FI88510B - Foerfarande foer kristallisering av glukos-isomeras med tillhjaelp av hoegt tryck - Google Patents

Description

1 38510

Menetelmä glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi korkean paineen avulla

Keksinnön kohteena on uusi menetelmä proteiinien kiteyttämiseksi. Keksintö perustuu siihen, että proteiinin ylikyllästynyt liuos saatetaan kiteyty-5 mään korkean paineen avulla, joka edullisesti on välillä 1000ja 3000 bar.

Proteiinien kiteyttäminen edellyttää joitakin sellaisia yleisiä olosuhteita, joita ei välttämättä vaadita pienimolekyylisten aineiden kiteytyksissä. Yksityiskohtaisia yhteisiä taatusti kiteytymiseen johtavia olosuhteita eri proteiineille ei 10 tunneta. Useimmiten proteiinien kiteytyminen on hidasta, ensimmäisten kiteiden ilmaantuminen voi viedä viikkoja tai kuukausia.

Myös painetta nostamalla voidaan saada aikaan ylikyllästyminen, ja on tunnettua soveltaa korkeapainekiteytystä hankalissa erotuksissa, esimerkiksi 13 silloin, kun erotettavilla aineilla on hyvin läheiset sulamispisteet tai kun seoksen lämpötilaa ei ole voitu nostaa eikä alentaa. Koikeapainekiteytystä on kuitenkin käytetty vain suhteellisen pienimolekyylisten aineiden erotuksessa (kts. Moritoki M, Kitagawa K, Nishiguchi N, Chem Econ. & Eng. Review, Voi 16, s. 30-35, December 1984). Ei ole yritetty eristää suurimolekyylisiä 20 aineita, kuten proteiineja korkeapainekiteytyksellä, koska proteiinit, kuten entsyymit helposti denaturoituvat korkeassa paineessa (kts. Moorild E, Advances in Protein Chemistry, Voi 34, s. 93 (1981)).

Nyt on keksitty, että korkeassa paineessa proteiinien kitcytymisnopeus 25 kasvaa voimakkaasti. Esimerkiksi glukoosi-isomeraasi kiteytyy 2000 barin paineessa muutamassa minuutissa, kun normaalipaineessa kuluu useita tunteja. Hyvin suuria paineita ei kuitenkaan kannata käyttää, koska proteiinien inaktivoitumis- ja denaturoitumisnopeus on silloin liian suuri; esimerkiksi glukoosi-isomeraasi muodostaa amorfista, niukkaliukoista massaa paineen 30 ollessa yli noin 3000 bar.

On yllättävää, että korkean paineen avulla saadaan aikaan suurimole-.* . kyylisen aineen kiteytyminen. Onhan proteiinimolekyyli mekaanisesti sangen • ; "heikko", eli se deformoituu helposti, ja kuten edellä mainittiin, se saattaa jopa 35 muuttua irreversiibelisti, eli denaturoitua. Siten ei ollut odotettavissa, että kor- 2 88510 kean paineen avulla muodostuu pysyviä kiteitä.

Menetelmän yleinen suodtusperiaate on seuraava. Valmistetaan proteiinista ylikylläinen liuos jollakin sinänsä yleisesti tunnetulla tavalla. Sitten 5 tämä ylikylläinen liuos siirretään painekammioon ja puristetaan korkeaan paineeseen, jolloin proteiinista osa kiteytyy.

Suoritettujen koesaijojen perusteella voidaan päätellä, että proteiinin ki-teytymisnopeus on käytetyn paineen jatkuva funktio. Kuitenkin paineen koho-10 tessa yli 3000 barin alkaa ilmestyä amorfista saostumaa kiteiden lisäksi.

Amorfisen sakan ilmestyminen ja ilmeinen proteiinimolekyylin rakenteen vaurioituminen katsotaan epäedulliseksi tässä yhteydessä. Näinollen on havaittavissa kiteyttämisen kannalta edullinen painealue, joka esimerkkitapauksissa on 1000 ja 2500 barin välillä.

15

Korkeapaineessa aikaansaadut kiteet olivat samanmuotoisia kuin vastaavasta liuoksesta normaalipaineessa valmistetut kiteet Korkeapaineessa valmistetut kiteet olivat säilyviä ja kasvoivat normaalipaineeessa, jos ympäröivä liuos oli ylikyllästynyt.

20

Esimerkkisuorituksissa käytetty menetelmä glukoosi-isomeraasin osalta oli seuraava.

Valmistettiin ensiksi glukoosi-isomeraasia seuraavasti. Tämä entsyymi, 25 D-ksyloosi isomeraasi (D-ksyloosi ketoli-isomeraasi, EC 5.31.1.5), on teolli suudessa käytetyltä nimeltään glukoosi-isomeraasi, ja se valmistetaan teollisessa mittakaavassa fermentoimalla Streptomyces rubiginosusta käyttäen. Fermentaation jälkeen liuos suodatetaan kirkkaaksi, ja konsentroidaan ultrasuodatuksella. Ammoniumsulfaattia (10 g/kuutiodesimetri) lisätään 30 glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi. Kiteet erotetaan sentrifugoimalla.

Tällainen glukoosi-isomeraasi on teollisessa käytössä kauppanimeltään Spezyme. Tarkka valmistusmenetelmä on esitetty patentissa "Visuri K, Stable glucose isomerase concentrate and a process for the preparation thereof, U.S.Pat. No. 4699882,1987".

35 3 88510

Liuotettiin glukoosi-isomeraasia 45-55 gramman määrä kuivaksi proteiiniksi laskettuna yhteen litraan 10% ammoniumsulfaatin vesiliuosta 50 °C lämpötilassa. liuos suodatettiin suodatinpaperin tai membraanisuotimen avulla 0,45 mikrometrin suodattimella mahdollisimman kirkkaaksi, jotta se ei sisäl-5 täisi kidealkioita tai hiukkasia, jotka voivat toimia kiteytymiskeskuksina. Liuos jäähdytettiin 15 °C lämpötilaan ja osa siitä siirrettiin painekammioon. Liuosta puristettiin kammiossa 500-4000 barin paineessa 2-30 minuutin ajan. Puristuksen päätyttyä kammio avattiin ja liuoksesta erotettiin välittömästi kiteet suodattamalla tai sentrifugoimalla. Liuoksen jääneen proteiinin pitoisuus määritettiin 10 ja huokoisuuden alenemasta laskettiin Iddesaanto. Kiteiden laatu todettiin mik- roskopoimalla ja valokuvaamalla mikroskooppikameralla. Yhteenveto kokeiden tuloksista on esimerkkitaulukossa. Vertailun vuoksi samalla tavoin tutkittiin se osa liuoksesta, joka jätettiin normaalipaineeseen.

15 Keksinnön mukaista menetelmää valaisevat yksityiskohtaisemmin seuraavat suoritusesimerkit.

Esimerkki I

20 Glukoosi-isomeraasin kiteytys.

Käytettiin kuvan 1 mukaista kiteytintä, jonka pääkomponentit olivat sylinterinmuotoinen terässäiliö, (sisähalkaisija oli 40 mm ja tilavuus 50 kuutiosenttimctriä), säiliöön menevä mäntä ja säiliötä ympäröivä vesivaippa, 25 jonka avulla säiliö termostoitiin lämpötilaan 15 °C. Lisäksi säiliöön oli kytketty lämpö- ja paineanturit, joiden lukemat johdettiin piirturille.

Valmistettiin glukoosi-isomeraasiliuos liuottamalla 11 g glukoo-.; : si-isomeraasia 200 ml:aan diammoniumsulfaattiliuosta, jonka pitoisuus oli 10 30 p-%, 50 °C lämpötilassa Oiuoksen glukoosi-isomeraasipitoisuus oli silloin noin .: 55 g/1). Liuos jäähdytettiin nopeasti 15 °C:een, ja noin 50 ml erä panostettiin kiteyttimen terässäiliöön, ilmattiin ja nostettiin paine hydraulisesti arvoihin . jotka olivat välillä 1000 ja 4000 bar. Kiteytysajat olivat välillä 2 ja 30 ' I minuuttia.

35 4 88510

Tulokset on esitetty taulukossa I.

Todettiin, ettei entsyymin aktiivisuus ollut huonontunut.

Taulukko I Kidesaanto prosentteina koeliuoksen glukoosi-isomeraasista S kunkin kokeen päättyessä. Glukoosi-isomeraasipitoisuus kokeen alussa oli noin SS g/1.

Kiteytysaika Isomeraasia Paine koeliuoksessa ____ ___1 bar 1000 bar 1500 bar 2000 bar min__gΛ__%__%__%__% 2 51,91 2,0 3 52,32 1,1 9,6 5 56,45 1,7 38,6 5 56,49 54,5 7__50,76__U____56,4 10 48,65 78,9 10 52,51 84,6 12 54,43 1,4 77,2 17 51,86 3,5 73,2 17__54,70__y)____82,4 25 52,91 80,7 30 52,46 2,5 77,9 30 52,11 1,3 57,1 10 53,20 0,1 0,8 15__45,09__1,3 13,0___ 20 50,50 1,3 30,1 20 55,79 3,8 53,55 10 53,40 14,35 15 55,03 0,0 30__52,59__08____ 15 55,48 1,8 30 56,73 0,3 80,65 15 50,63 1,4 _ 16,95 _ 5 88510

Esimerkki 2

Meneteltiin kuten esimerkissä 1, mutta käytettiin glukoosi-isomeraasiliuosta, jonka entsyymipitoisuus oli noin 70 g/1 (valmistettu liuottamalla 14 g glukoo-5 si-isomeraasia 200 ml:aan diammoniumsulfaattia). Kiteytyslämpötila oli 23 °C. Kiteytysajat olivat välillä 2 ja 20 minuuttia.

Tulokset on esitetty taulukossa Π.

Todettiin, ettei entsyymin aktiivisuus ollut huonontunut.

10

Taulukko Π Kidesaanto prosentteina koeliuoksen glukoosi-isomeraasista kunkin kokeen päättyessä. Glukoosi-isomeraasipitoisuus kokeen alussa oli noin 70 g/1.

_Paine__Kiteytysaika__Kidesaanto _bar__mm__%_ 1000 20 17 2000 20 70 2500 20 49 _1 20 _0 15

Esimerkki 3

Korkean paineen avulla valmistettujen kiteitten käyttö siemenkiteinä.

f\: 20

Valmistettiin 1 litra isomeraasiliuosta, jonka isomeraasipitoisuus oli 35 : g/1 kuiva-aineeksi laskettuna. Liuoksesta otettiin 50 ml erä, jota puristettiin painekammiossa 2000 bar paineessa 5 minuutin ajan 15 °C lämpötilassa. Erä otettiin pois painekammiosta, ja todettiin, että siinä olevasta isomeraasista 20 g 25 oli kiteytynyt keskimäärin 10 mikrometrin läpimittaisia kiteitä. Tästä erästä otettiin 1 ml, joka lisättiin 950 ml:aan normalipaineessa olevaa isomeraasiliuosta. Tätä seosta sekoitettiin potkurisekoittajalla siten, että kiteitä ei laskeutunut astian pohjalle (7 cm potkuri, 80 kierrosta minuutissa). Kiteytyminen liuoksessa alkoi välittömästi siemenkiteiden ansiosta, ja 5 tunnin kuluttua ki- 6 88510 teytyminen oli lähes päättynyt (liuoksessa oli jäljellä liukoisena 4 g/1 isome-raasia, eli kiteisenä loput 31 gA). Kiteitä tarkasteltiin mikroskopoimalla ja voitiin todeta, että suurin osa kidemassasta oli 95-120 mikrometrin läpimittaisina kiteinä.

Claims (6)

7 88510

1. Menetelmä glukoosi-isomeraasin kiteyttämiseksi, tunnettu siitä, että aineen ylikyllästynyt vesiliuos siirretään korkeaa painetta kestävään 5 astiaan, ja liuokseen annetaan vaikuttaa paine, joka edullisesti on välillä 1000 ja 3000 bar.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ylikyllästys on 5-20 ja paine 1500-2500 bar. 10

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytysaika on 30 sekuntia - 30 minuuttia.

4. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että kiteytys suoritetaan kahdessa tai useammassa vaiheessa, jolloin ensin valmistetaan siemenkiteitä korkeassa paineessa, ja varsinainen kiteytys suoritetaan alemmassa paineessa mainittujen siemenkiteiden avulla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 20 ensimmäisessä vaiheessa paine on 1500-3000 bar ja kiteytysaika on 30 sekuntia -15 minuuttia.

6. Patenttivaatimusten 4 ja 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että varsinainen kiteytys suoritetaan normaalipaineessa. * 88510 Patentkraven