DK168925B1 - Flerlagsprøvemateriale til bestemmelse af tilstedeværelse af en ion i en vandig analyseprøve - Google Patents

Description

i DK 168925 B1

Den foreliggende opfindelse angår et flerlagsprøvemateriale til bestemmelse af tilstedeværelse af en ion i en vandig analyseprøve, hvilket materiale omfatter (a) et reagenslag valgt blandt 5 (i) en i det væsentlige ikke-polær, ikke-porøs bærermatrix, hvori der er inkorporeret en ionofor, der kan danne et kompleks med en specifik ion, der skal bestemmes, og et neutralt meddelerstof med en dissocierbar 10 proton, som kan dissociere efter meddeler stoffets samvirken med komplekset af iono-foren og ionen til frembringelse af et detekterbart respons, og (ii) en hydrofil bærermatrix, hvori der er 15 inkorporeret findelte småkugler af et hydrofobt bærerstof, idet småkuglerne indeholder en ionofor, der kan danne et kompleks med en specifik ion, der skal bestemmes, og et neutralt meddelerstof 20 med en dissocierbar proton, der kan dis- sociere efter meddelerstoffets samvirken med komplekset af ionoforen og ionen, så at der frembringes et detekterbart respons, (b) et reflekterende lag anbragt oven på reagens- 25 laget og i laminært forhold dertil, idet det reflekterende lag omfatter et eller flere materialer, der fungerer som en baggrund for at lette bestemmelsen af et detekterbart respons i reagenslaget, og eventuelt 30 (c) et opacificerende lag i laminært forhold til det reflekterende lag, idet det opacificerende lag indeholder partikler, der meddeler laget et uigennemsigtigt udseende, og dette prøvemateriale er ifølge opfindelsen ejendom-35 meligt ved, at det yderligere indeholder natriumchlorid inkorporeret i et af lagene til opnåelse af hæmatokrit- DK 168925 B1 2 uafhængighed ved ionbestemmelsen.

Ved anvendelse af dette prøvemateriale opnås de ønskede resultater kort tid efter kontakt med en vandig analyseprøve. Besværligt, kostbart elektronisk udstyr, 5 såsom ion-specifikke elektroder, flammefotometre og atom-absorptionsspektrofotometre, er unødvendigt.

Et flerlagssystem til ionbestemmelse kan med fordel anvendes til at måle ionindholdet i stærkt farvede væsker. Således er flerlagssystemet særlig anvendeligt til 10 målinger på helblod. Flerlagssystemet er særegent derved,, at det kan anvendes til at skaffe oplysning om ultrafil-trerbart eller "frit" calcium og til bestemmelse af serum- kaliumniveauer ved hjælp af en helblodprøve uden interferens på grund af lysede blodlegemer.

15 Selv om det er kaliumionindholdet i serum, som udgør en afgørende klinisk indikation for mange tilstande, der fører til muskelirritabilitet og ekscitatoriske ændringer af myocardiefunktionen, blandt andre, ville det være nemmest at anvende en prøve helblod og elimine-20 re fraskillelsen af blodlegemer fra serummet før måling. Imidlertid indeholder blodlegemer store mængder kaliumion, og hvis de lyses under målingen, ville det føre til grove fejl i de rapporterede værdier. Derfor vil en anordning til helblod, der kan måle serumkalium, og som 25 er uafhængigt af "hæmatokrit" eller blodlegemeindhold i blodet, medføre en fordel, som ikke forefindes med de nuværende kaliumionprøver.

Fremgangsmåder til bestemmelse af ioner i opløsning omfatter flammefotometri, atomabsorptionsfotometri 30 og ion-specifikke elektroder. Analysestrimmelsystemer er omtalt i EP-A2-125.554, EP-A2-125.555, EP-A2-153.641 og i EP-patentskrift nr. 41.175. Foretrukne meddelerstoffer er omtalt i patentskrifterne nr. 4.540.520 og 4.552.697.

Flerlagssystemer til bestemmelse af analytter ved 35 analyttens kemiske reaktion med komponenter i reagenslaget er kendt (jf. f.eks. US patentskrift nr. 3.992.158. I US

DK 168925 B1 3 patentskrift nr. 4.356.149 omtales et samlet flerlagselement til kemisk analyse af blod, hvori reagenslaget er sammensat af et hydrofilt bindemiddel og fine hydrofobe partikler, der er dispergeret i bindemidlet, og som in-5 deholder det reagens, der er i stand til at give et farve-skift med den komponent, der analyseres. Det ovennævnte US patentskrift nr. 4.356.149 har som formål at eliminere ekstra lag, der er nødvendiggjort af uforligelige reagenskomponenter. Patentskriftet omhandler kun bestemmelse af 10 en neutral analyt med en reaktion, der kræver fraskillelse. af uforligelige reagenskomponenter. US patentskrift nr. 4.255.384 angår et integreret flerlagselement til kemisk analyse af blod.

Opfindelsen vil nu blive beskrevet i forbindelse 15 med tegningen, på hvilken fig. 1 som diagram viser et flerlagsprøvemateriale, der er særligt egnet til bestemmelser på helblod, fig. la viser en understøttet trelagsanordning, og fig.

Ib viser en understøttet tolagsanordning. Figurerne vil 20 senere blive detaljeret beskrevet.

Fig. 2 viser data for en flerlagsanordning angivet i eksempel 1. Den grafiske fremstilling viser tilsyneladende millimolær kaliumionkoncentration [K+] bestemt med prøvematerialer ifølge opfindelsen 25 sammenlignet med millimolær [K+] opnået med den sammenlignede f1ammefotometrimetode. Fig. 2a viser serumdata, og fig. 2b viser helblodsdata.

Fig. 3 viser nedgangen i hæmatokritafhængighed i en helblodskaliumbestemmelse, når der inkorpore-30 res natriumchlorid i flerlagsprøvematerialet. Kurven viser data, der fås som anført i eksempel 1.

Opfindelsen er baseret på, at man har fundet frem til et flerlagsprøveraateriale til påvisning af tilstedeværelse af en ion i en vandig analyseprøve og til 35 bestemmelse af dens koncentration. Flerlagsanordningen foretrækkes til bestemmelse af koncentrationen af kat- + ± -J-_L +-f- + ioner såsom K , Na , Ca , Mg og Li i helblodprøver· DK 168925 B1 4

Flerlagsanordningen omfatter som nævnt mindst ét reagenslag og et reflekterende lag og omfatter eventuelt også et lag, der gør uigennemsigtig, og en transparent understøtning.

Reagenslaget i flerlagsprøvematerialet omfatter 5 enten en hydrofil bærematrix, hvori der er inkorporeret findelte småkugler af et hydrofobt bærestof, og disse små-kugler indeholder to hovedbestanddele: en ionofor, der er i stand til at danne et kompleks med en specifik ion, der skal bestemmes, og et meddelerstof, der er i stand til at 10 samvirke med komplekset bestående af ionoforen og ionen, så at der produceres en påviselig reaktion, såsom en ændring i eller fremkomst af farve eller fluorescens, eller en hovedsagelig ikke-polær, ikke-porøs bærematrix, hvori der er inkorporeret en ionofor og en meddeler med de oven-15 for beskrevne karakteristika. Til bestemmelse af kationer foretrækkes en neutral meddeler med en dissocierbar proton, som er i stand til at dissociere ved samvirken mellem meddeleren og komplekset bestående af ionoforen og kationen, så at der fremkommer en påviselig reaktion.

20 Tilføjelsen af det reflekterende lag og eventuelt det lag, der gør uigennemsigtig, med et ikke-porøst, ikke-polært reagenslag tillader tilføjelse af sådanne komponenter som en puffer og et intérferensfjernende stof. Tilføjelsen af pufferen tillader ionbestemmelse med en upufret 25 ufortyndet prøve. Et interferensfjernende stof kan kompleksbindes med en interfererende ion, hvilket tillader større selektivitet og præcision.

En foretrukken udførelsesform er et flerlags -prøvemateriale til helblodskalium, hvori der er inkor-30 poreret tilstrækkeligt natriumchlorid i et lag i flerlagsmaterialet til at tilvejebringe hæmatokrituaf-hængighed.

Flerlagssystemet foretrækkes til bestemmelser på helblod, da elektrolytkoncentrationen kan bestem-35 mes kolorimetrisk uden vask eller aftørring af anordningen.

DK 168925 B1 5

O

De følgende definitioner er anført for at tydeliggøre den foreliggende opfindelses omfang og for at muliggøre dens udarbejdelse og anvendelse.

Udtrykket "ionofor" omfatter molekyler, der 5 selektivt kan danne et kompleks med en bestemt ion i et ikke-polært miljø, så at andre i det væsentlige udeluk kes. Således bindes den cycliske polyether 2,3-naphtho--1,4,7,10,13-pentaoxacyclopentadeca-2-en (undertiden kendt som 2,3-naptho-15-krone-5 og her kaldet kaliumio-10 nofor I) selektivt til kaliumioner, så at der dannes et kationisk kompleks. Omfattet af udtrykket er coronan-der, såsom kroneethere, cryptander, podander og ionoforer af den antibiotiske type, såsom valinomycin og makrote-tralid-actiner.

-i5 Et "meddelerstof" er et, der kan samvirke med et ionofor/ion-kompleks, så at der frembringes en ændring i eller fremkomst af farve eller en anden påviselig reaktion. Foretrukne meddelere er neutrale forbindelser med en dissocierbar proton, som er i stand til at disso-20 ciere efter samvirken mellem meddeler og ionofor/ion--kompleks til frembringelse af en påviselig reaktion.

Kår meddeleren mister en proton, bliver den ladet og bevirker en ændring i elektronfordeling. Ændringen i e-lektronfordeling frembringer en påviselig reaktion.

25 Udtrykket "meddelerstof" omfatter phenoliske forbindelser, såsom p-nitrophenol, og naphtholer, som er forholdsvis farveløse i ikke-ioniseret tilstand, men som farves ved ionisering, og fluorescerende forbindelser, som frembringer mere eller mindre fluorescens efter en ændring 30 i elektronfordeling. Meddelerstoffet kan også være et stof, der udløser en påviselig reaktion sammen med andre komponenter. Således kan ændringen i elektronfordeling i meddelerstoffet, fremkaldt ved samvirken med komplekset, på sin side lette samspillet mellem meddeler 35 og en anden komponent, som så vil frembringe en påviselig reåktian. Foretrukne meddelere er omtalt i US patentskrifterne nr. 4.540.520 og 4.552.697.

O

DK 168925 B1 6

Ved "samvirken" eller "samspil" skal forstås et hvilket som helst samarbejde mellem et meddelerstof og et ionofor/ion-kompleks, som fører til en påviselig reaktion. Samspillet mellem et ionofor/kation-kompleks 5 pg foretrukne meddelere med en dissocierbariproton vil få meddeleren til at miste en proton, hvorved der frembringes en påviselig reaktion. Et eksempel på, at meddeleren samvirker med komplekset^er det tilfælde, hvor meddeleren ændres af komplekset fra en farveløs til en 10 farvet tilstand, som f.eks. med p-nitrophenol.

Udtrykket "påviselig reaktion" anvendes her som en forandring i eller fremkomst af en parameter i et analysesystem, som kan opfattes, enten ved direkte observation eller ved hjælp af instrumenter, og som er 15 en funktion af tilstedeværelsen af en specifik ion i en vandig analyseprøve. Nogle påviselige reaktioner er ændring i eller fremkomst af farve, fluorescens, reflek-tans, pH, kemiluminiscens og infrarøde spektre.

Udtrykket "lille kugle", som det anvendes her, 20 refererer til sfæriske eller næsten sfæriske kugler eller andre formede partikler af et stof, sådan som de dannes i bifasiske suspensioner eller emulsioner. Når der dannes en olie-i-vand-suspension eller -emulsion, forekommer oliefasen (den hydrofobe) som sfæriske 25 enheder omgivet af en mere eller mindre kontinuerlig vandig fase. Jo mere energi, der tilføres ved dannelse af suspensionen, jo mindre bliver størrelsen af småkug-lerne. På lignende måde kan kuglestørrelsen reguleres ved hjælp af additiver, såsom detergenter og andre emul-30 gerende midler.

Også omfattet af betydningen af udtrykket "lille kugle" er findelte partikler af et faststof. Når således det hydrofobe bærestof er et hydrofobt fast materiale, såsom en polymer, kan det formales eller på an-35 den måde findeles til faststofpartikler.

DK 168925 B1 7 o

Ved udtrykket "hydrofil" skal forstås den e-genskab hos et stof, at det har en kraftig eller udtalt tendens til at binde eller absorbere vand. Omfattet af udtrykket er sådanne materialer, der kvælder eller som 5 danner reversible geler med vand, eller som er fugtelige eller permeerbare med vand, eller som danner vandige opløsninger.

Som udtrykket "hovedsagelig ikke-polær" anvendes her, skal det betyde den egenskab hos et stof, at 10 det ikke udviser et væsentligt dipolmoment eller elektrisk polaritet. Især omfatter det ikke-ioniske stoffer og stoffer, som er dielektriske. Et "hovedsagelig ikke-polært" materiale skal betyde et hydrofobt materiale. At et materiale er hydrofobt, betyder i reglen, 15 at materialet er ikke-blandbart med vand. Med de meddelerstoffer, der fortrinsvis anvendes her, skal hydrofob desuden betyde, at meddelerstoffet, når der ikke forekommer et kompleks af ionofor og ion i det ikke-po-lære (eller hydrofobe) lag, har den protonerede form.

20 Udtrykket "ikke-porøs" skal betyde hovedsage lig uigennemtrængelig for vandstrømmen. En ikke-porøs bærematrix er således en matrix, der udelukker passage af vand, både fra den ene og den anden side. Således vil en polyvinylchloridfilm til de her omhandle-25 de formål blive anset for ikke-porøs.

Udtrykket "hydrofobt bærestof", som det anvendes her, betyder et stof eller stoffer, som kan isolere ionoforen og meddeleren fra den vandige fase, der dannes ved prøvens kontakt med prøveanordningen. Bære-30 stoffet kan således være et faststof eller en væske eller en kombination deraf, forudsat at det forøger iono-for/ion-kompleksets og meddelerens evne til at forekomme sammen i den lille hydrofobe kugle. Anvendelige bærestoffer omfatter højtkogende væsker, såsom nitrophenyl-35 octylether, undertiden kaldet "blødgørere", og polymere, såsom polyvinylchlorid.

DK 168925 B1 8

Et flerlagsprøvemateriale ifølge opfindelsen er sammensat af et reagenslag, der indeholder ionoforen og meddelerstoffet inkorporeret i en bærematrix, og i det mindste ét reflekterende lag i en laminær forbindelse.

5 Reagenslaget og egnede bærematrixer er blevet detaljeret beskrevet i EP-A2-125.554 og EP-A2-125.555. I EP-A2-125.555 beskrives en ikke-porøs, ikke-polær bærematrix, der indeholder en ionofor, der kan samvirke med den pågældende ion, og et passende meddelerstof. Den ikke-porøse, ikke-10 polære bærer omtales her som ,,film,,-systemet. I EP-A2-125.554 beskrives et reagenslag i form af en emulsion, hvor findelte hydrofobe småkugler, der indeholder ionoforen og meddeleren, er inkorporeret i en hydrofil bærematrix.

Denne type reagenslag omtales her som ,,emulsions"-systemet.

15 Til bestemmelse af kationer er foretrukne meddelere neutrale forbindelser, der har en dissocierbar proton, der kan dissociere efter samvirken mellem meddeleren og komplekset bestående ionoforen og kationen, så at der fremkommer en påviselig reaktion. Den foretrukne påviselige 20 reaktion er en farve. Flerlagsprøveanordninger aflæses i reglen gennem en gennemsigtig understøtning ved reflek-tionskoefficientmåling fra den side, der er modsat den, hvorpå prøven er påført.

Yderligere komponenter kan tilføjes til rea-25 genslaget. Lysspredningscentre, der vil blive beskrevet mere detaljeret nedenfor, kan tilsættes til hvert reagens lagsystem. Når reagenslaget er en hydrofil bærer, der indeholder findelte hydrofobe småkugler, udgør den hydrofile bærer en matrix til inkorporering af puffere, 30 natriumchlorid og foretrukne vandopløselige, interferensfjernende stoffer. Imidlertid udgør tilsætningen af det reflekterende lag og eventuelt det opacificerende lag et bærestof for tilsætningen af natriumchlorid og puffer, der ellers kan destabilisere reagenslaget. Når der an-35 vendes et filmsystem, er de yderligere lag nødvendige for at muliggøre inkorporering af disse komponenter i prøveanordningen.

O

DK 168925 B1 9

Lysspredningscentre. Når der anvendes instrumentaflæsning ved reflektionskoefficient, er det en fordel at inkorporere lysspredningscentre i reagenslaget. Anvendelsen af sådanne centre forøger på effektiv måde 5 analysens nøjagtighed ved at reducere virkningen af variationer i den tørre filmtykkelse. Lysspredningscentre kan fremskaffes ved at inkorporere uopløselige uorganiske partikler, såsom titandioxid-partikler eller ækvivalenter dertil, såsom bariumsulfat, calciumcarbonat, 10 magnesiumoxid, aluminiumoxid, zinkoxid, blyoxid, mikro-krystallinsk cellulose eller talkum. Et arbejdsinterval for inkorporering af iitandioxid-partikler går op til ca. 40 vægt% af en overtræksemulsion; et foretrukket interval ligger fra ca. 0,5 til ca. 15 vægt% over-15 træksemulsion til reagenslaget. En partikelstørrelse på under 1 mikron foretrækkes.

Tilsætning af natriumchlorid for at nedsætte hæmatokritafhængighed. Hvis der anvendes en hydrofil bærer med inkorporerede hydrofobe småkugler som reagens-20 lag i en flerlagsprøveanordning til bestemmelse af helblodselektrolyt, kan der inkorporeres natriumchlorid i den hydrofile bærer. Tilsætning af ca. 0,1 til 0,2 molær natriumchlorid har vist sig at være tilstrækkelig til at undgå hæmatokritafhængighed, som ellers ses ved 25 kaliumprøver på helblod. Tilsætningen af salt er særlig fordelagtig i flerlagssystemet, der foretrækkes til helblodsbestemmelser, og vil blive forklaret mere detaljeret nedenfor i beskrivelsen.

Interferens fjernende stof. Legems væsker inde.·-' 30 holder normalt mange kationer, såsom natriumion (Na+), + ++ ++ kaliumion (K ), calciumion (Ca ) og magnesiumion (Mg ).

Selv om ionoforen i reglen vil blive valgt for sin selektivitet for den ønskede analyt-ion, kan tilstedeværelsen af andre kationer i visse tilfælde gribe ind i samspil-35 let mellem ionoforen og den ønskede analyt-ion og nedsætte prøvens nøjagtighed. Således vil natriumionofor I binde natriumion frem for calciumion i et forhold på DK 168925 B1 10 ca. 4:1. I prøver, hvor forholdet mellem natriumion og calciumion er mindre end 4:1, kan det være nødvendigt at forhindre calciumionens samvirken med ionoforen for at sikre det rigtige forhold mellem natriumionkoncentra-5 tion og den påviselige reaktion. For at undgå dette problem kan der anvendes et interferensfjernende stof.

Et interferensfjernende stof kan inkorporeres i den hydrofile matrix eller i de hydrofobe småkugler.

Ved en foretrukken udførelsesform er fjernelsesstoffet 10 udformet til at samvirke med en interfererende kation, så at den holdes i den vandige fase, der dannes ved kon- ' takt med den vandige væskeprøve, eller på anden måde forhindre kationens samvirken med ionoforen i den hydrofobe kugle. Således er ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA) 15 og ethylenglycol-bis(aminoethyl)tetraeddikesyre (EGTA) vandopløselige forbindelser, der danner komplekser med divalente kationer, såsom calciumion. Hvis der inkorporeres EDTA i den hydrofile bærematrix i emulsionsreagenslaget til bestemmelse af natriumion, vil EDTA for-20 trinsvis binde calciumion i en vandig prøve, der indeholder natrium- og calciumioner. Den bundne calciumion vil ikke gribe væsentligt ind i dannelsen af ionofor/na-triumion-komplekset i den hydrofobe kugle. Desuden kan der anvendes ionoforer til at fjerne interfererende kati-25 oner, hvis de er specifikke for den interfererende ion og er vandopløselige eller er modificeret kemisk for at forøge deres vandopløselighed uden at nedsætte deres evne til at samvirke med den interfererende. Således kan natriumionofor III (kemisk navn er anført i forkortelseslisten, og struk-30 turen findes i EP-A2-153.641) modificeres ved tilsætning af opløseliggørende grupper, såsom (-SO3H)-grupper til benzenringene for at forøge dens vandopløselighed, uden at dens evne til at samvirke med natriumion nedsættes.

Andre forbindelser, såsom trans-l,2-diaminocyclohexan-35 Ν,Ν,Ν'Ν’-tetraeddikesyre, kan også anvendes med fordel.

DK 168925 Bl 11 o

Puffer. En puffer eller kombination af puffere kan inkorporeres i emuisionsreagenslagets hydrofile bærematrix. Efter kontakt med en vandig flydende fase, genopløses pufferen i den således dannede vandige fase, 5 idet pH-værdien hæves eller sænkes til det ønskede niveau, for at dannelsen af den påviselige reaktion kan foregå. Med foretrukne meddelere, der er i stand til at miste en dissocierbar proton ved samvirken med iono-for/ion-komplekset, giver pufferen en passende pH-værdi 10 til, at reaktionen kan forløbe.

Passende puffere omfatter, men er ikke begrænset til, bis-[2-hydroxyethyl]imino-tris[hydroxymethyl]-methan, 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan, N,N-bis-(2-hydroxyethyl)glycin, tris(hydroxymethyl)ami-15 no-methan, N-[2-acetamido]-2-iminodieddikesyre, N-2-hy-droxyethylpiperazin-N'-—3-propansulfonsyre, 3-[N-tris-(hydroxyme thyl) methylamino-2-hydroxypropansulf onsyre, tetramethylammoniumborat, 3-(cyclohexylamino)propan-sul-fonsyre og tetramethylammoniumphosphat.

20 Det foretrukne pH-interval afhænger af medde lerstoffet. Derfor bestemmes valg af puffer af det anvendte meddelerstof og i en vis udstrækning af den ønskede påviselige reaktion. Når der således anvendes 7--decyl-MEDPIN som meddeler, ligger det foretrukne pH-in-25 terval fra 6 til 8,5. Når der imidlertid anvendes et meddelerstof med højere pKa for den dissocierbare proton, foretrækkes et højere pH-interval. Når på lignende måde en meddeler med lavere pKa for den dissocierbare proton anvendes, vil et lavere pH-interval være at 30 foretrække. Når den påviselige reaktion er en farveændring, kan pufferen påvirke graden af en sådan påviselig reaktion, og der kan vælges en særlig puffer med henblik på optimering af farveintensiteten. Således ligger det anvendelige pH-interval for meddeleren 7-decyl-35 MEDPIN fra ca. 6 til ca. 8,5, hvor farveændringen sker fra orange til blå. Et højere pH, pH 8,5-10, giver nuancer af mørkeblåt, som er vanskelige at skelne visuelt, og et

O

DK 168925 B1 12 lavere pH, pH 5-6, giver nuancer af bleggult, der også er vanskelige at skelne visuelt. Begge pH-ekstremer kan anvendes i forbindelse med instrumental analyse, men den bedste instrumentale præcision opnås ved et pH-interval fra 5 ca. 6 til ca. 8,5. Bestemmelsen af en passende pH-værdi sker ved rutinemæssige laboratorieforsøg.

Et flerlagsprøvemateriale til bestemmelse af en ion i en vandig væskeprøve kan fremstilles ved at tilsætte et reflekterende lag og eventuelt et lag, der gør ui-10 gennemsigtig (opacificerende), oven på reagenslagat.

Det reflekterende lag indeholder et materiale eller en blanding af materialer i form af uopløselige uorganiske partikler, der udgør en baggrund, der hjælpper brugeren til at bestemme den påviselige reaktion i 15 anordningens reagenslag. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen til helblodsbestemmelser er formålet med det reflekterende lag at afskærme farven Oå de røde blodlegemer i prøven, der analyseres, fra den farveændring, der skal iagttages af brugeren. En foretruk-20 ken forbindelse til afskærmning er titandioxid. Men der kan anvendes andre materialer, f.eks. bariumsulfat, calciumcarbonat, aluminiumoxid, magnesiumoxid, zinkoxid, blyoxid, talkum og mikrokrystallinsk cellulose. Et sådant materiale er indeholdt i det reflekterende lag i en 25 mængde fra ca. 5 til ca, 40 vægt%, fortrinsvis ' 15-40'vægt?., baseret på det reflekterende lags samlede vægt. Sådanne materialer har i reglen en partikelstørrelse på mindre end 1 mikron. Materialerne har i reglen i tør overtræk-ningsvægt på 2,5-75 g/m , fortrinsvis 10-25 g/m .

30 Foruden de uorganiske stoffer kan det reflekte rende lag indeholde et hydrofilt stof såsom gelatine.

Det hydrofile stof indeholdes i en mængde på 2-8 vægt%, fortrinsvis 2,5-5,5 vægt%^baseret på det reflekterende lags samlede vægt. Egnede hydrofile stoffer omfatter 35 gelatine, agarose, poly(vinylalkohol), poly(propylenimin), copolymere af acrylsyre, carragen og alginsyre. I reglen er resten af overtræksopløsningen til det reflekterende lag vand.

DK 168925 B1 13

Desuden kan det reflekterende lag indeholde ét eller flere fugtemidler (overfladeaktive stoffer) og/eller ét eller flere suspenderingsmidler. Et eksempel, der ikke skal fortolkes begrænsende, på et fugtemiddel, der kan 5 anvendes i det reflekterende lag, er "Triton"® X-100, et polyoxyethylen-overfladeaktivt stof, der fås hos Sigma Chemical Co. Til en prøve, der indebærer bestemmelse af kalium, kan der således anvendes 0-0,5 vægt% "Triton"® X-100.

10 Ikke-begrænsende eksempler på suspenderings midler til brug i det reflekterende lag omfatter gelatine, alginat og hydrofile urethaner.

Det reflekterende lag har en tør overtræks- 2 2 vægt i intervallet 2,5-75 g/m , fortrinsvis 10-25 g/m .

15 Ved fremstilling af et flerlagsprøvemateriale overtrækkes det reflekterende lag på det tørrede reagenslag og tørres ved ca. 40°C i ca. 10 minutter.

Ved en foretrukken udførelsesform påføres et opacificerende lag oven på det reflekterende lag, dvs.

20 det opacificerende lag er valgfrit. Det opacificerende lag har en vådlagstykkelse (tykkelse, når det påføres) på 10-50 mikron, fortrinsvis 15-35 mikron. Det opacificerende lag indeholder hovedsagelig inaktive partikler for at give det lag, der suspenderes i en hydrofil forbindelse, 25 et uigennemsigtigt udseende. Den anvendte hydrofile forbindelse og suspenderingsmidler kan være dem, der er beskrevet til det reflekterende lag. Sådanne partikler kan f.eks. være kønrøgpartikler.

Yderligere lag i flerlagsanordningen kan even-30 tuelt omfatte en puffer, et interferensfjernende stof og/ . eller natriumchlorid som tidligere beskrevet for reagenslaget. Præpufring gør. at prøveanordningen eller flerlagsmaterialet kan anvendes med upufrede og ufortyndede sera eller helblod. Selv om puffer kan tilsættes til 35 den hydrofile matrix sammen med emuisionsreagenslaget, udgør tilstedeværelsen af yderligere lag et bærestof DK 168925 B1 14 for mere pufferkapacitet, som ellers kan have en negativ virkning på emulsionen, hvis den inkorporeres direkte i reagenslaget.

Et flerlagsmateriale, der omfatter et opacifi-5 cerende lag, fremstilles ved at overtrække det opacificerende lag Oven på det reflekterende laq oq tørre hele materialet igen ved ca. 40°C i ca. 10 minutter.

Når flerlagssystemet anvendes, anbringes en prøve oven på det øverste lag, dvs. det reflekterende 10 lag, hvis der ikke benyttes noget opacificerende lag, eller på det opacificerende lag; og den påviselige reaktion, i reglen farve, af reagenslaget efter et vist tidsrum aflæses nedefra. Flerlagssysternet kan overtrækkes på eller fikseres på en transparent understøtning.

15 Anvendelige transparente understøtninger omfatter polystyren, polyester, polycarbonat, celluloseacetat og po-lyethylenterephthaiat. Polyethylenterephthaiat eller celluloseacetat, der er modtagelige for gelatine, foretrækkes .

20 En flerlagsanordning 12 ifølge en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse er vist i fig. la og lb. Som vist i fig. Ib er flerlagsanordningen 12 sammensat af et transparent støttelag 14, på hvis overside der er påført et reagenslag 16. Et reflek-25 terende lag 18 er påført oven på reagenslaget 16. Som vist i fig. la kan et opacificerende lag 20 eventuelt være anbragt oven på det reflekterende lag 18. En prøve 22 anbringes oven på det opacificerende lag 20. Farveud-vikling kan aflæses fra bunden af laget 14 med det blotte 30 øje eller ved hjælp af et instrument, såsom et "Seralyzer"® refleksfotometer (Ames Division, Miles Laboratories, Inc.), som er blevet indrettet til ionbestemmelse.

Tilstedeværelsen af det tilføjede reflekterende lag eller reflekterende og opacificerende lag 35 forsegler effektivt reagenslaget fra de ydre omgivelser. Følgelig beskytter flerlagsanordningen reagenserne på den måde, at uden det tilføjede reflekterende lag eller DK 168925 B1 15 de tilføjede reflekterende og opacificerende lag ville reagenserne være blotlagt og derfor udsat for beskadigelse på grund af mekanisk kontakt. Tilstedeværelsen af det tilføjede reflekterende lag eller de tilføjede 5 reflekterende og opacificerende lag tjener også til at forlænge den dannede farves stabilitet.

Anvendelse af det reflekterende lag eller det reflekterende og det opacificerende lag sørger også for en blokering af celler, proteiner og andre makromoleky-10 ler og tillader således anvendelse af helblod, uden at prøveanordningen skal vaskes eller aftørres. Desuden måler en flerlagsprøveanordning for calcium ultra-filtrerbart calcium på grund af disse lags filtreringsevne, da bundet calcium ikke ville nå reagenslaget. Calciumprø-15 veanordninger med et enkelt lag eller flere lag kan anvendes til at skaffe oplysning om samlet calcium i forhold til ultrafiltrerbart calcium i en analyseprøve.

Arbejds- og foretrukne koncentrationsintervaller for et flerlagsprøvemateriale med hensyn til kalium-20 ion er anført nedenfor. Foretrukne intervaller er anført for bestemmelsen af serumkalium ved reflektans på et Ames (r'· "Seralyzer"^ refleksfotometer. Disse koncentrationer kan benyttes som udgangspunkt til bestemmelse af anvendelige koncentrationsintervaller til bestemmelse af an-25 dre ioner med andre ionoforer og meddelere. Koncentrationerne af ionofor og meddeler refererer til koncentration i det anvendte organiske opløsningsmiddelvolumen, og andre koncentrationer er defineret som gram pr. 100 g opløsning. Reagenslagets tykkelse til flerlagsprøvema-30 terialet kan være fra ca. 25 mikron til ca. 500 mikron, idet en foretrukket vådtykkelse er fra ca. 150 mikron til ca. 200 mikron.

35 o DK 168925 B1 16

Arbejdsinterval Foretrukket I. Reagenslag

Filmtykkelse 25-500^,u 150-200^,u

Ionofor 10-500 nøl 80-160 mM

5 Meddeler 10-120 mK 30-60 mM

Lysspredningscentre (evt.) 0-40% 0,5-15%

Hvis reagenslaget er en hydrofil bærer indeholdende hydrofobe småkugler: 10 Hydrofobt bærestof 5-15% 7-12%

Hydrofil bærer 5-15% 7-12%

Puffer (evt.) 0-0,5 molær 0,2-0,5 molær

Interferens f j ernelses- middel (evt.) 0-30 g/liter 10-20 g/liter 15 Fugtemiddel (evt.) 0-3 g/liter 1-2 g/liter

Natriumchlorid (evt.) 0-0,6 molær 0,5-0,15 molær

Hvis reagenslaget er en ikke-porøs, ikke-po-lær bærematrix: 20 Arbejdsinterval Foretrukket

Polymer 5-25% væ/væ 5-25% væ/væ

Hydrofobt bærestof 8-50% væ/væ 8-50% væ/væ II. Eventuelle flerlag 25 1. Reflekterende lag

Titandioxid 5-40% 15-40%

Gelatine 1-6% 2-6%

Natriumchlorid 0-0,6 molær 0,06-0,5 molær (evt.) 30 Overtrækstørvægt 2,5-75 g/m2 10-25 g/m2 2. Opacificerende lag Kønrøg 3-30% 7-15%

Gelatine 1,0-12% 1,5-6%

Natriumchlorid 0-1 molær 0-0,6 molær 35 Filmtykkelse (våd) 10-50^u 15-35^

O

17 DK 168925 B1

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret ved hjælp af eksempler, hvori der anvendes følgende betegnelser. Firkantet parentes Π anvendes til at betegne ionkoncentration i mmol pr. liter i de lineære 5 regressionsligninger. Alle koncentrationer i procent er givet i vægt pr. dl, med mindre andet er anført.

+ + +

Ioner: Na = natriumion, K = kaliumion, Li = lithium-

I “f'-f· I

ion, Ca = calciumion og Mg = magnesiumion.

Forkortelser for kemiske komponenter, der an-10 vendes, er anført nedenfor. Ionoforbetegnelserne er kun anvendt for nemheds skyld. Navnet er i reglen baseret på den vigtigste ion, som ionoforen anvendes til at bestemme. Imidlertid svarer ionoforerne i reglen i varierende mindre grad til andre ioner. Strukturerne for de 15 nævnte ionoforer kan findes i EP-A2-153.641 .

Ionoforer

Natriumionofor I 1,1,1-tris-[11-(21-oxa-41-oxo- -51-aza-51-methyl)-dodecanyl]-2o propan

Natriumionofor II N^'-dibenzyl-N^'-fdiphenyl-l^- -phenylendioxydiacetamid

Natriumionofor III 6,7,9,10,18,19-hexahydro-17-n- -butyl-dibenzo[b,k],[1,4,7,10,-25 13]pentaoxacyclohexadecan-18- -yl-oxyeddikesyre

Kaliumionofor I 2,3-naphthol-l,4,7,10,13-penta- oxacyclopentadeca-2-en

Calciumionofor I diethyl-Ν,Ν'-[(4R,5R)-4,5-di- 30 methyl-1,8-dioxo-3,6-dioxaocta- methylen]bis(12-methylaminodo-decanoat)

Hydrofobt bærestof NPOE 2-nitrophenyloctylether 35 NPBE 2-nitrophenylbutylether

Meddelerstof 7-decyl MEDPIN 7-(n-decyl)-2-methyl-4-(31,5'- -dichlorphen-4'-on)-indonaphthol DK 168925 B1

O

18

Forskelligt EDTA Ethylendiamintetraeddikesyre

Tris-Cl Tris(hydroxymethyl)aminomethan- -hydrochlorid 5 EGTA ethylenglycol-bis(aminoethyl)te- traeddikesyre (G. Fredrick Smith Chemical Co., Columbus, Ohio) n "Triton" X-100 polyethylenglycol-p-isooctylphen- ylether (Sigma Chemical Co., St.

10 Louis, MO.)

NaDDBS Natriumdodecylbenzensulfonat

Eksempel 1

Flerlagskalium - korrelation af serum- og helblodsmålin-15 ger med sammenligningsmetoden

Kaliumionkoncentrationen bestemt ud fra en prøveanordning med to lag sammenlignes med kaliumbestemmelsen ved en sammenlignende flammefotometermetode. Der tages blod fra 15 normale individer, og kaliumkoncentrationen 20 bestemmes med anordningen ved hjælp af reflektionskoeffici-enten målt i 155-180 sekunder. Serum fremstilles ved centrifugering og analyseres med anordningen på samme måde. Alikvote mængder analyseres også‘véd sammenligningsflammef otometermetoden .

25 Reagenslaget fremstilles ved at emulgere det hydrofobe bærestof, NPBE, indeholdende 120 mmolær kalium-ionofor I og 30 mmolær 7-decyl-MEDPIN med en hydrofil bærer og ved hjælp af butanan-dicarboxylsyre, dodecyl-4,4'--[(1-methylethyliden)di-4,1-cyclohexandiyl]ester, der er 30 omtalt her, som oliedanner. Emulsionen overtrækkes og tørres, før det reflekterende lag påføres.

35 DK 168925 B1

O

19

Reagenslaq: Hydrofobt bærestof 8,3 % gelatine 8,3 ’ % oliedanner 0,042% polystyrensulphonat 0,02 % 5 Tris-Cl (pH 7,5) 0,2 molær Vådtykkelse: 375 mikron

Reflekterende lag:gelatine 2,750% titandioxid 19 % Vådtykkelse: 82 mikron 10

De anførte procentindhold er gram pr. 100 ml af overtræksopløsningen. Der fremstilles prøveanordninger med en transparent understøtning, og reflektionskoefficienten måles gennem understøtningen med en "Seralyzer"®.

15 Dataene er vist nedenfor. Den tilsyneladende kaliumion-koncentration (mmolær) for hvert datapunkt ses i parentes.

20 25 30 35

O

20 DK 168925 B1

Disse tilsyneladende koncentrationer beregnes ved hjælp af korrelationsligninger for blod og serum.

Prøve Sammenl.[K+] Reaktion Anordn.

5 nr._koncent.mmolær fra blod_K/S serum 1 4,40 1, 484 (3,-91) 2,043 (4, 00) 2 3,80 1, 399 (3, 59) 1 ,977 (3,71) 3 3,85 1, 536 (4, 12) 2 ,190 (4,65) 10 4 3,80 1, 525 (4, 07) 2 ,046 (4,02) 5 3,65 1, 444 (3,76) 1,992 (3,78) 6 3,55 1, 380 (3 ,51) 2,020 (3,90) 15 7 3 ,55 1,451 (3, 71) 1,854 (3,17) 8 3 ,85 1,585 (4, 31) 2,004 (3,83) 9 3,90 1,433 (3, 72) 1,964 (3,65) 20 1 0 3 , 85 1,3 0 3 ( 3 , 21) 1 ,9 4 9 ( 3,59) 11 4 ,25 1,456 (3, 81) 2,079 (4,16) 12 4,00 1,391 (3,55) 1,944 (3,57) „ 13 4,35 1,731 (4, 87) 2,162 (4,53) 14 4 ,65 1,734 (4,88) 2,270 (5,01) 15 4,25 1,679 (4, 67) 2 ,074 (4,14) 30 For blod er korrelationsligningen: K/S = 0,258 [K+] + 0,474; [K+] = K·^-"-^^4-4

Regressionskoefficient = 0,653

Standardfejl = 0,10 K/S 35

O

21 DK 168925 B1

For serum: K/S = 0/226 [K+] + 1,138; [K+] =

Regressionskoefficient = 0,713 5 Standardfejl = 0,076 K/S

Resultaterne viser god korrelation mellem kali umionkoncentrationen i både blod og serum målt med prøveanordningen og den, der måles ved flammefotometri*in-10 den for det kritiske koncentrationsinterval på 3-5 mmolær. kalium.

Eksempel 2

Tilsætning ifølcre opfindelsen af natriumchlorid for at 15 undgå en helblodskaliumorøves hæmatokritafhænqiqhed

Den volumendel af blodvolumenet, der optages af røde blodlegemer, hæmatokrit, er i reglen 40-42%. Inde i de røde blodlegemer er den normale kaliumionkoncen-tration ca. 120 mmolær, hvorimod den i serummet er ca.

20 4 mmolær. Derfor er en kaliumbestemmelse på helblod følsom over for en meget ringe ødelæggelse af røde blodlegemer (hæmolyse).

Medens hæmatokritten i reglen er 40-42%, kan den ved patologiske tilstande ligge fra 30 til 70%. Det 25 har vist sig, at reaktionen hos en enkeltlags kaliumprø-veanordning er følsom overfor hæmatokrittens værdi. Dette kunne føre til fejlagtige måleværdier for kaliumion-koncentration. Der blev fremstillet en række anordninger med en i det væsentlige fælles formel, men varieren-30 de med hensyn til den mængde natriumchlorid (NaCl), der er tilsat til reagenset eller til de reflekterende lag.

En emulsion af en oliefase dispergeret i en kontinuerlig vandig fase indeholdende gelatine fremstilles ved hjælp af et emulgeringsmiddel med høj forskyd-35 ning. Den anvendte oliedanner er den samme som anvendes i eksempel 1.

DK 168925 B1

O

22

Oliefasens sammensætning er:

Kaliumionofor I 120 mmolær 7-Decyl-MEDPIN 30 mmolær

Oliedanner 0,6% 5 NPBE resten

Emulsionens slutsammensætning er:

Oliefase 8,31%

Gelatine 8,31% 10 Polystyrensulfonsyre 0,0207%

Tris-Cl-puffer, pH 7,5 X

NaCl (vist i tabel)

De anførte procentdele er vægt pr. volumen 15 af den pågældende fase. Koncentrationen af Tris-chlo-rid, der anvendes som puffer, X, i anordning 1 er 0,2 molær; de øvrige anordninger fremstilles med 0,166 mmolær Tris-Cl-puffer. Reagenslaget støbes til en vådtykkelse på 175 mikron på et polyesterunderlag. Det re-20 flekterende lag indeholder

Titandioxid 19 %

Gelatine 2,75%

Tris-Cl-puffer,

pH 7,5 X

25 "Triton"® X-100 0,03%

NaCl (vist i tabel)

Koncentrationen af Tris-Cl-puffer, X, der anvendes i anordning 1, er 0,1 molær; de øvrige anordnin-30 ger fremstilles med 0,062 molær Tris-Cl-puffer. Det reflekterende lag spredes derpå over det tørrede reagenslag til en vådtykkelse på 82 mikron.

35 DK 168925 B1 23 o

Koncentration NaCl (molær)

Tilbe- [Reagens] [Reflekterende] redning_lag_lag_Samlet 10 0 0 5 2 0,05 0,05 0,05 3 0,15 0,05 0,12 4 0,05 0,5 0,19 5 0,15 0,5 0,26 -i o * Den samlede natriumchloridkoncentration beregnes ved at addere saltkoncentrationen i hvert lag ud fra ligningen: ς , _[reagens] + [reflekterende]_ ain e (reagens- + reflekterende lag) tykkelse 15 hvor koncentrationen i reagenslaget findes ved at multiplicere reagenslagets tykkelse med natriumchloridkoncen-trationen i dette lag, og koncentrationen i det reflekterende lag findes ved at multiplicere det reflekterende lags tykkelse med natriumchloridkoncentrationen i det re-2o flekterende lag.

Der fremstilles prøveanordninger, og kaliumion-reaktionen måles som tidligere beskrevet. Der fremstilles prøver med varierende hæmatokrit. En prøve med høj hæmatokrit (ca. 60%) dannes ved mild centrifugering og 25 fjernelse af noget serum. En række prøver med samme ka-liumionkoncentration, men varierende hæmatokrit,fremstilles ved atter at tilsætte forskellige mængder af det autologe serum.

Analyse af prøverne med de fem anordningsti1-30 beredninger viser, at med mindre end ca. 0,1 molær natri-umchlorid aftager kaliumionreaktionen med stigende hæmatokrit, og med for meget natriumchlorid stiger reaktionen. Tilsætning af fra ca. 0,1 til ca. 0,2 molær natriumchlorid ialt giver en prøveanordning, der i det 35 væsentlige er uafhængig af hæmatokrit. Disse resultater ses i fig. 3. Den samlede molære natriumchloridkoncen-

O

24 DK 168925 B1 \ tration i de tilberedte prøveanordninger er markeret for hver reaktionskurve.

Eksempel 3 5 Flerlags-calciumprøveanordning

En flerlagsprøveanordning til bestemmelse af ultrafiltrerbar- calciumion kan fremstilles med tre lag: et reagenslag, et reflekterende lag og et opacificerende lag.

10 Lagenes sammensætning er følgende:

Reagenslag: Olie 1,25 g

Gelatine 1. g

Tris puffer (100 mmolær 15 pH 8) 8. g "Triton'® X-100 0,05 ml

NaDDBS 0,05 ml

Reflekterende lag: Gelatine (10% væ/vo i

Tris-puffer) 60 ml 20 Titandioxid 36 g

Natriumhexametaphosphat 0,10 g "Triton"® X-100 1 ml

NaDDBS 0,25 ml .

Opacificerende lag: Kønrøg 15 g 25 Gelatine (10% væ/vo i

Tris-puffer) 60 ml

NaDDBS 0,5 ml

Destilleret vand 30 ml 30 Den olie, der anvendes i reagenslaget, er sam mensat af 0,1 g calciumionofor I, 0,05 g 7-decyl-MEDPIN og 5 ml NPOE. Den kønrøg, der anvendes, fås hos Degus-sa Corp., Teterboro, N.J. med varemærket "Derussol"® Z35. Olien og resten af reagenslaget udbredes på en transpa- 35 rent plastunderstøtning med en Meyer's stang til en vådtykkelse på 6,75 mil (171,45 mikron) og får lov at tørre.

O

DK 168925 B1 25

Det reflekterende lag fremstilles ved at blande de ovennævnte bestanddele og brede blandingen ud over det tørrede reagenslag til en vådtykkelse på 91,44 mikron.

De således dannede to-lagsprøvematerialer tør-5 res igen. Prøvematerialerne kan anvendes på dette tidspunkt til serumcalciumionbestemmelse.

Derpå påføres det opacificerende lag ved at blande de ovennævnte bestanddele og brede dem ud på det reflekterende lag på det tørrede to-lagsmateriale til en 10 vådtykkelse på 32 mikron. Por nemheds skyld monteres flerlagsprøvematerialet på en stiv understøtningsdel, såsom transparent polystyren, der tillader enten visuel eller instrumental bestemmelse fra den side af materialet, der ligger modsat prøvepåføringen. Det understøt-15 tede prøvemateriale kaldes undertiden en "prøveanordning".

Når det skal anvendes påføres en dråbe (ca. 50 mikroli-ter) af prøven (enten helblod eller serum) på det opacificerende lag. Farveudviklingen kan ses gennem den transparente understøtning og sammenlignes med et passen-20 de farvekort eller aflæses fortrinsvis ved hjælp af re-flektionskoefficient ved 640 nm med Ames "Seralyzer'*'^ reflektionskoefficientfotometer.

Eksempel 4 25 Magnesiumprøveanordning

Et reagenslag til bestemmelse af magnesiumion kan fremstilles på følgende måde. Der fremstilles en opløsning indeholdende 2,5 g magnesiumionofor (Ν,Ν'-dihep-tyl-N,N'-dimethyl-l,4-butandiamid), der fås hos Pluka 30 Chemical Co., 0,050 g 7-decyl-MEDPIN og 2,5 g NPOE. Der fremstilles en emulsion af 1,25 g af denne opløsning i en hydrofil bærer. Den hydrofile bærer er sammensat af: 35

O

26 DK 168925 B1

Gelatine 1,00 g

Tris-puffer (100 mmolær, pH 8,5) 8,00 g "Triton1® X-100 0,05 ml

NaDDBS 0,05 ml 5

Emulsionen bredes ud på en plastunderstøtning, såsom en polyester, med en tykkelse på 6,35 mikron og tørres.

Således dannede reagenslag forventes at producere god reaktion over for magnesiumion. Hvis calci-umioninterferens er mulig, kan der inkorporeres et passende niveau EGTA i den hydrofile bærer for selektivt at binde eventuel calciumion i prøven. Til kliniske serumprøver vil 2-3 mmolær EGTA være passende.

15

Et reflektionskoefficientlag og eventuelt et opacificerende lag kan tilføjes som vist i eksempel 3, så at der fås en flerlagsanordning, der reagerer på magnes iumion.

20

Eksempel 5

Prøvemateriale til ultrafiltrerbart calcium ved hjælp af en flerlagsfilm

Der fremstilles en filmstamopløsning ved hjælp 25 af 8,55 g 5%'å vinylidenchlorid/95% vinylchlorid-copoly-mer (VdC/VC) , 21,45 g diethylphthaiat og 70 g cyclohexa-non. Der fremstilles en film indeholdende

Filmstamopløsning 1 g 7-Decyl-MEDPIN 10 mg 30 Calciumionofor I 4 mg "Triton® X-100 (1% i acetone) 0,0 5 ml

Filmen bredes med en rakel ud til en vådfilm-35 tykkelse på ca. 0,0254 cm og tørres.

Der fremstilles en titandioxid/gelatine- DK 168925 Bl 27 o -blanding ved hjælp af 60 ml 10%'s gelatine i TAPSO-puf-fer (100 mmolær, pH 7,4), 18 g Ti02, 0,13 g natriumhe-xametaphosphat, 0,25 ml natriumdodecylbenzensulfonat (NaDDBS), 0,4 ml "Triton"® X-100 og 0,1 ml Makon 6.

5 Blandingen homogeniseres i en Waring-blender og udbredes foroven på den tørrede VdC/VC-film med en vådtykkelse på 0,00915 cm til dannelse af det reflekterende lag.

Eventuelt kan der spredes et lag af kønrøg foroven på Ti0o/gelatine-laget. Dette lag fremstilles af ^ (S) 10 en homogeniseret blanding bestående af 15 g "Derussol"^ Z35, 58 ml gelatine (10% i vand), 0,86 ml NaDDBS og 32 ml vand. Vådtykkelsen er ca. 0,032 mm.

Med denne tilberedning kan den frie calciumkoncentration i enten serum eller helblod bestemmes. En 15 dråbe prøve anbringes på filmens kønrøgside. Proteinbundet calcium kan ikke passere gennem gelatinelaget, det kan kun ultrafiltrerbart calcium, og derved fremkaldes farveudviklingen.

20 25 30 35

Claims (6)

1. Flerlagsprøvemateriale til bestemmelse af tilstedeværelse af en ion i en vandig analyseprøve, hvilket materiale omfatter 5 (a) et reagenslag valgt blandt (i) en i det væsentlige ikke-polær, ikke-porøs bærermatrix, hvori der er inkorporeret en ionofor, der kan danne et kompleks med en specifik ion, der skal bestemmes, og et neu-10 trait meddelerstof med en dissocierbar proton, som kan dissociere efter meddelerstoffets samvirken med komplekset af ionoforen og ionen til frembringelse af et detekterbart respons, og 15 (ii) en hydrofil bærermatrix, hvori der er inkor poreret findelte småkugler af et hydrofobt bærerstof, idet småkuglerne indeholder en ionofor, der kan danne et kompleks med en specifik ion, der skal bestemmes, og et neu-20 trait meddelerstof med en dissocierbar proton, der kan dissociere efter meddelerstoffets samvirken med komplekset af ionoforen og ionen, så at der frembringes et detekterbart respons, (b) et reflekterende lag anbragt oven på reagenslaget 25 og i laminært forhold dertil, idet det reflekterende lag omfatter et eller flere materialer, der fungerer som en baggrund for at lette bestemmelsen af et detekterbart respons i reagenslaget, og eventuelt (c) et opacificerende lag i laminært forhold til det 30 reflekterende lag, idet det opacificerende lag inde holder partikler, der meddeler laget et uigennemsigtigt udseende, kendetegnet ved, at prøvematerialet yderligere indeholder natriumchlorid inkorporeret i et af lagene til 35 opnåelse af hæmatokrit-uafhængighed ved ionbestemmelsen.

2. Prøvemateriale ifølge krav 1, kendeteg- DK 168925 B1 net ved, at den totale koncentration af tilsat natrium-chlorid ligger mellem 0,1 og 0,2 molær.

3. Prøvemateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analyseprøven er helblod.

4. Prøvemateriale ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den ion, der bestemmes, er kaliumion.

5. Prøvemateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den ion, der bestemmes, er calciumion.

6. Prøvemateriale ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at det yderligere indeholder puffer i et af lagene.