijä (PAF-tekijä, platelet-activating factor). Tämän yhdisteen (l-0-alkyyli-2(R)-asetyyli-sn-glysero-3-25 fosfokoliini) kaava on

H O

Rcr \>-p-o-ch2ch2n+(Ch3)3

CH3COO

30 jossa R on 16 tai 18 hiiliatomia sisältävä suora alkyyliketju.

Tärkeimmät luonnosssa esiintyvät glyserofosfolipidi- tl 3 92843 tyyppiset fosfolipidit ovat lesitiinit ja niiden tärkeimmät lähteet ovat kananmunan keltuainen, naudan aivot, punaiset verisolut ja soijapavut. Lesitiinejä käytetään moniin erilaisiin tarkoituksiin, etupäässä elintarvikkeiden 5 emulgaattoreina. Luonnon lesitiinit ovat eri glyserofosfo-lipidien seoksia, joissa kaavan (B) mukaisessa yhdisteessä R on tyypillisesti tyydyttynyt C16 - C18-asyyli, R' on tyypillisesti tyydyttämätön C16 “ C20-a syyli ja R'' on koliini ryhmä CH2CH2N+ (CH3) 3.

10 Lääkkeiden luovutukseen tarkoitettujen glyserofosfolipidien täytyy kuitenkin olla sekä kemiallisesti että optisesti puhtaita yhdisteitä, ei seoksia. Näihin tarkoituksiin tulevat ainoastaan synteettisesti valmistetut glyserofosf olipidit kysymykseen.

15 Synteettisesti valmistetut, glyserofosfolipidien puhtaat optisesti aktiiviset stereoisomeerit ovat tavallisesti monivaiheisten ja monimutkaisten prosessien tuloksia. Synteeseissä joudutaan käyttämään mm. monia erilaisia suojaryhmiä, jotta onnistutaan selektiivisesti valmistamaan 20 toivottuja johdannaisia ja jotta intermediaattina toimivan asyyliglyserolin isomeraatio voidaan estää. Glysero-fosfolipidisynteesien vaikeutena on nimenomaan puhtaan optisesti aktiivisen glyseroli johdannaisen valmistaminen ja glyserolijohdoksen optisen aktiivisuuden säilyttäminen 25 monivaiheisen synteesin aikana. On julkaistu 6 - 14- vaiheisia glyserofosfolipidien totaalisynteesejä, joissa lähtöaineina on käytetty D-mannitolia (1), L-seriiniä (2) tai allyylialkoholeja Sharplesin asymmetrista ·· epoksidaatiota soveltaen (3). Vaihtoehtona edellä 30 mainituille menetelmille on kirjallisuudessa esitetty myös prokiraalisten glyserolijohdannaisten entsymaattista stereoselektiivistä asylaatiota asyylidonoreita käyttäen, mutta optisesti aktiivisten stereoisomeerien puhtausprosentit, jotka riippuvat käytetystä entsyymistä ja • · · 35 liuotin-olosuhteista, ovat olleet suurimmillaan 96 % (4).

4 92843

Tuoreimpien julkaisujen mukaan reaktiovaiheiden määrä on saatu vähennettyä viiteen, mutta näissä synteeseissä on joko käytetty kallista, puhdasta optisesti aktiivista lähtöainetta (5), tai lähtöaine on syntetisoitu 5 monivaiheisessa reaktiossa (6).

Julkaisuissa (9), (16) ja (23) - (26) kuvataan 2-0-bentsyyli-1,3-propaanidiolin entsymaattista asylointia. Entsyymin katalysoiman stereospesifisen asylaatioreaktion kulkuun vaikuttavat monet tekijät kuten entsyymikanta, 10 substraattimolekyyli, asyylidonori, liuotin, lämpötila, veden määrä reaktiossa ja sekoitusnopeus. Kirjallisuudesta voidaan huomata, että jokaisessa entsyymin katalysoimaa stereospesifistä reaktiota kuvaavassa artikkelissa on jouduttu tekemään huomattava määrä kokeiluja ennen kuin 15 optimaaliset olosuhteet on löydetty. Siksi 2-0-bentsyyli- 1,3-propaanidiolin asylaatio-olosuhteita ei voida suoraan adoptoida? reaktion enantioselektiivisyys saattaa olla esim. juuri päinvastainen. Raseemisen 3-O-bentsyyli-l,2-propaanidiolin käyttö fosfolipidisynteesissä prokiraaliseen 20 2-0-bentsyyli-l,3-propaanidioliin verrattuna on monella tavoin parempi vaihtoehto, koska 1) fosfolipidien synteesiin saadaan vähemmän vaiheita, 2) voidaan valmistaa fosfolipidien molempia stereoisomeereja, sekä symmetrisellä että epäsymmetrisellä rasvahappokoostumuksella ja 3) 3-0-25 bentsyyli-1,2-propaanidioli on huomattavasti helpommin saatavissa ja merkittävästi halvempi reagenssi kuin vastaava 2-0-bentsyyli-l,2-propaanidioli.

Tämän keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä esitetty •i 30 ongelma ja aikaansaada uusi optisesti aktiivisten glyserolifosfolipidien synteesimenetelmä, jolla ei ole edellä esitettyjä epäkohtia.

Keksinnön kohteena on menetelmä optisesti aktiivisten 1-monoasyyliglyseroli- tai 1,2-diasyyliglyserolijohdannaisten * · k 11 5 92843 valmistamiseksi/ joiden yleinen kaava on

Rl-<?-cr X \}-X (I) HCj ^

5 S /\/\ · /\A

Rj-C-O^ X, 0-X tai Rj-C-O^ Λ, Ό-Χ a ^-c-r2 R2-|-0^ (Ha) (Hb) 10 jossa X on helposti poistettava suojausryhmä Y tai vety, jolloin suojausryhmä Y voi olla substituoimaton tai substituoitu bentsyyli tai trityyli tai silyyliryhmä Si(R)3, jossa R-substituentit voivat olla samanlaisia tai erilaisia ja ovat alkyyli- tai aryyliryhmiä; Rj ja R2, jotka voivat ·.; 15 olla samanlaisia tai erilaisia, ovat Cj - C28-alkyyli, C2 -C28-alkenyyli tai -alkynyyliryhmä tai samalla sekä alkenyyli- että alkynyyliryhmä, jossa kaksois- tai kolmoissidosten määrä voi olla yksi tai useita. Keksinnön mukaan saatetaan kaavan (V) mukainen raseeminen yhdiste 20 olT^^y^^OY (V)

OH

katalyyttinä toimivan lipaasientsyymin läsnäollessa reagoimaan anhydridin RjCOOOCRj tai yhdisteen (III) kanssa, jonka kaava on RlCOOR3 (III), jossa Rj on sama kuin 25 aikaisemmin ja R3 on vinyyli-, trifluoroetyyli- tai isopropenyyliryhmä, joko a) kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X on suojausryhmä Y ja joka yhdiste eristetään reaktioseoksesta ja joka mahdollisesti vaihtoehtoisesti 30 i) vedytetään suojausryhmän Y poistamiseksi, tai ii) esteröidään hapon R2C00H kanssa, jossa R2 on sama 92843 6 kuin aikaisemmin ja voi olla samanlainen kuin R1 tai erilainen, jolloin saadaan kaavan (Ha) tai (Ilb) mukainen yhdiste, jossa X on suojausryhmä Y, josta yhdisteestä haluttaessa poistetaan suojausryhmä Y 5 vedyttämällä, tai b) kaavan (Ila) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X on suojausryhmä Y ja R2 = Rj, jonka jälkeen saatu yhdiste mahdollisesti vedytetään katalyyttisesti suojausryhmän Y 10 poistamiseksi.

Sopivia substituentteja bentsyyli- tai trityylisuojausryhmissä ovat esimerkiksi alempi alkyyli, alempi alkoksi tai nitroryhmä.

Suojausryhmä on edullisesti bentsyyli ja lipaasientsyymi 15 lipaasi PS tai lipaasi AK.

Yllä mainituissa kaavoissa (I) ja (II) X on edullisesti .· bentsyyli ja Rx ja R2 samanlaisia ryhmiä.

Yllä mainitun kaavan (I) piiristä on ennestään tunnettu yhdiste, jossa Rj on C15H31-alkyyli tai C17-alkenyyliryhmä.

20 Kirjallisuudessa (16) on maininta optisesti aktiivisesta 1-stearoyyli-3-bentsyylioksi-2-propanolista, mutta sen « stereokemiaa ei ole spesifioitu. Kaavan (II) mukaisista yhdisteistä on tunnettu sellaisia, joissa R1 tai R2 on suora Ci5H3i-alkyyli tai suora C17H35-alkyyli.

25 Kaavojen (I) ja (II) mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia lähtöaineita arvokkaiden kaavan (IV) * mukaisten glyserofosfolipidi-yhdisteiden

II

7 92843

H O

η,χ/λΨ^ν>-1-ο-«, lIV) 5 O-C-R; o valmistamiseksi, jossa Rj ja R2, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat edullisesti C14 - C25-alkyyli, C14 - C25-alkenyyli tai -alkynyyliryhmä tai samalla 10 sekä alkenyyli- että alkynyyliryhmä, jossa kaksois- tai kolmoissidosten määrä voi olla yksi tai useita, ja R4 on -CH2CH2N+(CH3)3, -CH2CH2N+H3 tai -CH2-CH(OH)-CH2(OH) . Kaavan (Ha) tai (Hb) mukainen yhdiste

15 ^0-X tai Rx-C-o' t>-X

ii ^-C-R2 R2-j?-cr

O O

(Ha) (Hb) jossa Rj ja R2 ovat kuten edellä saatetaan reagoimaan jonkin 20 fosforireagenssin, kuten fosforioksikloridin tai 2-kloori- 2-oksi-l,3,2-dioksafosfolaanin kanssa, jolloin saadaan kaavan (IV) mukainen yhdiste.

Liposomivalmistukseen sopivat parhaiten sellaiset glyserofosfolipidit, joissa R3 ja R2 ovat samanlaisia ja 25 sisältävät 14 - 25 hiiliatomia.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä kaavojen (I) tai (II) mukaisen glyserolijohdoksen valmistamiseksi käytetty lähtöaine, kaavan (V) mukainen raseeminen yhdiste 8 92843

/\A

OH T OY (V)

OH

voidaan valmistaa kirjallisuudessa kuvatulla yksivaiheisella menetelmällä (7). Saanto on noin 80 %.

5 Asyylidonoreina voidaan käyttää sopivan karboksyylihapon vinyyli-, trifluorietyyli- tai isopropenyyli johdoksia. Vinyyli- ja trifluorietyylistearaattien valmistus on kuvattu viitteissä (8) ja vastaavasti (9), ja saannot ovat vastaavasti 60 % ja 83 %. Happoanhydridi on myös sopiva 10 asyylidonori (20). Lipaasi-entsyymin katalysoimassa esterifikaatiossa on asyyli-donoreina kokeiltu vain vinyyli- ja trifluorietyyli-stearaattia ja näistä vinyylijohdannainen antoi toistettavampia tuloksia. Reaktioajat ja käytetyn entsyymin määrä ovat riippuvaisia 15 asyylidonorin luonteesta ja ne on optimoitava kulloisessakin tapauksessa erikseen.

J Raseemiselle diolille suoritetaan lipaasientsyymin katalysoima enantioselektiivinen asylaatio ns. perättäisen 20 resoluution (10) periaatteella, jolloin tuotteeksi saadaan joko optisesti puhdasta 1-asyloitua 3-bentsyylioksi-2-propanolia tai 1,2-diasetyloitua 3-bentsyylioksipropaania reaktioajasta riippuen.

Perättäisessä resoluutiossa toteutetaan enantio-25 selektiivisen reaktion ja kineettisen resoluution synergian ideaa. Menetelmä pohjautuu premisseihin, joiden mukaan suoritetut reaktiot ovat irreversiibelejä ja lopputuotteen inhibitiota ei tapahdu. Jokaisesta ko. entsymaattisesta transformaatiosta on syytä saada ensin kineettinen 30 yleiskuva, jotta halutun kiraalisen lopputuotteen kemiallinen saanto ja optinen puhtaus voidaan optimoida. Biokatalyyttisen asylaation kinetiikkaan vaikuttavat mm. käytetyn entsyymin eräkohtainen aktiivisuus ja määrä.

Lipaasientsyymin katalysoima kaavan (V) mukaisen raseemisen

II

9 92843 yhdisteen reaktio edellä mainittujen reagenssien R^OOORj tai RJC00R3 kanssa tuottaa optisesti puhdasta 1,2-diasyloitua kaavan (Ha) mukaista johdannaista tai optisesti puhdasta 1-monoasyloitua kaavan (I) mukaista 5 johdannaista reaktioajasta riippuen. Monostearyloitu tuote muodostuu ensimmäisessä vaiheessa melko epäselektiivisesti. Varsinainen resoluutio tapahtuu toisessa asylaatio-vaiheessa, jolloin (S)-monostearyloitu enantiomeeri reagoi distearyloiduksi tuotteeksi huomattavasti nopeammin kuin 10 (R)-muoto.

Tämän keksinnön mukaisesti syntetisoidulla intermediaatilla (Ha) voidaan helposti valmistaa symmetrisen rasvahappo-koostumuksen omaava fosfolipidejä. Epäsymmetrisen rasvahappoköostumuksen omaavia (R)— tai (S)-fosfolipidejä 15 voidaan syntetisoida lähtien liikkeelle yhdisteestä (I). Asyloimalla intermediaatin (I) 2-asema kemiallisesti suoraan halutulla rasvahapolla sinänsä tunnetulla menetelmällä (13) päästään tunnettujen vaiheiden (14), (15) jälkeen (S)-fosfolipideihin. Suorittamalla intermediaatille 20 (I) Mitsunobu-tyyppinen inversio asylaatio (17) käyttäen haluttua rasvahappoa ja täydentämällä synteesi tunnetuilla menetelmillä (14), (15), voidaan valmistaa (R)-fosfolipide jä, joissa on siis epäsymmetrinen rasvahappo-koostumus .

« 25 Keksintö kuvataan seuraavassa konkreettisesti esimerkkien avulla, mutta se ei rajoitu niihin.

Esimerkki 1

Optisesti aktiivinen (R)-l-stearoyyli-3-bentsyylioksi-2-propanoli ja optisesti aktiivinen (S)-l,2-distearoyyli-3-30 bentsyylioksipropaani Näitä yhdisteitä valmistettiin entsymaattisesti katalysoidulla paikka- ja stereoselektiivisellä asylaatiolla. Käynnistettiin kaksi reaktiota, joista toinen pysäytettiin, kun olosuhteet olivat optimaalisia 10 92843 enantiomeerisesti puhtaan monostearyloidun glyserolijodannaisen osalta. Toinen reaktio pysäytettiin, kun olosuhteet olivat optimaalisia enantiomeerisesti puhtaan distearyloidun glyserolijohdannaisen suhteen.

5 Käytetty analyysi pohjautui monostearyloidun bentsyyliglyserolin optisesti aktiivisten isomeerien havaitsemiseen käyttämällä kiraalista HPLCstä (Chiralcel OD, heksaani/2-propanoli = 95/5, 0.9 ml/min, 254 nm).

Reaktioastia kuivattiin liekillä argonkaasun alla.

10 Liuotettiin 50 mg (0.275 mmol) (±)-3-bentsyylioksi-l,2-propaanidiolia kuivaan di-isopropyylieetteriin (2.5 ml, liuotin kuivattu molekyyliseulan avulla). Lisättiin 196 mg (0.632 mmol) vinyylistearaattia. Reaktio käynnistettiin lisäämällä kirkkaaseen liuokseen 50 mg lipaasia (Lipase 15 Amano PS, Pseudomonas cepatia). Suspensiota ravisteltiin huoneenlämmössä (22°C) ja 400 rpm:ssä useamman tunnin ajan, ja reaktion etenemistä seurattiin kiraalisen HPLCsn avulla. Enantiomeerisesti puhtaan monostearyloidun bentsyyliglyserolin eristys tehtiin 505 minuutin reaktioajan jälkeen 20 ja enantiomeerisesti puhtaan distearyloidun bentsyyliglyserolin eristys tehtiin toisesta reaktioastiasta 385 minuutin reaktioajan jälkeen.

Kun reaktio oli viety tarpeeksi pitkälle poistettiin ·’ entsyymi suodattamalla ja liuotin haihdutettiin 25 pyöröhaihduttajalla. Ylimäärä vinyylistearaattia erotettiin mono- ja vastaavasti distearyloiduista bentsyyli-glyseroleista flash-kromatografisesti (19) silikageeli-pylväässä (25 g silikageeliä). Reaktioseoksesta, josta haluttiin eristää optisesti puhdasta (S)-1,2-distearoyyli-30 3-bentsyylioksipropaania eluoitiin tuote 5 % etyyliasetaatti/heksaani-liuoksella, jolloin distearyloidun tuotteen saanto oli 81.9 mg (42 %). lH NMR- ja GC-MS-analyysien tulokset vastasivat kirjallisuudessa esitettyjä (3), (16). Yhdisteen optinen puhtaus määritettiin JH NMR- ja 35 polarometristen tulosten jälkeen. NMR-analyysiä varten yhdisteestä poistettiin bentsyylisuojausryhmä kuten tl 11 92843 esimerkissä 3, jonka jälkeen siitä muodostettiin Mosherin esterijohdannainen kuten kirjallisuudessa (3) on kuvattu. lH NMR (400 MHz, CHC13): ee >95 %,· [cx]D + 4.61° ± 0.05 (CHC13) .

5 Reaktioseoksesta, josta haluttiin eristää optisesti puhdas (R)-l-stearoyyli-3-bentsyylioksi-2-propanoli, eluoitiin tuote 20 % etyyliasetaatti/heksaani-liuoksella, jolloin monostearyloidun tuotteen saanto oli 50.8 mg (41 %). *H NMR-ja GC-MS-analyyseillä todettiin yhdisteen rakenne.

10 *H NMR (400 MHz, CHCI3): 6(m, 5 H, C6H5) f 4.56(s, 2 H, 0-CH2-Ph) , 4.17(m, 2 H, CH2-OCO), 4.04 (m, 1 H, CH(OH)), 3.53 (m, 2 H, CH2-0-CH2Ph), 2.48 (s, 1 H, OH), 2.32(t, 2 H, CH2CO), 1.60 (m, 2 H, CH2(CH2)14), 1.25(m, 14 H, CH2), 0.88 15 (t, 3 H, CH3) .

MS (EI+): m/z 520 (M+), 505(M - CH3), 429(M - CH2-Ph), 413(M - 0-CH2-Ph), 399 (M - CH2-0-CH2-Ph), 324 (M - (0-CH2-Ph ja 0-TMS)), 91(-CH2-Ph), 73(TMS).

Tuotteen optinen puhtaus analysoitiin kromatografisesti 20 kiraalista HPLC-analyysiä käyttäen sekä optisen kiertokulman määrityksellä. HPLC (Chiralcel OD, 5 % 2-propanoli/hek-saani, 0.9 ml/min, 254 nm): ee > 95 %; [a]D -1.54° ± 0.08 (CHCI3).

Reaktioseos, joka sisälsi vinyylistearaattia sekä mono- ja 25 distearyloituja bentsyyliglyseroleja voitiin jatkokäsitellä myös kiteyttämällä tuotteet erilleen toisistaan.

Liuottamalla seos 2.5 ml isopropyyliasetaattia ja 0.6 ml absoluuttista etanolia ja jäähdyttämällä liuos -18°C:ssa yli yön voitiin eristää kiteytynyt distearyloitu 30 bentsyyliglyseroli 95 % puhtaana, 85 % saanto. Tämä kiteytysmetodi soveltuu siis vain kun halutaan eristää di-tuotetta jatkoreaktioita varten. Sopivia kiteytys-olosuhteita vastaavasti monotuotteen selektiiviseen kiteyttämiseen ei onnistuttu luomaan.

12 92843

Esimerkki 2

Optisesti aktiivinen (R)-l,2-distearoyyli-3-bentsyylioksi-propaani 5 Käytettiin lähtöaineena esimerkissä 1 saatua optisesti aktiivista (R)-l-stearoyyli-3-bentsyylioksi-2-propanolia, jota stearyloitiin kemiallisesti (R)-l,2-distearoyyli-3-bentsyylioksipropaaniksi seuraavasti: Lisättiin steariinihappoa (32.2 mg, 0.139 mmol) 5 mlsssa 10 dikloorimetaania argon-atmosfäärissä dikloorimetaani-liuokseen (5 ml), joka sisälsi 50.8 mg (0.139 mmol) optisesti aktiivista (R)-1-stearoyy1i-3-bentsyy1ioksi- 2 -propanolia 0°C:ssa sekoittaen. Reaktio käynnistettiin lisäämällä dikloorimetaaniliuos (5 ml), joka sisälsi 60.7 15 mg (0.361 mmol) disykloheksyylikarbodiimidia ja 12.5 mg (0.125 mmol) 4-dimetyyliaminopyridiiniä. Seosta sekoitettiin 5 minuutin ajan 0°C:ssa, jonka jälkeen se lämmitettiin huoneen lämpötilaan ja sekoitettiin 2.5 tunnin ajan. Reaktioseos suodatettiin ja liuotin haihdutettiin 20 pois. Saanto oli 89.3 mg, 90 %. Raakatuote kiteytettiin isopropyyliasetaatti (75 %)-etanoli (25 %)-liuoksesta -18°C:ssa. *H NMR- ja GC-MS-analyysien tulokset vastasivat edellä eristetyn distearyloidun tuotteen analyysejä.

[a]D -4.85° ± 0.10 (CHC13) .

25 Esimerkki 3

Optisesti aktiivinen (S)-l,2-distearoyyli-3-propanoli

Esimerkin 1 tai 2 mukaisesti valmistetusta optisesti aktiivisesta (S)- tai (R)-1,2-distearoyyli-3-bentsyyli-oksipropaanista poistettiin bentsyyliryhmä vedyttämällä.

30 Laitteesta poistettiin huolellisesti ilma ennen reaktion käynnistämistä. Liuos, joka sisälsi 81.9 mg (0.115 mmol) optisesti aktiivista (S)-1,2-distearoyyli-3-bentsyylioksi-propaania 25 ml:ssa tetrahydrofuraania (vedetön) vedytettiin palladium-katalysaattorin läsnäollessa (13 mg, 11 13 92843 10% Pd/C) huoneenlämmössä (1 atm). Kun vedyn absorptio oli täydellinen 90 minuutin reaktioajan jälkeen suspensio suodatettiin ja katalysaattori pestiin dietyylieetterillä. yhdistetyt orgaaniset fraktiot väkevöitiin vakuumissa.

5 Raakatuote kiteytettiin kloroformi (0.9 ml)-petroolieetteri (2.7 ml)-liuoksesta -18°C;ssa. Saanto 64.7 mg (79 %). Kiteyttämällä puhdistetusta (S)-l,2-distearoyyli-3-propanolista valmistettiin Mosherin esterijohdannainen kirjallisuuden (3) mukaisesti, ja *H NMR-spektrin sekä 10 optisen kiertokulman perusteella määritettiin vedytetyn välituotteen optinen puhtaus. *H NMR (400 MHz, CHC13): ee > 95 %; [a]D -2.65° ± 0.11, (CHC13), ee > 95 % , kirjall. (3), (16), (18).

Esimerkki 4 15 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-£osfokoliini

Liuos, joka sisälsi 11.3 mg (0.112 mmol) trietyyliamiinia absol. bentseenissä (0.1 ml) lisättiin tiputtamalla liuokseen, joka sisälsi edellä valmistettua optisesti aktiivista (S)-l,2-distearoyyli-3-propanolia (64.7 mg, 20 0.104 mmol) ja 2-kloori-2-oksi-l,3,2-dioksafosfolaania (15.5 mg, 0.123 mmol) bentseenissä (0.6 ml) 0 - 5°C:ssa sekoittaen. Sekoitusta jatkettiin huoneenlämmössä yli yön, jonka jälkeen seos suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Raakatuote liuotettiin 15 ml saan 25 dietyylieetteriä ja tuote kiteytettiin -18°C:ssa. Eristetty tuote liuotettiin asetoniin (10 ml) ja se siirrettiin jäähdytettyyn paineastiaan. Suljettuun paineastiaan lisättiin trimetyyliamiini (vedetön, 0.3 ml) ja reaktioseosta sekoitettiin 24 h 65°C:ssa. Jäähdytyksen 30 jälkeen erottunut valkoinen sakka suodatettiin ja pestiin dietyylieetterillä. Plash-kromatografisen puhdistuksen (silikageelipylväs, eluenttina ensin CHCl3-CH3OH = 3/2, sitten CHC13-CH30H-H20 * 65/25/4) jälkeen eristettiin tuotetta 58 mg (monohydraatti, 70% saanto). *H NMR-analyysin 35 tulokset vastasivat kirjallisuudessa (5), (21) esitettyjä.

14 92843

Yhdisteen optinen puhtaus määritettiin optisen kiertokulman avulla. [a]D +6.5° ± 0.4 (CHCI3-CH3OH = 1/1).

Kirjallisuudessa on lukuisa määrä erisuuruisia kiertokulmia optiselle puhtaalle 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-5 fosfokoliinille (CHC13-CH30H = 1/1), esim. [a]Q + 6.95° (5), 6.80° (Sigma Chemical Co.), + 6.4°(22).

Seuraavalla sivulla on esitetty kaavio yllä olevissa esimerkeissä kuvatusta menetelmästä ja sen avulla saatujen intermediaattien reaktioista optisesti aktiivisiksi 10 fosfolipideiksi.

Il 15 92843

Kirjallisuusviitteet 1. Eibl, H. Chem. Phys. Lipids 1980, 26, 405 2. Lok, C.M.; Ward, J.P.; van Dorp, D.A. Chem. Phys. Lipids 1976, 16, 115 5 3. Burgos, C.E., Ayer, D.E.; Johnson, R.A. J. Org. Chem.

1987, 52, 4973 4. Wang, Y.F.; Lalonde, J.L.; Momongan, M.; Bergbreiter, D.E.; Wong, C.H. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 7200 10 5. Ali, S.; Bittman, R. J. Org. Chem. 1988, 53, 5547 6. Baba, N.; Yoneda, K.; Tahara, S.; Iwasa, J.; Kaneko, T.; Matsuo, M. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990, 1281 7. Fairbourne, A.; Gibson, G.P.; Stevens, D.W. J. Chem.

Soc. 1931, 445 15 8. Swern, D.; Jordan, E.F. Organic Synthesis; Wiley: New

York, 1963; Coll. Vol. IV, s. 977 - 980 ' 9. Baba, N.; Tahara, S.; Yoneda, K.; Iwasa, J. Chemistry

Express, 1991, 6, 423 10. Guo, Z.W.; Wu, S.H.; Chen, C.S.; Girdaukas, G.; Sih, 20 C.J. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4942 11. Howe, R.; Shanks, R.G. Nature, 1966, 210, 1336 12. Demopoulos, C.A.; Pinhard, R.N.; Hanahan, D.J. J. Biol. Chem. 1979, 254, 9355 13. Delfino, J.M.; Schreiber, S.L.; Richards, F.M.

25 Tetrahedron Lett., 1987, 28, 2327 92845 16 14. Phuong, N.H.; Thung, N.T.; Chabriev, P. C.R. Acad. Se. Paris, Serie C, 1976, 283, 229 15. Miyazaki, H.; Ohkawa, N.; Nakamura, N.; Ito, T.; Sada, T.; Oshima, T.; Koike, H. Chem. Pharm. Bull., 1989, 37, 5 2379 16. Ioannou, V.; Dodd, G.; Golding, B. Synthesis 1979, 939 17. Mitsunobu, 0 Synthesis 1981, 1 18. Sowden, J.C.; Fisher, H.O.L. J. Am. Chem. Soc. 1941, 10 63, 3244 19. Still, W.C.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43(14), 2923 20. Bosetti, A.; Bianchi, D.; Cesti, P.; Golini, P.;

Spezia, S. J. Chem. Soc. Perkin Transl. 1992, 2395 15 21. Laube, T; Kurreck, H. J. Labell. Comp. Radiopharm.

1983, 20(1), 111 22. Patel, K.M.; Morrisett, J.D.; Sparrow, J.T. J. Lipid .: Res. 1979, 20, 674 23. Baba et ai., Indian Journal of Chemistry 31B (1992), 20 824 - 827 24. Ghisalba et ai., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 110 (1991), I 263 - 264 25. Wang et ai., J. Org. Chem. 53 (1988), 3127 - 3129 26. Murata et. ai, Chem. Pharm. Bull. 37 (1989), 2670 - 25 2672

II

Claims (2)

17 92843 PATENTTIVAATIMUKS ET

1. Menetelmä optisesti aktiivisten 1-monoasyyliglyseroli-tai 1,2-diasyyliglyserolijohdannaisten valmistamiseksi, joiden yleinen kaava on i? X\A\

5 Rrc-cr A Ό-Χ (I) Hu ^H f /\//\ ?i /\Α Rj-C-O' N0-X tai Rj-C-C/ J^ 0-X W ^3-<j-R2 R2-jj-0* 10 0 0 (Ila) (Hb) jossa X on helposti poistettava suojausryhmä Y tai vety, jolloin suojausryhmä Y voi olla substituoimaton tai substituoitu bentsyyli tai trityyli tai silyyliryhmä Si(R)3, 15 jossa R-substituentit voivat olla samanlaisia tai erilaisia ja ovat alkyyli- tai aryyliryhmiä; Rj ja R2, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat C3 - C28-alkyyli, C2 -C28-alkenyyli tai -alkynyyliryhmä tai samalla sekä ·* alkenyyli- että alkynyyliryhmä, jossa kaksois- tai 20 kolmoissidosten määrä voi olla yksi tai useita tunnettu siitä, että saatetaan kaavan (V) mukainen raseeminen yhdiste olf/NXNJ//^N'\)Y (V) • OH 25 katalyyttinä toimivan lipaasientsyymin läsnäollessa reagoimaan anhydridin RjCOOOCRj tai yhdisteen (III) kanssa, jonka kaava on (III), jossa Rj on sama kuin aikaisemmin ja R3 on vinyyli-, trifluoroetyyli- tai isopropenyyliryhmä, joko 18 92843 a) kaavan (I) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X on suojausryhmä Y ja joka yhdiste eristetään reaktioseoksesta ja joka mahdollisesti vaihtoehtoisesti i) vedytetään suojausryhmän Y poistamiseksi, tai 5 ii) esteröidään hapon R2COOH kanssa, jossa R2 on sama kuin aikaisemmin ja voi olla samanlainen kuin Rj tai erilainen, jolloin saadaan kaavan (Ha) tai (Ilb) mukainen yhdiste, jossa X on suojausryhmä Y, josta yhdisteestä haluttaessa poistetaan suojausryhmä Y 10 vedyttämällä,· tai b) kaavan (Ha) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X on suojausryhmä Y ja R2 = Rt, jonka jälkeen saatu yhdiste mahdollisesti vedytetään katalyyttisesti suojausryhmän Y 15 poistamiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan (I), (Ha) tai (Ilb) mukaisten optisesti aktiivisten yhdisteiden valmistamiseksi, jossa Rj ja R2, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat C14 - C25-alkyyli, C14 - C25-20 alkenyyli tai -alkynyyliryhmä tai samalla sekä alkenyyli-että alkynyyliryhmä, jossa kaksois- tai kolmoissidosten määrä voi olla yksi tai useita tunnettu siitä, että lipaasientsyymi on lipaasi PS tai lipaasi AK ja että R3 on vinyyli. ’* 25 » tl 19 92843 Förfarande för framställning av optiskt aktiva 1-monoacylglycerol- eller 1, 2-diacylglycerolderivat, vilkas allmänna formel är

5. AAv, Rj-C-O^ X ND-X (I) Ha ?, l /\//\ R^C-O' X 0-X eller Rj-C-O^ 0-X

10 Ta ^>-C-R2 R2-C-(7 O 0 (Ila) (Hb) där X är en skyddsgrupp Y som lätt kan avlägsnas eller väte, varvid skyddsgruppen Y kan vara osubstituerad eller 15 en substituerad bensyl eller trityl eller en silylgrupp Si(R)3, där R-substituenterna kan vara desamma eller olika och är alkyl- eller arylgrupper; Rj och R2, som kan vara desamma eller olika, är Cj - C28-alkyl, C2 -C28-alkenyl eller -alkynylgrupp eller samtidigt bäde alkenyl- och 20 alkynylgrupp, där dubbel- eller trippelbindningarnas mängd kan vara en eller flera, kännetecknat därav, att man omsätter en racemisk förening med formeln (V) 0Η^Χγ/^Νχ0Υ (V) OH 25. närvaro av ett lipasenzym, som fungerar som katalysator, med en anhydrid R^OOOCRj eller en förening (III), vars formel är RjC00R3 (III), där Rj är samma som tidigare och R3 *2843 20 är en vinyl-, trifluoroetyl- eller isopropenylgrupp, antingen a) till en förening enligt formeln (I), där X är en 5 skyddsgrupp Y, och vilken förening isoleras ur reaktionsblandningen och eventuellt antingen i) hydreras för avlägsnande av skyddsgruppen Y, eller ii) förestras med en syra R2C00H, där R2 är sanana som tidigare och kan vara saroina som R1 eller olika, varvid 10 man erhäller en förening med formeln (Ila) eller (lib), där X är en skyddsgrupp Y, frän vilken förening, om sä önskas, skyddsgruppen Y avlägsnas genom hydrering, eller b) tili en förening enligt formeln (Ila), där X är en skyddsgrupp Y och R2 = Rlf varefter den erhällna föreningen 15 eventuellt hydreras katalytiskt för avlägsnande av skyddsgruppen Y.

2. Förfarande enligt patentkravet 1 för framställning av optiskt aktiva föreningar enligt formeln (I), (Ha) eller (Ilb), där Rj och R2, som kan vara desamma eller olika, är 20 C14 - C25-alkyl, C14 -C25-alkenyl eller -alkynylgrupp eller samtidigt bäde alkenyl- och alkynylgrupp, där dubbel- eller trippelbindningarnas mängd kan vara en eller flera, kännetecknat därav, att lipasenzymet är lipas *. PS eller lipas AK och att R3 är vinyl. tl