FI87932B - Membran - Google Patents

Description

1 37932

Kalvo Tämä keksintö koskee entsyymielektrodityyppisen tuntoelimeen tarkoitettua kalvoa, jolla on parannetut 5 ominaisuudet, tuntoelintä, joka on erityisesti entsyymi-elektrodityyppinen tuntoelin, joka sisältää parannetun kalvon, ja analyyttistä menetelmää, joka on erityisesti menetelmä, jossa käytetään parannetun kalvon sisältävää entsyymielektrodityyppistä tuntoelintä.

10 Entsyymielektrodeja käytetään lisääntyvässä määrin lääketieteellisissä ja muissa laboratorioissa sellaisten materiaalien kuin glukoosi ja urea määrittämiseen veri- ja muista fysiologisista nestenäytteistä. Tällaisia elektrodeja kuvataan monissa julkaisuissa, joista mainittakoon 15 Clarkin ja Lyonsin artikkeli /Annals of the New York

Academy of Science 102 (1962) 29 - 45? ja US-patentti-julkaisut 3 539 455 ja 3 979 274 (Clark ja vastaavasti Newman). Entsyymielektrodeja käytetään yleisesti sellaisten materiaalien määrittämiseen, jotka itsessään eivät ole 20 elektrokemiallisesti aktiivisia mutta jotka sopivien ♦entsyymien läsnä ollessa osallistuvat reaktioihin, joissa ... syntyy elektrodeilla helposti detektoitavissa olevia spesieksiä. Entsyymielektrodeissa entsyymit sijaitsevat usein polymeerikalvoissa läheisessä kosketuksessa alla "'25 olevaan elektrodiin.

On tehty huomattava määrä tutkimustyötä entsyymi-elektrodeissa käytettäviksi tarkoitettujen kalvojen ominaisuuksien parantamiseksi, ja on julkistettu monia kalvoja : tähän tarkoitukseen. Esimerkkki eräästä usein käytetystä '30 kalvotyypistä on laminoitu kalvo, jonka on julkistanut

Newman US-patenttijulkaisussa 3 979 274. Tämä kalvo sisältää .. sisemmän kerroksen, joka on suurin piirtein homogeenista materiaalia, esimerkiksi selluloosa-asetaattia, joka pystyy estämään jopa pienimolekyylisten materiaalien, jotka toden-35 näköisesti häiritsevät entsyymivälitteistä signaalia, 2 37932 läpikulun, itse entsyymistä (joko yhdessä muiden sen kanssa sekoitettavissa olevien materiaalien kanssa tai ilman niitä) koostuvan lähellä olevan kerroksen, ja ulomman kerroksen, joka on huokoinen tukikerros, joka pystyy estämään solumais-5 ten ja kolloidisten rakenneosien läpikulun.

Glukoosin määritys voidaan ottaa esimerkiksi materiaalin määrittämisestä entsyymielektrodin avulla. Glukoosi-oksidaasientsyymin läsnä ollessa tapahtuu seuraava reaktio: glukoosi- 10 D-glukoosi + O0 + H_0--> D-glukonihappo + H-0- oksidaasi Tässä reaktiossa syntyvä vetyperoksidi läpäisee kalvon, kuten US-patenttijulkaisun 3 979 274 mukaisen kalvon, sisemmän kerroksen, ja voidaan määrittää käyttämällä elektrodia. Koska 15 vetyperoksidin muodostuminen riippuu näytteessä läsnä olevasta glukoosista, voidaan glukoosipitoisuus määrittää käyttämällä sopivasti kalibroitua tuntoelintä.

Tähän asti on joukko vaikeuksia rajoittanut entsyymi-elektrodien käyttökelpoisuutta ja niiden käyttöaluetta esi-20 merkiksi verinäytteiden rutiinianalyysissä. Eräs tärkeä vai-: : keus on tutkittavassa näytteessä olevien häiritsevien r spesiesten, jotka voivat itsessään aiheuttaa signaalin ja . siten suurentaa kokonaissignaalia ja saada elektrodin anta maan liian suuren lukeman, vaikutus. Käytettäessä entsyymi-25 elektrodia esimerkiksi glukoosin mittaamiseen verestä saattaa entsyymivälitteinen signaali olla oikea, mutta havaittua signaalia saattaa suurentaa joukko veressä olevia muita spesieksiä, kuten askorbiinihappo, jotka saattavat antaa : suoria elektrokemiallisia signaaleja vetyperoksidin detektoi- •30 valla elektrodilla.

Tämän keksinnön mukaisesti tarjoamme käytettäväksi nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon, joka sisältää entsyymipitoisen kerroksen ja yhden tai useamman materiaalikerroksen, jolloin ainakin yksi materiaalikerros :35 on muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta poly- aryylisulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyliketonista.

3 87932

Keksinnön mukaisesti tarjoamme lisäksi käytettäväksi tuntoelimen, joka sisältää nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon, joka sisältää yhden tai useamman mate-riaalikerroksen, jolloin ainakin yksi materiaalikerros on 5 muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyli- sulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta poly-aryyliketonista.

Keksinnön mukaisesti tarjoamme lisäksi käytettäväksi entsyymielektrodityyppisen tuntoelimen, joka sisältää nes-10 teitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon, joka sisältää entsyymipitoisen kerroksen ja yhden tai useamman materiaali-kerroksen, jolloin ainakin yksi materiaalikerros on muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryylisulfo-nista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyli-15 ketonista.

Keksinnön mukaisesti tarjoamme lisäksi käytettäväksi menetelmän näytteessä olevan analysoitavan aineen määrittämiseksi, jossa menetelmässä näyte saatetaan kosketukseen kalvon ulomman pinnan kanssa, joka kalvo on nesteitä ja 20 liuenneita aineita läpäisevä, sisältää yhden tai useamman materiaalikerroksen ja sisältyy tuntoelimeen, joka on herkkä ... analysoitavalle aineelle, ja mitataan tuntoelimen reagointi analysoitavaan aineeseen, jolloin vähintään yksi materiaali-kerros on muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta "25 polyaryylisulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyliketonista.

Koko tässä hakemuksessa käytetään termistä sulfonoitu tai sulfonoimaton polyaryylisulfoni tästedes lyhennettä PAS ja termistä sulfonoitu tai sulfonoimaton polyaryyli-30 ketoni lyhennettä PAK.

Keksintöä voidaan myös soveltaa muihin kuin entsyy-mielektrodityyppisiin tuntoelimiin, esimerkiksi tuntoelimiin, joissa käytetään kalvoja, jotka eivät sisällä entsyy-mikerroksia. Tällaisen ei-entsyymityyppisten tuntoelinten ;35 kalvot sisältävät yhden tai useampia materiaalikerroksia, 4 37932 ja laminoidut kalvot muodostetaan samaa tai eri materiaalia olevista kerroksista.

Kun keksinnön mukainen tuntoelin on entsyymielektrodi-tyyppinen tuntoelin, siinä olevan kalvon ja keksinnön mukais-5 ten kalvon yksinkertaisin muoto koostuu entsyymipitoisesta kerroksesta ja PAS:sta tai PAKista muodostetusta kalvosta, jolloin viimeksi mainittu kerros sijaitsee edullisesti entsyymipitoisen kerroksen ja elektrodin välissä.

On kuitenkin edullista, että keksinnön mukainen kalvo 10 ja keksinnön mukaisissa entsyymielektrodityyppisissä tunto-elimissä oleva kalvo on laminoitu kalvo, jonka tyypistä US-patenttijulkaisussa 3 979 274 kuvattu kalvo on esimerkki. Tällainen kalvo sisältää ensimmäisen eli sisemmän materiaali-kerroksen, joka sijaitsee entsyymipitoisen kerroksen ja 15 elektrodin välissä, entsyymipitoisen kerroksen ja toisen, entsyymipitoisen kerroksen toisella puolella sijatsevan materiaalikerroksen, jonka läpäisykyky saattaa olla rajoitettu. On hyvin edullista, että ensimmäinen kerros muodostetaan PASista tai PAKista.

20 Toisessa kerroksessa käytettävä, läpäisykyvyltään : rajoitettu huokoinen materiaali on yleensä polymeerinen . materiaali, mutta ainakin soveltuvia materiaaleja voidaan käyttää. Toinen kerros voidaan siten muodostaa lasista tai metallista, jossa on laserilla leikattuja huokosia.

Tässä hakemuksessa jäljempänä kuvattava keksinnön mukainen entsyymielektrodityyppinen tuntoelin sisältää laminoidun kalvon, jonka tyypistä on esimerkkinä US-patentti-julkaisussa 3 979 274 kuvattu kalvo ja jossa on ensimmäinen ja toinen polymeerikerros .

.30 Tulisi ymmärtää, että keksinnön mukainen kalvo voi sisältää enemmän kuin kaksi materiaalikerrosta. Toinen kerros • ei esimerkiksi ole välttämättä kalvon uloin kerros. Toisen kerroksen ja näytteen välissä voi olla yksi tai useampia lisämateriaalikerroksia, ts. kolmas, neljäs jne. kerros.

35 Toinen kerros on kuitenkin usein uloin kerros, ja sen uiko- 5 37932 pinta tulee kosketukseen näytteen kanssa keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Keksinnön mukaisessa kalvossa voidaan käyttää mitä tahansa soveltuvaa PAS:ää tai PAK:ta. Monet käytetyistä 5 polymeereistä ovat kuitenkin materiaaleja, jotka sisältävät

toistuvia yksiköitä, joilla on yleinen kaava A

-(-Ar - Y-)- A, jossa Ar on divalenttinen aromaattinen ryhmä ja mahdolli-10 sesti, mutta edullisesti ainakin jotkut ryhmistä Ar ovat sulfonoituja; ja Y on -S02- tai -CO-.

Ryhmä Ar on edullisesti ryhmä, joka sisältää kaksi aromaattista rengasta, jotka voivat olla kondensoituneita 15 tai suoran sidoksen, alifaattisen ryhmän, happi- tai rikki- atomin tai sulfoni- tai ketoniryhmän yhteenliittymä.

PAS tai PAK on edullisesti sulfonoitu polymeeri ja erityisesti sulfonoitu polyaryylieetterisulfoni tai sulfonoitu polyaryylieetteriketoni, jossa ryhmä Ar sisältää vä-20 hintään kaksi happiatomin kautta yhteen liittynyttä aromaat tista ryhmää.

Tämän tyyppisiin sulfonoituihin polymeereihin kuuluvat polymeerit, jotka sisältävät toistuvia yksiköitä, joilla on kaava B

";25 -/-{-Ph1 - 0-) -Ph1 - Y-7- B

: : : - n jossa Y on edellä määritelty;

Ph1 on fenyleeniryhmä, edullisesti parafenyleeniryh-mä, jolloin ainakin jotkin ryhmistä Ph1 ovat sulfonoituja; ja V 30 n on 1 tai 2 ja n:n arvo voi olla erilainen poly- meeriketjun eri kohdissa.

Jos ryhmä Y on ryhmä -S02~ kaavan B mukaisessa sulfo-noidussa polymeerissä, voi n olla vain yksi tai vain 2, mutta on edullista käyttää kopolymeeriä, jossa n on yksi 35 joissakin toistuvissa yksiköissä ja kaksi muissa toistuvissa 6 07932 yksiköissä. Tällaisia kopolymeerejä ja niiden valmistusta kuvataan EP-julkaisussa 8 894. Soveltuvissa sulfonoiduissa

polysulfoneissa on toistuvia yksiköitä, joilla on kaava C

-(-Ph2 - O -Ph3 - O - Ph2 - S02-)- C,

5 yhdessä toistuvien yksiköiden kanssa, joilla on kaava D

-(-Ph2 - O - Ph2 - SC>2 —)- D, joissa kaavoissa 2

Ph on fenyleeniryhmä, edullisesti parafenyleeni- ryhmä; 3 10 Ph on fenyleeniryhmä, edullisesti parafenyleeni- ryhmä, jossa on yksi tai kaksi ryhmää -SO^M; M on vetyatomi, metalliatomi ja/tai ryhmä NR^, jolloin ryhmät M voivat olla samoja tai eri ryhmiä ja ryhmien M osuus on riittävä täyttämään ryhmän -SO^ vapaat valenssit; ja 15 R on vetyatomi tai alkyyliryhmä.

Sulfonoitu polysulfoni voi sisältää myös sulfonoima-tonta kopolymeeriä, jossa on toistuvia yksiköitä, joissa on kaava E

-(-Ph2 - O - Ph2 - O - Ph2 - S02~)- E

20 jossa • 2 : ; : Ph on edellä määritelty, yhdessä kaavan D ja kaa van E mukaisten toistuvien yksiköiden kanssa.

• 3 .· . Kaavan C mukaisissa toistuvissa yksiköissä Ph :n ollessa orto- tai parafenyleeniryhmä siinä on tyypillisesti 3 25 vain yksi ryhmä -SO..M, kun taas Ph :n ollessa metafenyleeni- ·1 3 ryhmä, siinä on tyypillisesti kaksi ryhmää -SO^M. Kun Ph on ortofenyleeniryhmä, ryhmä -SO^M sijaitsee para-asemassa toiseen eetteriryhmään nähden ja meta-asemassa toiseen eette- riryhmään nähden, ja mahdollinen lisäsulfonointi tapahtuu . 30 siten, että ryhmät -SO.M tulevat meta-asemaan toisiinsa näh- 3 4 den. Kun Ph on parafenyleeniryhmä, ryhmä -SO^M sijaitsee ortoasemassa toiseen eetteriryhmään ja meta-asemassa toi- ... 3 seen eetteriryhmään nähden. Kun Ph on metafenyleeniryhmä, ryhmät -SO^M sijaitsevat ortoasemassa toiseen ja para- 35 asemassa toiseen eetteriryhmään nähden.

7 37932

Sulfonoituja kopolymeerejä voidaan valmistaa sulfo-noimalla kopolymeeri, joka koostuu toistuvista yksiköistä D ja E. Sulfonointi on helppo tehdä liuottamalla kopolymeeri väkevään rikkihappoon (98 p-%) huoneen lämpötilassa ja 5 sekoittamalla seosta riittävän pitkään suurin piirtein kaik kien kaavan E mukaisten toistuvien yksiköiden alayksiköiden -O-Ph^-O- sulfonoimiseksi. Sulfonoitaviksi sopivat kopoly-meerit sisältävät 1 - 99 mol-% yksiköitä E ja vastaavasti 99 - 1 mol-% yksiköitä D, ja erityisesti 5-80 mol-% 10 yksiköitä E ja vastaavasti 95 - 20 mol-% yksiköitä D.

Sulfonointi tehdään edullisesti siten, että vähintään 90 % yksiköistä E muuttuu yksiköiksi C.

Sulfonoidut polysulfonit ovat polymeerisiä materiaaleja, joilla on suuri molekyylipaino, niin että polymeerin 15 muunnettu viskositeetti (RV) (mitattuna liuoksesta, joka sisältää 1 p-% polymeeriä dimetyyliformamidissa, lämpötilassa 25°C) on vähintään 0,2 ja edullissti vähintään 0,4. Polymeerin RV voi olla jopa 2,5, mutta on yleensä edullista, ettei polymeerin RV ylitä arvoa 2,0.

20 Sulfonoitu polysulfoni sisältää ryhmiä -SO^M, joissa M voi olla vety, metalliatomi tai ryhmä NR^. Sulfonoidut polysulfonit, joissa M on divalenttinen metalliatomi, erityisesti maa-alkalimetalli, ovat niinissämme oleva EP-hakemus-julkaisun 145 305 aiheena, jossa hakemuksessa julkistetaan .25 myös menetelmä tällaisten divalenttisten metallisuolojen valmistamiseksi ja niiden käyttämiseksi asymmetristen puoli-läpäisevien kalvojen valmistamiseksi.

Kalvo voi vähemmän edullisesti sisältää kerroksen, joka on muodostettu materiaalista, jolla on kaava B, jossa 30 ryhmä Y on ketoniryhmä. Sulfonoituihin polyketoneihin, joita ' voidaan käyttää kuuluvat polymeerit, jotka sisältävät tois- - tuvia yksiköitä, joilla on kaava F,

-/1(-Ph1 - 0 -) -Ph1 - CO-)-7~ F

• · - n - 1 ' 35 jossa ph1 ja n ovat edellä määriteltyjä.

8 37932

Sulfonoitu polyketoni voi olla materiaali, jossa n on vain yksi tai vain kaksi tai jossa n:n arvo vaihtelee polymeeriketjussa ja on yksi ja kaksi ketjun eri kohdissa. Sulfonoitu polyketoni voi siten olla materiaali, joka 5 saadaan sulfonoimalla polyketonia, joka sisältää ainoastaan

toistuvia yksiköitä G

-(-Ph2 - O - Ph2 - 0 - Ph2 - CO-)- G

tai ainoastaan toistuvia yksiköitä H.

-(-Ph2 - O - Ph2 - CO-)- H, 2 10 joissa Ph on edellä määritelty.

Sulfonoitu polyketoni voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa sulfonoimalla kopolymeeriä, joka sisältää sekä toistuvia yksiköitä G että toistuvia yksiköitä H. On edullista, 2 että ryhmät Ph ovat parafenyleeniryhmiä polyketonissa, 15 joka on määrä sulfonoida.

Käyttökelpoisia sulfonoituja polyketoneja kuvataan alan kirjallisuudessa, esimerkiksi EP-julkaisuissa 8 895 ja 41 780. Siten on mahdollista käyttää tuotteita, joita saadaan sulfonoimalla polymeeriä, joka sisältää kaavan G mukaisia 20 toistuvia yksiköitä, mahdollisesti yhdessä muiden toistuvien yksiköiden kanssa. Sulfonointi voidaan tehdä liuottamalla polyketoni väkevään rikkihappoon (98 p-%) ja sekoittamalla . liuosta, kunnes polymeeri on sulfonoitunut halutussa määrin.

I Väkevässä rikkihapossa tehtävä sulfonointi voidaan toteuttaa “ ; 25 ympäristön lämpötilassa tai korotetussa lämpötilassa, esi-: merkiksi vähintään lämpötilassa 50°C, sulfonoitavasta poly- ketonista riippuen.

Sulfonoitava polyketoni on edullisesti sellainen,

Vjoka sisältää pelkästään kaavan G mukaisia toistuvia yksi-•30 köitä, tai kopolymeeri, joka sisältää kaavan G mukaisia

toistuvia yksiköitä ja korkeintaan 50 mol-% komonomeeri-yksiköitä, joilla on kaava J

-(-(Ph2 - O - Ph2 - Y-)- J

tai komonomeeriyksiköitä, joilla on kaave E (kuvattu edellä), • ie 2 : '.:3b jolloin sekä Ph että Y ovat edellä määriteltyjä.

9 37932

Edulliset sulfonoidut polyketonit sisältävät toistuvia yksiköitä K

-(-Ph2 - 0 - Ph3 - 0 - Ph2 - CO-)- K

yhdessä toistuvien yksiköiden G ja mahdollisesti myös 2 3 5 toistuvien yksiköiden H kanssa, jolloin Ph ja Ph ovat mo lemmat edellä määriteltyjä.

Sulfonoituja polyketoneja on kätevä valmistaa sulfo-noimalla polyeetteriketoneja käyttämällä tässä ja EP-jul-kaisuissa 8 895 ja 41 780 kuvattuja menettelyjä. Sulfonoita-10 vat polyeetteriketonit ovat soveltuvasti kiteisiä polymeere jä, jotka sisältävät toistuvia yksiköitä G joko yksinään tai yhdessä muiden toistuvien yksiköiden kanssa ja joiden RV (mitattuna lämpötilassa 25°C liuoksesta, joka sisältää 0,1 p-% polymeeriä väkevässä rikkihapossa) on vähintään 15 0,7. Tällaisia polymeerejä kuvataan tarkemmin EP-julkai sussa 1 879.

Sulfonoidut polyaryylisulfonit ovat edullisempia kuin sulfonoidut polyaryyliketonit. Polymeerien on kätevä olla sellaisia, joiden sulfonoitumissuhde on vähintään 2, 20 esimerkiksi vähintään 4, ja korkeintaan 20, edullisesti . . korkeintaan 15. "Sulfonoitumissuhteella" tarkoitetaan sulfo- noidussa polymeerissä olevien sulfonoimattomien fenyleeni-ryhmien lukumäärän suhdetta sulfonoidussa polymeerissä olevin sulfonoitujen fenyleeniryhmien lukumäärään. Sulfo-... 25 noitumissuhde voidaan määrittää titraamalla tai NMRillä.

Sulfonoidussa polysulfonissa ryhmä -SO^M voi olla vapaan hapon muodossa, ryhmänä -SO^H, tai se voi olla suola, esimerkiksi ammoniumsuola tai metallin, kuten natriumin, kal-;'· siumin, bariumin tai alkuaineiden jaksollinen järjestelmän . : 30 ryhmän VIII metallin, suola.

Keksinnön mukaisen kalvon ollessa kyseessä on edullista, että ensimmäinen materiaalikerros, ts. entsyymin ja elektrodin välissä oleva kerros, on muodostettu PAS:stä tai PAKrsta. Ensimmäisen kerroksen sopiva paksuus on alueel-.‘.35 la 0,2 -1,0 pm.

10 37932

Keksinnön mukaisen kalvon toinen polymeerikerros toimii läpäisykulkuna ja estää tai rajoittaa suurimolekyy-listen yhdisteiden läpikulkua sekä antaa kalvolle riittävän lujuuden, jotta se pystyy säilyttämään muotonsa ja pysymään 5 sopivalla tavalla kosketuksessa elektrodin kanssa. Toiseksi kerrokseksi soveltuviin polymeerimateriaaleihin kuuluvat huokoiset polykarbonaatit, polyuretaanit ja muunnettu selluloosa, kuten selluloosa-asetaatti. Soveltuviin materiaaleihin kuuluvat myös materiaalit, joiden prosentuaalinen huokoi-10 suus (huokospinta-ala x huokostiheys x 100) on korkeintaan 5 % ja edullisesti alueella 0,001 - 0,5 %. Tällaisissa materiaaleissa huokosten keskiläpimitta on usein alle 0,3 pm. Elektrodin nopean reagoinnin varmistamiseksi toisen polymee-rikerroksen paksuus on edullisesti alle 20 pm, erityisesti 15 alueella 1 - 10 pm. Erityisen soveltuvia polymeerimateriaale ja toiseksi kerrokseksi ovat materiaalit, joiden prosentuaalinen huokoisuus on korkeintaan 15 % ja joita käytetään samankaltaiseen tarkoitukseen samanaikaisesti avoinna olevan EP-hakemuksemme nro 86 307 011.6 mukaisissa tuntoelimissä.

20 Tällaisissa materiaaleissa toisen kerroksen läpäisevyys on . . siinä määrin rajoitettu, että analysoitavan aineen tunkeu- tumisnopeus tämän kerroksen läpi on aineen ja tuntoelimen välisen reaktion nopeutta rajoittava vaihe.

Keksinnön mukaisessa kalvossa läsnä oleva entsyymi ..';25 voidaan sijoittaa siihen millä tahansa sopivalla tavalla.

: Laminoidussa kalvossa se on edullisesti ensimmäisen ja : ; · toisen materiaalikerroksen välissä ja saa aikaan niiden tarttumisen toisiinsa. Tässä tapauksessa ja myös yleisesti : on edullista immobilisoida entsyymi sekoittamalla siihen .-:-30 ainetta, joka saa aikaan silloittumisen. Eräs tähän tarkoi tukseen hyvin soveltuva aine on glutaraldehydi; voidaan myös käyttää proteiineja, kuten albumiinia, ja muita aineita. Jotta tuntoelimestä, jossa kalvoa käytetään, saataisiin .·. : helpommin nopeita stabiileja lukemia, on edullista, että 35 entsyymipitoinen kerros on ohut, ts. korkeintaan 50 pm:n paksuinen.

11 37932

Keksinnön mukaisessa kalvossa käytettävä entsyymi riippuu analysoitavasta aineesta, jonka pitoisuus on määrä määrittää. Jos analysoitava aine on glukoosi, on entsyymi esimerkiksi glukoosioksidaasi. Muihin entsyymeihin, joita 5 voi olla läsnä, kuuluvat urikaasi ja laktaattioksidaasi virtsahapon ja vastaavasti maitohapon määrittämiseksi.

Kalvon uloimman kerroksen ulkopinta, ts. pinta, joka on kosketuksessa näytteen kanssa, voidaan haluttaessa käsitellä organosilaanilla EP-hakemuksessamme nro 86 303 907.9 10 kuvatulla tavalla.

Keksinnön mukaisessa tuntoelimessä käytettävä laminoi-tu kalvo glukoosin määrittämiseksi voidaan valmistaa menetelmällä, johon kuuluvat seuraavat vaiheet: 1. Liuotetaan 1 mg glukoosioksidaasia 50 plraan 15 albumiiniliuosta (100 mg/ml); 2. 3 μΐ 12,5-%:ista glutaraldehydiliuosta sekoitetaan 3 pl:aan entsyymialbumiiniseosta lasisella mikroskooppile-vyllä; 3. 1 μΐ edellisessä vaiheessa saatua seosta levite- 2 20 tään polykarbonaattikalvon (1 cm ), jonka huokosten keski- : .·. läpimitta on alle 0,03 pm, toiselle pinnalle; 4. Entsyymikerroksen toinen pinta peitetään välittö- mästi ohuella sulfonoidusta polysulfonista valmistetulla kalvolla, ja tuloksena oleva laminoitu kalvo suljetaan 3 ---25 minuutiksi lasilevyjen väliin. Kun edellä mainittujen vaihei- ' : den kautta valmistettu laminoitu kalvo on irrotettu lasi- r ·.· levyistä, se voidaan levittää platinaelektrodille, jolloin muodostuu keksinnön mukainen tuntoelin, jossa sulfonoidusta polysulfonista valmistettu kalvo on lähinnä elektrodia ja r ; 30 muodostaa ensimmäisen kerroksen.

Edellä kuvatun menetelmän, jossa ensimmäinen eli sisin PAS-kerros muodostetaan puristamalla polymeeriliuospisaru kahden lasilevyn välissä, lisäksi ovat mahdollisia muutkin : ·.: menetelmät. Voitaisiin esimerkiksi käyttää pyöröpäällystin- -.35 tä, jolloin pisaran koko, polymeeripitoisuus ja pyörimis- 12 87932 nopeus ja -aika optimoidaan. Mitä tahansa pyöröpäällystin-tyyppiä, matalaistukkainen tyyppi mukaan luettuna, voitaisiin käyttää. Tällaisella menetelmällä pitäisi pystyä tuottamaan kalvoja joiden toistettavuus on 1 pm tai pienempi.

5 Muihin menetelmiin kuuluvat erilaiset painomenetelmät,kuten silkki- ja syväpaino, ja vesi- tai muun nestepinnan käyttäminen kalvon valamisalustana. Valaminen vedelle antaa mahdollisuuden valmistaa äärimmäisen ohuita kalvoja ja kontrolloida orientaatiota ja pinnan tiivistymistä. Nämä menetelmät 10 mahdollistavat kalvon valamisen suoraan elektrodille, tai, nestepinnan ollessa kyseessä, kalvo voidaan poimia elektrodille turhaa käsittelyä välttäen.

Keksinnön mukainen tuntoelin voi sisältää irrotettavissa olevan kalvon, tai se voi olla kertakäyttöinen tuntoelin, 15 jossa kalvo on pysyvästi kiinni. Tuntoelimiin soveltuvien elektrodien valmistamiseen käytettäviin materiaaleihin kuuluvat inerttimetallit ja/tai hiili. Elektrodikokoonpano voidaan muodostaa alipainehaihdutussputteroinnilla tai ionipäällystämällä alustalle.

20 Tämän keksinnön mukaisen analyysimenetelmän käytöllä : .. on se etu, että se antaa mahdollisuuden vähentää suuresti ’ · tai joissakin tapauksissa jopa poistaa kokonaan häiritsevien . ; spesiesten vaikutus tuntoelimellä mitattavaan signaaliin.

Tämä parantaa voimakkaasti keksinnön mukaisten entsyymi-'25 elektrodituntoelinten luotettavuutta.

- ·" Keksintöä valaistaan liitteenä olevien piirrosten kuvilla 1 ja 2, joissa: kuva 1 on halkileikkauskuva osasta entsyymielektrodi-tyyppistä tuntoelintä, johon on kiinnitettynä keksinnön 30 mukainen kalvo; ja kuvio 2 on halkileikkausräjäytyskuva osasta keksinnön ; mukaista tuntoelintä, joka on tarkoitettu vetyperoksidin määrittämiseen.

Kuviossa 1 merkitään numerolla 1 kalvon toista poly-: 35 meerikerrosta, joka on muodostettu polykarbonaattikalvosta, 13 87932 jonka huokosten keskiläpimitta on alle 0,03 μη. ja jonka prosentuaalinen huokoisuus on korkeintaan 5 %, 2 on kerros, joka sisältää glukoosioksidaasia liuotettuna albumiiniin ja sekoitettuna glutaraldehydin kanssa, 3 on ensimmäinen 5 polymeerikerros, joka on muodostettu sulfonoidusta poly- sulfonista, 4 on platinamittauselektrodi ja 5 on hopea-referenssielektrodi. Platinasta valmistettu mittauselektrodi 4 toimii anodina, kun taas hopeasta valmistettu referenssi-elektrodi 5 katodina. Kalvo pidetään paikallaan elektrodilla 10 pleksilasirenkaalla, joka puristaa ulompaa kerrosta 1 reu noistaan kohdassa 6.

Kuviossa 2 7 on platinasta valmistettu mittaus- elektrodi, joka on polarisoitu jännitteellä +6,50 mV referens-sielektrodia vastaan, 8 on hopea/hopeakloridireferenssi-15 elektrodi, 9 on tiivisterengas ("O"-rengas), 10 on sulfonoi dusta polysulfonista valmistettu kalvo, 11 on virtausmittari ja polarisointijännitelähde, ja 12 on ruuvikiinnittei-nen yläosa, jossa on näytekammio. Tämän tuntoelimen saattamiseksi käyttökuntoon laitetaan muutama pisara puskuriliuos-20 ta, joka sisältää 50 mmol/1 natriumkloridia, tuntoelimen pinnalle, jotta saadaan aikaan elektrolyyttikosketus mittaus-ja referenssielektrodien 7 ja vastaavasti 8 välille. Sitten sijoitetaan sulfonoidusta polysulfonista valmistettu kalvo 10 mittauselektrodin päälle 7 ja kiinnitetään se paikoilleen 25 elektrodin rungon ruuvikiinnitteisellä yläosalla 12. Tunto- elin on nyt valmis vetyperoksidin vesiliuosten mittaamiseen.

KΛIvon muodostaminen

Kuvion 1 mukaisen entsyymielektrodityyppisen tunto- elimen ja kuvion 2 mukaisen tuntoelimen kalvoissa käytetyt .*"30 sulfonoidusta polysulfonista koostuvat kalvot valettiin liuoksesta, joka sisälsi 10 % (paino/tilavuus) sulfonoitua polysulfonia (kokeiltiin sulfonoitumissuhteita 5, 10 ja 20; esimerkissä suhde on 10) dimetyylisulfoksidissa. 50 μΐ liuosta levitettiin tasaisesti lasilevylle, jonka pinta-ala 2 35 oli 20 cm . Levy laitettiin vakuumiuuniin ja pidettiin 0,1 mmHg:n paineessa 50°C:ssa 6 tuntia.

14 87 932

Polymeerien RV-arvot olivat seuraavat: 5, RV = 0,95; 10, RV = 0,86 ja 20, RV = 0,70.

Seuraavassa esimerkissä valaistaan kuvion 1 mukaisen entsyymielektrodityyppisen tuntoelimen käyttöä.

5 Esimerkki

Eräs pääongelmista glukoosientsyymielektrodien käytössä verimittauksiin on veressä olevien häiritsevien spesiesten, kuten askorbiinihapon, jotka antavat suoran signaalin H202:n detektoivalla elektrodilla, vaikutus. Tämä esimerkki 10 valaisee, kuinka keksinnön mukaisessa kalvossa olevaa sulfo-noidusta polysulfonista koostuvaa kalvoa voidaan käyttää näiden häiritsevien spesiesten seulomiseen pois ja mahdollisten H202:n, jota muodostuu glukoosioksidaasientsyymin (EC 1.1.3.4) reagoidessa substraattiensa, glukoosien ja 15 hapen, kanssa, selektiivisen mittaamisen.

Liuos (10 pl) , joka sisälsi 3 mg/ml glukoosioksidaasia ja 200 mg/ml seerumialbumiinia sekoitettiin glutaraldehydin 5-%:iseen vesiliuokseen (5 μΐ), ja annettiin seistä, kunnes seos oli jäykkäliikkeinen. 2 pl tätä seosta levitettiin 2 20 polykarbonaattikalvon (1 cm ), jonka huokosten keskiläpimit- ta oli 0,015 pm, toiselle pinnalle. Entsyymikerrokselle' • " 2 painettiin 1 cm :n pala sulfonoidusta polysulfonaatista valmistettua kalvoa, ja laminaatin annettiin seistä entsyymin silloittamiseksi edelleen. Laminaattia voidaan sitten käyttää 25 korvaamaan pelkästä sulfonoidusta polysulfonista valmistettu kalvo kuvion 2 mukaisessa tuntoelimessä, tai sitä voidaan käyttää kuvion 1 mukaisessa tuntoelimessä glukoosiliuoksiin reagoivanan entsyymielektrodina. Laminaatti sijoitettiin tuntoelimeen siten, että ensimmäinen sulfonoidusta poly-.*'30 sulfonista koostuva kerros oli vasten tuntoelimen pintaa.

,· Taulukossa annetaan tulokset, joita saatiin käytet täessä laminaattikalvoa glukoosin ja glukoosin ja erilaisten häiritsevien spesiesten läsnä ollessa. Taulukossa tuloksia verrataan tuloksiin, joita saatiin kalvolla, josta puuttui 35 sulfonoidusta polysulfonista koostuva kerros. On havaitta- 15 87932 vissa, että kalvo, jossa oli sulfonoidusta polysulfonista koostuva kerros, reagoi tavalla, johon häiritsevät spesiekset vaikuttivat paljon vähemmän kuin tavanomaisella kalvolla saatuun reaktionn.

5 TAULUKKO

______ Reaktio

Tavanomainen Entsyymikal- entsyymikal- vo, jonka vo (valin- ensimmäinen nanvaraisia kerros on 10 Liuenneet aineet yksiköitä) Kasvu sulfonoitua Kasvu __________%__polysulfonia__% -1 (a) 1 mmol 1 pelkkää glukoosia 9 4,2 (b) +0,2 m mol 1 1 askorbiinihap- poa 14,5 60 4,3 2 -1 (c) +0,1 m mol 1 kysteiiniä 9,9 10 4,2 0 -1 2Q (d) +1 m mol 1 glutationia 11,5 28 4,2 0 (e) +0,5 m mol uraattia 26 190 4,2 0 (f) liuos, joka - 25 sisältää kaik ki edellä esitetyt aineosat 33 270 4,4 5 (g) 1 m mol 1 1 glukoosia + -1 3Q 1 m mol 1 asetamino- feenia 78 770 5,0 20

Claims (8)

1. Nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevä kalvo, joka soveltuu käytettäväksi entsyymielektrodityyppisissä 5 tuntoelimissä, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden ensimmäisen materiaalikerroksen, joka on muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryy-lisulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta po-lyaryyliketonista, ja mainitun ensimmäisen kerroksen pääl-10 le asetetun toisen kerroksen, joka sisältää entsyymiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kalvo, tunnettu siitä, että ensimmäinen kerros on muodostettu sulfonoidusta polyaryylieetterisulfonista.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen kalvo, t u n -15 n e t t u siitä, että sulfonoidun polyaryylieetterisulionin sulfonoitumissuhde on alueella 2-20.

4. Entsyymielektrodityyppinen tuntoelin, joka sisältää entsyymipitoisen kerroksen ja elektrodin t u n -n e t t u siitä, että entsyymipitoisen kerroksen ja 20 elektrodin väliin on asetettu materiaalikerros, joka on muodostettu sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryy-lisulionista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta po-• lyaryyliketonista.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen tuntoelin, 25 tunnettu siitä, että mainitun sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryylisulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyliketonista muodostetun kerroksen paksuus on alueella 0,2 - 1,0 mikronia.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen tuntoelin, 30 tunnettu siitä, että entsyymiä sisältävän kerrok sen elektrodista pois päin olevalle pinnalle on asetettu toinen materiaalikerros, jolla on rajoitettu läpäisevyys.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen tuntoelin, tunnettu siitä, että toinen kerros on muodostettu - 35 polymeerisestä materiaalista, jonka prosentuaalinen huo- 17 87932 koisuus on alueella 0,001 - 0,5 %.

8. Menetelmä näytteessä olevan analysoitavan aineen määrittämiseksi, jolloin näyte saatetaan kosketukseen nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon ulkopinnan 5 kanssa, joka kalvo sisältää entsyymiä, jonka läsnäollessa analysoitava aine on muutettavissa spesiekseksi, joka voidaan detektoida entsyymielektrodityyppisellä tuntoelimellä, joka sisältää mainitun kalvon ja elektrodin, ja mitataan spesieksen aiheuttama reaktio tuntoelimessä, 10 tunnettu siitä, että kalvo sisältää entsyymiä sisältävän kerroksen ja tämän ja elektrodin väliin asetetun sisäkerroksen, joka on muodostettu sulfonoidusta tai sul-fonoimattomasta polyaryylisulfonista tai sulfonoidusta tai sulfonoimattomasta polyaryyliketonista. ie 87932