FI85627C - Jontestmedel i flerskikt. - Google Patents

Description

1 85627

Monikerroksinen ionitestiväline

Esillä oleva keksintö kohdistuu ionien mittaamiseen, erikoisesti vesiliuoksessa olevien ionien mittaami-5 seen ja monikerroksiseen testivälineeseen tai laitteeseen näiden mittausten suorittamiseksi. Keksintö antaa helppokäyttöisen tavan ionien läsnäolon ja/tai pitoisuuden määräämiseksi, jolloin tulokset ovat käytettävissä nopeasti kosketuksen jälkeen vesipitoisen testinäytteen kanssa. Han-10 kalia kalliita elektronisia laitteita kuten ionispesifisiä elektrodeja, liekkifotometrejä, atomiabsorptiospektrofoto-metrejä tai vastaavia laitteita ei tarvita.

Monikerroksista välinettä ionitestaukseen voidaan käyttää edullisesti ionipitoisuuden mittaamiseksi voimak-15 kaasti värillisissä nesteissä. Esimerkiksi monikerroksinen väline on erikoisen käyttökelpoinen kokoverimittauksia varten. Monikerroksinen väline on ainutlaatuinen sikäli, että sitä voidaan käyttää informaation saamiseen ultrasuodatet-tavasta tai "vapaasta” kalsiumista ja seerumin kalium-20 tasojen määräämiseen käyttäen kokoverinäytettä ilman uut-tautuneiden verisolujen haitallista vaikutusta.

Vaikka kaliumionipitoisuus seerumissa antaa kriittisen kliinisen osoituksen useista tiloista, jotka aiheuttavat muun muassa lihasärsytystä ja ärsykemuutoksia sydämen 25 lihastoiminnassa, olisi edullista käyttää kokoverinäytettä ja välttyä verisolujen eroittamiseita seerumista ennen mittausta. Kuitenkin verisolut sisältävät suuria määriä ka-liumioneja ja jos niitä liuotetaan mittauksen aikana, voi aiheutua suuria virheitä ilmoitettuihin arvoihin. Siten ko-30 koveriväline, joka pystyy mittaamaan seerumin kaliumin ja joka on riippumaton "hematokriitista" eli veren solusisäl-löstä, antaisi helppokäyttöisyyden, mitä ei voida saavuttaa nykyisillä kaliumionitesteillä.

: Menetelmiin ionien määräämiseksi liuoksessa kuulu- .·. : 35 vat liekkifotometria, atomiabsorptiofotometria ja ionispe- 2 S5627 sifiset elektrodit. Testiliuskamuotoja on esitetty julkaistuissa EP-patenttihakemuksissa A-125 554; A-125 555; A-153 641 ja EP-patentissa 41 175, mitkä tässä viitteenä mainittakoon. Suositeltavia ilmaisuaineita on esitetty 5 US-patenteissa 4 540 520 ja 4 552 697, jotka tässä viitteenä mainittakoon.

Monikerrosmuotoja analyyttien määräämiseksi analyy-tin kemiallisen reaktion avulla reagenssikerroksessa olevien komponenttien kanssa on esitetty (katso esim. US-pa-10 tentti 3 992 158; Przybylowicz et ai). Kitajima et ai esittelevät US-patentissa 4 356 149 monikerroksisen yhtenäisen elementin veren kemiallista analyysiä varten, jolloin rea-genssikerros muodostuu hydrofiilisesta sideaineesta ja sideaineeseen dispergoiduista hienojakoisista hydrofobisista 15 osasista, jotka osaset sisältävät reagenssia, joka pystyy antamaan värinmuutoksen analysoitavan aineosan kanssa. US-patentti 4 356 149 (Kitajima et ai) kohdistuu ylimääräisten kerrosten poistamiseen, jotka ovat olleet välttämättömiä yhteensopimattomien komponenttien vuoksi. Kitajima 20 käsittelee vain neutraalin analyytin määrittämistä reaktion kanssa, joka vaaditaan yhteensopimattomien reagenssikompo-nenttien erottamiseksi. US-patentti 4 255 384 (Kitajima et ai) kohdistuu monikerroksiseen, yhtenäiseen elementtiin veren kemiallista analyysiä varten.

25 l. Piirrosten lyhyt esittely • Kuvio 1 esittää kaaviollisesti monikerroksisen vä- lineen muodon, joka soveltuu erikoisesti kokoverimääri-tyksiin. Kuvio la esittää tuettua kolmekerroksista väli-* / nettä; kuvio Ib esittää tuettua kaksikerroksista välinettä.

30 Kuviot on esitelty yksityiskohtaisesti osassa 4 nimellä "monikerroksinen testiväline".

Kuviossa 2 on esitetty arvot esimerkissä 5.1 esi- : tettyä monikerroksista välinettä varten. Käyrä esittää ha- : vaitun millimolaarisen kaliumionipitoisuuden (K*), joka on : 35 määrätty tämän keksinnön mukaisen testivälineen avulla, « »· • « 3 85627 verrattuna millimolaariseen (K*)-arvoon, joka on saatu liekkifotometrisen menetelmän avulla. Kuvio 2a esittää seerumin arvot ja kuvio 2b esittää kokoveren arvot.

Kuvio 3 esittää hematokriittiriippuvuuden laskun 5 kokoveren kaliummäärityksessä, kun natriumkloridia lisätään monikerroksiseen testivälineeseen. Käyrä esittää esimerkissä 5.2 saadut arvot.

Tämä keksintö perustuu monikerroksisen testiväli-neen löytämiseen ionin läsnäolon ilmaisemiseksi vesipitoi-10 sessa testinäytteessä ja sen pitoisuuden määräämiseksi. Monikerroksinen väline on edullinen määrättäessä kationien kuten K+, Na+, Ca+, Mg++ ja Li+ pitoisuutta kokoverinäyttees-sä. Monikerroksinen väline käsittää ainakin reagenssiker-roksen ja heijastavan kerroksen ja käsittää haluttaessa 15 myös himmentävän kerroksen ja läpinäkyvän tukiosan.

Monikerroksisen testivälineen reagenssikerros käsittää joko hydrofiilista kantajamatriisia, johon on lisätty hydrofobisen apuaineen hienojakoisia pallosia, jotka palloset sisältävät kahta pääaineosaa: ionoforia, joka pys-20 tyy muodostamaan kompleksin määritettävän, spesifisen ionin kanssa ja ilmaisuainetta, joka pystyy vuorovaikutukseen io-noforin kompleksin ja ionin kanssa muodostaen ilmaistavan vasteen kuten värin tai fluoresenssin muutoksen tai esiintymisen; tai oleellisesti ei-polaarista, huokosetonta kan--V: 25 tajamatriisia, johon on lisätty ionoforia ja ilmaisuainet ta, joilla on edellä esitetyt ominaisuudet. Kationien roää-rittämiseksi neutraali ilmaisuaine, jossa on dissosioituva ; protoni ja joka pystyy dissosioitumaan ilmaisuaineen ja io- noforin kompleksin sekä kationin välisen vuorovaikutuksen 30 tapahtuessa muodostaen ilmaistavan vasteen, on suositeltava.

Heijastavan kerroksen ja haluttaessa himmentävän kerroksen lisääminen huokosettoman, ei-polaarisen rea-- genssikerroksen kanssa sallii sellaisten aineosien kuten .·[ : 35 puskurin ja haitallisia aineita poistavan aineen lisäämi- « · ♦ · * 4 85627 sen. Puskurlaineen lisäys sallii ionin määrityksen pusku-roimattoroan, laimentamattoman näytteen känssa. Haitallisia aineita poistava aine voi muodostaa kompleksin häiritsevän ionin kanssa, mikä sallii paremman selektiivisyyden ja 5 tarkkuuden.

Suositeltava toteutus on monikerroksinen testiväli-ne kokoveren kaliumia varten, jolloin riittävästi natrium-kloridia on lisätty monikerroksisen välineen yhteen kerrokseen, jolloin saadaan riippumattomuus hematokriitista.

10 Monikerroksinen muoto on suositeltava kokoverimää- rityksiin, koska elektrolyytin pitoisuus voidaan määrittää kolorimetrisesti tarvitsematta pestä tai pyyhkiä välinettä.

2. Määritelmät

Seuraavien määritelmien tarkoitus on selventää kek-15 sinnön aluetta ja sallia sen muotoilu ja käyttö.

2.1 Termi "ionofori" käsittää molekyylit, jotka pystyvät muodostamaan selektiivisesti kompleksin määrätyn ionin kanssa ei-polaarisessa ympäristössä ja torjumaan oleellisesti muut ionit. Esimerkiksi syklinen polyeetteri 20 2,3-nafto-l,4,7,10,13-pentaoksasyklopentadeka-2-eeni (kutsutaan joskus nimellä 2,3-nafto-15-crown-5 ja kutsutaan tässä nimellä "kaliumionofori I") sitoo selektiivisesti ka-liumioneja muodostaen kationisen kompleksin. Termi käsittää koronandit, kuten crovm-eetterit, kryptandit, podandit ja 25 antibioottiset ionoforit kuten valinomysiinin ja makro- • f: tetralidiaktiinit.

2.2 "Ilmaiseva aine" on sellainen, joka pystyy ·/·.· vuorovaikutukseen ionofori/ioni-kompleksin kanssa muodos- . .·. taen muutoksen värissä tai sen esiintymisen tai muun il- 30 maistavan vasteen. Suositeltavia ilmaisevia aineita ovat neutraalit yhdisteet, joissa on dissosioituva protoni, joka . pystyy dissosoioitumaan ilmaisevan aineen vuorovaikutuksen aikana ionifori/ioni-kompleksin kanssa muodostaen ilmaistavan vasteen. Menettäessään protonin ilmaiseva aine varau-35 tuu, mikä aiheuttaa muutoksen elektronien jakautumisessa.

5 85627

Muutos elektronien jakautumisessa aiheuttaa ilmaistavan vasteen. Termiin "ilmaiseva aine" kuuluvat fenoliyhdisteet kuten p-nitrofenoli ja naftolit, jotka ovat verrattain värittömiä ionisoitumattomassa tilassa, mutta jotka väritty-5 vät ionisoituessa sekä fluoresoivat yhdisteet, jotka muodostavat enemmän tai vähemmän fluoresenssia elektronien jakautumisen muuttuessa. Ilmaiseva aine voi myös olla aine, joka pystyy laukaisemaan ilmaistavan vasteen yhdessä muiden komponenttien kanssa. Esimerkiksi muutos elektronien jakau-10 tumisessa, mikä on aiheutunut vuorovaikutuksesta kompleksin kanssa, voi vuorostaan aiheuttaa ilmaisevan aineen vuorovaikutuksen muun komponentin kanssa, mikä sitten muodostaa ilmaistavan vasteen. Suositeltavia ilmaisevia aineita on esitetty US-patenteissa 4 540 520 ja 4 552 697, jotka tässä 15 viitteenä mainittakoon.

2.3 Termillä "vuorovaikutus" tarkoitetaan jokaista yhteisvaikutusta ilmaisevan aineen ja ionofori/ioni-kompleksin välillä, mikä johtaa ilmaistavaan vasteeseen. Vuorovaikutus ionofori/ioni-kompleksin ja suositeltavien ilmai- 20 sevien aineiden välillä, joissa on dissosioituva protoni, aiheuttaa ilmaisuaineen menettämään protonin ja muodostaa tällöin ilmaistavan vasteen. Esimerkki ilmaisevan aineen vuorovaikutuksesta kompleksin kanssa on tapaus, jolloin ilmaiseva aine muuttuu kompleksin vaikutuksesta värittömästä 25 värilliseen tilaan, kuten p-nitrofenolin tapauksessa.

2.4 Termi "ilmaistava vaste" tässä käytettynä tarkoittaa parametrin muutosta tai sen esiintymistä testivä-linejärjestelmässä, mikä voidaan havaita joko suoralla havainnolla tai kojeellisesti ja joka on funktio määrätyn 30 ionin läsnäolosta vesipitoisessa testinäytteessä. Eräitä ilmaistavia vasteita ovat värin, fluoresenssin, heijas-tuskyvyn, pH-arvon, kerniluminenssin ja infrapunaspektrin muutos tai esiintyminen.

2.5 Termillä "pallonen" tässä käytettynä tarkoite-35 taan aineen pallomaisia tai lähes pallomaisia palloja, kuu- 6 85627 lia tai muita muotokappaleita, joita muodostuu kaksifaasi-sissa suspensioissa tai emulsioissa. Jos muodostuu öljy-ve-dessäsuspensio tai -emulsio, esiintyy öljy (hydrofobinen) pallomaisina yksilöinä, joita ympäröi enemmän tai vähemmän 5 jatkuva vesifaasi. Mitä enemmän käytetään energiaa suspensiota muodostettaessa, sitä pienempi on pallosten koko. Lisäksi pallosten kokoa voidaan säätää lisäaineiden kuten pinta-aktiivisten aineiden ja muiden emulgoivien aineiden avulla.

10 Termi "pallonen" tarkoittaa myös kiinteän materiaa lin hienojakoisia osasia. Täten jos hydrofobinen kantaja on kiinteää hydrofobista materiaalia kuten polymeeriä, voidaan se jauhaa tai muutoin pienentää hienojakoisiksi kiinteiksi osasiksi.

15 2.6 Termillä "hydrofiilinen" tarkoitetaan aineen ominaisuutta sitoa tai absorboida voimakkaasti tai huomattavasti vettä. Termi käsittää ne materiaalit, joissa tapahtuu turpoamista tai reversiibelin geelin muodostumista veden vaikutuksesta tai jotka kostuvat tai läpäisevät vettä 20 tai jotka muodostavat vesiliuoksia.

2.7 Tässä käytettynä ilmaisulla "oleellisesti ei-polaarinen" tarkoitetaan ominaisuutta, että aine ei omaa merkittävää dipolimomenttia tai sähköistä polariteettia. Erikoisesti se kohdistuu ei-ionisiin aineisiin ja dielek- 25 trisiin aineisiin. "Oleellisesti ei-polaarinen" materiaali tarkoittaa hydrofobista materiaalia. Hydrofobisuus tarkoittaa yleisesti sitä, että materiaali ei sekoitu veden kanssa. Tässä käytettynä suositeltavien ilmaisevien aineiden yhteydessä hydrofobisuus tarkoittaa lisäksi sitä, 30 että ionoforin ja ionin kompleksin puuttuessa ei-polaari-*·'·* sesta (hydrofobisesta) kerroksesta ilmaiseva aine on proto- noidussa muodossa.

2.8 Termillä "huokoseton" tarkoitetaan sitä ominaisuutta, että materiaali ei oleellisesti läpäise vettä.

.·’ 35 Täten huokoseton kantajamatriisi on sellaista, joka estää 7 85627 veden kulun lävitseen yhdeltä puolelta toiselle. Esimerkiksi polyvinyylikloridikalvoa pidetään tätä tarkoitusta varten huokosettomana.

2.9 Ilmaisulla "hydrofobinen apuaine” tässä käy-5 tettynä tarkoitetaan ainetta tai aineita, jotka pystyvät eristämään ionoforin ja ilmaisuaineen vesifaasista, joka modostuu näytteen koskettaessa testivälinettä. Täten apuaine voi olla kiinteä tai nestemäinen tai molempien yhdistelmä edellyttäen, että se parantaa ionofori/ioni-10 kompleksin ja ilmaisuaineen kykyä esiintyä samanaikaisesti hydrofobisessa pallosessa. Käyttökelpoisiin apuaineisiin kuuluvat korkeassa lämpötilassa kiehuvat nesteet kuten nit-rofenylioktyylieetteri ja joita joskus kutsutaan "pehmen-timiksi" sekä polymerit kuten polyvinyylikloridi.

15 3. Monikerroksinen testiväline

Esillä olevan keksinnön mukainen monikerroksinen testiväline muodostuu reagenssikerroksesta, joka sisältää ionoforia ja ilmaisevaa ainetta kantajamatriisiin lisättynä ja ainakin heijastavaa kerrosta laminaarisesti sijoitet-20 tuna. Reagenssikerroksia ja sopivia kantajamatriiseja on perusteellisesti esitetty julkaistuissa EP-patentti-hakemuksissa A-125 554 ja A-125 555, jotka tässä viitteenä mainittakoon. EP-patenttihakemusjulkaisu A-153 641 esittelee huokosettoman, ei-polaarisen kantajamatriisin, joka 25 sisältää ionoforia, joka pystyy vuorovaikutukseen halutun - ionin kanssa ja sopivaa ilmaisevaa ainetta. Huokosetonta, ei-polaarista kantajaa kutsutaan tässä "kalvo"-muodoksi. Julkaistu EP-patenttihakemus A-125 554 esittelee reagenssi-. kerroksen emulsion muodossa, johon on lisätty ionoforia ja 30 ilmaisevaa ainetta sisältäviä hienojakoisia pallosia hydro-fiilisessä kantajamatriisissa vastaavasti. Reagenssikerrok-sen tyyppiä kutsutaan tässä "emulsio"-muodoksi. Kationien [ * määritystä varten suositeltavat ilmaisuaineet ovat neutraa leja yhdisteitä, joissa on dissosioituva protoni, mikä pro-35 töni pystyy dissosioitumaan ilmaisuaineen vuorovaikutukses- 8 85627 sa ionoforin ja kationin kompleksin kanssa muodostaen ilmaistavan vasteen. Suositeltava ilmaistava vaste on väri. Monikerroksinen testiväline luetaan tavallisesti heijastus-mittauksen avulla suoritettuna näytteen levityspinnan vas-5 takkaiselta pinnalta läpinäkyvän tukiosan lävitse.

Reagenssikerrokseen voidaan lisätä muita komponentteja. Valonsirontakeskuksia, kuten tarkemmin seuraavassa esitetään, voidaan lisätä molempiin reagenssikerros-muotoihin. Jos reagenssikerros on hydrofiilinen kantaja, 10 joka sisältää hienojakoisia hydrofiilisiä pallosia, muodostaa hydrofiilinen kantaja matriisin puskurien, natriumklo-ridin ja suositeltavien vesiliukoisen häiritsevän aineen poistoaineiden lisäämistä varten. Kuitenkin heijastavan kerroksen ja haluttaessa himmentävän kerroksen lisääminen 15 antaa välineen natriumkloridin ja puskurin lisäystä varten, mikä muutoin voisi destabiloida reagenssikerroksen. Jos käytetään kalvomuotoa, tarvitaan lisäkerroksia näiden komponenttien lisäystä varten testivälineeseen.

3.1 Valonsirontakeskukset 20 Jos käytetään heijastuksen lukemista mittalaitteen avulla, on edullista lisätä valonsirontakeskuksia reagenssikerrokseen. Näiden keskusten käyttö suurentaa tehokkaasti analyysin tarkkuutta pienentämällä kuivan kalvon paksuuden muutosten vaikutusta. Valonsirontakeskuksia voi-25 daan muodostaa lisäämällä liukenemattomia, epäorgaanisia osasia kuten titaanidioksidiosasia tai vastaavia kuten bariumsulfaattia, kalsiumkarbonaattia, roagnesiumoksidia, sinkkioksidia, lyijyoksidia, mikrokiteistä selluloosaa tai ; talkkia. Käyttöalue titaanidioksidiosasten lisäämiseksi on 30 noin 40 painoprosenttiin saakka päällyste-emulsiosta; suositeltava alue on noin 0,5 - 15 painoprosenttia päällyste-. emulsiosta reagenssikerrosta varten. Pienempi kuin 1 mik rometrin osaskoko on suositeltava.

9 85627 3.2 Natriumkloridin lisäys hematokriittiriippuvuu-den alentamiseksi

Jos hydrofiilistä kantajaa, johon on lisätty hydrofobisia pallosia, käytetään monikerroksisen testivälineen 5 reagenssikerroksena kokoveren elektrolyyttimäärityksessä, voidaan natriumkloridia lisätä hydrofiiliseen kantajaan. Natriumkloridin noin 0,1 - 0,2 moolin lisäyksen on havaittu olevan riittävän estämään hematokriittiriippuvuus, jota muuten esiintyy kokoveren kaliumtesteissä. Suolan lisäys on 10 erikoisen edullista monikerroksiseen muotoon, joka on suositeltava kokoveren määrityksiä varten ja käsitellään sitä tarkemmin myöhemmin tässä esitteessä.

3.3 Häiritsevän aineen poistavat aineet

Kehon nesteet sisältävät normaalisti useita katio-15 neja, kuten natriumionia (Na+) , kaliumionia (K+), kal- siumionia (Ca++) ja magnesiumionia (Mg++) . Vaikka ionofori valitaan tavallisesti sen selektiivisyyden perusteella halutun analyytti-ionin suhteen, eräissä tapauksissa muiden kationien läsnäolo voi vaikuttaa haitallisesti ioniforin 20 yhteisvaikutukseen halutun analyytti-ionin kanssa ja pienentää testin tarkkuutta. Esimerkiksi natriumionofori I sitoo natriumionin mieluummin kuin kalsiumionin noin 4:1 olevassa suhteessa. Näytteissä, joissa natriumionin suhde kalsiumioniin on pienempi kuin 4:1, voi olla välttämätöntä 25 estää kalsiumionin vuorovaikutus ionoforin kanssa asianmukaisen suhteen varmistamiseksi natriumionin pitoisuuden ja ilmaistavan vasteen välille. Häiritsevän aineen poistavaa ainetta voidaan käyttää tämän vaikeuden välttämiseksi.

Häiritsevän aineen poistavaa ainetta voidaan lisätä 30 hydrof iiliseen matriisiin tai hydrofobisiin pallosiin.

Suositeltavassa toteutuksessa poistava aine on suunniteltu vuorovaikutusta varten häiritsevän kationin kanssa niin, että se pysyy vesifaasissa, joka muodostuu kosketuksessa vesipitoisen, nestemäisen näytteen kanssa tai muuten estää 35 kationin vuorovaikutuksen ionoforin kanssa hydrofobisessa ψ » · * m λ 10 85627 pallosessa. Esimerkiksi etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) ja etyleeniglykoli-bis-(aminoetyyli)-tetraetikkahap-po (EGTA) ovat vesiliukoisia yhdisteitä, jotka muodostavat komplekseja kaksiarvoisten kationien kuten kalsiumionin 5 kanssa. Jos EDTA-materiaalia lisätään emulsioreagenssiker-roksen hydrofiiliseen kantajamatriisiin natriumionin määritystä varten, EDTA sitoo ensisijassa kalsiumionin natrium-ja kalsiumionin sisältävässä vesipitoisessa näytteessä. Sidottu kalsiumioni ei oleellisesti häiritse ionofori/nat-10 riumioni-kompleksin muodostumista hydrofobisessa palloses sa. Lisäksi ionoforeja voidaan käyttää poistamaan häiritseviä kationeja, jos ne ovat spesifisiä häiritsevän ionin suhteen ja ovat vesiliukoisia tai modifioituja kemiallisesti niiden vesiliukoisuuden suurentamiseksi alentamatta nii-15 den kykyä vuorovaikutukseen häiritsevän aineen kanssa.

Esimerkiksi natriumionofori III (kemiallinen nimi on esitetty lyhenneluettelossa ja rakenne esitetty EP-patentti-hakemusjulkaisussa A-153 641) voidaan modifioida lisäämällä liukenevaksi tekeviä ryhmiä, kuten (-S03H)-ryhmiä, bentsee-20 nirenkaisiin sen vesiliukoisuuden parantamiseksi alentamat ta sen kykyä vuorovaikutukseen natriumionin kanssa. Muitakin yhdisteitä kuten trans-1,2-diaminosykloheksaani-Ν,Ν,Ν',N'-tetraetikkahappoa voidaan käyttää myös edul-lisesti.

. 25 3.4 Puskuri

Puskuroivaa ainetta tai puskuroivien aineiden yh-distelmää voidaan lisätä emulsioreagenssikerroksen hydro-fiiliseen kantajamatriisiin. Kosketuksessa vesipitoisen nestenäytteen kanssa puskuri liukenee uudestaan täten 30 muodostuneeseen vesifaasiin nostaen tai alentaen pH-arvon halutulle tasolle ilmaistavan vasteen muodostumisen edistä-miseksi. Käytettäessä suositeltavia ilmaisuaineita, jotka pystyvät luovuttamaan dissosioituvan protonin vuorovaikutuksessa ionofori/ioni-kompleksin kanssa, puskuri ylläpitää . 35 sopivan pH-arvon reaktion etenemistä varten.

li 85627

Sopiviin puskureihin kuuluvat, mutta eivät rajoitu niihin, bis-(2-hydroksietyyli)-imino-tris-(hydroksimetyyli) -metaani; l,3-bis-(tris-(hydroksimetyyli)-metyyliami-no)-propaani; N,N-bis-(2-hydroksietyyli)-glysiini; tris-5 (hydroksimetyyli)-aminometaani; N-(2-asetamido)-2-imi- nodietikkahappo; N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N1-3-pro-paanisulfonihappo; 3-(N-tris-(hydroksimetyyli)-metyyliami-no-2-hydroks ipropaan isulfonihappo; tetrametyy1iammonium-boraatti; 3-(sykloheksyyliamino)-propaanisulfonihappo ja 10 tetrametyyliammoniumfosfaatti.

Suositeltava pH-alue riippuu ilmaisuaineesta. Siten puskuriaineen valinta määräytyy käytetyn ilmaisuaineen ja jossain määrin halutun ilmaisutavan vasteen perusteella. Esimerkiksi jos 7-desyyli-MEDPIN:iä käytetään ilmaisu-15 aineena, suositeltava pH-arvo on alueella 6 - 8,5.

Kuitenkin jos käytetään ilmaisuainetta, jonka pKa-arvo on suurempi dissosioituvaa protonia varten, korkeampi pH-arvo-alue on suositeltava. Samoin jos käytetään ilmaisuainetta, jonka pKa-arvo on alempi dissosioituvaa protonia varten, 20 alempi pH-arvoalue on suositeltava. Jos ilmaistava vaste on värin muutos, voi puskuriaine vaikuttaa tämän ilmaistavan vasteen asteeseen ja voidaan valita määrätty puskuri värin voimakkuuden optimointia varten. Esimerkiksi käyttökelpoi-nen pH-arvon alue ilmaisuainetta 7-desyyli-MEDPIN:iä varten 25 on välillä noin 6 - 8,5, jos värinmuutos on oranssista siniseksi. Suuremmilla pH-arvoilla välillä 8,5 - 10 saadaan . tummansinisiä värisävyjä, jotka on vaikea erottaa visuaali- - sesti toisistaan ja pienillä pH-arvoilla, välillä 5-6, saa- daan vaaleankeltaisia värisävyjä, jotka myös on vaikea 30 erottaa visuaalisesti. Molempia pH-ääriarvoja voidaan käyttää mittarianalyysissä, vaikka paras mittauslaitteen tark-*:·2 kuus esiintyy pH-arvolla noin 6 - 8,5. Sopivan pH-arvon määrittäminen on tavanomainen laboratoriomenettely.

.1 . 4. Monikerroksinen testiväline • · · ' ; 35 Monikerroksinen testiväline ionin määräämiseksi ve- · 1 2 • · i2 85627 sipitoisessa nestenäytteessä voidaan valmistaa lisäämällä heijastava kerros ja haluttaessa samentava kerros reagens-sikerroksen päälle.

Heijastava kerros sisältää materiaalia tai materi-5 aaliseosta liukenemattomina epäorgaanisina osasina, jotka muodostavat taustan helpottamaan käyttäjää määritettäessä ilmaistava vaste välineen reagenssikerroksessa. Suositeltavassa toteutuksessa kokoverimäärityksiä varten heijastavan kerroksen tarkoitus on eristää punaisten verisolujen 10 väri testattavassa näytteessä värin muutoksesta, jonka käyttäjän on havaittava. Suositeltava aine erotustarkoitus-ta varten on titaanidioksidi. Voidaan kuitenkin käyttää myös muita materiaaleja esimerkiksi bariumsulfaattia, kal-siumkarbonaattia, alumiinioksidia, magnesiumoksidia, sink-15 kioksidia, lyijyoksidia, talkkia ja mikrokiteistä selluloosaa. Tätä materiaalia sisältyy heijastavaan kerrokseen noin 5-40 painoprosentin suuruinen määrä, edullisesti 15-40 painoprosenttia heijastavan kerroksen kokonaispainosta laskettuna. Näiden materiaalien osakoko on yleensä pienempi 20 kuin 1 mikrometri. Materiaalin kuivapäällystyspaino on yleensä noin 2,5 - 75 g/m2 (grammaa neliömetriä kohti), edullisesti 10-25 g/m2.

Epäorgaanisten aineiden lisäksi heijastava kerros voi sisältää hydrofiilistä materiaalia kuten gelatiinia.

25 Hydrof iilistä materiaalia sisältyy 2-8 painoprosentin, edullisesti 2,5 - 5,5 painoprosentin suuruinen määrä heijastavan kerroksen kokonaispainosta laskettuna. Sopiviin hydrofiilisiin aineisiin kuuluvat gelatiini, agaroosi, polyvinyylialkoholi, polypropyleeni-imiini, akryylihapon ;;; 30 kopolymeerit, karrageeni ja algiinihapot. Tavallisesti loppuosa päällystysliuoksesta heijastavaa kerrosta varten p ; on vettä.

... Lisäksi heijastava kerros voi sisältää yhtä tai • · · useampaa kostutusainetta (pinta-aktiivista ainetta) ja/tai ; 35 yhtä tai useampaa suspendoivaa ainetta. Ei-rajoittava esi- ·*»·* i3 85627 merkki kostutusaineesta, jota voidaan käyttää heijastavassa kerroksessa, on Tritoi(^ X-100, joka on polyoksietyleeniä oleva pinta-aktiivinen aine ja jota toimittaa Sigma Chemical Co. Esimerkiksi testissä, jota käytetään kaliumin mää-5 rittämiseen, voidaan käyttää 0-0,5 painoprosenttia

Tritoi@ X~100 pinta-aktiivista ainetta.

Ei-rajoittaviin esimerkkeihin suspendoivista aineista, joita voidaan käyttää heijastavassa kerroksessa, kuuluvat gelatiini, alginaatti ja hydrofiiliset uretaanit. 10 Heijastavan kerroksen kuivapäällystyspaino on alueella 2,5 - 75 g/m2 (grammaa neliömetriä kohti), edullisesti 10-25 g/mz. Monikerroksisen testivälineen valmistamiseksi heijastava kerros levitetään päällysteeksi kuivatulle reagenssikerrokselle ja kuivataan noin 40 °C lämpötilassa 15 noin 10 minuutin aikana.

Suositeltavassa toteutuksessa päällystetään himmen tävä kerros heijastavan kerroksen päälle, s.o. himmentävä kerros on valinnainen. Himmentävän kerroksen märkäkerros-paksuus (paksuus levitettynä) on 10-50 mikrometriä, edul-20 lisesti 15-35 mikrometriä. Himmentävä kerros sisältää oleellisesti inerttejä osasia samentavan vaikutuksen muodostamiseksi hydrofiiliseen aineeseen suspendoituun kerrokseen. Käytetyt hydrofiiliset aineet ja suspendoivat aineet voivat olla niitä, joita on esitelty heijastavan kerroksen 25 yhteydessä. Nämä osaset voivat olla esimerkiksi hiilimus- .. taosasia.

Monikerroksisen välineen lisäkerrokset voivat haluttaessa sisältää puskuroivaa ainetta, haitallisen aineen poistavaa ainetta ja/tai natriumkloridia, kuten edellä on 30 esitetty reagenssikerroksen yhteydessä. Esipuskurointi sal lii testivälineen tai monikerroksisen kokoonpanon käyttämi-:"· sen puskuroimattomassa tai laimentamattomassa seerumissa tai kokoveressä. Vaikka puskuroivaa ainetta voidaan lisätä hydrofiiliseen matriisiin emulsioreagenssikerroksen kanssa, 35 antaa lisäkerrosten käyttö mahdollisuuden suurempaan pusku- i4 85627 rointikykyyn, mikä muutoin voisi vaikuttaa haitallisesti emulsioon, jos lisäys tapahtuu suoraan reagenssikerrokseen.

Monikerroksinen väline, joka käsittää himmentävän kerroksen, valmistetaan levittämällä himmentävä kerros 5 päällysteeksi heijastavan kerroksen päälle ja kuivaamalla koko yhdistelmä uudestaan 40 °C lämpötilassa noin 10 minuutin aikana.

Monikerroksista välinettä käytettäessä, levitetään näyte ylimmän kerroksen pinnalle, s.o. heijastavalle ker-10 rokselle, jos himmentävää kerrosta ei käytetä ja reagenssi-kerroksen ilmaistava vaste, tavallisesti väri, luetaan määrätyn aikaviiveen jälkeen alapuolelta. Monikerroksinen muoto voidaan päällystää läpinäkyvällä alustalla tai kiinnittää siihen. Käyttökelpoisiin läpinäkyviin alustoihin kuulu-15 vat polystyreeni, polyesterit, polykarbonaatti, selluloosa-asetaatti ja polyetyleenitereftalaatti. Polyetyleeniteref-talaatti tai selluloosa-asetaatti, joka on käsitelty gelatiinin hyväksyväksi, ovat suositeltavia.

Esillä olevan keksinnön suositeltavan toteutuksen 20 mukainen monikerroksinen väline 12 on esitetty kuvioissa la ja Ib. Kuten kuvioissa Ib on esitetty, monikerroksinen väline 12 muodostuu läpinäkyvästä aluskerroksesta 14, jonka päälle on levitetty reagenssikerros 16. Heijastava kerros 18 on levitetty päällysteeksi reagenssikerroksen 16 päälle. 25 Kuten kuviossa la on esitetty, himmennyskerros 20 voidaan haluttaessa sijoittaa heijastavan kerroksen 18 päälle. Näyte 22 sijoitetaan himmentävän kerroksen 20 päälle. Värin kehittyminen voidaan havaita pohjakerroksesta 14 ihmisen silmin tai käyttäen mittalaitetta kuten SERALYZE^ hei-30 jastusfotometriä (Ames Division, Miles Laboratories, Inc.), joka on sovitettu ionimäärityksiä varten.

Lisätyn heijastuskerroksen tai heijastavan ja himmentävän kerrosten käyttö eristää tehokkaasti reagenssikerroksen ulkopuolisesta ympäristöstä. Täten monikerroksinen 35 väline suojaa reagensseja sikäli, että ilman lisättyä hei- t * * is 85 62 7 jastavaa kerrosta tai lisättyä himmentävää kerrosta rea-genssit paljastuisivat ja olisivat sitten alttiita vaurioille mekaanisen kosketuksen vaikutuksesta. Lisätyn heijastavan kerroksen tai lisättyjen heijastavan ja himmentävän 5 kerrosten käyttö pidentää myös muodostuneen värin stabiliteettia.

Heijastavan kerroksen tai heijastavan ja himmentävän kerrosten käyttö antaa myös estomekanismin solujen, proteiinien ja muiden makromolekyylien suhteen, mikä 10 sallii kokoveren käytön ilman testivälineen pesua tai pyyhkimistä. Lisäksi näiden kerrosten suodatuskyvyn vuoksi monikerroksinen testiväline kalsiumia varten mittaa ultra-suodatettavan kalsiumin, koska sidottu kalsium ei saavuta reagenssikerrosta. Yksikerroksista ja monikerroksista tes-15 tivälinettä täytyy käyttää informaation saamiseksi koko-naiskalsiumista ultrasuodatettavan kalsiumin suhteen tes-tinäytteessä.

Seuraavassa on esitetty toimivat ja suositeltavat pitoisuusalueet monikerroksista testivälinettä varten ka-20 liumionin suhteen. Suositeltavat alueet on annettu seerumin kaliumin määrittämiseksi heijastusmittauksen avulla Ames SERALYZEI^ heijastusfotometrillä. Näitä pitoisuuksia voidaan käyttää lähtöarvoina määritettäessä käyttökelpoisia pitoisuusalueita muiden ionien mittaamiseksi muilla ionofo-25 reillä ja ilmaisuaineilla. Ilmaisuaineiden ja ionoforien pitoisuudet tarkoittavat pitoisuuksia käytetyn orgaanisen liuottimen tilavuusyksiköissä, muut pitoisuudet määritellään grammoina 100 grammaa kohti liuosta. Reagenssikerrok-sen paksuus monikerroksista testivälinettä varten voi olla 30 noin 25-500 mikrometriä ja suositeltava märkäpaksuus on noin 150-200 mikrometriä.

1β 85627

Toiminta-alue Suositeltava alue I. Reagenssikerros

Kalvon paksuus 25-500 μη» 150-200 μη»

Ionofori 10-500 mM 80-160 mM

5 Ilmaisuaine 10-120 mM 30-60 mM

Valonsirontakeskuksia (haluttaessa) 0-40 % 0,5 - 15 %

Jos reagenssikerros on hydrofobisia pallosia sisältävä hydrofiilinen kantaja: 10 Hydrofobista apuainetta 5-15 % 7-12 %

Hydrofiilista kantajaa 5-15 % 7-12 %

Puskuroivaa ainetta

(haluttaessa) 0-0,5 M 0,2 - 0,5 M

Häiritsevää ainetta poista-15 vaa ainetta (valinnainen) 0-30 g/1 10-20 g/1

Kostutusainetta (valinnainen) 0-3 g/1 1-2 g/1

Natriumkloridia (valinnainen) 0-0,6 M 0,5-0,15 M

Jos reagenssikerros on huokoseton, ei-polaarinen kantaja-alusta: 20 Toiminta alue Suositeltava alue

Polymeeriä 5-25 paino-% 5-25 paino-% hydrofobinen apuaine 8-50 paino-% 8-50 paino-% II. Valinnaiset monikerrokset 1. Heijastava kerros . .·. 25 Titaanidioksidia 5-40 % 15-40 % gelatiinia 1-6 % 2-6 %

- natriumkloridia (valinnainen) 0-0,6 M 0,05-0,5 M

kuivan päällysteen paino 2,5-75 g/m2 10-25 g/m2 2. Himmentävä kerros 30 hiilimustaa 3-30 % 7-15 % gelatiinia 1,0 - 12 % 1,5 - 6 %

natriumkloridia 0-1 M 0 - 0,6 M

: - kalvon paksuus (märkänä) 10-50 μη» 15-35 μοι .·* ; 5. Esimerkit 35 Esimerkeissä käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: » · · • * * 1’ 85627

Sulkuja, ( ), käytetään tarkoittamaan ionipitoi-suutta millimooleissa (mM) litraa kohti lineaarisissa regressioyhtälöissä. Kaikki prosentuaaliset pitoisuudet on annettu painon mukaan desilitraa kohti, ellei toisin ole 5 mainittu.

Lämpötila (° C) celsiusaste

Pituus (cm) senttimetri

Paksuus (μτα) (1 mil on 25,4 mikro-metriä) mikrometri 10 Paino (g) gramma (mg) milligramma

Tilavuus: dl desilitra ml millilitra 15 μΐ mikrolitra L litra

Pitoisuus mM millimolaarinen (millimoolia litrassa) 20 M molaarinen (moolia litraa kohti) paino-% painoprosenttia de silitraa kohti ‘ tilavuus-% tilavuusprosenttia • 25 desilitraa kohti

Ionit:

Na* natriumioni K* kaliumioni

Li* litiumioni 30 Ca** kalsiumioni

Mg** magnesiumioni

Lyhenteet kemiallisille komponenteille on esitetty : seuraavassa. Ionoforien merkinnät ovat keksinnön tekijät ____ 35 antaneet vain käytännöllisistä syistä. Nimi perustuu taval- • ··*» ie 85627 lisesti pääioniin, jonka määrittämiseen ionoforia käytetään. Ionoforit reagoivat yleensä, vaihtelevin määrin, kuitenkin myös muille ioneille. Nimettyjen ionoforien rakenteet on esitetty EP-hakemusjulkaisussa A-153 641.

5 Ionoforit

Natriumionofori I l,l,l-tris[l'-(2'-oksa-4'-okso-5'- atsa-5·-metyyli)dodekanyyli]-propaani Natriumionofori II NjN'-dibentsyyli-^N'-difenyyli-l^- fenyleenidioksidiasetamidi 10 Natriumionofori III 6,7,9,10,18,19-heksahydro-17-n- butyyli-dibentso(b,k), (1,4,7,10,13)- pentaoksasykloheksadekaani-18-yyli-ok- sietikkahappo

Kaliumionofori I 2,3-naftoli-l,4,7,10,13-pentaok- 15 sasyklo-pentadeka-2-eeni

Kalsiumionofori I dietyyli-Ν,Ν'-[(4R,5R)-4,5-dimetyyli- 1,8-diokso-3,6-dioksaoktametyleeni]-bis(12-metyyliaminododekanoaatti)

Hydrofobinen apuaine 20 NPOE 2-nitrofenyylioktyylieetteri NPBE 2-nitrofenyylibutyylieetteri

Ilmaisuaine 7-desyyli-MEDPIN 7-(n-desyyli)-2-metyyli-4-(3',5'- Ύ: dikloorifen-4'-oni)-indonaftoli - 25 Sekalaiset aineet EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo .·. : TRIS-C1 tris(hydroksimetyyli) -aminometaanihyd- rokloridi EGTA etyleeniglykolibis(aminoetyyli)tet- 30 raetikkahappo (G. Fredrick Smith

Chemical Co., Columbus, Ohio) TRITO10 X-100 polyetyleeniglykoli-p-iso-oktyylifeny- ylieetteri (Sigma Chemical Co., St. Louis, Ho).

35 NaDDBS natriumdodesyylibentseenisulfonaatti a · · 19 δ 5 627 Tätä keksintöä esitellään, mutta ei rajoittavasti, seuraavien esimerkkien avulla.

5.1 Monikerroskalium - seerumin ja kokoveren mittausten korrelaatio vertailumenetelmän kanssa 5 Kaliumionipitoisuutta, joka määritettiin kaksiker roksisen testilaitteen avulla, verrattiin kaliumin määritykseen liekkifotometri-vertailumittausmenetelmän avulla. Verta otettiin viidestätoista normaalikohteesta ja määrättiin kaliumpitoisuus välineen avulla käyttäen 155-180 se-10 kunnin aikana mitattua heijastusta. Seerumi valmistettiin linkoamalla ja analysoitiin testivälineen avulla samalla tavalla. Alimäärät analysoitiin myös liekkifotometri-vertailumenetelmän avulla.

Reagenssikerros valmistettiin emulgoimalla hydrofo-15 bista apuainetta, NPBE, joka sisälsi 120 mM kaliumionoforia I ja 30 mM 7-desyyli-MEDPIN:iä hydrofiilisen kantajan kanssa ja käyttäen apuna butanonidihappo,dodesyyli-4,4'-[(1-me-tyylietyy1ideeni)di-4,1-sykloheksaanidiyyli]-esteriä, jota tässä kutsutaan öljynmuodostajaksi. Emulsio levitettiin ja 20 kuivattiin ennen heijastavan kerroksen levittämistä. Reagenssikerros: hydrofobinen apuaine 8,3 % gelatiini 8,3 % öljynmuodostaja 0,042 % polystyreenisulfonaatti 0,02 %

^ 25 Tris-Cl (pH-arvo 7,5) 0,2 M

Märkäpaksuus: 375 mikrometriä

Heijastava kerros: gelatiini 2,75 % titaanidioksidi 19 % Märkäpaksuus: 82 mikrometriä 30 Annetut prosenttiluvut ovat grammoja 100 ml kohti päällystysliuosta. Testivälineet valmistettiin läpinäkyvälle alustalle ja heijastus mitattiin alustan lävitse SERALYZEI^-laitteen avulla. Arvot on esitetty seuraavassa. Ilmeinen kaliumionipitoisuus (mM) jokaiselle arvolle on 35 esitetty suluissa. Nämä ilmeiset pitoisuudet laskettiin käyttäen korrelaatioyhtälöitä veren ja seerumin suhteen.

20 &j627 Näyte- Vertailupitoisuus Vaste testivälineestä, K/S nro (K+) (mM) Veri Seerumi 5 1 4,40 1,484 (3,91) 2,043 (4,00) 2 3,80 1,399 (3,59) 1,977 (3,71) 3 3, 85 1,536 (4,12) 2,190 (4,65) 4 3,80 1,525 (4,07) 2,046 (4.02) 10 5 3,65 1,444 (3,76) 1,992 (3,78) 6 3,55 1,380 (3,51) 2,020 (3,90) 7 3, 55 1,451 (3,71) 1,854 (3, 17) 15 8 3,85 1,585 (4,31) 2,004 (3,83) 9 3,90 1,433 (3,72) 1,964 (3,65) 10 3,85 1,303 (3,21) 1,949 (3,59) 20 11 4,25 1,456 (3,81) 2^079 (4,16) 12 4,00 1,391 (3.,55) 1,944 (3,57) 13 4,35 1,731 (4,87) 2,162 (4,53) • · • V: oc 14. 4,65 1,734 (4,88) 2,270 (5,01)

• · · * J

• * 5 ’·· 15 4,25 1,679 (4,67) 2,074 (4,14) • · • · · • · · 9 ·

Verelle korrelaatioyhtälö on: :Y: K/S = 0,258 [K+] + 0,474; [K+] = K/S ~ °:474· 30 0,258 . regressiokerroin = 0,653 keskivirhe = 0.10 K/S • · · * 9 9· '·’ ' Seerumille: 9 O·: K/S = 0,226 [K+] + 1,138; [K+] = § 22'^%

*:*: 35 regressiokerroin = 0,713 .·. : keskivirhe = 0,076 K/S

2i 85627

Tuloksista ilmenee hyvä korrelaatio kaliumionin pitoisuuksien sekä veressä että seerumissa mitattuna tes-tivälineen avulla ja liekkifotometrisesti mitattujen arvojen välillä 3-5 mM olevalla kaliumin kriittisellä pi-5 toisuusalueella.

5.2 Natriumkloridin lisäys hematokriittiriip-puvuuden poistamiseksi kokoveren kaliumtestissä

Punaisten verisolujen ottama tilavuusosa veressä on normaalisti 40-42 %. Punaisten verisolujen sisällä ka-10 liumionin normaali pitoisuus on noin 120 mM ja seerumissa se on likimain 4 mM. Siten kaliumin määritys kokoverestä on herkkä punaisten verisolujen erittäin pienelle tuhou-tumisasteelle (hemolyysi).

Vaikka hematokriitti on tavallisesti 40-42 %, voi 15 se olla patologisissa tiloissa alueella 30-70 %. On ha vaittu, että yksikerroksisen kaliumin testivälineen vaste on herkkä hematokriitin arvon suhteen. Tämä voi aiheuttaa virheellisiä mitattuja kaliumionipitoisuuden arvoja. Valmistettiin sarja testivälineitä, joiden kokoonpano oli 20 oleellisesti sama, mutta joissa vaihdeltiin heijastavan kerroksen reagenssiin lisätyn natriumkloridin (NaCl) määrää.

Valmistettiin emulsio öljyfaasista dispergoituna jatkuvaan vesifaasiin, joka sisälsi gelatiinia, voimak-25 kaasti hiertävää emulgointilaitetta käyttäen. Öljynmuo- dostaja oli sama kuin esimerkissä 5.1 käytetty.

Öljyfaasin koostumus oli seuraava:

Kaliumionofori I 120 mM

7-desyyli-MEDPIN 30 mM

30 öljynmuodostaja 0,6 % NPBE loppuosa

Emulsion lopullinen koostumus oli seuraava: öljyfaasi 8,31 % gelatiini 8,31 % 35 polystyreenisulfonihappo 0,0207 %

Tri-Cl-puskuri (pH-arvo 7,5) X

- NaCl esitetty taulukossa 22 85627

Prosenttiluvut ovat painon mukaan tarkasteltavan faasin tilavuusyksikköä kohti. Puskurina käytetyn Tris-kloridin pitoisuus, X, oli välineessä 1 0,2 M; muut tes-tivälineet valmistettiin käyttäen 0,166 M Tris-Cl-pus-5 kuria. Reagenssikerros valettiin 175 mikrometrin märkä-paksuuteen polyesterialustalle. Heijastava kerros sisälsi: titaanidioksidia 19 % gelatiinia 2,75 %

10 Tris-Cl-puskuria (pH-arvo 7,5) X

Triton X-100 0,03 %

NaCl (esitetty taulukossa)

Tris-Cl-puskurin pitoisuus, X, testivälineessä 1 oli 0,1 M; muut testivälineet valmistettiin käyttäen 15 0,062 M Tris-Cl-puskuria. Heijastava kerros levitettiin kuivatulle reagenssikerrokselle 82 mikrometrin märkäpak-suuteen.

NaCl-pitoisuus (M)

Valmiste rreagenssi- rheijastava kaikkiaan* 20 Kerros1 kerros1 10 0 0 2 0,05 0,05 0,05 3 0,15 0,05 0,12 4 0,05 ,5 0,19 Ύ 25 5 0,15 ,5 0,26 ··· * natriumkloridin kokonaispitoisuus on laskettu lisäämällä yhteen suolapitoisuus jokaisessa kerroksessa " yhtälöstä:

Kokonaismäärä = Γreagenssikerros! +rheiiastava kerrosl ::: 30 (reagenssikerros + heijastava kerros)paksuus jolloin pitoisuus reagenssikerroksessa saadaan kertomalla •:··· reagenssikerroksen paksuus natriumkloridipitoisuudella tässä kerroksessa ja pitoisuus heijastavassa kerroksessa saadaan kertomalla heijastavan kerroksen paksuus natrium-35 kloridipitoisuudella heijastavassa kerroksessa.

23 8 5627

Valmistettiin testivälineitä ja mitattiin kalium-ionivaste, kuten edellä on esitetty. Valmistettiin muuttuvan hematokriittiarvon omaavia näytteitä. Suuren hema-tokriittiarvon omaava näyte (noin 60 %) muodostettiin 5 linkoamalla varovasti ja poistamalla hieman seerumia.

Valmistettiin ryhmä näytteitä, joissa kaliumionipitoisuus oli sama, mutta hematokriittiarvo vaihteli, lisäämällä takaisin eri määriä samasta yksilöstä saatua seerumia.

Näytteiden analyysi käyttäen viittä testiväli-10 ainekokoonpanoa osoitti, että jos käytetään vähemmän kuin noin 0,1 M natriumkloridia, kaliumionivaste pienenee hematokriittiarvon kasvaessa, kun taas liian suurella natriumkloridipitoisuudella vaste kasvaa. Natriumkloridin noin 0,1 - 0,2 M oleva kokonaislisäys tekee testivälineen 15 oleellisesti riippumattomaksi hematokriittiarvosta. Nämä tulokset on esitetty taulukossa 3. Natriumkloridin molaa-rinen kokonaispitoisuus testivälineen koostumuksessa on esitetty jokaiselle vasteen käyrälle.

5.3 Monikerroksinen kalsiumin testiväline 20 Monikerroksinen testiväline ultrasuodatettavan kalsiumin määritystä varten voidaan muodostaa kolmesta kerroksesta, jotka ovat reagenssikerros, heijastava ker- . . ros ja himmentävä kerros.

**; Näiden kerrosten koostumukset voivat olla seuraa- 25 vat:

Reagenssikerros: öljy 1,25 g V*: gelatiini 1 g

Tris-puskuri (100 mM, pH-arvo 8) 8 g 30 TritorPX-100 0,05 ml

NaDDBS 0,05 ml

Heijastava kerros: gelatiini (10 paino/tilav.-% 60 ml tris-puskurissa) *.**: titaanidioksidia 36 g 35 natriumheksametafosfaatti 0,1 g .·! : Tritoii® X-100 1 ml .[..I NaDDBS 0,25 ml 24 8 5 627

Himmentävä kerros: hiilimusta 15 g gelatiini (10 paino/tilav.-% tris-puskurissa) 60 ml

NaDDBS 0,5 ml 5 tislattua vettä 30 ml

Reagenssikerroksessa käytetty öljy sisältää 0,1 g kalsiumionoforia I, 0,05 g 7-desyyli-MEDPIN:iä ja 5 ml NPOE:ta. Käytettyä hiilimustaa myy Degussa Corp., Teter-boro, N.J. kauppanimellä DERUSSOL Z35. Öljy ja reagenssi-10 kerroksen loppuosa levitetään läpinäkyvälle muovialus- talle Meyer-tangon avulla 171,45 mikrometrin märkäpaksuu-teen ja sen annetaan kuivua.

Heijastava kerros valmistetaan sekoittamalla edel-läesitetyt aineosat keskenään ja levittämällä seosta kui-15 vatulle reagenssikerrokselle 91,44 mikrometrin märkäpak-suuteen.

Täten muodostettu kaksikerroksinen testiväline kuivataan jälleen. Testivälinettä voidaan tällä kohtaa käyttää seerumin kalsiumionipitoisuuden määritykseen.

20 Himmentävä kerros muodostetaan sitten sekoittamal la edellämainitut aineosat keskenään ja levittämällä sitä kuivatun kaksikerroksisen välineen heijastavalle kerrokselle 32 mikrometrin märkäpaksuuteen. Mukavuussyistä mo- . . nikerroksinen testiväline asennetaan lujalle tukialus- * ; 25 talle kuten läpinäkyvälle polystyreenille, mikä sallii • » * ·:·* visuaalisen tai kojeellisen määrityksen laitteen levitys- : *' puolen vastakkaiselta puolelta. Tuettua testivälinettä • · V*: kutsutaan joskus "testilaitteeksi". Käytettäessä yksi tippa (noin 50 mikrolitraa) näytettä (joko kokoverta tai :Y: 30 seerumia) levitetään himmentävälle kerrokselle. Värinmuo- dostus voidaan havaita läpinäkyvän alustan lävitse ja verrata sopivaan värikarttaan tai edullisesti luetaan heijastus arvolla 640 nm (nanometriä) Arne s SERALYZEI@ • · · heijastusfotometrin avulla.

25 65627 5.4 Magnesiumin testiväline

Reagenssikerros magnesiumionin määritystä varten voidaan valmistaa seuraavasti. Valmistetaan liuos, joka sisältää 2,5 g magnesiumioniforia (N, N'-diheptyyli-Ν,Ν’-5 dimetyyli-1,4-butaanidiamidia, myy Fluka Chemical Co.), 0,050 g 7-desyyli-MEDPIN:iä ja 2,5 g NPOErta. Valmistetaan emulsio 1,25 grammasta tätä liuosta hydrofiilisel-le kantajalle. Hydrofiilinen kantaja sisältää: gelatiinia 1,00 g 10 Tris-puskuria (100 mM, pH-arvo 8,5) 8,00 g

Tritori® X-100 0,05 ml

NaDDBS 0,05 ml

Emulsiota levitetään muovialustalle kuten polyesterille 6,35 mikrometrin paksuuteen ja kuivataan.

15 Täten muodostetun reagenssikerroksen oletetaan an tavan hyvän vasteen magnesiumionille. Jos kalsiumionin häiritsevä vaikutus on mahdollista, sopiva määrä EGTA-ma-teriaalia voidaan lisätä hydrofiilisen kantajan kanssa mahdollisen kalsiumionin sitomiseksi selektiivisesti 20 näytteessä. Kliinisille seeruminäytteille 2-3 mM EGTA-ma-teriaalia on sopiva.

Heijastava kerros ja haluttaessa himmentävä kerros voidaan lisätä, kuten esimerkissä 5.3 on esitetty, monikerroksisen laitteen muodostamiseksi, joka muodostaa vas-25 teen magnesiumionille.

5.5 Ultrasuodatettavan kalsiumin testiväline

Monikerroksisen kalvon käyttö *- Kantaliuos kalvoa varten valmistetaan käyttäen :V: 8,55 g 5-prosenttisen vinylideenikloridin ja 95 prosent- 30 tisen vinyylikloridin kopolymeeriä (VdC/VC), 21,45 g di-etyyliftalaattia ja 70 g sykloheksanonia. Valmistetaan kalvo, joka sisältää:

Kalvon kertaliuosta 1 g 7-desyyli-MedPIN 10 g 35 Kalsiumionofori I 4 mg .·. Tritor^ X-100 (1 % asetonissa) 0,05 ml 26 8 5 62 7

Kalvo levitetään vetoterän avulla noin 0,0254 cm paksuuteen ja kuivataan.

Valmistetaan titaanidioksidi/gelatiini-seos käyttäen 60 ml 10-prosenttista gelatiinia TAPSO-puskurissa 5 (100 mM, pH-arvo 7,4), 18 g titaanidioksidia, 0,13 g nat- riumheksametafosfaattia, 0,25 ml natriumdodesyyli-bentseenisulfonaattia (NaDDBS), 0,4 ml Tritoi^ X-100 ja 0,1 ml Makon 6. Seos homogenisoidaan Waring-sekoittimessa ja levitetään kuivatun VdC/VC-kalvon pinnalle 0,0915 mm 10 märkäpaksuuteen heijastavan kerroksen muodostamiseksi.

Haluttaessa hiilimustakerros voidaan levittää Ti02-gelatiinikerroksen päälle. Tämä kerros on valmistettu homogenisoidusta seoksesta, joka sisältää 15 g Derus-sol Z35, 58 ml gelatiinia (10-prosenttinen vedessä), 15 0,86 ml NaDDBS ja 32 ml vettä. Märkäpaksuus oli noin 32 mikrometriä.

Tämän koostumuksen avulla voidaan määrittää vapaa kalsiumpitoisuus joko seerumissa tai kokoveressä. Näyte-tippa pannaan kalvon hiilimustapinnalle. Proteiiniin si-20 dottu kalsium ei voi läpäistä gelatiinikerrosta ja vain ultrasuodatettava kalsium läpäisee sen aiheuttaen värin kehittymisen.

Ilmeisesti useita muita modifikaatioita ja muunnoksia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön hengestä ja 25 alueesta.

Claims (10)

1. 27 85627
2. 1. Testiväline ionin läsnäolon määrittämiseksi vesipitoisessa testinäytteessä, tunnettu siitä, 5 että se käsittää (a) reagenssikerroksen, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat (i) oleellisesti ei-polaarinen, huokoseton kan-tajamatriisi, johon on lisätty ionoforia, joka pystyy 10 muodostamaan kompleksin määrätyn, määritettävän ionin ja neutraalin ilmaisuaineen kanssa, jossa on dissosioituva protoni, joka protoni pystyy dissosioitumaan ilmaisuaineen vuorovaikutuksessa ionoforin ja kationin kompleksin kanssa muodostaen havaittavan vasteen; ja 15 (ii) hydrofiilinen kantajamatriisi, johon on li sätty hydrofobisen apuaineen hienojakoisia pallosia, jotka palloset sisältävät ionoforia, joka pystyy muodostamaan kompleksin määritettävän, määrätyn ionin ja neutraalin ilmaisuaineen kanssa, jossa ilmaisuaineessa on 20 dissosioituva protoni, joka protoni pystyy dissosioitumaan ilmaisuaineen vuorovaikutuksessa ionoforin ja kationin kompleksin kanssa muodostaen havaittavan vasteen; ja (b) heijastavan kerroksen, joka on sijoitettu rea- * : : 25 genssikerroksen päälle laminaarisesti sen kanssa ja joka heijastava kerros sisältää yhtä tai useampaa materiaalia, joka vaikuttaa taustana havaittavan vasteen määrittämisen helpottamiseksi reagenssikerroksessa; ja haluttaessa (c) himmentävän kerroksen laminaarisessa suhteessa 30 heijastavan kerroksen kanssa ja sijoitettuna heijastavan kerroksen päälle, joka himmentävä kerros sisältää osasia, jotka muodostavat himmeän ulkonäön kerrokseen.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen testivälineen käyttö kaliumionin määritystä varten.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monikerroksinen 28 8 5 62 7 testiväline, tunnettu siitä, että reagenssiker- ros on hydrofiilinen kantajamatriisi, johon on lisätty hydrofobisen apuaineen hienojakoisia pallosia ja häiritsevästi vaikuttavan aineen poistavaa ainetta, joka pystyy 5 vuorovaikutukseen häiritsevien ionien kanssa, on lisätty hydrofiiliseen kantajaan.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monikerroksinen testiväline, tunnettu siitä, että reagenssikerros on ei-polaarista, huokosetonta kantajamatriisia, johon 10 matriisiin on lisätty valonsirontaosasia.
6. 5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen monikerroksinen testiväline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää hydrofiilista polymeeriä joko heijastavassa kerroksessa, himmentävässä kerroksessa tai molem- 15 missä.
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää puskuroivaa ainetta jossakin tai kaikissa näistä kerroksista.
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen monikerroksinen testiväline, tunnettu siitä, että näyte on ko-koverta ja että se lisäksi sisältää natriumkloridia, jota on lisätty johonkin tai kaikkiin näistä kerroksista mukaanluettuna hydrofiilinen polymeeri hematokriittiriip- 25 pumattomuuden saamiseksi ionimäärityksessä. . 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen monikerroksinen testiväline, tunnettu siitä, että lisätyn nat-riumkloridin kokonaispitoisuus on 0,1 - 0,2 molaarinen.
9. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukaisen monikerroksisen 30 testivälineen käyttö kaliumionin määrityksessä.
10. 10. Patenttivaatimuksen 5 mukaisen monikerroksisen testivälineen käyttö ultrasuodatettavan kalsiumionin mää- . rityksessä. 29 85627