FI85148B - Foerfarande foer framstaellning av amider av teikoplanfoereningar. - Google Patents

Description

85148

Menetelmä teikoplaniiniyhdisteiden amidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää teikoplaniiniyhdisteiden amidien valmistamiseksi, jolla on seuraava kaava (I) 3f,n 29 ?S6 24 „ 122 80\ 1 II2' 11 ’ ra h J47 0 H Jt 60 H Jit (« f f v> '* 43 |44 45 H0^Xr\’/'0'55j(^12

I OH

OH

jossa R tarkoittaa vetyä tai amiinifunktion suojaryhmää pl / Y tarkoittaa ryhmää -N , jossa '''"'R2 R1 tarkoittaa vetyä, (Cy-Cg)alkyyliä, hydroksi (C2~C4 )al-kyyliä, halogeeni(C2-C4 )alkyyliä, )alkoksi (C2-C4)- alkyyliä, amino(C2-C4)alkyyliä, (Cy-C^) alkyyliamino (C2-C4) -alkyyliä, di(Cy-C4)alkyyliamino(C2-C4)alkyyliä; R2 tarkoittaa vetyä, (Cy-Cg)alkyyliä, hydroksi(C2-C4)alkyyliä, halogeeni(C2-C4)alkyyliä, (Cy-C4)alkoksi(C2-C4)-alkyyliä, typpeä sisältävää 5-6-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka on kokonaan tyydyttynyt ja joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai O, ja jossa yksi rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (Cx-C4)— alkyylisubstituentin ja yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substituentin R5, joka on (Cy-C4)alkyyli, 2 85148 fenyyli-(Cj-C4)alkyyli tai pyridyyli, ja kaksi rengasjäsentä voi mahdollisesti olla sitoutuneena toisiinsa silta-sidoksella, jonka muodostaa (0^-03 )alkyleeniketju; ryhmää alk-W, jossa "alk" tarkoittaa lineaarista, 1-8 hiiliatomia sisältävää alkyleeniketjua, joka mahdollisesti on substituoitu substituentilla, joka on (C^-C^)alkyyli, hyd-roksi(C1-C4)alkyyli, hydroksi, karboksi, aminokarbonyyli, (Ci-C4)alkyyliaminokarbonyyli, di(C^-C^ )alkyyliaminokarbo-nyyli, (C1-C4)alkoksikarbonyyli tai fenyyli(C^-C^)alkoksi-karbonyyli, ja W tarkoittaa karboksia, (C1-C4)alkoksikar-bonyyliä, fenyyli(C^-C^ )alkoksikarbonyyliä, aminokarbonyy-liä, (C1-C4 )alkyyliaminokarbonyyliä, di(C^-C^ )alkyyliami-nokarbonyyliä, pentoosiaminokarbonyyliä, heksoosiaminokar-bonyyliä, ureidoa, guanidinoa, typpeä sisältävää 5-6-jäse-nistä, edellä määriteltyä heterosyklistä rengasta, joka voi olla myös tyydyttymätön, ryhmää, jonka kaava on

-N

\r4 jossa R3 ja R4 tarkoittavat kumpikin, toisistaan riippumatta vetyä, (C^-Cg)alkyyliä, hydroksi(C2-C4)alkyyliä tai halogeeni(C2-C4)alkyyliä, tai R4 tarkoittaa fenyylimetyy-lioksikarbonyyliä ja R3 tarkoittaa vetyä tai ryhmää, jonka kaava on

V

-K / v; Re jossa R®, R^ ja R® tarkoittavat jokainen, toisistaan riip-: pumatta (C^-C^ )alkyyliä, il 3 85148 tai R1 ja R2 yhdessä viereisen typpiatomin kanssa tarkoittavat tyydyttynyttä, 5-7-jäsenistä heterosyklistä rengasta, jossa voi mahdollisesti olla yksi (C^-C^jalkyylisubs-tituentti rengashiiliatomissa ja joka voi sisältää toisen heteroryhmän, joka on -0-, -S- tai -NR5-, jossa R5 tarkoittaa samaa kuin edellä; A tarkoittaa vetyä tai N[(C10-C11)alifaattinen]asyyli-3-D-2-deoksi-2-aminoglukopyranosyyliä, B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli~3-D-2-deoksi-2-aminoglu-kopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai a-D-mannopyranosyyliä; sillä edellytyksellä, että B tarkoittaa vetyä vain kun A ja M samanaikaisesti ovat vety ja M tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, ja edelleen sillä edellytyksellä, että kun W tarkoittaa /R3 ®/R6 7 ryhmää -N. , ryhmää -N -— R , XR8 ureidoa, guanidinoa tai typpeä sisältävää, 5-6-jäsenistä, edellä määriteltyä heterosyklistä rengasta sitoutuen suoraan "alk'Osaan sidoksella, joka lähtee rengastyppiatomis-ta, lineaarisen alkyleenin "alk'Osan täytyy sisältää ainakin kaksi hiiliatomia, ja sen additiosuolojen valmistamiseksi.

Teikoplaniini on kansainvälinen, ei-rekisteröity nimi (INN) antibiootille, jota aikaisemmin kutsuttiin teikomysiiniksi ja joka saadaan viljelemällä kantaa Actinoplanes teichomy-ceticus nov.sp. ATCC 31121 viljelualustalla, joka sisältää 4 85148 assimiloituvat hiili- ja typpilähteet ja epäorgaanisia suoloja (katso US-patentti 4,239,751). Edellä mainitussa patentissa kuvatun menetelmän mukaisesti erotetusta käy-misliemestä otetaan talteen antibioottinen kompleksi, joka sisältää teikomysiini Α3:η, A2:n ja A3:n, uuttamalla sopivalla, veteen liukenemattomalla, orgaanisella liuottimena ja saostamalla uuttoliuottimesta tavanomaisten menetelmien mukaan.

Teikomysiini A2, joka on eristetyn antibioottisen kompleksin päätekijä, erotetaan sen jälkeen muista tekijöistä pylväskromatografisesti Sephadex®-pylväässä. GB-patentti-hakemusjulkaisussa n:o 2121401 esitetään, että antibioottinen teikomysiini A2 on itse asiasa viiden, läheistä sukua olevan, samanaikaisesti muodostuneen pääkomponentin seos.

Viimeisimpien rakennetutkimusten mukaan on mahdollista esittää teikoplaniini A2:n (aikaisemmin nimitetty teikomysiini A2) pääkomponentit, 1, 2, 3, 4 ja 5 edellä esitetyllä kaavalla (I), jossa R on vety, Y on hydroksi, A tarkoittaa N[(C^q-C]^ )alifaattinen asyyli]-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, B tarkoittaa N-asetyyli-3-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, M tarkoittaa a-D-manno-pyranosyyliä.

Erityisesti teikoplaniini A2:n komponentti l:ssä [(cio-C31)alifaattinen asyyli]-substituentti tarkoittaa Z-deke-noyyliä, teikomysiini A2:n komponentti 2:ssa se tarkoittaa 8-metyylinonanoyyliä, teikoplaniini A2:n komponentti 3:ssa se tarkoittaa dekanoyyliä, teikoplaniini A2:n komponentti 4:ssä se tarkoittaa 8-metyylidekanoyyliä, teikoplaniini A2:n komponentti 5:ssä se tarkoittaa 9-metyylidekanoyyliä.

Kaikki sokeriosat, silloin kun niitä esiintyy, ovat sitoutuneet teikoplaniininukleoniin O-glykosidisilla sidoksilla.

5 85148

Lisäksi on havaittu, että on mahdollista muuttaa teikopla-niini, sen puhdas tekijä tai mainittujen tekijöiden mikä tahansa seos missä tahansa suhteessa yksittäisiksi antibi-oottituotteiksi yhden tai kahden sokeriosan selektiivisellä hydrolyysillä. Nämä on merkitty antibiootti L 17054 ja antibiootti L 17046 ja kuvattu EP-hakemusjulkaisussa n:o 119575 ja vastaavasti EP-hakemusjulkaisussa n:o 119574. Edulliset hydrolyysiolosuhteet antibiootti L 17054:n tuottamiseksi ovat: 0,5 N kloorivetyhappo lämpötilassa 70°C - 90°C ja aika, joka on tavallisesti 15-90 minuuttia.

Antibiootti L 17054 on esitetty edellä olevalla kaavalla (I), jossa Y on hydroksi, R ja A tarkoittavat vetyä, B tarkoittaa N-asetyyli^-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, M tarkoittaa α-D-mannopyranosyyliä, jossa sokeriosat ovat liittyneet peptidiseen nukleoniin O-glykosidisella sidoksella .

Edulliset hydrolyysiolosuhteet antibiootti L 17046:n valmistamiseksi ovat: 1-3 N kloorivetyhappo, lämpötila 50°C -90°C ja aika, joka tavallisesti on 30-60 minuuttia.

Antibiootti L 17046 on esitetty edellä olevalla kaavalla (I), jossa Y on hydroksi, R, A ja M tarkoittavat vetyatomeja ja B on N-asetyyli-3-D-2-deoksi-2-amino-glukopyrano-syyli, jossa sokeriosa on liittynyt peptidiseen nukleoniin O-glykosidisella sidoksella.

Teikoplaniiniyhdisteiden kaikkien sokeriosien täydellinen, selektiivinen poislohkaisu tuottaa aglykonimolekyylin, jota kutsutaan antibiootti L 17392 tai deglukoteikoplaniini ja joka on esitetty edellä olevalla kaavalla (I), jossa Y on hydroksi ja R, A, B ja M tarkoittavat jokainen, toisistaan riippumatta, vetyatomia. Tämä selektiivinen hydrolyy-simenetelmä on esitetty EP-patenttihakemuksessa No 84114558.4.

6 85148

Yhdiste, jolla on sama rakennekaava, on esitetty EP- hakemusjulkaisussa No 0090578 ja nimetty antibiootti A 41030 tekijä B.

Tämä yhdiste saadaan mikrobiologisella menetelmällä, jossa kantaa Streptomyces virginiae NRRL 12525 tai Streptomyces virginiae NRRL 15156 viljellään sopivassa kasvualustassa, eristetään, puhdistetaan ja erotetaan antibiootin A 41030 komponenteiksi, antibioottikompelksi sisältää ainakin 7 tekijää, mukaan luettuna antibiootti A 41030 tekijä B.

Kaikki edellä mainitut yhdisteet, ts. teikoplaniini, tei-koplaniini A2 kompleksi, teikoplaniini A2 komponentti 1, teikoplaniini A2 komponentti 2, teikoplaniini A2 komponentti 3, teikoplaniini A2 komponentti 4, teikoplaniini A2 komponentti 5, antibiootti L 17054, antibiootti L 17046, antibiootti L 17392 ja mikä tahansa näiden seos, missä tahansa suhteessa, ovat sopivia lähtöaineita keksinnön mukaisten amidijohdannaisten valmistamiseksi.

Tässä selityksessä "teikoplaniiniyhdistettä" tai "teiko-planiinilähtöainetta" käytetään tarkoitettaessa mitä tahansa edellä mainittua lähtöainetta, ts. teikoplaniinia, joka saadaan US-patentin 4,239,751 mukaan, sen mitä tahansa edelleen puhdistettua muotoa, teikoplaniini A2 kompleksia, edellä esitetyn kaavan (I) mukaista yhdsitettä, jossa R on vety, Y on hydroksi, A tarkoittaa vetyä tai N[(cio-Cn)~ alifaattinen asyyli]-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyy-liä, B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-3-D-2-deoksi-2-ami-no-glukopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai a-D-mannopy-ranosyyliä, sillä edellytyksellä, että B voi tarkoittaa vetyä vain kun A ja M ovat samanaikaisesti vety ja M voi tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, sen suolaa tai sen seoksia missä tahansa suhteessa.

Tässä selityksessä käytettäessä käsitettä "alkyyli" joko yksinään tai yhdessä muiden substituenttien kanssa, tar- 7 85148 koitetaan sekä suoria että haarautuneita hiilivetyryhmiä: erityisesti "(C^-Cg)alkyyli" tarkoittaa suoraa tai haarautunutta, alifaattista, 1-6 hiiliatomia sisältävää hiilive-tyketjua, kuten metyyliä, etyyliä, propyyliä, 1-metyyli-etyyliä, butyyliä, 1-metyylipropyyliä, 1,1-dimetyylietyy-liä, pentyyliä, 1-metyylibutyyliä, 2-metyylibutyyliä, 1-heksyyliä, 2-heksyyliä, 3-heksyyliä, 3,3-dimetyyli-l-but-yyliä, 4-metyyli-l-pentyyliä ja 3-metyyli-l-pentyyliä; samalla tavalla "(C1-C4)alkyyli" tarkoittaa suoraa tai haarautunutta, 1-4 hiiliatomia sisältävää hiilivetyketjua, kuten edellä esimerkkeinä mainittuja alkyylejä, joissa on 1- 4 hiiliatomia.

Käsite "halogeeni" tarkoittaa halogeeniatomia, joka on fluori, kloori, bromi tai jodi.

Pentoosiaminokarbonyyli-substituentin pentoosiamino-osat ovat 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)- joko D- tai L- tai D,L-pentoosiryhmiä, joko anomeerisessa muodossa tai ano-meerisena seoksena, kuten 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)-riboosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)arabinoosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)ksyloosi ja 2- tai 3-amino(2- tai d-deoksi)lyksoosi.

Heksoosiaminokarbonyyli-substituentin heksoosiamino-osat ovat joko D- tai L- tai (D,L-) 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)heksoosiryhmiä joko anomeerisessa muodossa tai anomeerisessa seoksessa, kuten 2- tai 3-amino(2- tai 3-deok-si)alloosi, 2- tai 3-amino(2- tai deoksi)altroosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)glukoosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)mannoosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)guloosi, 2- tai 3-amino(2- tai 3-deoksi)galaktoosi ja 3- tai 4-ami-no(2- tai 3-deoksi)fruttofuranoosi.

Tässä hakemuksessa määritellyt "lineaariset, 1-8 hiiliatomia sisältävät alkyleeniketjut" ovat suoria alkyleeniket- 8 85148 juja, joissa on 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8 hiiliatomia. Tyypillisiä esimerkkejä 1-8 hiiliatomia sisältävistä, lineaarisista alkyleeniketjuista ovat: -ch2- -ch2-ch2- -ch2-ch2-ch2- -ch2-ch2-ch2-ch2- -ch2-ch2-ch2-ch2-ch2- -ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2- ~ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2- -ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2- Näissä lineaarisissa alkyleeniketjuissa voi mahdollisesti olla substituentteja, kuten edellä esitettiin.

Maininta "typpeä sisältävä, 5-6-jäseninen heterosyklinen rengas, joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai 0" tarkoittaa tämän keksinnön mukaisesti tyydyt-tymättömiä, osittain tyydyttyneitä ja kokonaan tyydyttyneitä rengassysteemejä, kuten pyridyyliä, pyrimidinyyliä, pyratsinyyliä, pyrrolidinyyliä, piperidinyyliä, piperatsi-nyyliä, oksatsolyyliä, oksatsolinyyliä, oksatsolidinyyliä, pyratsolinyyliä, pyratsolidinyyliä, tiatsolidinyyliä, mor-folinyyliä, tiomorfolinyyliä, pyrrolyyliä, pyrrolinyyliä, imidatsolyyliä, imidatsolidinyyliä, tiadiatsolyyliä, oksa-diatsolyyliä ja tetratsolyyliä.

Mainitussa "typpeä sisältävässä, 5-6-jäsenisessä hetrosyk-lisessä renkaassa" yksi rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää edellä määritellyn (C1-C4)alkyylisubstituentin.

Kun edellä määritelty "typpeä sisältävä, 5-6-jäseninen heterosyklinen rengas" on kokonaan tyydyttynyt rengas, tämä määritelmä käsittää myös sellaiset heterosykliset renkaat, 9 85148 joissa kaksi rengasjäsentä ovat sitoutuneet toisiinsa sil-tasidoksella, jonka muodostaa 1-3 hiiliatomia käsittävä alkyleeniketju. Esimerkkejä mainituista siltasidoksen sisältävistä renkaista ovat seuraavat: l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani, 1,4-diatsabisyklo[3.2.2]no-naani, l-atsabisyklo[2.2.1]heptaani, l-atsabisyklo[3.2.1]-oktaani, 8-atsabisyklo[3.2.1]oktaani, 3-atsabisyklo[3.2.l]-nonaani, 9-atsabisyklo[3.3.1]nonaani, 3,8-diatsabisyklo-[3.2.1]oktaani, 2-atsabisyklo[2.2.1]heptaani, 2-atsabisyk-lo[2.2.2]oktaani, 3-atsabisyklo[3.2.2]nonaani.

Näin ollen tämän keksinnön mukaiset tyypilliset yhdisteet ovat sellaisia, joilla on edellä esitetty yleinen kaava, jossa symboli

Rl

-N

r2 tarkoittaa substituenttia, joka on johdettu jostain seu-raavasta osata: l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-3-amiini, l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-2-amiini, l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-3-amiini, 6-metyyli l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-3-amiini, N-metyyli l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-3-etaaniamiini, l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-4-amiini, l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-4-amiini, N-metyyli l-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-2-metaaniamiini, l-atsabisyklo[2.2.1]heptaani-3-amiini, l-atsabisyklo[3.2.1]oktaani-3-metaaniamiini, 8-atsabisyklo[3.2.l]oktaani-3-amiini, 8-metyyli 8-atsabisyklo[ 3.2.1 ]oktaani-3-amiini, 8-etyyli 8-atsabisyklo[3.2.1]oktaani-2-metaaniamiini, 10 8 5 148 3-atsabisyklo[3.2.1]oktaani-3-etaaniamiini, 1-atsabisyklo[3.3.1]nonaani-4-amiini, 1- atsabisyklo[3.3.1]nonaani-3-metaaniamiini, 9-atsabisyklo[3.3.1]nonaani-3-amiini, 9-metyyli 2- atsabisyklo[2.2.1]heptaani-5-amiini, 2-metyyli 2-atsabisyklo[2.2.2]oktaani-5-amiini, 2-metyyli

Ilmaisu "tyydyttynyt 5-7-jäseninen heterosyklinen rengas, jossa voi mahdollisesti olla yksi [C-j^-C^j-alkyylisubstitu-entti rengashiiliatomeissa ja joka voi mahdollisesti sisältää jonkin toisen heterosyhmän, joka on -O-, -S- tai -NR5-" tarkoittaa esimerkiksi seuraavia heterosyklisiä ryhmiä: morfolinyyli, piperidinyyli, piperatsinyyli, tio-morfolinyyli, pyratsoliidinyyli, 1,3-oksatsolidinyyli, 1,3-tiatsolidinyyli ja heksahydroatsepinyyli, jotka voivat mahdollisesti olla substituoidut yhdellä (C^-C^)alkyyli-ryhmällä hiilirungossa.

Edullisen, keksinnön mukaisten yhdisteiden ryhmän muodostavat sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R tarkoittaa vetyatomia ja muut substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä.

Toisen edullisen, keksinnön mukaisten yhdisteiden ryhmän muodostavat sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R ja R1 tarkoittavat vetyä ja muut substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä.

Edelleen tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden edullisen ryhmän muodostavat sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R tarkoittaa vetyä ϋ 11 8 5148 Y tarkoittaa ryhmää -N , jossa R 2 R1 tarkoittaa vetyä tai (^-(^ )alkyyliä, R2 tarkoittaa (03^-04 )alkyyliä, typpeä sisältävää 5-6-jä-senistä heterosyklistä rengasta, joka on kokonaan tyydyttynyt ja joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai 0, ja jossa 1 rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (C-L-C4)alkyylisubstituentin ja yksi rengas-typpiatomi voi mahdollisesti olla substituoitu substituen-tilla R5, joka on (C1-C4 )alkyyli , fenyyli (<^-04 ) alkyyli tai pyridyyli, ja kaksi rengasjäsentä voi olla sitoutuneena toisiinsa siltasidoksella, jonka muodostaa 1-3 hiiliatomia sisältävä alkyleeniketju; ryhmää -alk-W-, jossa "alk" tarkoittaa 1-8 hiiliatomia sisältävää lineaarista alkyleeniketjua, joka mahdollisesti on substituoitu substituentilla, joka on (C1-C4)alkyyli, karboksi, aminokarbonyyli, (C1-C4)alkyyliaminokarbonyyli, di (C2-C4)alkyyliaminokarbonyyli, (C1-C4)alkoksikarbonyyli, fenyyli(0^-04)alkoksikarbonyyli, ja W tarkoittaa karboksia, (C1-C4)alkoksikarbonyyliä, fenyyli-(<^-04)alkoksikarbonyy-liä, aminokarbonyyliä, ((^-04)alkyyliaminokarbonyyliä, di(<^-04)alkyyliaminokarbonyyliä, glukoosiaminokarbonyyliä, ureidoa, guanidinoa, typpeä sisältävää 5-6-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka voi olla tyydyttämätön, osittain tyydyttynyt tai kokonaan tyydyttynyt ja joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai 0, ja jossa 1 rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (C1-C4)alkyylisubstituentin ja yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substitentin R5, joka on )alkyyli, fenyyli- (<^-04)alkyyli tai pyridyyli; kokonaan tyydyttynyttä typ- i2 8 514 8 peä sisältävää, 5-6-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka voi sisältää toisen typpiatomin ja jossa 1 rengashiili-atomi voi mahdollisesti sisältää (0]_-04) alkyylisubstituen-tin, yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substituentin R5, joka tarkoittaa (C^-C^)alkyyliä, ja kaksi renkaan jäsentä voi olla sitoutuneet toisiinsa siltasi-doksella, jonka muodostaa 1-3 hiiliatomia sisältävä alky-leeniketju; ryhmää, jonka kaava on ,r3

-N

^^R4 jossa R3 ja R4 tarkoittavat kumpikin, toisistaan riippumatta vetyä, (ci~C4)alkyyliä, hydroksi (C2-C4 )alkyyliä tai halogeeni (C2-C4)alkyyliä, tai R4 tarkoittaa fenyylimetyyli-oksikarbonyyliä ja R3 tarkoittaa vetyä, tai ryhmää, jonka kaava on © R6 / ’'XR7 !8 jossa R6, R7 ja R8 tarkoittavat jokainen, toisistaan riippumatta, (C^-C4)alkyyliä, tai R1 ja R2 yhdessä viereisen typpiatomin kanssa tarkoittavat tyydyttynyttä, 5-7-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka voi mahdollisesti sisältää yhden (C^-C^ )alkyyli-substituentin rengashiiliatomissa ja joka voi sisältää jonkin muun heteroryhmän, joka on -0-, -S- tai -NR5-, jossa R5 tarkoittaa samaa kuin edellä; A tarkoittaa vetyä tai N[(C10_cn)alifaattinen asyyli]-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, l! i3 6 51 4 8 B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-p-D-2-deoksi-2-amino-glu-kopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai a-D-mannopyranosyyliä; sillä edellytyksellä, että B tarkoittaa vetyä vain kun A ja M samanaikaisesti ovat vety ja M tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, ja edelleen sillä edellytyksellä, että kun W tarkoittaa R3 Q)^ ryhmää -N v , ryhmää -N--R , XR4 XR® ureidoa, guanidinoa tai typpeä sisältävää, 5-6-jäsenistä, heterosyklistä, edellä määriteltyä rengasta, liittuen suoraan "alk'Osaan sidoksella, joka lähtee rengastyppiato-mista, lineaarisen alkyleenin "alk"osan täytyy sisältää ainakin kaksi hiiliatomia, ja näiden additiosuolat.

Edelleen edullinen, keksinnön mukaisten yhdisteiden ryhmä sisältää kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R ja R1

O

tarkoittavat vetyä ja R tarkoittaa ryhmää -alk-W, jossa "alk" on lineaarinen 2-6 hiiliatomia sisältävä alkyleeni-ketju, W tarkoittaa pyrrolidinoa, morfolinoa, tiomorfoli-noa, piperidinoa tai piperatsinoa, jotka mahdollisesti on substituoitu N'-typpiatomissa ) alkyyli-, bentsyyli- tai pyridyyliryhmällä, tai W tarkoittaa ryhmää, jonka kaava on -N ^ jossa R3 ja R4 tarkoittavat kumpikin, toisistaan riippumatta, (Cj^-Cg)alkyyliryhmää, ja A, B ja M tarkoittavat samaa kuin edellä, ja näiden happoadditiosuolat.

14 8 5148

Edullisia, keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat myös sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R, R1 , A, B ja M tarkoittavat vetyatomeja ja R2 tarkoittaa ryhmää, jonka kaava on 5 R3 -alk-Ν'; \ 4 jossa "alk" on lineaarinen, 2-6 hiiliatomia sisältävä al- 3 4 kyleeniketju ja R ja R tarkoittavat (C1-Cg)a 1kyyliryhmiä, 10 ja näiden farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditio-suolat.

Eräs toinen keksinnön mukaisten edullisten yhdisteiden ryhmä ovat sellaiset, kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R tarkoittaa vetyä; R tarkoittaa vetyä tai (C,-C.)a 1kyy- 2 1 ^ 15 liä, R tarkoittaa kokonaan tyydyttynyttä, typpeä sisältävää 5-6-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka voi sisältää toisen typpiatomin ja jossa 1 rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (C1-C^)a 1kyylisubstituentin, yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substi-20 tuentin R , joka tarkoittaa (C^-C^)a 1 kyy1iä , ja kaksi ren-gasjäsentä on sitoutunut toisiinsa siltasidoksella, jonka muodostaa 1-3 hiiliatomia sisältävä aikyleeniketju; 2 25 tai R tarkoittaa ryhmää a 1 k -W, jossa alk tarkoittaa 1-3 hiiliatomia sisältävää lineaarista ai ky 1eeniketjua ja W on kokonaan tyydyttynyt, typpeä sisältävä, 5-6-jäseninen heterosyklinen rengas, joka määriteltiin juuri edellä olevassa kappaleessa .

30 Eräs toinen keksinnön mukaisten edullisten yhdisteiden ryhmä on sellainen, jonka yhdisteissä A, B ja M tarkoittavat joko edellä määriteltyjä sokeriosia tai jokainen tarkoittaa samanaikaisesti vetyatomia.

15 851 48

Muita erityisen edullisia yhdisteitä ovat sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa A, B ja M tarkoittavat joko samanaikaisesti edellä määriteltyjä sokeri-osia tai ne tarkoittavat samanaikaisesti vetyatomeja, 5 R tarkoittaa vetyä, ja NR1R2 tarkoittaa ryhmää -HN(alk)W, jossa "ai k" tarkoittaa lineaarista aikyleeniketjua , jossa on 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8 metyleeniyksikköä, ja W tarkoittaa ryhmää, joka on -NH^, -NHCH^ 5 -NHC^, -N(CH3)2, -N(C2Hg)2 tai -N(CH3)(C2Hg) , tai ryhmää

10 -HNCH(C00CH-)(CH9),.NH9, V N-CH0 tai -HN

3 2 4 2 N_/ 3

I I

v N —

Tyypillisiä esimerkkejä keksinnön mukaisista yhdisteistä ovat sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R on vety, A, B ja M tarkoittavat samaa kuin edellä ja 15 R1 ^ R2 tarkoittaa: -NH2 , -NHC4Hg, -NH(CH2)4~0H, -NHCH2COOH, -nhch2cooch2c6h5, -nhch2cooc2h5, -nh-ch2conh2, 20 -nh-ch2-con(c2h5)2, 16 8 5 148 -NH-CH-COOH, -NH-CHCONH2 , -NH-CH-COOC^, COOH C0NHo COOC„Hc Z Z 3 -NHCH(CH_) CONH., -NHCH-(CH-) CONH-, -NHCH(CH-) COOH, 2rn 2 2m 2 2m COOH COOH CON(CH3)2 joissa m tarkoittaa kokonaislukua 1, 2, 3 tai 4, -NH-(CH~) -NH,,, -NH-(CH0) NHCH-, -NH(CH,) -N(CH,),, 2 n 2 2 Π 3 2 Π 32 -NH-(CH2) nN(C2H5)2, -HN(CH2)nN(CH3) (C^) joissa n tarkoittaa 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8, -NH-(CH2)2N(C2H4OH)(C2H4C1); -NH(CH2)2N/TcH2)40h72, -NH(CH2)4N(C2H4C1)2, Θ -NH-(CH2)3N(C4Hg)2, -NH-(CH2)3N(CH3> 3> / / \ / \ -NH(CH)2-N^_ , -NH(CH2)2-N^_J, -NH-(CH2) 2-N ^^ , / \ /“λ -NH(CH_)--N NH, -NH-(CH~)0-N N-CH-, 2 2 \_/ 2 2 \_/ 3

-NH (CH0) ~-N^ ^N-CH0C^H_, -N^ ^N

2 2 2 6 5 W 1 CH2-CH2-CH3 i7 85 1 48 /—\ -NH-CH2-CH-CH2-N(C2H5)2 , -NH-CH2-CH-CH2-CH2-N n-ch3 ch3 c2h5

S- N-N

I I —“

-NH-CH2-CH2-^ n , -NH-CH2-CH2-^ /, -NH-CH2-CH2-l / N

\-/ N

H

-NH-Oi2-CH-CH2-CH2-N(C2H5) , -NH-CH2-C-CH2-N (CH3) 2

OH CH2OH

H

W3 ' -NH-CH2-CH2O ' -NH-CH2-Cn^

in I

C2 5 CH3 / \ -NH-CH2-CH2-CH2-N . > I ' CH3 -N(CH3)2, -N(CH2CH2OH)2, -N(CH2CH2NH2)2, -N(CH2CH2NHCH3)2, 18 85 1 48 -N/CH2CH2N(CH3)2_72* -N(CH3)(CH2CH2NH2), -n<ch3)/Tch2)nhch3_7, -n(ch3)/Tch2)2n(ch3)2_7, -n(c2h5) /Tch2) 2-nhch3_7, -n/ch2ch2ch2n(c2h5) 2J2, (CHj) 4-N(C2H5) 2 ^^(CH2) 4-NH (n-C4H9) -n; -w \ \ (CH2)4-N(C2H5)2 (CH2)4-NH(n-C4H9), -N^ , -NHCH2CH2-N^ ^0, -N^ \, ΓΛ /-λ -N^ ^NH, -NHCH2-CH2-N^ ^N-CH3/ ch3 r\ /n=\ y\ -N^_^N-CH2-C6H5, -N^_/N /) ' ~N\_/N_CH3 CH3 t ^~° /- ΑΛ N -N , -HNCH0CH0-N > ,

)- ' W

-HNr j C H 1

2 5 H

i9 85148 _Τ3 ~ΗΝΥ7ΐ ΥΤι ^Ν^Η3 1Ν<1 ~yn (CH )Ν- Π] Λι jj] K,{J -hnch2^n/

CH -N-CH

| I ’βνυΛί CH2 CH2 CH2 I ) CH2-CH-CH-NH- CH.- N-CH CH-CH-CHo II2 il CH CH-NH- | (CH.) CH-NH- l 3 j CH2- CH-CH2 CH2-CH-CH2

N_N

-HM—itN JA

i

H

20 85148

Keksinnön mukaiset yhdisteet voivat muodostaa suoloja tavanomaisten menetelmien mukaisesti.

Erityisesti sellaiset kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R tarkoittaa vetyä, sekä sellaiset kaavan (I) mukaiset 1 2 5 yhdisteet, joissa ryhmä -NR R sisältää muita amiinifunk-tioita, muodostavat happoadditiosuoloja .

Lisäksi ne keksinnön mukaiset yhdisteet, jotka sisältävät 1 2 happofunktioi ta -NR R -osassa, voivat myös muodostaa emäs-addi tiosuoloja .

10 Yleensä ne keksinnön mukaiset yhdisteet, jotka sisältävät happo- ja emäsfunktiot, voivat muodostaa sisäisiä suoloja. Tämän keksinnön piirissä "sisäiset suolat" on sisällytetty määritelmään "ei-suolan"muodossa olevat yhdisteet.

Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden edullisia additio-15 suoloja ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät happo- ja/tai emäsadd i tiosuolat.

Käsitteellä "farmaseuttisesti hyväksyttävät happo- ja/tai emäsadditiosuolat" tarkoitetaan sellaisia suoloja happojen ja/tai emästen kanssa, jotka biologisesti, valmistuk-20 sei 1isesti ja formulointiteknisesti ovat käyttökelpoisia farmaseuttisessa sovellutuksessa sekä eläimen kasvupro-moottori na .

Tyypillisiä ja sopivia kaavan (I) mukaisten yhdisteiden happoadditiosuoloja ovat suolat, jotka muodostetaan stan-25 dardireaktiol1 a sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen, kuten esimerkiksi kloorivety-, bromivety-, rikki-, fosfori-, etikka-, trifluorietikka-, tri kloori etikka-, meripihka-, sitruuna-, askorbiini-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, kooli-, pamoe-, lima-, glutamiini-, 30 kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-,

II

21 85148 sorbiini-, pikriini-, bentsoe-, kanelihapon ja vastaavien happojen kanssa.

Tyypillisiä esimerkkejä emäksistä ovat: aikaiimetalli-tai maa-alkalimetallihydroksidit, kuten natrium-, kalium-5 ja ka 1 siumhydroksidi; ammoniakki ja orgaaniset, alifaatti-set, alisykliset tai aromaattiset amiinit, kuten metyyli-amiini, dimetyyliamiini, trimetyy1iamiini ja pikoliini.

Kun keksinnön mukaiset yhdisteet sisältävät -NR^R^R^-osan, jossa R^, R^ ja R^ tar-10 koittavat samaa kuin edellä, vastaava anioni on farmaseuttisesti hyväksyttävästä haposta johdettu anioni. Tyypillisiä esimerkkejä mainitusta anionista ovat sellaiset, jotka johdetaan edellä luetelluista hapoista.

Keksinnön mukaisten vapaiden amino- tai ei-suolamuodossa 15 olevien yhdisteiden muuttaminen vastaaviksi additiosuoloik-si ja päinvastoin, t.s. keksinnön mukaisen yhdisteen addi-tiosuolan muuttaminen ei-suolamuodoksi tai vapaaksi amino-muodoksi, ovat alalla tavanomaista tekniikkaa ja kuuluvat myös tämän keksinnön piiriin.

20 Esimerkiksi kaavan (I) mukainen yhdiste voidaan muuttaa vastaavaksi happo- tai emäsadditiosuolaksi liuottamalla ei-suolamuoto vesipitoiseen liuottimeen ja lisäämällä vähäinen molaarinen ylimäärä valittua happoa tai emästä.

Sen jälkeen muodostunut liuos tai suspensio 1yofi1isoidaan 25 toivotun suolan taiteenottamiseksi. Lyofi1isoinnin sijasta eräissä tapauksissa on mahdollista ottaa lopullinen suola talteen uuttamalla orgaanisella liuottimella, konsentroimalla erotettu orgaaninen faasi pieneen tilavuuteen ja seostamalla siten, että lisätään ei-1iuottimia.

30 Siinä tapauksessa, että lopullinen suola on liukenematon orgaaniseen liuottimeen, johon ei-suolamuoto liukenee, se otetaan talteen suodattamalla ei-suolamuodon orgaanisesta 22 85 1 48 liuoksesta, sen jälkeen kun stökiömetrinen määrä tai vähäinen molaarinen ylimäärä valittua happoa tai emästä on lisätty.

Ei-suolamuoto voidaan valmistaa vastaavasta happo- tai 5 emässuolasta liuottamalla vesipitoiseen liuottimeen, joka sen jälkeen neutraloidaan vapaaksi ei-suolamuodoksi. Sen jälkeen tämä otetaan talteen esimerkiksi uuttamalla orgaanisella liuottimella tai se muutetaan toiseksi emäs- tai happoadditiosuolaksi lisäämällä valittua happoa tai emäs-10 tä ja työskentelyä jatketaan edellä esitetyllä tavalla.

Kun neutraloinnin jälkeen on tarpeen suolanpoistaminen voidaan käyttää tavallista suolanpoistomenetelmää.

Esimerkiksi voidaan edullisesti käyttää pyiväskromatogra-fiaa kontrolloidun hiukkaskoon polydekstraanihartseilla 15 (kuten Sephadex L H 20) tai silanoidulla piihappogeeli11ä. Sen jälkeen kun ei-toivotut suolat on eluoitu vesipitoisella liuoksella, toivottu tuote eluoidaan veden ja polaarisen tai ei-polaarisen, orgaanisen liuottimen seoksen lineaarisella gradient!11a tai vaihe-gradientilla, kuten 20 asetonitrii1i/vedel1ä alkaen 50:50 - noin 100 % asetoni t r i i 1 i ä .

Kuten on alalla tunnettua, suolan muodostamista joko farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen (emästen) tai ei-farma seutti sesti hyväksyttävien happojen (emästen) kanssa 25 voidaan käyttää tavanomaisena puhdistusmenetelmänä. Muodostamisen ja eristämisen jälkeen, kaavan (I) mukaisen yhdisteen suolamuoto voidaan muuttaa vastaavaksi ei-suola-muodoksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Eräissä tapauksissa kaavan (I) mukaisen yhdisteen happo-30 additiosuola on enemmän veteen ja hydrofi ilisi in liuottimiin liukeneva ja sen kemiallinen stabiilisuus on lisääntynyt .

23 8 5148

Kuitenkin, koska kaavan (I) mukaisten yhdisteiden ja niiden suolojen ominaisuudet ovat hyvin samanlaiset, se mitä tässä hakemuksessa esitetään, käsiteltäessä kaavan (I) mukaisten yhdisteiden biologisia aktiivisuuksia koskee 5 myös niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ja päi nvastoi n.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia puolisynteettisinä anti bakteeri sinä aineina, pääasiassa ne ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita vastaan, mutta 10 ne ovat aktiivisia myös gram-negatiivisia bakteereita vastaan.

Keksinnön mukaiset yhdisteet, joissa R on eri kuin vety, paitsi että niillä on tietty antimikrobinen aktiivisuus, ne ovat pääasiassa käyttökelpoisia välituotteita valmis-15 tettaessa kaavan (I) mukaisia yhdisteitä, joissa R on vety.

Yleistä menetelmää keksinnön mukaisen yhdisteen valmistamiseksi kuvaa sopivan, edellä määritellyn teikoplaniini- 12

lähtöaineen reaktio (ami do iminen) valitun, kaavan HNR R

12 20 mukaisen amiinin kanssa, jossa R ja R tarkoittavat sa-maa kuin edellä, inertissä orgaanisessa liuottimessa kon-densaatioaineen läsnäollessa.

Käytettäessä lähtöaineena teikoplaniinia tai teikoplaniini kompleksia vastaava, kaavan (I) mukainen amidi, joka 25 saadaan tämän keksinnön mukaisen amidoim is reaktion mukaisesti, on viiden amidi johdannaisen seos vastaten teiko-planiini A^:n edellä mainittua viittä pää komponenttia. Mainittu seos voidaan erottaa viideksi, yksittäiseksi amidi johdannaiseksi menetelmillä, jotka ovat analogises-30 ti alalla tunnettuja (katso esimerkiksi GB-hake- musjulkaisu No 2121401). Selvyyden vuoksi mainittakoon, että sekä itse seos, joka saadaan amidoimisreaktiolla että jokainen viidestä amidi johdannaisesta muodostavat 24 8 5 1 48 osan tätä keksintöä, kuten patenttivaatimuksissa esitetään tähteen A tarkoittaessa N | (q-C^)ai ifaattinen asyyli^--/3-D-2-deoksi-2-amino-gl ukopyranosyyl iä. Päinvastoin jokaisen teikoplaniini komponentin yksittäinen, puhdas 5 amidi johdannainen saadaan käyttäen keksinnön mukaista menetelmää ja siinä lähtöaineena yksittäistä komponenttia itseään kompleksin sijasta.

Suoritettaessa amidoiminen tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on edullista joskus ja erityisesti 10 silloin kun ainakin yksi ryhmistä A, B ja M teikoplaniini-1ähtöaineessa tarkoittaa vetyä, suojata teikoplaniini-lähtöaineen primäärinen aminofunktio mahdollisten ei-toi-vottujen sivureaktioiden vähentämiseksi.

1 2

Myös silloin kun amiini HNR R sisältää muita reaktiokykyi-15 siä funktioita, kuten amino- tai karboksiryhmiä, jotka voivat epäsuotuisasti häiritä amidoimisen etenemistä, ne suojataan sinänsä tunnetuilla ja alalla käytetyillä menetelmillä, kuten sellaisilla, joita kuvataan viitekirjoissa esim. T.W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis", 20 John Wiley and Sons, New York, 1981 ja M. McOmie "Protecting Groups of Organic Chemistry" Plenum Press, New York, 1973. Näiden suojaryhmien täytyy olla pysyviä reak-tiomenetelmän olosuhteissa, ne eivät saa epäsuotuisasti häiritä pääamidoimisreaktiota ja niiden tulee olla hei -25 posti poislohkaistavissa ja poistettavissa olevia reaktio-väliaineesta reaktion lopussa ilman, että ne muuttavat juuri muodostunutta amidisidosta.

Tyypillisiä esimerkkejä N-suojaryhmistä, joita voidaan edullisesti käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä amino- 30 funktion suojaamiseksi sekä teikoplaniinilähtöaineessa, 1 2 ja kun se on tarkoituksenmukaista, kaavan HNR R mukaisen 1 2 amiinin R - ja R -osassa, ovat karbamaatin muodostavat rea-genssit, joita kuvaavat seuraavat oksikarbonyyliryhmät: 25 85 1 48 1 ,1 -dimetyylipropynyylioksikarbonyyli, tert.-butyylioksi-karbonyyli, vinyylioksikarbonyy1i, aryylioksikarbonyyli, kinnamyylioks i karbonyyli, bentsyy1ioksi karbonyyli , p-ni tro-bentsyylioksikarbonyyli, 3,4-dimetoksi-6-nitrobentsyyli oks i-5 karbonyyli, 2 ,4-diklooribentsyylioksikarbonyyli, 5-bents-iso-oksatsolyylimetyylioksikarbonyyli, 9-antranyylimetyy-1 i oks i ka rbonyyl i , S-bentsyyl i oks i ka rbonyyl i ja vastaa vat.

10 Muita sopivia N-suoja-aineita ovat aldehydit tai ketonit tai näiden johdannaiset, jotka kykenevät muodostamaan Schiffin emäksiä teikoplaniininukleonin suojattavan ami-noryhmän kanssa.

Edullisia esimerkkejä tällaisista Schiffin emäksen muodos-15 tavista aineista ovat bentsaldehydit ja erityisen edullinen on 2-hydroksibentsaldehydi (saiisyylialdehydi).

Edullinen suojausmenetelmä siinä tapauksessa, että amiini-1 2 reagenssi HNR R sisältää primäärisen amiinifunktion täh-1 2 teen R ja/tai R substituenttina, on eräissä tapauksissa 20 bentsylideenijohdannaisen muodostaminen, joka voidaan val- 12 mistaa saattamalla amiini HNR R reagoimaan bentsaldehydin kanssa aiempialkanolissa, kuten etanolissa, mieluimmin huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun reaktio valitun teikoplani ini1 ähtöaineen kanssa on täysin tapahtunut, bentsyli-25 deenisuojaryhmä voidaan poistaa tunnetulla tavalla, esim.

käsittelemällä laimealla mineraa1ihapol1 a, mieluimmin kloori vetyhapol 1 a huoneen lämpötilassa.

On selvää, että kun kaavan (I) mukainen lopputuote sisältää ryhmiä, jotka ovat pysymättömiä happamissa olosuhteis-30 sa, esim. silloin kun A, B tai M tarkoittaa edellä määriteltyjä sokeriosia, jotka voivat hydrolysoitua happamessa väliaineessa, täytyy käyttää tietyn suojaryhmän poistamiseksi muita poisto-olosuhteita, kuten katalyyttistä hyd- 26 8 5 1 48 ra usta, esimerkiksi käytetään katalysaattorina palladiumia hiilellä.

Tässä tapauksessa kuitenkin on otettava huomioon niiden ryhmien läsnäolo, joita katalyyttinen hydraus voi muuttaa.

5 Tyypillinen seuraus kaavan (I) mukaisen johdannaisen, jossa A tarkoittaa edellä määriteltyä ryhmää, jonka asyyliosa on Z-dekenoyyli (t.s. teikoplaniini komponentti 1:n johdannainen tai sitä sisältävä seos), katalyyttisestä hydrauksesta on, että yhdiste ainakin osittain muuttuu 10 vastaavaksi dekanoyylijohdannaiseksi (t.s. teikoplaniini A^ komponentti 3:n johdannaiseksi).

Alan ammattimies pystyy myös tämän selityksen perusteella 1 2 päättelemään mitkä amiinin HNR R funktiot täytyy suojata, kuinka ne tulee suojata ja valitsemaan sopivan suojaus-15 ryhmien poistoreaktion, joka on välttämätön lopputuotteen vapauttami seksi.

Esimerkiksi sopiva suojaus reaktiokykyisei 1 e karboksyyli-happofunktioi 1 e on esteri funktion muodostaminen.

Alan ammattimiehelle on selvää, että spesifisen suojaryhmän 20 lopullinen valinta riippuu tietyn, toivotun amidijohdannai-sen tunnusmerkeistä. Itse asiassa lopullisessa yhdisteessä tämän amidifunktion tulisi olla pysyvä suojaryhmän (-ryhmien) poisto-olosuhteissa.

Koska erilaisten suoja ryhmien poisto-olosuhteet ovat tunnet-25 tuja, alan ammattimies pystyy valitsemaan sopivan suojaryhmän. Esimerkiksi kun lopullisessa yhdisteessä on myös bent-syyli esteri funktio tai N-bentsyyli funktio, suoja ryhmiä, jotka tavallisesti poistetaan katalyyttisesti hydraamalla, kuten bentsyylioksikarbonyyliryhmä, tulisi välttää, koska voi-30 daan käyttää edullisesti sellaisia suojaryhmiä, jotka ovat poistettavissa happamissa olosuhteissa, kuten tert.-butoksi-karbonyyli. Sitä vastoin katalyyttistä hydrausta voidaan käyttää edullisesti siinä tapauksessa edellä, kun halutaan 27 85148 muuttaa kaavan (I) mukainen yhdiste, joka sisältää maini- 1 2 tun N-bentsyyli- tai bentsyyliesterifunktion -NR R -osassa, vastaavaksi yhdisteeksi, jossa mainittu N-bentsyyli-tai bentsyyliesteri funktio on korvattu vetyatomilla.

5 Inerttejä, orgaanisia liuottimia, jotka ovat käyttökelpoisia kondensaatioreaktiossa, ovat sellaiset orgaaniset, aproottiset liuottimet, jotka eivät epäsuotuisasti häiritse reaktion kulkua ja jotka kykenevät ainakin osittain 1 luottamaan teikoplani inilähtöainetta.

10 Esimerkkejä mainituista inerteistä, orgaanisista liuotti mista ovat orgaaniset amidit, aikyyliesterit, glykolien ja polyol ien eetterit, fosforiamidit, sulfoksidit ja aromaattiset yhdisteet. Edullisia esimerkkejä inerteistä, orgaanisista liuottimista ovat: dimetyyliformamidi , dime-15 toksietaani, heksametyylifosforiamidi, dimetyylisulfoksi-di, bentseeni, tolueeni ja näiden seokset.

Kondensaatiaine keksinnön mukaisessa menetelmässä on jokin sellainen, joka on sopiva amidisidosten muodostamiseen orgaanisissa yhdisteissä ja erityisesti peptidisyntee-20 sissä.

Tyypillisiä ja edullisia esimerkkejä kondensaatioaineista ovat (Cj-C^)alkyyli-, fenyyli- tai heterosykliset fosfori-atsidaatit, kuten difenyyli-fosforiatsidaatti (DPPA), di-etyy1ifosforiatsidaatti, di(4-nitrofenyyli)fosforiatsi-25 daatti, dimorfolyylifosforiatsidaatti ja di fenyylifosfori-klooridaatti. Edullinen kondensaatioaine on difenyyli-fosforiatsidaatti (DPPA).

1 2

Keksinnön mukaisessa menetelmässä amiinireagenssia HNR R käytetään tavallisesti molaarisessa ylimäärässä.

30 Yleensä käytetään 2-6-kertaista molaarista ylimäärää, kun taas 3-4-kertaisen molaarisen ylimäärän käyttö on edul-1i sta.

28 85148 1 2

Jotta ami do iminen tapahtuu, on tarpeen, että amiini HNR R

pystyy muodostamaan suolan teikoplaniini1ähtöaineen karbok- 1 2 sifunktion kanssa. Siinä tapauksessa, että amiini HNR R ei ole tarpeeksi voimakas muodostaakseen tällaisen suolan 5 valitussa reaktiovällaineessa, on tarpeen lisätä reaktio-seokseen suolaa muodostavaa emästä ainakin ekvimolaarinen määrä teikoplaniinilähtöaineen kanssa.

Esimerkkejä mainituista suolaa muodostavista emäksistä ovat tertiääriset, orgaaniset, alifaattiset tai alisykli-10 set amiinit, kuten tri metyyli ami i n i, tr i etyyli ami i n i , N--metyyli-pyrrolidiini tai heterosykliset emäkset, kuten pikoliini ja vastaavat.

Kondensaatioainetta käytetään yleensä vähäisessä mol aari-sessa ylimäärässä, kuten 1,2- 1,7- ja mieluimmin 1 ,5-kertaa 15 teikoplaniinilähtöaineen määrä.

1 2

Lisäksi ami inireagenssia HNR R voidaan sopivasti lisätä reaktioväl iaineeseen vastaavana happoadditiosuolana , esim. hydrokloridina. Tässä tapauksessa käytetään ainakin kaksinkertaista molaarista osuutta ja mieluimmin 2-4-kertais- 20 ta molaarista ylimäärää vahvaa emästä, joka kykenee va- 1 2 pauttamaan HNR R amiinin sen suoloista. Tässä tapauksessa sopiva emäs on myös tertiäärinen, orgaaninen, alifaattinen tai alisyklinen amiini, kuten edellä esimerkkeinä mainitut. Itse asiassa ainakin eräissä tapauksissa amiinin 1 2 25 HNR R , joka sen jälkeen vapautetaan in situ edellä mainituilla emäksillä, suolan käyttö on huomattavasti edullisempaa erityisesti kun suola on paljon pysyvämpi kuin vastaava, vapaa ami i n i .

Reaktioiämpöti1 a vaihtelee huomattavasti riippuen spesifi-30 sistä lähtöaineista ja reaktio-oloista. Yleensä on edullista suorittaa reaktio lämpötiloissa 0-20°C.

Myös reaktioaika vaihtelee huomattavasti, riippuen muista reaktioparametreistä. Yleensä kondensaatioreaktio on tapah- I: 29 6 5 1 48 tunut täysin 24-48 tunnissa.

Joka tapauksessa reaktion kulkua seurataan TLC:11ä tai mieluimmin HPLC:llä alalla tunnettujen menetelmien mukaisesti.

5 Näiden kokeiden tulosten perusteella alan ammattimies pystyy arvioimaan reaktion kulkua ja päättämään, milloin pysäyttää reaktio ja alkaa jatkotyöskentely reaktiomassan kanssa sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, joita ovat esimerkiksi uuttaminen liuottimilla, seostaminen ei-10 liuottimia lisäämällä jne. johon liittyy erottamiset ja puhdistamiset pyiväskromatografisesti.

1 2

Kuten edellä jo mainittiin, kun kaavan HNR R mukaisen rea-genssin tai teikoplaniini1ähtöaineen tai näiden molempien suojaaminen on tarpeen, suojattu lopputuote vapautetaan sen 15 jälkeen suojaryhmistä menetelmillä, jotka ovat sinänsä tunnettuja ja riippuvat pääasiassa käytetystä suojaryhmästä.

1 2

Siinä tapauksessa, että sekä amiini HNR R että teikoplanii-nilähtöaine ovat suojatut, saattaa olla edullista käyttää saman tyyppisiä suojaryhmiä, jotka voidaan poistaa samoissa 20 olosuhteissa, niin että tarvitaan ainoastaan yksi vaihe suojauksen poistamiseksi ja molempien funktioiden vapauttamiseksi .

On myös selvää, että monissa tapauksissa keksinnön mukainen yhdiste voidaan valmistaa useampaa kuin yhtä tietä ja 25 että keksinnön mukainen yhdiste voidaan muuttaa toiseksi yhdisteeksi sinänsä tunnetuilla reaktioilla.

1 2

Esimerkiksi, kun HNR R amiini on diamiiniyhdiste, kuten HN(R^)-aik-NR^R^, joka edellä on määritelty, kaavan (I) mukainen haluttu amiiniyhdiste voidaan valmistaa joko suo-30 raan kondensoimal1 a mainittu amiini, mieluimmin tarvittaessa suojattuna, valitun lähtöaineen kanssa tai se voidaan valmistaa saattamalla kaavan (I) mukainen amidi, jossa 2 30 85 1 48 substi tuentti R on alk-halo, jossa halo on mieluimmin kloori- tai bromiatomi, reagoimaan kaavan HNR^R^ mukaisen amiinin kanssa.

Lisäksi kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jolla on karbok-1 2 5 sifunktio -NR R -osassa, voidaan muuttaa vastaavaksi amidiksi tai substituoiduksi amidi johdannaiseksi tavanomaisilla menetelmillä.

Lisäksi mainittu karboksifunktio voidaan myös muuttaa vastaavaksi asyylihaiogenidifunktion esteriksi tavanomaisi1-10 la menetelmillä. Erityisesti esterifunktio muodostetaan yleensä saattamalla karboksin sisältävä tuote reagoimaan ai koiivai misteen kanssa happokatalysaattorin läsnäollessa lämpötilassa, joka vaihtelee huoneen lämpötilasta reaktio-seoksen kiehumispisteeseen. Happo on mieluimmin mineraali-15 happo ja alkoholi sisältää osan, joka tulee sitoutumaan karboksyylifunktioon esterijohdannaisessa . Voidaan käyttää myös inerttiä liuotinta. On selvää, että kaavan (I) mukainen yhdiste, jolla on karboksyylinen esterifunktio 1 2 -NR R :n substituenttina, voidaan muuttaa vastaavaksi k a r -20 boksyyliyhdisteeksi hydrolyysi11ä.

Edullisessa hydrolyysimenetelmässä käytetään ai kai imetä!1i-karbonaatin, kuten natrium- tai kaliumkarbonaatin vesipitoista liuosta, lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilasta reaktioseoksen kiehumispisteeseen.

1 7 25 Kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa on -NH2-funktio -NR R osassa, voidaan muuttaa vastaavaksi monoalkyyliaminojoh-dannaiseksi "pelkistävällä alkyloinnilla", jossa yhdiste saatetaan reagoimaan valitun karbonyylijohdannaisen kanssa (joka pystyy luovuttamaan halutun aikyylisubstituentin 30 reaktion jälkeen), vastaavan Schiffin emäsvälituotteen valmistamiseksi, joka sen jälkeen pelkistetään sopivan pelkistysaineen, kuten natrium- tai kaliumboorihydridin läsnäollessa.

31 85148

Kun läsnä on vapaa aminoryhmä kaavan (I) -NR R osassa, se voidaan alkyloida sinänsä tunnetulla tavalla, esim. saattamalla yhdiste tai mahdollisesti vastaava yhdiste, jossa teikoplaniini-osan primäärinen aminoryhmä on suojattu, rea-5 goimaan alkyylihalogenidin (bromidin, kloridin tai jodidin) kanssa. Samalla tavalla sekundäärinen aminofunktio voidaan muuttaa tertiääri seksi funktioksi tai tertiäärinen aminofunk-tio voidaan kvaternisoida.

Lisäksi kaavan (I) mukaisen amidiyhdisteen sokeriosa voidaan 10 poistaa selektiivisesti muuttamalla se toiseksi kaavan (I) mukaiseksi amidiyhdisteeksi .

Esimerkiksi kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyä sokeriosaa, voidaan muuttaa vastaavaksi yhdisteeksi, jossa B ja M tarkoittavat samaa 15 kuin edellä ja A on vety, käyttäen kontrolloitua happohydro-lyysiä vahvassa, konsentroidussa vesipitoisessa orgaanisessa hapossa. Konsentroitu orgaaninen happo on tässä tapauksessa mieluimmin vesipitoinen trifluorietikkahappo , konsentraa-tion ollessa 75 % - 95 %, ja reaktiolämpötila on mieluimmin 20 10°C - 50°C. Edulliset hydrolyysioiosuhteet ovat noin 90- prosenttinen trifluorietikkahappo huoneen lämpötilassa. Reaktioaika vaihtelee riippuen muista spesifisistä reaktiopara-metreistä, mutta joka tapauksessa reaktiota seurataan TLC-ja mieluimmin HPLC-menetelmi 11ä . Vastaava, selektiivinen 25 hydrolyysi on kuvattu EPO-patenttihakemuksessa 84114559.2.

Samalla tavalla kaavan (I) mukaiset amidiyhdisteet, joissa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyä sokeriosaa tai A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat sokeriosia, jotka edellä on määritelty, voidaan muuttaa vastaaviksi, kaavan (I) 30 mukaisiksi amidiyhdis teik si, joissa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa edellä määriteltyä sokeriosaa, selektiivisellä hydrolyysi11ä, käyttäen vahvaa happoa polaarisen, aproot-tisen liuottimen, joka on eetteri, ketoni tai näiden seos ja joka on huoneen lämpötilassa neste, läsnäollessa. Edulliset 35 hydrolyysioiosuhteet tässä tapauksessa ovat konsentroitu 32 8 5 1 4 8 mineraalihappo, jota käytetään eetterin, kuten dimetoksietaa-nin läsnäollessa huoneen lämpötilassa. Myös tässä tapauksessa reaktion kulkua voidaan seurata TLC:11ä tai mieluimmin HPLC: llä. Analoginen, selektiivinen hydrolyysi on esitetty EP-5 patenttihakemuksessa 85109495.

Tämän keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaan kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyjä sokeriosia, kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat edellä mää ri-10 teltyjä sokeriosia, tai kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa edellä määriteltyä sokeriosaa, voidaan muuttaa vastaavaksi kaavan (I) mukaiseksi amidiyhdisteeksi , jossa A, B ja M tarkoittavat vetyatomeja selektiivisellä hydrolyysillä orgaanisessa, proottisessa 15 1iuottimessa , joka on alifaattinen happo tai aifa-halogenoitu alifaattinen happo, joka reaktioiämpöti1 assa on neste, alifaattinen tai sykloalifaattinen alkanoli, joka reaktiolämpö-tilassa on neste ja joka heikosti sekoittuu veden kanssa, fe-nyylisubstituoitu ai empiä!kanoli, jossa fenyyliosa voi mahdol-20 lisesti sisältää (C^-C^)alkyyli-, (C^-C^)alkoksi- tai halogee-nitähteitä ja joka reaktiolämpöti1assa on neste ja heikosti sekoittuu veden kanssa, tai beta-polyhalogenoitu alempialka-noli, joka reaktiolämpötilassa on neste; vahvan hapon, joka sopii yhteen liuottimen kanssa ja joka on vahva mineraalihap-25 po, vahva orgaaninen happo tai vahva kationinen vaihtohartsi vetymuodossa, läsnäollessa ja lämpötilassa joka on 20-100°C.

Tässä tapauksessa edulliset hydrolyysioiosuhteet ovat mineraa-lihappo, kuten kloorivetyhappo , haioalkanolissa , kuten tri-f1uorietanolissa , lämpötilassa 65°C-85°C.

30 Vastaavat, selektiiviset hydrolyysiolosuhteet samanlaiselle substraatille on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 84114558.4.

Seuraavassa taulukossa (Taulukko I) on esitetty keksinnön mukaisten yhdisteiden tyypillisten esimerkkien rakennekaavat.

Il 85148

<N

cm cn cm — a . - m f > ro a o te CN I I J\ / _ 'vg. 2 a

2 2 2 i I U

CM CO Γ0 Γ0 CM CM I

a — — 0 — — ~ 2 r-l CM CM XJ CM CM CM ^ \ a aa a a a Γ ]

2 U U U U CJ I I

a a k a a x ^ 2 2 2 2 2 2

II I III

0 0 0 0 0 0 a a Ό Ό Ό Ό 'Ο Ό

»—I

o ro ^ 2 0 0 0 000 CO ZD 2 I Ό Ό Ό Ό Ό Ό _j < Ι- ΓΟ - a u m oooo ooo CJ Ό Ό Ό TJ Ό Ό .. . a - 2 0 uo km

I — I

t—i 04 rH

a a a o o o Λ < UOUU 000 a ό a a ό ό ό 2 2 2 0 o o

1 I I

0) +j (ΰ J2

rt r-, CM <N ro 'srUOVO

- ·ί— Ό

-C

>- 65148

(N

<n σ* O O

CN — 2 / \ - IN <·" \ —. m ^ f η , ro 2 O ro

2 <n I 1 K ) K

O O G \ / N / ro O \ / — -- — 2 2 2-2 <N 2 2 S l 0 2 1 04 rororocNCNi ro cn

04 ojcNCNrjcN-v.rNrM

2 2 2 2 2 2^^2 2 I O O O O O o o 2 2 2 2 2 \ / 2 2

22222222 I I I I I I I I

o o o o o o o 2^3^3^373¾¾¾ rs 3

-P

<0

M 200000 O

5 I x> Ό Ό Ό Ό K Ό 00 o

ZD

Ed n I 5 ^ o uooooooo CQ 2¾¾^¾¾¾¾ 2 0 < 20000000 Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Q)

-M

y* o i—( (N ro '«J· ^ Γ" CO Oi t—i r-H rH t—l f—i

JC

>- 85148

<N

<n σ\ O

- CN — X \|-

,-. in f I

m X U

k J u-ι X cn ι I J l J

\ / x m u U c \ / \ /

2 '22 (N I U U 2 2 2 I I

X (MOO ro ro ro (N cm tH — O O ·~- Λ ·—. .—.

X CMUU<NCNCN<N<N

2 XCNfNXXXXX

I UXXUUUUU

XXXXXXXX 22222222 I I I I I I I I

ooooooo

ca aO'OTj'OOOO

3 3 +->

rO

Ό ^ ooooooo lD i—'S xooooooo r> o x —I m ·=> ® <c u

h* O

U 0 0 0 0 0 0 --- ca χόόχόόόό 2

U

V

«< ooooooo εόόόόόόό

--- I

+->

10 ITiVOt^-OOCT'Of-ttN

f— rHr-HiHfHrHCNCNCN

Ό

_C

>- 851 48

s" O

Ä I I

rH . Z Z O Cfl » O O u o

I I I I

— 0 0 0 Z3 Ä ffi Ό Ό Ό 3

+J

ro *r_> 1-1 0 0 2

O 2 K Ό Ό I

Ιβ ^ n i*£

ZD _I

ra < H- Γ0

E

: U

O O O

« EC Ό Ό O

K

2 0 in

‘ I

f-H

(¾ O o o < ÖG Ό Ό y *-k-l 2 0 0) 1 *-> I ΙΛ r- ro ττ in id

TD (N fM CM CN

-C

>- 85148

K rH

O u

(N (N

E E

CM U U

CM X CM CM

X XXX

X ^ O U

\ /

CM CM XX

X E en u cm «-* U / \ -"E ·—-

X E | I O <N

X I O E O E

I E O l J u-u u a-u \ ^ i ·—

XXX X

X i X X

I i I

's 0 0 0 n E Ό Ό Ό

X

-p

rtS

•r~3

M

S S O O X

r- ^ S I Ό Ό n => _i <c t— ro - . IT* u 0

« U

E 0 0

X Ό Ό K

U

m i

rH

x < s E 0 0 X X Ό Ό e» i

OJ

+J

- ' Γ'. 1/1 ♦r“ -o r* oo σι o jz cm cm cm m >- 85148

K

O EC «N CN (N

™ C>7\ ffi K 33 ®_y/ \ 222

O —f Q~i K I K I 33 I

33 2=0 2=0 2= 0 1 33 2 2 2 O J-2 2 2 2 \ / I ro ro ro

KO (N CN (N

CN UI K K K

K — OK OK OK

I-H CN^-O --'O —' o

es K KO KO KO

2 O 0—0 0—0 0—0

I I I I

KK K K

2 2 2 2

Il I I

=i 0 0 0

=5 « K Ό Ό V

-M fO ,f—3

"o S O O

m ^ S K I Ό Ό

3D

_J

3D

< Ι- ΓΟ

K

o o o o O Ό Ό ea kk 2 0 in ro in I ’ >—< CN -S' es k es o o o o o o

<< K K K K

2 2 2

0 O O

1 I I

CU

*-> ΙΛ •Γ- (ΟΛΟ

“O <H (N CN CN

E CO ΓΟ Γ0 Γ0 >- 85148

(N

X CN CN

2

Xi γη ro 2=CJ r-ι rH cn m

X X XXX (N X

2 in ID 2 O X U

ro CJ CJ X O 2 0 ro

-.--- CJ— CJ X O X

cn ro 2 2 l CJ—CJ CJ

cn XXro ro »a· »a· O

X OU — ~ — O

rH —O cn CN CN (N CJ

X XOX XX X CN

2 U—U O CJ CJ CJ X

I I — — — — CJ

X 2 2 X X X

2 X X 2 2 2

I I II I I

3 3 ooooo ^ X X Ό ΌΌ Ό Ό

iO

hH

σ> ° ro ^ 200000 ^ 2 I Ό Ό Ό Ό Ό _i ra < ro

X

u o

CJ

X o o o o o 2 Ό Ό Ό Ό Ό

U

ffl I

in i

rH

x o u O 0 0 o o < X Ό Ό Ό Ό Ό 2 0

CU

+J

e/) •r- ro rt m id r* oo "o ro ro ro ro ro ro .e >- 85148

(N CN

2 2 cn 2 2

K 2 K I 2 I

O 2 2“ O 2— U

O O 2 2 U U 2 2 cn f\i ro ro CN CN CN CN (N Ό

Pi 2 2 2 2 2

r-c U 2 O 2 O 2 O O

2 -^O '-'O — O — O

2 20 20 20 20 I 0—0 0—0 0—0 0—0

Ph 2 2 2 2 2 2 2

Il II

3 = _ 0 0 0 OS K Ό Ό Ό +-> fÖ *o >S—«*

M

O o ^ ^ s o o o

^ S I Ό V TJ

_i 2> < Ι- ΓΟ 2

O

O

0 O 0 0 ffl 2 T3 Ό Ό 2

O

m

rH

2

O

O O o < 2 Ό 2 Ό 2 0 CL> +-> (/> •f—

Ό <Ti O r-l CN

.e ro o· o· o· >- 85148

(N CM

i—i co ro

r-l T-H CM CM S

aa k s aa s o

LT) VO SO SO

U U SO SO

CM — -- U—U U—O

a s z t i .-h ro co rr ·=τ

z CM CM CM CM

I SS X s

U O U O

t»r*( »TM *—l tJ-4 t-M k-M μΜ S 2 2 2

I I I I

ΪΞ 0 0 0 3(¾ SO Ό Ό 4->

<V

•r->

t-H

S g o o o T- ^ S I Ό Ό t3 ^ =3 _l Z3 < I—

CO

S

u 0 o o o U Ό Ό Ό

ffl S

2 O

k· 0 0 o < S Ό Ό T3 <u +-> 1/1 •f- co ^ m m ΤΓ rj> tj· «q* >- 85148

CN

SC SC

O 2

O O

ro U U

SC (N (N

u —. —

CN O O') CN

PS O 33 SC

ή U CJ SC U SC

PS cn O — O

z sc sc o sc o I U U-U u-u sc sc sc 2 2 2

III

3 0 0 PS SC Ό Ό +-> <o

hH

o ^ SO 0 ^ ^ 2 I Ό Ό

^ =D

_I

=) < I—

OS

SC

υ o u o o PQ SC 13 Ό 2 0 «: sc o o r0 Ό O)

+J

1/) •r“ *o ^ r- oo cn ll 85148 (Ν ΓΜ E — 2 Ή

E I fH

Z-U fN X

XX m z z o ro ^ —« —. in z CN CN <n a co PS E E (N —

tH US U U CN

PS O O X

z SO so u I U—U U—U —'

E E Z

z z s

I I I

EE oo ^ E E Ό 03

-M

03 ,f“3

M

S 0 0 co 2 s ® Ό Ό ^ => _i =3 < (—

. CO

--- E

u o o Ο Ό Ό

CQ U

E Z o \ 0 0 < E Ό Ό t ω +-> 00

Γ; O r-( (N

m m m >- 851 48

(N

ro ro

rH <N K <N

K EU KE

Ό E O 2 0

U E O E O

CN — U-U U-U

OS 2 I I E

<-t ro τΐ< o PS — — — o 2 (N (N (N u

l E E E CM

U U CJ E

Zhh *-h *r*

t-M ML« t_U

K Z 2 Z

(I I I

=5 0 0 0 =3 0$ 33 Ό Ό Ό +-> <0 *o

t—I

o 0 0 0 *sr *£ S E Ό Ό Ό

«t V

_l

E

<C

(— ro

U O O O

O Ό T3 'O

m u

E

2

O

O 0 O

< K T3 T3 Ό ω

M

</) •r- n Tr m \d “o m tn m in x: >· 85148

CN (N

κ a CN a 2 a a a I a i

Ο 2 Z=U Z=U

o CD a a U U Z 2 cn cn n m a CN CN CN CM fl a a a a a a ua us us uu a —o -"O —o — o I ao ao a o ao u—u u—u u—u u-u a a a a 2 2 2 2 III ( 3 0 0 0 .ic a a ό ό ό

P

I—I

O

iZ 0 0 0 in ;z E K Ό Ό Ό Ν’ Z3 _J rD < t- co a u 0 U 0 0 ffl a ό a ό

2 U

0 O 0 < a Ό Ό Ό Φ 4->

CO

r- Γ' CO <J\ O

-o in lf> in VO

JC

>- 85148

(N CM

γη ro i—I ϊ-Η Γ0

K K (N a (N

m vo KU KK

U U 2 0 2 0

-- ^ KO KO

2 2 U—U U-U

CM CO CO •vi'

rH CM CM CM CM

K KKK K

2 U U U U

K K K K

2 2 2 2

III I

EE ooo

K K TD no TD

*-> ro Ό

M

3 ooo

vo 3 2 K TD TD TD

'r ~

—I

ro <

ΙΟ O O

CQ 33 TJ Ό TD

0 0 O

< K TD TD TD

<U

4-> i/i ,r" rH (N CO «T·

jo VO VO VO VO

>- 851 48 m IX ό

O

CN

K

u o

(N O

x x u O 2 x: 0 0 2 u o ^ (N (N ^ X —» — (N ro

O ΓΜ XX

(N O X X u u

X U UX U X w O

I-I (N o '-O XO

X X X O X o u—u

2 U 0-0 U—O I

I X X X X

2 2 2 2

Il I I

rj => 0 0

-* X X Ό Ό X

•p ra ·<-> t—4

O

^ O O S

f" ^ s x Ό Ό i X5 _i x «t I— . . ro

U

O

0 O u

m X Ό Ό X

2 0 ? r·^

X

o O O u

< X Ό Ό X

2 0

<U

•P

10 •r- ι/o vo r* x -o vo vo vo vo

-C

>- 85148 m

CC

\o 0 l

<N

cc u O 04

O —s CN

U m cc CC CC 2

2 U

— 2 (N ro 04 oi CC 2 <N K —. u o 2 0 2 04—0 rH — o 2 2 0

2 2 0 O U U

2 U-U — n | 1 I 12 2 2 2-0 2

2 I I

^ oo 3 0$ CC Ό *0 +j Π3 •r-3

t-H

00 ^ o 23 0 0 ^ a I Ό Ό Z3

_J

rd < h~ Γ0 2

U O

O O Ό O Ό 2 2 2 0 m ro l rH 04 2 0 2

O Ό O

^ U O

<2 2 2 2

0 O

1 I

0) 4-> (Λ ON O r-4 -ϋ iö -C >- li 85148 in <n

DC O

ID 2

U I

I DC

m 2

DC DC I

o z=u

0 I

O DC

U m 2 m DC 2 12 2 2 m id

U

^ (N I

mm mm DC m 2 2 2 2 U 2

m u U U U — U

2 - O -0 I O

^ 2 0 2 0 2 0 2 U-O 0-0 u-o 2 111 12 2 2 2 2 2

1 I I

m 2 id 0

'T <N

5 2 2 2 2

3 U

o

« O

(Ο ζ_)

,r-> I

σ> - rr ^ a a

g a I 2 I

13

_I

2 < K- m m 2 2

O O

ο ο

U 2 U

2 2 2 2 2

0 O

1 I

in m

I ‘ I

rH Ή 2 2

O O

U 2 U

<2 2 2 2

0 U

1 I

<U

.: -p ιλ m m -r- r~ *o

-C

>- 851 48

Ρ~ί O O

_/ I I

I ro ro <n <n · . „

OS — CM (N CN

•h ro K X 22 os a u u u 2 O I —' “

I —' in KK

2 2 2 2 il li 3 o o

3 OS K TD TD K

+-> to Ό o *-·

o SO O

^ ϊ I TD TD K

35

_J

3) C I— to

K

u o o o

U TD TD K

m k 2 0 in f—< OS o o

O TD TD K

. u

< K

2 0

CD

-t-> 10 •i- m vo r* oo -a t- r- r* r»

-C

>- 85148

CN

ΓΟ

-v CN U

\ (\j ® 2 — U 2 2 _r co -cr

Cd CN CN CN O

*~c X X X T) oa υ u o

2 I

IX XX

2 2 2

I I I

r OOO

3 pa X Ό Ό Ό

-*C

+J

(O

Ό

I—I

m o gOO

:*£ g X I Ό Ό

_J

=3 c h- m x u 0 U 0 0 XX X Ό Ό 2

(J

m

iH CN

pa pa 0 o u o u

< X X Ό X

2 2 u o

1 I

a> Ί-»

</i cO

(Tl O rH rH

Or·* oo oo oo

JZ

>- 8 5148

(N

mm t ^ l· \ >

( ,Z f Z fN

1 VV h

2 J HJH KO

I S g U-U

' ' i 2 3 o 3 K KK Ό +-> to •o (N Μ ,Λ o a o ^ g (K *0 ra _j

ZD

< Ι- ΡΟ

K

O

O

u o CO KK Ό 2 0 m

K

O

^ u o < kk *0 2 0

<U

·*-> </> r- (N n Ό 00 00 00

C

>- 85148

(N (N

m ffi ro ro

CN M tE

U EC U U

0 O — ~

(N O O Z Z

01 O O in r- i-H II'-»'-» te (N (N (N (N o 2 tC tC K tn Ό I u u u u 1 I — — tn tn tn te z z z z

I I I I

3 0 0 0 0 ^ Oi EC Ό Ό Ό Ό

+J

ro Ό

M

ro 10 2 s o o o o ^ a I Ό Ό Ό Ό

ZD

_J

ro i— ro te o o • - u o o o o ffl tn Ό Ό Ό Ό z 0 m

rH CM

oi Pi

o 0 O O O

U Ό Ό Ό U

< EC K

z z 0 o

1 I

OJ

+-> «Λ in m ["· oo oo

Jr oo oo co oo oo >* 85148 m

EC

vo

U CN CN

cn n m ro

2 K EC EC

U EC ,—. u u u i i /“ \ ro ~ — ^ Z Z (y ~~ 2 2 rt“ r "lr" SM^ sf »T -T1

Di * U U (N <NO

2 l J ^ J cn '—o 2 2 n 1 I o u-u — _ ~ K 2 S K I aT1 2 2 2 2 2 2—D 2

lii I I I

*3· 0 0 0 0 :3 Di EG EC XJ Ό K Ό Ό

M

ro •Γ-)

►—I

o _ _ 0 O 00 ** S S Ό τ3 ac ό Ό ΙΟ =3 _l

ID

«t K m cc u o u o o o 0 0 (0 EC XJ Ό Ό K XJ Ό 2 0 m 1 ·

rH OM

01 c£

OOO O OO

U XI Ό Ό K X) U

e k a 2 2 0 o

1 I

ai +-> </> r- <3 -Q atOr-t cn ro tt rr f— 00 <n σι σ» σ en en >- 85148 rs 2 2

es rs 2 I

— — 2=0 ro ro X iti S3 2 2 2

0 rs O ro vo (N

— 2 ^ —O 2 rs 2 2 2 rs rs z 2 rs *3* 'a* 2 2 «tr rt — — — O O — 2 rs rs rs ^ O rs 2 2 2 2 2 0 2 I U O O O —O o

Hr-» HM *-r< *T» Nrt HM hm HM hm hm 2 2 2 2 2

1 II I I

"=j 0 0 0 0 3 2 Ό T3 2 Ό Ό

Jk: +-> m •fj i—i o 0 0 0 in ϊέ Σ S Ό 2 Ό Ό m i«£ 2 _j 2 < 1 I— ro 2

O

O

O

« 2 0 0 0 2 Ό 2 Ό Ό 0 m i

rH

2

O

O 0 0 0 rij 2 Ό 2 Ό Ό 2 0

<D

+J

(/) _ >r- m vo r» co σι ό σι σι σι σ σ χ: >- 85148

(N

E

2 (N (N El — — 22U — nm e σ\

EE 2 E

U O m ro t

^ E — U

CN 2 2 2 (N |

E in i"· vo EC

m — — — CJ Ύ E (N CN (N —' o

2 E E E SO

I O U U U-U

E E E E

2 2 2 2

III I

^ 0 0 0 3 E E Ό Ό Ό 4-> m

M

o _ 0 0 0 VO vx a E Ό Ό Ό m ^ rs _i

E

< I— : 0 0 0 ffj E Ό Ό Ό 0 0 0 < E Ό Ό Ό i

CU

+-> “ o i-π cn m

T3 O O O O

r iH rH rH i·^ >- I: 85148 * r~ CM CM '— 0 O >> 2 Z >1 I I oo -r- ~r O re re CM m m C ·!-) <-> cd m I mi re

ZruU m~ O S- ·>- ·>- ·>“ oc m m >> *— r-· I— >- mm m CL > > > r— I co oo O > > > >i ,—- -—-*C ΙΠ l/l 00 >

CM CM CO 3000 CO

m mm o <_i nr o o cnrcs rere c: --- O —' O O i- i- S- Π3 mo mo c > > > ίο- o o-o •'-Q. o_ cl > I I ε ο ·Γ- o o o.

T- T- re^«Ci— .iC-ii: o m m I 3 >> 3 3 -I- ^ I I CM r— > r— r— p— 3 I CJO on O CT> > I— r- o o o o > o on sr c c c oo o -t- Π3 -r- -Γ- o c O £E S- EE c -r-

<u fo >> re re re E

-—- Ο Ο Ό I Cl i I S~ to

3 Od TD Ό I CM O CM CM > I

3 CM I Jsd I I Ω. CM

V I *r~ 3 'r— ·ρ— O I

-l_> o oo I— οοοη_^:·ι— ro I cr> J*: 3 on •r-> cO O O O O r— L* -_- <D c <υ ω σ> o

I m -I- T3 Ό Ο CD

I—I 1--1 I E I I C Ό

•r-‘ CM re CM CM ·ι- I

> o I— I I I I ε cm in iZ s: o > o cm o o re ι iz ς; ι ό >,11111 o o oo >- rr rO cm i _j re m on m. ι

3) I I I I

et l_ <d -f— a> -f—T- ^ ·/—

Cf— “Οι— «—o -r- Γ— r- >» I >> >> OJ »— >>

CM U

CO +> ο I ο O I > o □C rocococMtnc; o to re ι re re ι o ro O <4-CoO-V-*COCC: CQ O O ·— O CD CD I re o m T3 r— Cl Ό Ό 'r· s- c m re ·!- >- -ι- ·<- " . > -r- o -—' I— .— c— I— I CL ,— 1 ^ > > >>·.- 0> ^ > > > > r— c> O +-> O 4-> +-> > C +->

I CD C CD CD > re CD

--- coEreEE-MEE

LfO «- I I ι CD I I

I OOOCDOOCTiooOoO

^ ι --- Ό --- --- fOI —' — Hr4 11 11 1 ' cd mzmmmm»' m o

c o o II II II II II II

m -σ m o ^ ^

ι in co LD

.. ι ·> ·>

OO -— CM CO

o — -— '— m cm CD (— cc cd cd o cd +J Ο Ο Ο o o o c/ι «d- un cooooo o o srmmmmm -a ,— ommmmm _c ro ο ο cd ο Σ cd > m ι ι ι ι ι ι 58 8 5 1 48

Seuraavassa taulukossa (Taulukko II) on esitetty keksinnön mukaisten yhdisteiden tyypillisten esimerkkien valmistusmenetelmät, lähtöaine ja reaktiosaannot: 8 514 8 o +-> Έ. νο o m vo cm

Tr in m 'T ^ <T3 00

<N

CN CN CT\ CN 2 m in

ro X K U

S (N CN I

_ u u S .

2 2 2 2 ro ro ro ro

CN CN <N CN

δ 6 S 6 te se k a:

t—i (O

>—i :c cm +j o _c +j ^ :o cvj cvj +-> cm i*: _i «e <c e e on ru <y 10 e e o e —^ «r— *r- CL *r- <C -r- -r- E Π3 ··“ I— CC O CM e

ro fO ±C fO

Q_ Q. ·> +-> Q.

O O CM VO O

js·: <C ·>-

·!-·!- TO ΤΟ) O) ·Γ- _c CU

l—* I— e >- I— • n~* :co e E ό 5 1 CU *r* e <u CU ·“ e CO >· 3

+-* rH i-Η rH rH

vo e rt; rtl O *ί •r”

E

fO

>

CU

| rH Λ Ä

-C

>- 85148 0 vo «h on VD VO rp Oi

iO

tn 0 u N ϊ: 2 ro

1 l X

CN CN O

(N (N Z

ö S f >

^ ^ L gJ

x x S

3 cu 3 c -^C -r-

4-> tO

ro :o fsj c\j CM

·-->+-> < <c c —' 1(0 ·ι— ·ι— τα ·—1 —I c c c VO 1—1 -Γ- -i- T- •r · i— »r— o c: c e *— i«C cö ro ro v: i— i— r— cu x Q. CL CL +-> —I O O O cr> X ·ι- < ·!— T- T- ~o

h- CD CU OJ X

h- I— h- >- :ro ε

CU

+-> 01 c: cu

E

rH r-H rH

£ < < < u

CO

£

fO

>

QJ

4-> 1/) ^p in vo >- 85148 o

-M

ΕΞ \D CO KO IT) KQ LT)

o\ <T\ CT> LO OK

UI

CVJ

*"cn I

zc xr

V

3 s

2 CN

n —»

CN

<N te g s a CN ffi

£C

<U

e I—

rD

:o

^ +J

rs .e r :ro *=f

-* _J «3- LO

+-> CM CO UT) «a-LDCD V£3 (O o i^~

r—j <U <1> I— G) O *— QJ

-__ +J +J »— -t-> +J +-> to to to to _i to I-1 ·Γ- '1— _| '— ·(— *r— i—i -a X3 TJ T3 >“ X)

_e jz ·ι- j= x: +-> -E

o >->-+-> >->-»-> >- ^ +-> o v; o o ra o ·>- _i -o X) ra ·>- < ·>- -p (— +J e

e (O

(O I

c_a O o

N CQ

QQ I

<_) -P

I I

Z z :rö

E

QJ

-t-J

QJ

E ‘

E

^ u o cT u υ ca™ u

+J

00

E

ro >

<U

O (—I

,J2 CO O rH rH rH

TD

-C

>- S51 48 o +-> c rt* ro (N ro co φ oo ro oo jo m ro oo oo \o uo (N (N /°N g

Oo Oo 1/1 g g ^ go go > y

*"oJ "~OJ K CN

g g 5 | 2: 2 ^fN cn (N <N m S3 tn te a» e

Z3 ·ι— kO

3 Π3 «X) «3* :o vo o -M +-> «d* co «ä- ro .e o r*^ *— co •o :<o r^» «r— r-> ro ^ —J ^ —J *—

LO -J VO

i-H *r— 4-)

•r- +J 0J 0> <U +-> QJ »f— QJ

O +J+J+J+J4->0 4->4->4-> ^ -M O LO 1/1 LO o IS) +-> l/l ^ o O 4I— ·Γ“ ·ι— ·ι— *(— o *r-

=> O ’r- "O "O “O _Q "O O “O

_j *r- _q _c jc ·«- _c *r- .e =5 .O ·»->->· >--P>-_Q>- < -r- +-> C *1- h- +> C rO +->

C Π3 I C

<£ I O <C

O O

N CO

CO I

O 4->

I I

:rö z z e

CU

+->

CU

e <u

E

in ‘ o

+-> CN rH rH CN H CN rH Γ0 rH

^ < CO Q O QC0 C < 4r~

E

rö 5»

CU

4-> </> ••-ro m v£> r-

"O rH rH rH rH rH

-C

>- 85148 o +-> c

fOVDr^rH^i-HCOVDOO'wDr-H

oOiHcovououo^^f^rmuo

CN

σ>

X

CN ^ (N CN Ο

—* ^ LO T

ro ro X C

δ K CN ' _ Ö u zn 5° 5° 5°

On On Ovi S

§ g g * ^

2cn Zcn *<ν K

φ a “ ffi

C

fΌ ΙΟ , T- *r- ·»- +-> c c c _C *t- ·«- ‘f- *«—> ;<Ό ·ι— *·— ,r“

3 —I C C C

3 *c- fO 03 Π3 ^ C f— I— 1“

4-> *f— Q- CL CL

ro »r- o O O

•r-5 r^*-^OsJCO-vro ro __ -n—* ro M— *r- *r- ^i ,— αιαιαιαιαιαιαιαιαι

VO >—I Q.+J+J+J+J+J+J+J+J+J

►—I ΟΟ<Λ<ΛΟ(Λ(/)Ο10</1 \/ s/ · r“ ·(- JxL *r* *i— ^ *r— ’r

O •r-STS'D^-OOnO'O

^ air-j=j=-— -C-c:<— -£= -c ^ +j cn>->- cn>->- en >- >- ^ o ai <u ai _I J*C Ό X) Ό

ZD ID I I I

C ·— O <_) O

h— Dl O O O

(U CO CO CO

TD I I I

+J +->

» I I

z z ϊ; :re

E

ai +-> ai c: a» g o

-l-> : CM <N r-i CN <N rH (N <N f—I CN

</i<CQWWCQWWCQ«W

*Γ"

E

fO

>* '

QJ

-M

l/> 00 ON O

·»- r-H rH CN

"a

JC

>- 85148 s-s o

+J

Ξ <j* in <7 in n* n· co σι o ^ ro ro io ro vo tr cm «Nro ro in

r°i O O

L J ? δ I

2 cn T S

f i o Cl Z <N Z ^ g cm Ä S Ξ

K

ω -r- ·.-

C r- CC

•r- C ·γ- ·Γ- · r~ ro 'Γ- C -r- -Γ- ^ :θ *r- -r- C c 3+-5 C «r- rO ro 3 XT fO C r— . r— ^ :<0 r— n Cl Cu

+-> _J CL «—O O

rO O «3- *3* Q- CM -*C

·<-> ^ ♦— <— tn O T— *— ··— —' ·«- j* o <d o> <d cd cd cd <d ·«- +> cd +> ΓΤ *—* +-> +J -P +> +> cd o +-> o •° »—* O CO to 00 CO </>+-> ^ oo

Jxi -f— *1— T- -f- ·!— O 3 »r* 3 O 3 Ό Ό U TJ Ό ^ I— "Ό r- ^ ♦— χ χ _c x: x 3 cr> _c en en >->->->“ >- r— cd >- o» o <v . en "O *3 —I "O <d t i Οι -σ o o C O I o o

H— O O CQ CQ

CO Nil I CQ +j +> +> Oli I i 2: 2: z z :r0 ε

<D

+5

CD

e

CD

E

en

_2 (N * * rH CN CN (N

OQ WQWQ WCQ CQW tfl •r—

E

<0 > <υ ti rH CN CO N*

CN CN CN CN

-D

JZ

>- li 85] 48 ΐΗϊ

O

M

C lO (N rH O O (T»

ro ro VO ^ σ\ ON CM

fO LO

m Ä

LO

o

CN

0 co w O

W %f o. s g δ δ S ?-8

-£C CN

3 ;ib K '-o n _i *r— cm cm ^r jk: c +J -Γ- QJ 0) CL) IB -r- -J-» 4-> -t->

•I-J C CO CO CO

--- IB ‘r- ,r~ '·~ in ·- -o Ό o

K? V—. O. -C -C -C

C3 |-1 O >->->-

Jk; O T-

LkC O) i*; +-> cm cm =) o «< c

_J -V

ZD 3 T- -r-

<C r- C C

I— 01-1--1-

Qj -i— -γ-

Ό C C

1 « (B

O f— ΙΟ CL CL

00 O O

I -V -1C

+J -Γ- -I- :ib i cu di E Z H- I—

(U

+-> <u c:

QJ

E

(/)

•3 <N ι-t CN

</1 CQ C < U O W

E

fB

>

QJ

-*-> co ui vjo r·» oo σι o r- CN CM CN CM CN m Ό

-E

>- 85148 o +j c vo oo ί· vo rr o «3 r-» ro vo in vo m ro

(N

CN O

~ o 2 O g 'f i fSi B-/oN g_i §-u 3

* U a: K

_ κ m g in • S 2 K - n u \^o 8 Osur, =T=r z«

" « -1" δ S S R

•f- (N —'O SOK

:o g Ö_8 9“Ö S

w 2 2 2

^JC 2 CN CN CN (N CN

13 :ro Hn k co ro 2 ffi rs -j a ^

-ä* CD OI

4-> 4_> +J

iO 00 LO

' r“3 «- ·!— ^ *o to

CN -C .C CN CN

HH «C >- >- <C <C

Γ-H | ^ O -r- VO O J* c c cc ^ 3 T- *r- t— · r— r— ·»- T- -r- -πιο en e e cc _I QJ ra <T3 ra ra ro TO r— r— n- r- C I Cl Cl cl Q.

I— O O O O O

o 00 *r- »r- ·γ- ·γ- ι φ φ φ φ +->+-> -Μ 4-> -*-> :ra Ε *05 +-> Φ

C

Φ £ 3

+-> CN Γ» VO <—C

(Λ m < ο ο < < * 1— ε Γ ΙΟ > Φ

-M ΙΤ3 Λ U

00 »H CM N CN CO Ν* ·«- m en ro ro m ro Ό

-C

>- 85148

O

+-> O O O lD O LT)

c vo ro nj» ^ r- (N

S 2 * > ^ * *1 oo I—I >1 -P 3 CM (N <N Xl

— K ιΛ fd I

m Z E g rH 4-1 CN

r-i M1 <x> m· CJ 1 lO K

3o "m Ucm *“?m ro 3 ö 3o S

ö S § SS g" 2^ > -r, I-8 S-8 § s 9 ss <u § 6 i 3 6-8 6-8 e 23 N n cm 25 2

•i— cM 03 m K CM tN

to k ö D Sk k » :o 3 +-> 3 .c :to

+-> _I CM CM CM CM CM CM

tö <C <C <C <C «£ C

Ό —' · i— T- T— ·ι— ·ι— ·γ— c c c c c c ' I—I ·<- ·ι~ ·Γ- -Γ- -t- -r- Ό |_H ·«-!- ·<— ·!— ·!“ -r- cc c: cc c o to to to to (O to N*; CL CL Cl CL CL Cl

CO O O O O O O

_I ^ Jk: -Si ^ -*£ —I T- -r- ·ι— *r- *1 "f

cc a) CU CU CU CU CU

h- +J +J +->+>+-> -t-> :to

E

O) +->

CU

c cu »

E

3 rH M> Ό< Γ0 M" CM

+J < (< < <L < Cu c/1

E

r— <0 >·

Qi _

4-J LO VD 00 ΟΪ O

on ro ro en ro ro Ό sz >- 85148

2 S

S ^

/S. OOOOOOOO-r-O

w CTN CT» O CTi CT» CTi O,— <J\ Ϊ\ΙΊΊΙ*·1%1 4- >

-Q

I '1 (N +-> —* Z5 CN_o S h 5- u ai CNJCO^J-UllOr^OOCTi ►yT'1 o e nromrorororoeogri- ro ω <d . ω ai φ φ oj cd a» s :o ·+-> +-> 4-> -m +-> 4-> +-><3- 4->

3 -M CO CO CO LO CO to CO CO LO CO

Γ3 _C ·γ- ·ι- ·Γ- ·Γ- *r- *ι— ·Γ- *r- Ο ‘Γ ΟΟ :<Τ3 ΌΌΌΌΌΌΌΌΝ Ό νο 4-> -J xi-cjrjzjzxrjr^r^-jc <Τ3 >->->->->->->->· >- Ό —) •r* ►—1 4-> ►—* +-> Ο Ο Ο *r- ^ :ο3 jtj =5 Ε -Jr- +->

Ζ3 Φ C

< 4-> «£ h- O)

C

a> £ UUUUUUUUflTo

+J

i fÖ k > Φ

+J

CO

ITI rHCNro^Tinvor^oo σ> >- li 85148 S3 o O O LT) o o o o oo m in cd co m <r> <2 ^ \ l \ > (N CM ,— —. CN >, -p m p >, Ή i—l g 4-> SE n: n< =>

LTI CO —. .O

U O n n I

*-* -- S 'T* -P

Z Z Ö Π J

m ro ^ Q Q

~CN (N S—Π U

g g S - sf

c Z 2 6 ~<N

re k K CO 2 :o <-< -p , jz 1— i-* ^3- :ro n- c\j en .·— __i

3 a> <u co co ω CD

3 -P -P *3- ^3" CD -P "=3"

(Λ </> O O CO CO

-P ·ι- ·<- r-. r-^ o -Γ- r·^ ro Ti Ό «— Ό ·—

•r-j _C -£Z «— -C

v-' >- >- _J _J >- _l _l m ·—' ·γ- -f- -1-

m -< -P -M -r- +J

O O O -P O

iȣ O O O O

^ ·.- ·γ- o -r-

—| JZ _Q ·ι— -Q

_I ··— -1— _Q ·ι-

30 ·Ρ -P ·ι- -P

<C C C -P C

(— (O ro C ro

I I ro I

c_> c_> i o o o o o

CO CO N CO

I I CO > :to -p +-> o -p

E

-p ai c

CU

E

(Λ 3 P k </l

'c 1—( n (N CN >—t CN CO

,Ξ O fcu CO ¢0 CQ PG

fO

>

CU

4-> m

ITI

in m m m m m in >- 85148 _ o o o o o m R ro vo r~ r- \o

+J X

5 1 ^ Ϊ <0 £ $ £ cT1 S3 f § jy S -? § i 3 -M <r~ -P ·γ— (N -r- 2 2 te irrin- Kr- E I Ki m

O >» O >, S >, z^y Z=U CJ

O r? Q >, O >, Em E -

OtfO+j O *-> 22 2 2 (N Jj CN 3 CN 3 n ω ro ro <N 1 cn "*? cn rN in ~cn n Tn ÖVSV g Ϊ g § g ö g „ B-8 S-8 6-8 B-8 6-8 s~ ^ (N CN CN CN (N g ^222 2 2 :o +j ^ KO KO ·Γ- .^.,-

3 **5 C CC

—J t—i CD 'r- *r— *r— w r-* ·«- ·γ- *r- T3 T- *- C E c 11 rö (O Π3 * VO -I -1 Γ- --

J3 CL Cl CL

O ·«- T- O OO

r-. _ r^+J+-> ^ 4-) 4-> *r- «I- T- o o ω <v qj r-ϊ -JOO 4-> -m -*-> y ·γ- T- o o o

y 'r- _Q JD

=: 4-> * r— *r- n no j +J +J 4-> r- r— 1“ =Ξ O c c cn cn cn 2* O ^3 ro O O O) S *f- I I -o Ό “Ό

^ -O O O I II

•f- o o o 00

4_> CO 00 N NN

C I I 00 CO CO

fO +J 4-> O OO

:«T3

E

0 4-> <u c <1>

E

CO

n 4->

CO

•jr in ro ro r-H rH

E < PQ CQ pQ <J PQ

f— rö > <u

P

</> 00 cn o th r: m m m vc \o

TD

JC

>- 85148 S-5

O

4-) c ra o o n* o r-~ o <o rr vo co ov co oo " i \ > * *>> 4-> •Γ- rs CN CN r- .Ω

—- ffi >> I

ro g >, 4J -r- CN ·!— I“t N* 4-> JL i— g I— CC — 3 o >, g VO (N ro _o O >> O >,

O a E I U 4-> U +J

^ ÖÖ -P <N 3 CN 3

g ' Q I ^ JO -Q

ro te ö 0 cn i tN i ’’"rv, |“ö 8N gi sr ω § 6 5 S-§ S-§

c CN N (N CN CN

« g 8 § g g :o

n 4-> CO

3 x: vo 3 :<o _J <U ·»-·»- ·Γ-

+J *r- ·γ- 4J C C C

fO CC t/l *<— *r- T- •f) «r- *r— ·γ— *r- τ- *r—

' »r- ·γ- Ό C C C

C C -C f0 ro ro M (O Π3 >- r— τ—

^ ι-h i— i— CL CL CL

^ Q. CL O O O

O O O J* -b* V v/ V <r- <r- «f— -r- -r- ai oi ai ro «li ai +j 4_> +j _l o o o ro o o -* < ^C 3 3 3 I— 3 3 r- r— I— r— i— cn cn cn

cn cn ai ai <U

ai <u -o ό -a Ό T3 lii il o o cj o o o o o

Crö N N CO CQ CO

E co co il i r— O O 4-> 4-) 4-) O) 4-> ai c

CU

ε tn 3 4-)

r-l ro (N (N ro CN

e CQ CQ &< CQ CQ CQ

r— <υ

+J

(/) cni ro m vo r-

•r- VO VO V£) O VO VO

"O

JC

>- 85148 o et'- es vo ro .—I ι-l oo σι co vo σ\ o’ »o oo m K m in in VO K E 32

O VO sO VO

JN U U U

Q ^CN

^ JO § § S

g g O* ~—· es co es co es co

^ '*04 (O ^VN δ S δ G δ G

_ i Il s g· „ ?-§ SJ ?J

I 3 l·8 S §-S x~ x- x- a3 ^ oo •Γ-J *r- ^ Ό

CNJ -C C\J CNJ

(M ^ C >“ <C «C

*“* •r— *r— ·γ— I *r τ- Ο c c c O c c ^ T- -r- -r- ^ T- T-

^ -r- 'r- T- 3 ‘r- ΤΟ C C C r— C C

_J rö r0 1¾ O rö l <0 O r— i— r- O) r- O f— C Q_ CL Q_ Ό Q- Λί a

h- O O O I O CJ O

•f- ‘r- *f— rvl T- C7) *r- φ <U QJ m η) m n>

+j +-> +J o +J *O -M

E

0) 4-> <u c <u

E

i/i

E CO CN CS O· CO rH

ti « Cm rt! C m CO

•r“

E

(O

>

QJ

-t-> w co σι o γ-h rs co vo vo r» r- r-' r- x: >- 85148 «ςρ ο Γ' (N CTl ΓΟ VO OOVO 00 M* ΙΛ <Nf*^

O

+-> c <o ro

<N

"l< θΓ-ΝΐΟΟη-ί i CM (N y I I / 5 2 5 a: — ... . / m n i ' 2 'r n cm i — —. . i vo

—’O CM CM CM CM .—- (N

9-8 eT 9 S S 9 -g· § n. 2 ~ 2 222 ii2 ai cm 2 cm cm cm cm 2 -Γ4

c K S» K23: cm K

'5 * :o 3 -t .;: +J cc

„ <Ö (O

•r—i T~~ r~“

CM CM CM CM CL Cl. CM CM

n <c <c«< < _g ° cc^c ’ * ., .,— ·.— 1 r— *i— ‘1 ‘1 ,r” c CC C OI <U cc O ·γ= -r2 -r- -"+->·£

S »i— -r- -Γ- -r- O O ·£ •’Z

V C CC c. -St SS

^3 (O rOfO fö 3 3 ^ ® =ί 'ο.'ο.'ο.'η.'σί'σιο-ο- < ° oo o a; a> o o ^ ί- t- »r- *r- l i ·*- a> ai ai oj o o

+j +J +J -P O O 4-i+J

CO CO

II -P 4-> t(0

E

Γ“

CD

+J

0) c g

CO

| «r «r «r* <r «r uT «r «r

E

«5 > a; 4-> ιλ^ι m vo γ~ oo crv o·—i ·>- r~ t~~ r~ r> r" oo oo "O JZ >- 851 48

O

Μ ro rfroc>fOtHvooorHr-

ro OO^OrOOOO^VDinVDrO

UO

r-4

CJ iD ID

se <n (n k x •—’ <0

m m o O

x1" S S

1/ \| 1/ 4 8 Zm =>- *? *?

PP I riÖG

<u «N ™ r» CM tn JN (N

c CC S3 cnj S3 CO S3 CC I j • r— ^ *2

-—^ Π3 (U dJ CM (N

Z3 :o +-» +-> CC S3 Z3 -M ♦<— c/ι en j= e ·ι- ·<—

M :ro 4r- “Ό TD

rö —J *»- jC -C

•O C >- >-

>— C\J rO OJ (X) (XI Cx C\J

C r— e «C < <t <

M CL

V-» M-* O 'r“ 'i- 'r- V| ^ e e e e e e O »r- * i—’ *r— * f— -f- *r- *r- ^ *r- d) -r- -r- -f- v- T- 'Xi E -M e e e e e

^0 roo m rO ro ro rO

—| i— Jki r— »— i— '— '“T

ZD CL 13 CL CL Q. CL CL

< o r— O OOOO

I— ^ en •I— QJ *r— «f— *r- ·Γ— *r- <D XJ Φ QJ <D <D Oi

Ml -M -M -M -M *M

< CJ

O CO I

:ro m

E

CD

M

ω e di

E

I/) 3 %

•M

r-4(NCNfOCNrMr-(CS^r E <CQW<fc<<<<

(O

> ω iNnrrm^r^coc^o 00 00 00 00 00 00 00 00(7« T5 >- V? 6 5148 o 4-> £ V£> rs· (N CT\ 00 U5 (O (n r» Tf n TT Tr <n »—i y

-_· (N (N (N

Q S ro ro ro ·> g S § ™ ^ g" 5^ 5· ^ y

—' ö ”"c\J (N (N (N

g f ^-8 g δ g g

3 J CM ^CN g ^CN ^CN

J2 k se Ex KU: 4-> ro *»”5

C\J C\J CVJ C\J OsJ

»—« < C et *t <1

UI f—» I

f*·* »r- · r— · r- O * r— *·“

o e e C-^CCC

N< *r— »r— *r-“ 3 **““ ‘f- ,f"“ N/- ·γ- * r~ ·(— r— ··— T- *r-

z=> C C CCTiCCC

_I ro ro ί0Φ<ΟΠ3ΐτ> ZD r- i— i— X r— «— i—

C Q. Q. CL I CL Q- CL

f— O O O O O O O

^ ^ O ^ ^ • r— ·»— *r— CQ ·*— ·«— *r- Φ o; a; i o) o; φ 4-> 4-> -*-> -+->+-> -P +-> :a3

E

ω +-> <u e

CU

E

CO

I <r «r «r af *r -r*

E

ιΰ <υ ti γη cn en *r m σ\ σ> σ» σ> σ> σ»

TD

>- 85148 o

+J

c

ns i-t ro σ> r-t ro σι TT

ns t~~ ro es vo vd cn vo i/)

(N

Q

s=S « o» z k c ro vo

— U

fö (N (N

5 5 5 CO CO CD CV» JZ CO ^OCncOCOOO^f

Lj oi Ö—O cd cd cd cd cd

s +J T 4-J 4-> -M 4-> 4-J

3 00 2 00 CO 00 00 (/) 3 *1— CN *»— -r— ·«— *r- ·»—

"O T3 “O “O “D "O

jz xz sz jz jz ro >- >->->->->- ,r~3 r- o ·»— o c rs *r- ^ r— ί- ξο en e _J <D ro Z3 "O r- C I Q.

I— O O

O ^2 CD *r-I CD

4J +J

:rö ε r—

CD

4->

CD

C

CD

ε 00 3

4-> rH Γ"** rH rH »-H CN fH

ι/i W rt! W W M w w •r- ε Γ“

(O

>

QJ

+J O rH (N Γ0 co r-~ oo en o o o o

• f— OV Cn OV |H rH i-H rH

Ό .C >- i 8 5148 o 4—> c ro vo in

rd 00 CO

CN

§=ώ g ro 0) LO fN Γ0 .= ° So

ro trr Q

:o a> ^ Q

4-> +j 0 — 0

*—h jz co I

3 :«d ··- 2: .

=3—1 TD ™

jz X

•4—> >- rd >r~>

P· CM

r— ·— *=c o c ^ ·ί- ^ ·»-

=3 C

—I iO

ZD r—

C CL

! , , rd =>

OJ

4-) oo ** u"> •r- o o

“O rH rH

-C >·

HPLC-ANALYYSI

78 85 1 48

Seuraavassa taulukossa on esitetty keksinnön mukaisten yhdisteiden tyypillisten esimerkkien Rt-arvot.

Kokeet suoritettiin laitteella Varian model 5000 LC-pump, 5 joka oli varustettu 20 pl:n si1 mukkainjektori11 a (loop injector) Rheodyne Model 7125 ja Perkin-Elmer LC 15 UV-detek-torilla aallonpituudella 254 pm.

Kolonnit: esikolonni (1,9 cm) Hibar LiChro Cart 25-4 Merck, ennakolta pakattu LiChrosorb RP-8:11 a ( 20-30 pm), jonka 10 jälkeen kolonni Hibar RT 250-4 Merck, ennakolta pakattu LiChrosorb RB-8 (10 pm).

Eluentit: A, 0,2-prosenttinen vesipitoinen HCOONH^ ja B, CH3CN.

Injektio: 20 pi - Virtausnopeus: 2ml/min.

15 Reaktiota seurataan injektoimalla määräajoin liuosten (tai suspensioiden) näytteet laimennettuna 1 iuotinseoksel 1 a (CH3CN:H20, 6:4 til/til) siten, että lopulliset konsentraa-tiot ovat joko 1, 2 tai 3 mg/ml.

MENETELMÄ A: lineaarinen vaihegradientti 5 %:sta - 75 %: i i n 20 B:tä A:ssa 35 minuutin kuluessa seuraavan oh- jelman mukai sesti :

Aika (min) B:tä A:ssa % 0 5 10 23 25 20 30 30 50 35 75 MENETELMÄ B: lineaarinen gradientti 5 %:sta - 60 %:iin B:tä A:ssa 30 minuutissa.

79 851 48 MENETELMÄ C: lineaarinen gradientti 20 %:sta - 60 %:iin B:tä A:ssa 30 minuutissa.

MENETELMÄ D: sopivat kromatografiset olosuhteet kaikkien teikoplaniiniamidien vertailemiseksi degluko-5 teikoplaniiniin.

Automaattinen HPLC-laite: Hewlett-Packard mod. 1084

Kolonni: Hibar (Merck) LiChrosorb RP-8 (7 jjm)

Virtausnopeus: 1,5 ml/min.

Eluentit: A, 0,02 M vesipitoinen NaH^PO^/CH^CN 25/75 10 (til./til) B, 0,02 M vesipitoinen NaH£PO^/CH^CN 95/5 (t i 1 . /1 i 1 .)

Eluointi: lineaarinen vaihegradientti 8 %:sta 60 %:i i n B:tä A:ssa 48 minuutissa, seuraavan ohjelman mukai-15 sesti :

Aika (min) B:täA:ssa% 0 8 40 40 45 60 48 60 85148

ιηίΝΓ'Γ'-^οίΠΓ^ι—I «K r^r-iOOCOOlNOOOO

* ^rinvocNinroroo 1 λ: ........

“I rH i—i f"l t—I r-4 t-4 r*4 τ—1 τ—1 *Γ“ >, 00 >>

00 O I

<n a) o

CICU C\J

Φ (VJ X

Cl mH'TNmt'VOl/l ’r-

,r" Q C * ......... +J

-1-51 o* in mvcoominn^TCTioo

+JC0·'- (NCNCMCMCNCMCMrH,—t E

tO ~0 QJ

(O I *r- c

*4- 'r- E O

•r- r— (O Q.

>— >> E

rO >> —- O

---- +>·!- Jk: «- ai r— ·>— W >, r om>, mco(\icnvoincNcor-i cm 1 I <λ « ......... c <-< ozo τι· muiooc-Jinoi^ooco

1-1 ·“ C NINNOIINfNNHH

i—i C_3 C to sz ,-^j O S- O o t—J >, 00 il CO CL c 1«C O ro id c « c r-

_i o ·<- c CL

ID r- ro -i-O

<c>>E criinnN'Tr-r'rC'i ·σ I— >ι I * ......... -f- ··- ό </> cd ro n^r^r-r^i—i<n[^-ld Ξ αι

»rt O I (NCNCNCNCNCNCNrHrH .,- ro H-J

«Λ C 4., O ro +J 04 06 ••-J $- C 1) Jj

>, C · _ C

·> C- ® C o 4 r-' ο -H Q.

i-h s: g e

^D *-r * OOCNOVCr-tCNCNOOO O

« — « CM ......... ·* > σι τ- (¾ ro^rr^O’si't-tcMr^vo c .7:

Oil— 4J CNCMCNCMCNCNCMr-lr-l r- ro

rO O >> ι/l O

-* C >, < 'r-

on QJ +J

E O irO CL S

C ro C E £ +j

• · I (O >— O QJ

NW L (u j*: s- < 1 >> H->

•Γ- Q. a) * CTinJ-^VOVOfOrH .-H «-r S

•r- 00 O C fH ....... . c c^c^cid (NmLDCTimcJr-i 1 in ·<- ··- •r-OUE <N CM CM rH (N CM CM rH C i— •1- (U 1— -l_ >—

c -σ di c S

ro I O ·<- -r- (O H-> 1— cm c on c,— _c CL I -Γ- >, QJ τ- CL 3 O Q E >> +-> ‘p 9 1/1 ^ 7“ 1/1 Lor-^Tf

‘r— \W I ro -Γ- τ—ICMCOnfinoOCMCM i— a> II

OJ \ CM C Ό CL H-> I— I I to -C O 04 ^

>- 7½ I

.— a) ™ * (0 +J < * * l: 85148 r* >> >> at 1/) (T3 *r~ Z >> >» C </> o o c CQ rd i- . ^ t^-rr^-iooLnoor^cn

^q ^DtTiin^rcerOLnrH

^£- « nco<x>rMm(M<NrH

QJC * * *.....

rH»Hr-)rHr-i?—tr-)rHr-1

E

(T3 I

(O Q

4-> ) £ 7f o T- ^ «= 00 o

(O

+j s: c ·> ΙΛ >, c

O ^ m £ cncMovOrHLnp' fMW

1 2 ^inoominromcNO

„ — ‘p Ph i-Hl—ti—tr-trHr-tl—li—IrH

___ s_ Jr -m *—· >» a»

«— a. +J

0 QJ

(TS C

>3 0)

<ö I— E

<o cn — -^° —.

— e -r- ^

- «Λ S

5 il >! ai ^ O I r— : 4-> ^ r-~ cm re) ιλ .

1 C »r- " * -a o ^ OJ 00 cn _I LO I .£= I^OOCnrHrHrHCNCN,^ JC o >- +-> •r- O _J -t-* +j <υ a. o -p TJ π: o O I ··-

O CM C

•I- I <L> ’r~ JD Q -r- +->

I- I TO C

P r (0

C ^ E

C I rt> 1 3 85148

A

UV

>>

P

<v :ia > ·γ- -P >, (O >> > tn ta O ro Oi CT\ (Λ r» +j sz o vo r-~ r~ <n

-p ro (N rr (N

•r i. .....

O >» '—Il—t i-H t—t i—I T-H

Jät CL

i- O

ia P Z3 Σ en 0 (O e ΓΜ -r-5 -r-

CO E

< (O

rö CM ι/i i en ·*— —*

O to C

0 ^-n *H iH

O CO E r^fHVOVOVOCN

λ <D ······ ^ "O :o3 vo in r** r- i-h I—ilE P*

C\l i— *P

• i <υ <V O 4-> > i <υ

«3 ςη C

ro ^— Cl·»

^ I E

1 £ ~ ·· >, tn to -p >> 0) >, cu to o tn i— +j ***

r~. m ia tn O

«-IC·!- Γ" zz ta ~o n ** m to t'» i-h > | t—i rH fH rH i—< r0 O >* t-3

•r- (O I

-P -P CL

-p -p :r ·γ- O +->

O O C -P

•I- ^ QJ o

J3 5- ·γ- O

r- (β Ό 1-

P -P T- -O

C E

<£ 00 (fl -P

e *0 ^ 85148 +-> ro > ro +-> +j 'q rr r-π <Nir>mv£>«tfr-o z_ (NJ H OfOVÖfHOVr-iin X tn n te n m (N cd n i—irHCNiHrHr^r—IrHi—liHr-t 2ϋ

rO O

•r-j

:<o cq E

CO #» QJ

00 e£ 4->

<U

ro C

t/J φ

oo E

| " ui

*~2 ^ o^Oin^oor^cnvDCN^tN

^ Γ-tCNCNrHfNr-tr-ir-HCNrHrH

m ^

<Q C

> ro ro l

rO O

Q» X T- c c •r- C 'f C 0) » *»-

•r- *r— C

»r- *TD <D rO

C *r- +-> r- (O E ΙΛ O.

ΓΓ'0 οοσιθ'-Η(ΝΓθ·α·ιηο'-ι ° Q <_^ ^ r-I^CN<NfSCN<NCSnn^ JX (O >- O) •r— *r-> -*-> cu αι σ +-> ε ^ O O 3 +J r— - a (O en t— >> <u

CT -M "O

<u ai Q >

'O

«5148 84 e) HPLC-analyysi menetelmän D mukaisesti (K' = tR / deglukoteikoplaniinin tR)

Yhdiste k1 5 (deglukoteikoplaniini (tR = 14,78 min.) 1.00) (tei koplan i i ni A2 1.75) I 2.09 10 2 2.16 3 2.60 4 2;13 5 2.15 6 2.06 15 7 0.85 8 0.89 9 1.45 10 0.85 II 0.88 20 12 0.86 13 1.00 14 1.03 15 1.05 16 1.18 25 17 1.05 18 1.32 19 v 1.48 20 2.48 21 1.36 30 22 1.44 23 1.38 24 1.99 25 1.49 li 35 85 1 48

Yhdiste κ' (deglukoteikoplaniini (t^ = 14,78 min.) 1.00) (teikoplaniini A2 1.75) 5 26 2.13 27 1.93 28 0.97 29 0.74 10 30 2.77 31 1.19 32 33 71 2.14 15 73 1.44 74 2.60 75 2.03 82 2.08 83 1.36 20 85 2.03 86 1.78 89 2.88 90 1.90 91 2.11 25 92 2.14 104 1.79 105 v 2.10 30 K'-arvot, jotka on esitetty kompleksijohdannaisille tarkoittavat komponentti 2 : ta .

35 86 85 1 48

Seuraavassa Taulukossa IV esitetään keksinnön mukaisten eräiden tyypillisten yhdisteiden happo-emä stitrausarvot. Kokeet suoritettiin Metyylisei 1osolve ® /vedessä , 4:1 (til./til.)· Näyte liuotettiin Metyylisellosolv /H 2 0:h o n , 5 4:1 (10 /jmoolia noin 20 m 1 : s s a ) , jonka jälkeen 0,01 N HC1 (2 ml) lisättiin ja seos tiirattiin 0,01 N K0H:lla samassa 1iuotinseoksessa.

Il S51 48 2· co ίπ vo m · . · ti vo vo a (N m UJ οοοσνιηοοσν tr ro co cc

Qj I I I I I I « i · · r» oo t"· co r" r» vooo vo r- rH in in ui « cn co «a* σ\ co n m m n n. at··»· · · · · vo vo in m m vo mvo in vo oo 2 in oo vo in σν ooa γη «a· ov o x ro m n vo ro l— E3 vo ro ro σν o oo roi-ι <h o ·—· co o vo vo r- o οσ> oo oo

> H- rH f—l rH

I—< 00

O X

^ s: ^ uj vo oo in cd r·^. Ξ3 · « · · 1 i o ro σν rH ro vo vo χ cm n* 00 ID CL. CN VO I—t (— <—I VO r~ (N ΓΟΟ X cl .—. σν o av o t—i >-i o oo vo vo I— X CN H N H N (N N CN rH r-l Ή Ό I ·Γ- •r— !— i. T- -α V- o-o o T- o -r" +J · r~ S_ -r- '1— D ·ι- S-

O +-> O +-> 4-* 1— 4-> O O

3 +Jl— -*-> 4->H_4J ι-πΟ1-; E r0-*0'a0f°'r-'° ΟΟΟΟΟ^ΌΌ^ί

Π3 rOOrQraraOS-OrDOOXJO^ P

4-) .S- -t-> ^ +-> 4-> +J -c ΙΟ <u Ό a» a> i <u i Ό 3 ΙΛ >» l/> ΙΛ T- 10 T- >1 00 < £ X ra O (O Q 3Γ Γ~ Γ'Γ'ΟΟΓ'Γ'-ΓΜΓΟΓνΙ

•CN (NCNCNCNCNCNCNCNtT

O OOOOOOOO CN

O OOOOOOOO0 rH rH rH rH rH rH rH rH rH O'* 2 222:22222:2

^ <N fN(N(NfN(N(NM(N(N

rH rH r-H rH rH rH rH rH rH rH rH

^ a uuuuuucjcjo o ^rrsiOOoooooLn ro co οοσ>οοοθΓ-ρ-Γ-Γ-»νι>

> Ä ÄÄSCÄSCSCSrÄSC

n3 r- o*rooooor^rH<NCNO

<0 r*» r^oor-r-r-r^r-r^r- ^ uuuouuuuoo <u oo o h m n ^ in Φ

•r H M f) ^ Ι/’) l£l Is OOONrHrHi-HrHrHrHrH

"O

x: >- 85148 on co κο oo HM · ·

Cu KO xf (N o ro oo oo co ^ σ\

^ «····· I

CU oo co vö r- vo r- vo o »H in m m ru Kr roiHO ^^or^vor-oo r- rr ^ ^ · I I I ······ ··· CU ^ φ in ko m m kd <cr κο κο in κο 3 4-> *iH, m m ro ro cn cn S rg o in ro Of-ivoinrsif-H vorno > W oo n in h (N h id r\ h σ» cn ro οί

k-, V£> νΟΓ-Γ"* 00 00 n* ^ O T-H t~H

r—1 r—I CN rH r—I t-H

O

03 ^ 00 Zj in rH ID N· N·

5? (N CN OiniO O (N (Ti in CN CN CN (N O

i_: ·— oo ίο o cn n1 n· cn cn r- oo mmm rs id cn in n1 vo r~ cn n o m cn n· r-

iH rH rH t-H rH rHiHt—I CN CN CNtHrH

4-> +-> 4-> 4-> 4-> +J 4-> 4->

r0 rO cO rO

fO (O c0 cO fO

I I 4-> .— 4-> 4-> 4-> I- f— -r- -r- ·ι- Cl) O ai OI Cl) ·γ-

X S- X X S- c/1 3 1/1 c/1 c/1 X

O ·ι— o ·γ- ·ι— O cO ι/l c/1 co cO CO *·— 4-> S- 3 ·ι— S- i- 3 ·γ- ·,— ·ι— ;cO ·ι— ·ι— ΙΟ Οι— +-) O O I— 4-> 4->S-ECi-S-S-0 3 i— If- 4-) i— r— l+-4-> 4-)OQJQJOOO)— E JCTiOJCjC'riO 103 C 3 3 3

cO OS-coOOi-roOOcOc— fO-r-i— i— i— O

r— S-4->4-> S- S-4->4-> T) T3 +) Ί- ro CIO 4- <+- Ή ΙΟ X I φ X X I CU CL) T CL ΙΛ T ·!-!- X

3 >, ·!-(/):>,>, ·ι- C/1 oot-cOT-S-t-S->>

00 -C X (O -C -C X CO C04-) > 1/1 4-> 4-> 4-> -C

r- n1 r-- t^-r^oo r- n- ,Η oo CN i—l rH i—l i—t rHiHO 1—l

OO OOO OO OO

cn cn cn cn cn cn on h oo 2 2 2 2 2 2 2 2 2

— CN CN CN CN CN CN CN (N CN

rH rH rH rH l—! I—l l—( t—I rH rH

~ UU UUU UOUO

n, rH γη h ci n γ~ m no cn ir co in co cc m mmm un « XX XXX xxxx « oo m m on ν' f n n (Ί v co co cd no m co o co co uu uou uuuu O)

ti r- co anoin cNm^mvot^coonOtH

-r- rH rH rH CN CN CNCNCNCNCNCNCNCNmCO

X

_£= >- l! 85148 r? ro ^ r- ττ <τ\ σ> ^ · · · · »

Qj σ\ σ> σι οο οο (N oojo (NincNtniriko ^ ··· ······

Cu c^· r- > Γ" ^ ^ ΐ“4 00 r“i τ-Η 00 »“H CT\ ^ ***** · di ^iDin^vo^r 3 3 4~> ro •ο > »—· ο S = °0 _ι

=5 CM

< - γ— £ ·γ“ +-) 4-> •γ- ·Γ- η3 *f— *r- T? Ό ΙΟ (Ο Ό Ό •r— »r— +J γ— «f— ·ι— i- ·«- i- <D ·γ- O i. t- -r-

O Ό O CO "O 13 O O “O

o r— ·»— r— <0 ·Γ- υο I— p— *r— 4~> ^ 1. ^ 'r t- ^ t- O O O O S- ocooo 3 L. I— t. O <— φ S- 1. ΙΕ Ό Ό 3 C υ Ό

(O >, O >1 t— O *“ >, >> O

r- _c: s_ _c= M— J- :<o .e .e: ίο I T3 I ·Γ- Τ300ΙΙΌ 3 *r- >, ·ρ- t» >, ·γ- ·ι— ·ι- >, 00 Τ3 -Ε Ό -*-> Γ ΙΛ Ό Ό £ k·

rH

ίΟ > ro 3 ω to λ a <ν vd οο en r-ί ro m •r- nrorovo ujvor^r^r*

“O

x: >- 85148 I · r— >> i— * :03 >> :o3 j* I >> co to to c o :03 φ +> o

Φ -Q

to C S- C *r- 03 Φ 3 3 •f- +-> -^ • · E to c

+-> *r- O ·«“ O

03 Φ Φ Φ Φ Φ -P Ό CL CL

>1— .— I— »— I— -P O E 03

fO .— p— I— ·— «— O 3 Φ -C

<T3 3 E »— £- rororororo -r— ro c ^ rororororo .— c >>

(UOOOOO 030 -P

tO 0^1 en CTi CTi O") ro r— > φ z z z: z z toos- +-> -P C\J CM OJ OJ C\J to O 03 >>

fO r— r— r— r— I— 03 tO *fQ

>00000 ··- 3 JaC

O m N N (Jl CO ·»- -P

CTi CT3 CT> CT> ΟΊ rö 03 03 C

-p n: ic π= n: m w -p «3 oj o3 co co co ^ σι :o3 to φ > CO CO CO 00 00 Q- --—^ ·"—" to <000000 o 03 3 > 03 3 3 S- +-> -p

•I— λλολ#» 4“> 05 to CO

I- n σι ro ro -c o

>> rv N rv Oi OCi- "O

>>00 00 00 00 00 -«-τ> Φ Γ03 o ^ ^ CI03 3

o <D :o3 -r- E E

CT> ,— .......... ,— -P v- c o m ro ^ in I— -p .— 03 E ·»- φ >> i—

•r- -f— c— O» O

C +-> +J +-> 4-J +J :oJ L :oJ 3

Φ -P -P -P P P > O P tO

OCCCCC 0> CO

•r- (D CD (D Φ (D C P -r- p 03CCCCC O C 03 P O O O O O > C <L) > to CL Cl Cl CL Cl S- ·»-·»- 3

•r- EEEEE 03 3 CL P

T300000 _C

c 03 o >> φ -I— +-> -r-j

C\J C\J CM C\J CM tO CL tO

C C C <£ <C < »- E *r- P

CD -P 03 > O

-P *r- *<— -I— -I— P CD CD > tOCCCCC Φ -*£ r— S-

·· -I— ·.— -I— *r— *r— -r— CD S- O fO

p* :o3 ·»- *<— -I— ·— -i— i- o 03 -p ccccc o :o3 -p-p

^ P 03 03 03 03 03 Φ i—· >> CO

O *r~ f— i— i— c— i— P O — -P CD

0 oO CL CL CL CL CL ><D (DtO

ooooo «3 i- ·»-> · p ^ >> ro <— -r- 3

_I -I— -r— -r*- -f— -I— o to fO

CD C Φ Φ Φ Φ Φ C 3 ·»“> > Φ £- 2 -r- (-1-(-1-(- 3 +-> S- 4-> ' </> T3 (O C CO CO -r- 1 ^ to <o o </)+-> LU CL) rO to Q. C to

CO — </> --- (0 d> T- C

^ CL .C E 3 O

Er O fO ‘1 f— ^ C S- -l-> C +-> 3 4-> <C uj to >, +-> i/i ς o +j <u c o ^—* ----- r— QJ Φ '—^ 3 (XIO+JS-004- 85148 ro Ö «o §o o o o in m m in ui in m m i—H i—t i—1 »—1 ? m O · · · · · ·

cT

o o o o o o •Γ- O ^

r— C

o <υ •r-J μ- 3

Cr-0 o o O O O o .« ST 00 O 00 O 00 O CO O 00 o en o cU ihld h in t-ι ld r-» in t-π in *-h m -v i—i c> rH en ι-h en i-ι en rH o> rn o> 5 ^ <i <i ci ö <i ö ci ό ό o ό ό

___ UlDC N H Γ'' (N r-CN m CN Γ- CN l CN

O O (N i-l CN rH CN rH CN r—4 CN rH CN «H

I i v tQ rH rH rH rH r-H rH rH rH rH rH rH rH

O >> > «— T- en

<*1 H

CtL H

^ M ·Γ- o o o o o o

,,2-σ rH rH r-H rH rH rH

> I!, ·γ- m m in in m in

E *H rH rH rH rH rH

O (O

y "r v ro _i

3 H

*“ O ·ι- in m m m m in jT-r-i in in m m m m (j vo vo io vo vo vo

^ £ rH rH »H rH rH rH

fO * ^ g e > o o o o o o

rH rH rH rH rH rH

S -o e ro ro ro ro ro ro ^ m e ci ci ci ci ci ci

O -r= o o o o o O

i— [h. Γ' r~ p* p- >, o n ro ro ro ro ro

r- C

σ> a» u_ <u H-» rH cn ro m vo -o

JC

>- 851 48 m in o o m o r o m nr m ^ rH tH rH f—I i—f f—(

Γ0 rH rH rH »H r—i rH

&»* * *· ·» a» % o o o o o o to o o o o o o

^ <N CN CM CN <N <N

»H rH rH »H »H rH

8 m mm

I I ΙΟ t l£> VO

U VO VO VO

^ «H rH iH

C

CU

CO · * # · « · ·- T Λ Λ Λ Λ . Λ Λ Ορ Ο 00 ο ο ο φ <4-

C

φ O ο ο ο ο ο — c τ m ο νο οο ο οο ο οοο

Ο ·*“ O r-( ΙΟ r-t H ITI rH U0 i-Η LO

03 "O o i—t en rH rH en i—i tn rH en

-* - - I I II II II I

+ΗΙΛ^ o o o o o oo o o <o ok r^-rH m r- o no r~o

•r-) ^ O CN rH CN (N rH CN O CNrH

'—y >> <-0 i—I f—i rH rH rH rH rH rH rH

n» en ™ o _

en ^ H

h ro —i ffi ,r_ m mm m m m

13 52 T5 rH rH »H »H rH »H

m mm m m m

E iH rH rH rH iH iH

rö M* S«r- m m o m m m "o m m m m m m

•f- l£> id VO VO VO VO

£ »H rH rH iH iH rH

> <d id fc •r, g c-s O oo o o o Φ ^ o oo o o o

S CT rH iH rH rH rH rH

g t- e n m ro ro ro ro > ? Z ci «ici ci ci ci </>··- o oo o o o

Or— r- r- t" r*· p* p» o ro roro ro ro ro >> e r- φ en 4- Φ H->

(Λ O rH CN

>r- C 00 ON rH rH rH

Ό -C >- ro 85Ί 48 & 1 1

i <ö O CO

IN rH

| rH »H

? t I 1 o in o o

CM O »—I rH

C * * Φ n · · · o o c Y .0 Λ Λ m co

•r n · · * CM O

r— Q Q 0 T-H rH

g ? dl Ί- C Q o o o οι Y m o Tr o LO o cO <h<ti h m h σι *r- rH ΟΊ r-i ΟΛ i—I ΟΊ 3 TD ^ «,| - | - I t

3 t- * O O O O O O

</i se ro o roo m o

4-1 O O N H CM rH CM rH

1¾ rH rH rH rH *H rH

Ό

^ CD

s > —

Oi uj

§ H

JO >— LO LO LO LO

—1 2 Lj t—I r—t "—t rH

-J £0 -r- LO LO LO LO

O ^ E rH rH rH rH

<C (O

t— w

LO

ro ^

— ^ T

- · M rH

M * QJ

S·-- io in in +i in

Ό LO LO LO ^ LO

•r- V£> VO VO ω VO

E »H rH rH rH

^ ro Π3 v - g CO o o o oi ;> o o o o

ffi C i—I rH rH rH

g ·>- c ro ro ro ro O <u i I I l

^ >- C O O O O

l/> T- o o o o or— r- r- r- •V o ro ro ro ro >> c I— 0) σι Ί- αι 4-1 i/) ro ττ m vo oo

•r- rH rH rH rH rH rH

X3 J= >- 85148 mom ro co

rH rH

rH i—I rH

Γ0 * * * I

bo O O

III o o o

CN CN CN

«O H H rH

» P lii m in m o < VO ID VD Ιώ vo vo ιο in

rH T-H rH rH

om o om o om om oo o o o vo o o oo

CM O CM CM O O CM O (N O

t— rH rH rH rH ,—* rH rH rH rH rH

QJ H H ^ * H * » < \ S

cO oo o m oo oo oo om •r- T noo no n vo Oi-h co vo coco

r- O CM O CM O CM O CM O CM O CM O

O rH »-H iH rH rH rH rH rH rH rH rH rH

c ? <u 4- S o

U

— -Op, , I I I I I

3 ·<- I

O <Λ * X O $

H-> H«C O

fO >> «o •r-5 r- ^ CJ>

> H

O M

S/ *|— K -o in m m m in in

—) 2 #r_ rH rH rH rH rH rH

_I <o c m in m m in in

—, ^ rHrHrHrHrHrH

<t h-

H

S -5 o in in in m m in in in in in m

p VO VO VO VO VO VO

p rH rH rH rH rH rH

fÖ i -» a c o

dl O O O O O O

O o O o o o

ffi <r- r“ rH rH rH rH rH rH

Z-acu ro ro ro ro ro ro * -5 i d> i i d, ^ o_ o o o o O o J2 o p* p- n- p» r- p- >, e co ro co co ro ro I— CU σι 4- cu +-> σν o rH cm ro M·

-O rH CM CM CN CN CM

x: >- li 85148 m m m ; co ro ro

f rH rH i-H

Γ0 L r-H rH rH

b* ^ I ^ ^ | O I o o o o o

<0 (N CN CN

rH rH rH

i i ^ o o o ?* vo <o i vo l l vo vo

r—( t—I rH

‘ O LO O

O O 00

CN O O

rH rH rH

C «% «* * O) O o o · · · o o

c T ro vo Λ Λ Λ , ro rH

; ‘i- (_) (NO · · · · I CN O

i— rHr-tOO O i—(rH

O ? c

CU

*♦- I

i

CO o o o I

CU T CO o o o o o r-^cö h m (N i/i cn m

3 ·!- _ rH 0> rH ON rH ON

3 xi ^ 1 I I I lii I

-V -r- » | o o O o oo H-> c/ι κ r~ o m o vno

fO o O CN rH CN rH CN rH

'Π JC rH rH rH i—1 rH rH

— ^ VO > _ σ» o h

H

iki =3 K -r- m m o omin

_I Z Ό rHrHrH rHrHrH

33 v- mmm mmm

flTtoE rHrHrH rHrHrH

I- «O

M

St- m o o m m o xl mmm mmm

•i— VO CO VO VO VO VO

--- ΕΞ rH rH rH rH rH rH

S S

o o o o o o c P o o o ooo pa CU rHrHrH i—1 f—1 I—1 g c ro ro ro ro ro ro

-r- c 111 III

^ Ό QJ OOO OOO

•I-C OOO ooo νο·ι- Γ" Γ' r~ r~- i— t— o f— ro ro ro ro ro ro o >> c f— a» CD <+- ai 4-1

IS) m VO P- 00 ON O rH

r- CN CN CN CN CN ro ro

XJ

- - -C

>- ro 85148 b <o § c

^ Q

£ Λ Λ Λ Λ ,Ρ A

o _ o o o o o e ^

CU

4- £ Q o o o o o

,= T CO O (Ti O (TO (TO (TO

O t-ι n i-( τ i—t rH »3*

„—, -T-ι rH CO rH CO rHCT r-IT rH CO

3 ^ It·· Il II II

3 tn * , OO OO OO OO OO

J2 o S tri i—( in o n o mo r-o 53 J2 O (N r-l (N r—( (N i—( (Nl r-Η (N 1—( rg 1—( rH 1—( I—t i—li—( 1—1 I—1 r-H i—t Ό i—

--- OI

VO _ <* > h

° H

S -5 o o o o tn

—-n 2 f-H rH t—l t“H O

u-, t= . m m tn m

^ ^ S -H rt rH rH rH

< w h- ----- 1—I --—- I—| —. li ·!- Z. ·!- H (D Ό O) Ό H-> v- 4J ·►”

Qt-i tn o tn ιλειλε

Tl r! tn tn m a> (¾ at m O £ vo vo vo '— ^ 3 m Ή rH r-t > ra o o tn o w ro LO (N tn t— vo r·» vo

rH rH rH rH

" g r- -> o o o o o «a3 ° o o o o

S I— rH rH rH ι—I rH

Z .r: <- ro ro ro ro ro -σ ω JL I l l l o o o o o yl o o o o o o ,Ζ Γ'' r- r~ r* r- ^ q ro ro ro ro ro >o c I— (U CT 4- .2 (ΟΛΟ

tl <N CN (N CO rH

m m ro vo r- o sz >-

II

85148 co b o m on

°o CN H

I—I rH

c ω c o · o o o o

•r- I _C| CO rH CO rH

<— O · CN O CN O -

O -> O I—4 T—4 r-H r—I

C CU ΜΙ ?

^ ·Γ- O

i £ p ^ in ·* ro

4-> O K O

ro j*: o cl o >o Q- —r F— ‘O Π3 en -e ro CT OH Ό ^ H > ^ ro r> K 'r· o in in +->

_J g Ό r-t rH r-H CO

o o- m in m o «C Ό E rH rH rH Ό h- ro o -r ^

r— E

t—I

<r- ro —. i- ·γ- ro m ai ~a — +J T- o ST- CO E O o =5 tj ai ro in co io

•r- w v-^ VO CO

E r-t p-t H-> p ro in m ro τ cn -o· > r» co ro «—I rH H-> h-> •r- ‘ o m $ H-> t-j o J- ro p o o o ro > e o o o 4-> o g QJ rH rH rH 3 g e ro co ro +J >-»

•r- C | I I O

O X3 O) O O o > = •r-c O O O s- Ό en ·γ- r* r- r~ ro cu o f— ro ro co cl o ro Cl >> e u. ro I— CU C_3 r— CT «4- UO ^ ·· > ai oo ro o H-> CD T-J = m co f" ao i— •r- i" r-> r~ ro n X) =£ o sz s: o >- O 0-0 n *o 85148

CM

o z O) (N o co ro oo p co oo r* co

00 CN CN CN CN CM

"O

JZ

>- 'e' c

CM

fO I

00 E — σ> — O *—

Z CO

P I O 00 O O 00 0 p lt> οορ-οοοοσ*

r 0> C\J CM ON CM <N CN

rO 0J

1 P (O

> 00 t-> ZD .,-

.· "O

»—I

> >-

«3- CD

O n a ^ rv.cn 3 = x a. o.

<c I— i- s- 3 3 k l/l l/l 3 3 Q. Q.

·>- (H 4-> +-> X

r- U 4J 4-> O

O X «3 Π3 X

C ΙΟ Π3 <a 2 4- 4- χ +J ιΗ ΙΛ «Λ i-l <L> · O O ·

E O 4- 4- O

I; 85148

SO

SO

OJ

., σ> o> to t/ι Γ- r- cr.

,)1 <N CN (N \ Ό

_C

>-

^ CSJ

E ro c u

CJ C\J

Λ Jj ro (/) VD VO VO O *· ^ *r“ (0 Γ-Γ-Γ-Γ-cn

ro -α ·η> ™ CN CN <Ν CN

E -C

o> * o > i- fO <0

I CSJ

> ro .. ?J CN VO VO o M (/> Γ-Γ-Γ-Γ-σ.

5, -r_ CN CN CN CN CN

"O

O J= ^ >-

2*C

=>

—I

ZD

<c t— «a- cd f« #* r-. σι i» :r rc

O. CL

•f— T“

U

_*! </) 10 3 3 CL Q.

.— Ή 4_> +J

- y ^ ^ g o ® <0 (O ^ C _ ro Π3 rt, Z (+_ 4_ ^ +J r'"’ l/l l/> r-' CU * O O * e ° «v- m- ° 85148

CD

?? O O 00 „ 00 00 (Π

00 fN <N <N

•Γ"

"O

.c >- cr> to

E OJ

C -P

to Λ ,r_ o o O V£> ^ CO 00 00 O'*

<N CN fN CN

f0 >“

E

P

O ° S £ fO 00 I «3 > ro ai -t-’ o o o o oo ‘ ^ oo oo oo oo σ>

1-1 ,r· <N<N<NCN<N

> T3

_C

o >- =5 _l ro «c

I— «3- O

mt r% 2C 3=

Q. CL

•r— »r— P L.

3 3 ^ J* to V) 3 3

CL CL

•r— *r—

,r" rH K

r- ^ 4-> -P O

o m ra ns vj

C (O fO

ro 2 <p 2 4-> rH 00 to p-1 0) · o o .

E O <*- <*- O

li 85148 co α> —

! I 00 σ CO

ιλ r- Γ' σ

CM CM CM

•σ si >- c\j .

^-s

E

c <υ +j ·> t/i ιλ .,- σ o co -rj r» oo σ

ro J= CM CN CM

E >- +-> O > s s I Γ^» > r=> a) σ o oo -. .r- r' oo σ

> -o CM CM CM

_c o >- ixi =3 _l =3

C

K- O

A (I

P>* CTi a: i 3:

CL CL

•r· *r— t- S- 3 3 1/) </> 3 3 CL Q.

*r- £ rH £ £ a

Ο υ £ * O

C * «J «J * +> * v> v> * <u 1-1 o o ^ E * 4- <+- ’

O O

85Ί 48 00 r*·* Γ".

4-> 00 αι σι o oo , a> ίο Γ' oo σ>

, 4-> ·Γ-5 CM CM CM

i V) I -a .c >- E io c r-» « <υ σι

(/) 4-> O O CO

(/) oo oo σ

(Ο : ·ι- (O CM CM CM

E 1 Ό >-) -i' 1 -*= -< j >-

+J

0 CM > O S-

1-1 (O LO

1 r-~ > =3 0)

+J

* t (/) O O 00 1-( .r- 00 00 σ

> -σ CM CM CM

C

O I >- ^ i

=3 I

_J

rD

c I— o n it cr> re re

CL CL

•I— *r- 13 3 J* ^

to CO

3 3

j CL CL

•r- +-> 4->

I— Ή +-> -M 3C

O U rö rO O

C ® fO <0 W

Ό _ **- _

+-> 2 to oo Z

Qj Ή O O ^ E · <+- <4- o o 1: 85148 00 o o O o 00 00 o CU fN <N ro +-> ^ co

i S

>-«I

to rt) ε *3-

^ CO

4-> O CO

•p o» c\j oo r* o

0 CU CT! (N (N CN

> s ro fo -5 ^

1 JC

> >-ra

l—I CVJ

> CO

o tu id ai ro id +-> oo ^3 LO O 00 <Tl O Γ' fλ I ·γ-(0 co Γ' Γ' co

-J rr TD-r-i CN CN CN CN CN

σ 5 -C

<-* «t >- I—

A

CO

00

LO

00 o * o o «— oo _ * o σ» σ> co +j r- σ>

<U CTi (N «N CM

<U rt) •P ^ O CO 00 •Γ- (Tv T3 .e >· «d- o r n r-. eri a: n CL Q.

•r— ΤΙ. i- 3 3 -V ad to ΙΛ 3 3 a. cl rH -M +j «

<— M -P -M O

o S 2 2 « C rO 03 Π3 Z M- 2

- +j 3 to to ,-H

ai . o o .

E O *4- o 104 85 1 48

Taulukossa VII esitetään ^H-NMR-arvot, jotka saadaan 270 MHz:llä Bruker WH-270 Spectrometer-1aitteel1 a DMS0-dg:ssa 20°C:ssa, näytekonsentraation ollessa 20 mg/ml (sisäisenä standardina: TMS, Ö = 0,00 ppm).

li 85148 p ^ >> α> -»-> >» (Λ ·· •r- χ ·— P 0(0 ρ -~·

« « P

£ 00 ίϋ o •r- E Xi 1/1 ir c o oo -r- O' •r- i. «XI · •i- (0 r-ι ,Γ~ 1-1 e ·* — +? <0 '— ... <3- --.

• r- ·ι— Φ

(/1 C ^ <— Q- "ΤΟ ·ι— ΟΊ ’— C

O'"-· 'r'

3 (O I fc _J E

,— ·<- I JZ ^ (0 CD *' (/1 1—1 >, " M— ·,- ^ o ^ i- ^ (/1

«— Χ O . ·(-! I O

p1 ^ 3 ^ ^ 3 φ 04 cn "* P · I— c/ι CJ * < αι (Π cn (0 — <— ^ >1 p — Γ- (3 >1 ·· · >1 ° P X _ C· >1 r~ i—I φ o ok +j

00 . (/1 Ο I OJ

. m rap · vo 1/1 p —' °J 04 04 ^ _ .* .£ u " (/) ·«<-» f^-CJ ~ ' ' °

</> JE ON ·γ- VO ON

• · [-«* · 4-> ON ON · o*> ~ - &

φ ~ · -3- m .. K

>—i a p .—. ·« I

> *r- 00 I—I -—. VO

_ o· 'Tin 3 O' _ ^ 3 fN

O e >1 -3> . 3 K o rj _ 1*/ Cl >, P · Ό 7 P ci ΙΛ ^ Cl (/)VT) Ojin ρ I φ OO (0-— P I Φ O' 3/ p _1 - w P ·(- VO P OJ —‘ ·ί- (Tl 3 ^ ~ c ^ := H 2 ·£ °.

^ 2'3S ^ ^

•I- *00(0 (/) VO p (O

i- rs) o S- —' ·«. ro m o w,* p ca. Λ W . S- ^

-* * Jr oo in p K

Q- ^ΕΦ °:π3 0.«4J OI

(/1 '— on »E O 3 φ · O» . ·Γ- 04 _C · ·(- (/) OJ Ovi £ - ; S . £ "SI .2 f . . s « § - i s « T- θ' n E *3· -r- N IO m 'S' O'

«— PO ·ε 04 ·*- E « (O

,.»,5- p "3 · J3 p P · _1 (O ,p" _J O V— |Λ . ^ <— , O (O _ I OI — - >, I — ' ro k n >, oio vf .« P U O 04 ^ P ·— O P^ • l · 'Z *7T · .£? O' · ._ p K p*®.,— »—i l_ · i—i '-'O' ' C >1 ^ ·(- - t » o - >1 I ~ -e

01 p n inoop oopov ·ντ E

00 04 Γ0 00 P P 00 ω 04 00 rt • · · ·*ο_ · ij · · oojvo o ro o JS VO o1- Φ to (0 Λ •r- P 04 04 ro X) jr >- 85148

O I

I o o o c o o c c

C (T3 C

c E Π3

03 s— E

E ^ σ\ vo ·* σ> n* · · 33 • m m ( ΓΟ \£)

·* <-N CN

** ^ ^ P O

*r- ·»— T- w c c c ::= S o

C — E E O 1-H

•i— tn <TJ Π3 t- ·

•r- , -r- ·Γ- Q- ID

r— V0 <Λ 00 or; o o +-> 4- . f* o O 0> s. U ^ to —.

O >— 3 3 T- E

E Γ— I— +-> I

— o CT CD +-> ^ ^ — — ία 04

<N >, >, E U

w m >i >i o — . +j +j t.

" ·' S S *2 o

rO ^ (O CO

to *· E '— —- σο

00 rr I iH VO 03 LD

• · tr Γ" σι oo —· (N · · Γ- ·«* ^ Cr> (N u tH rH I * si w ro 3 O u «* ··* fO 33

-¾ _ —CO — . U

* ^ o ^ ' •O CL ’' ) * ,f—) 3 -— cl +j in +j —·!->·* vo cu 0) E +-1 — o ·—1 * -v ... -^i <u no vo ^ ^Ι^Γ^Ινο^ι r- O >,'r->>CJ>,tNtNc

^ -1- 00 T- >> O O

ilii- ro E ro to w +J

ro -m ^ ra ra -— o —I -* T- Ξ — _ — I- ro a> oo ^ o c a.

<C Q_ ΓΜ o CN · 01 ι-Η τ- Η- to ooomo· ·>-+-> · · in E gj

“= CN ^ CN ·« CN

Z cn ** to 4->

1 '»•i- * E O+J

□e m — oo E ora ·— Tf >, «3< f~~ CO I ra

. >> . CN · t" O

·—· a> rHCN cot- oo '—' U ·ι- to *· f0 ^ ·» r— 00 ^ 00 CM >1 »H00 »Hin H VO ^ iT)

• 00 ·· · lO

rH· rH LO rH· </>· rH ID rd Γ-

^ h ^ **—^ I

·% c^· ·% cn γη

00 ^ 00 ^ 00 ^ <T\ CN

• · *r“ · · (— · ·

O 1/) o 00 o CO I-HIO

CD

-P

if) n* m Γ" -a

XL

>-

II

85148

ο ω S

[—10 • 'jr n ^ ro

+? rS

·* Cl ·» t= — JJ — § K “-CC i-

i I -—· 0O

to σι r~ CG '

(N VO <N I O

CJ · U VO CO

— ΙΛ — (N · I U r~ o cn o — i

7—I r—i VO O

• · · r—I Γ0 in rr m γη ·

• VO

«te »te in £C —- ""ro ·* i ,r- k +->

cn S i l S

U c Z r- 3 — c — . cn o g U s- «H J= O — Cl «> “ _ ^ • 00 * O qj (O in —- ^ cn ,—. m ^ 10 -t-> · 4-> · ·τ- vo "’Z m — ·<- m ό · a C 4r—

VO o —-o +J

r— O +-> ·- r-te -r- +J Q.

3 (/> ·γ- O — +J i/> o '—. qj 3 Σ toi- cn o i_ m q

LxC Q 00.5.0:00.3: -__ +-* o r) O ci rj o <u r-. o-t-iU+Jo+jU o ό E cailoocu· ^

—> Q- <a to S S- e to Z

O. E ‘7- s— O. --- .r- — m r— ·—· —' *-> +J 1 o ^ ^ a> 00 m ^ 0 rl '•'O *T % oJ! ^ ™ O · E . -r- · E · -I- · nc moco+JcnofNc"^ NC ·ί— S- -t-5 1- o •Rh j. <° j, 5 .te « .te +j .te 5 -r- „ -i- E -7- V- S- -r- <c ai c in co c^co-c h- Q. ·γ- co *1— 1- 1— σ · i— - - </) V— , ‘1— (T5 · i— « v— -*_i · f—

„ i= t" g ^ & [~~ EdJ E

££ Π3 Ό _. Ό| (O to ro 2l ·Γ- I -r- O' -r- 1 -r-

- - . Z LO n (/>00 LO ^ (/> 4_> CO

.. 1 ocn o. on o+j o m o.ojte. o . o ro o

*“ ίί\ο -^1 -^vc JC

CT· ·*» CT (N CT ·* CT S- CT

I- -—. 'r- . T- -—' ·γ- ro -f— I— 1— VO I— £ 1— —1 r— >> >> >0 I >> >1 >*> ,r~ >> >1 in >> r- >, +JC +j.te +-> (LI *r- CU — qj <N qj CT> qj .—s

(Λ·Γ- 10+-> (Λ O CO* 1/7+J

<Oi— (O·!— ro rOr» ro ·ι- *— o '— o —- V—. 1 — c cn *j” σ ° σ o σ cn °2

CT o OOO 00 rH 00 CN 00 Q

• E 1 L. ·· » 1 · 1-1- <-H ^ rN in r-l VO r-l Q_ <υ +* O »H (N m -o·

>r_ rH r-i tH rH r-H

Ό £ ... >- 85148 •p CD · * to •P · P” .,-

QJ -P C

tO ·Ρ ·ρ- 'r- rö ·ρ—

P <T3 ^ E

-Ρ Ε +-> ro Π3 Ο ^ ·<— ·Γ- π3 S- · " $? C ιο E C0 Ο Ο Ο Ο -Ρ · 4-> Ο Ρ ,Γ" LT) Ο Π3 ^ C i- 3 '-'n S .* °· -

οο · o ~ -m -S

00 VO S- ® —. οι ,— • I Ο- I +-> οο >, Γ- CS , Γ-. · · ,|_ >>

I O'! ν (vj 2C +-> +J

' . οι .r^o+joj ^ co vJ ro IS) ON Γ" ·ι— +-> ro ro

• T3 <U E

VO .* -l- CO 1/1 ° . ^ +J (O S'"

·** *—* φ * 4-> CT\ +J

#—* «p o_ m ns · ..

53 *r- 'w-' rc o^i »H m l c ro ·* E o- <-> ^ S «> — g +->

<N O · ,<N « 1" <D

U s- m k i co — Q. l (j es ·* ·>- J4 vo | oo es ·—' n-; — ω -< S ^ ' S o r-t co · · ε to • ·γ- r~ _c ε * o in o vo i .« >, o 1/1 ,r· ·* a\ ,h s- i- ·' q. — · <s ffi g o»; co ·—· aj ro es · i .,_ +-> o ® o. ffi vo vo g στ Ό <n I --- u ·' CS ro 1— yj ^ f" o O u ,,_ · 1-1 (N vo O ro — Ί: r-

— — U · U K ^ C I

>— ε — m — υ-uo^cco OO >5- I I ·· r-l r- es O f-. °- rH CN O 2^,f0· ^ „ m ^ I" — <-> in ' vo

^ oTl * * · -r- 4-> VO

:=> υ in rr ro e es <u ··. rH ·» -j N“—' O tO *-H · 2 ._ ·; ·; v· «irKro® ί s- C C 2 ^ .S i i +-> e e e: cl ·* +j n- ·> vo

Ori -r- -r- -r- CL CS CO <N

φ ·Γ- T- -r— H-Η -_| <D U VO CJ

ο- ε ε εαι Να w vo to ro ro CO »JH --- oc co co t/i +j O m ov ov Σ O O o -M — vo >· o Z O O O rr I · . OV · ' -¾ ^£2 rs m m ro m *- 3 S S O * 1 en en ens- Cjoo ·' i—r ·» r— »e— »r- rO 1 rH ^·. ·—* f— »— i— 'w' ^ · CN »* 53

>> >> t >> rs TT ffi VO I

Λ1 >p r? ro ® U «st" (U ^ 0)^ U ·' I .es

10 4-> 10 4-5 CO * I— >—» 2 r-t CJ

ro ·γ- ro ·Γ- ro VO K — —

— C — C — , I

o ° (s 9 rs <n σ> vo rr n- m m o oo 0 oo en i" rs vo oorr • t- ·ν. · · *CJ · · ·

rH O- rH CL rH Γ- rH ^ (N O ID

QJ

-P

to m \o r- oo σ> o

*/~ rH rH rH rH iH CN

XJ -C >- il 4-> 85148 • r- r~* 4-) C +-> CL) O M— 1/) +J ·" C *i— O'-' ^-» 4-> O T3 S_ 4-> 4-> <U 4_> -ΙΟ. m— ·ι—1/) O 4->

C C -I- S- CL

4- ) O O 4-) CL QJ

<U 4-) 4-) 4-) CL

(/) Ο Ο Π3 4-) --- •I— i- i- (O O Irt 4-> CL CL E l/l z: +J Ο -Γ- ° fd 4-) 4-) S- 4-> · rö αι a; <o +-> *3·

E to (/) — fö I

O ·(“ ·>— _l <0 (T-.

5- +j 4-) £ E 2 fd 4-) 4-) 00 O ^ --- rd fd · S- · id <d p* <d m O E E I w r- 0 2 f) 7" • ,d id ^ 00 -i,

I— v. v. v · · CN

I LD Γ* X

in r-' σι I υ

CN 00 P* CN I

. . . CN JS

ld r* p~ PC ·

1 I I LD

•»00 co vo 0 r—1 m cn ·* co ^ · · O · Π3 1 LD ld ^ EG co

(/) LD I

LO (LJ »» · » r—( LD · - ·,· U —· —- rd CN ^ w W E · U ^ +-> 3 oo I I u"1 w 0 ·--

3 2Γ Ρ» LO LD

-iC Q 0 CN CN·* P* +-> O

«-* . U U — οω-e •o e m w w W ’ ί °

JJ q. I 00 r_ CL

cl ·» o p* r* >, CD ·“· rd O CN .* >, 4-) O ® · · U — £ £ »η nq i in in £E .,- O *-r Γ* I 4-> n/· CN ·* ·« Ο Γ' O 4-> 24 ·τ~ U«— r^in (N o ^ => t- w ® ® . a · 2 =J £ 1 4ΙΓ 1 in w «o <t <u co r* .. r~ s- I— CL LD CN ΙΠ CN O' * rd (/) · U 0 U · CN —' „ m ^ rn-cr

Σ. cu CN · CN

ST ·* CL (/) (Τι nr ·* rd ro I Ό· -I- +r 0 ·

DC . -— * LD

—- in cd ir> ‘JI XT p* 1 c 5 -- c ^ 00 -r- «» (4. ·* -r- -r- · Γ* r— CN ”~CO 4-> 1— I P* t; 00 u φ t: rd.» 0 I · I CL --- O *--- E (30 z -1-4-) E rH 4-) w ~ 7 ^*_r c _ c 1 0 0 LD σι Ό· 00 0^5 O ^+-) LD in 00 P* CO 0 LD COo . ·. · · S- · .Ι- ΓΟ COCO CN CO CL CO O G- a; 4-) . ' (/)

)“ rd CN CO dT in LD

2 <N <N CN CN CN CN

>- 851 48 m «Η • ·« — I tn „ _ V~ r: ^ in (N 4-> ie -p U ω o ·γ- ^ CO c

^ T- 4—J O

•r- _ "O O) +-> C <->·«- CO o •r- VO +J -r- Sn.

*r- · O. 4-> CL

Ξ m <u +->

rö Q (O *P

*r- >—' rO <1) to „ ε </i o '—- 00 o t-

O (N LO S- "O

|£ . <o ·>- Ξ. n u-> — σ> * · 5* ai r- 2 LO Γ0 n r- —

>1 . ‘ LO

_pn o ro I ro

OJ <O ro VO

l/ι T- · ·" 00 · «o c ro »—» · in O +-> -r- Γ" i ΙΟ (Tl 4-> -I- C o LO X. O C -r- to ^ S- ··> O *r- ^ -—- · Q- -—- ·*-> H .« * 3 to rH -r- o ra ·—-

3 0 -P LO S- -r- -M

-iioo a» o o. to · „ +->2: to o o x ra a T- c +-> o <—> <r-j ,— +j c Φ

--- 3 +-> (O tO 3 -M

e ·Γ-> ra E >- i— <U

o *—» Q_ +-> (O —« -p σο to 1—1 en. <υεΓη+->·ί— ·»— _T > -* O ra ι— -σ ” · -r- S- ^ ra >, -f-—'

O I— ra · E >> +-> -P

^ >,--- ro o 4-> Cl .—· -I—

lxi —' >, rH S- ai QJCNJC

O to _ ra to O. X O

_I ·ι— rO u ^ -— ra — o +-> OS- s—- · *r— --- o C -P r~ c ro r- ro c s_ H- -V r»j | ·Γ- OO O O-I-Q.

£ o m "r · · +£ S- · N ^ N ^ 5 ω oi to to uo ·* -p ro -r- Σ « o ro ·γ- xr -I- -p z ro o . ^ c . +-> -p X ^ "3 Χ°° ° 1/1 .a ro

*- * -P r— <_) O 3 E

«—i · en ·* S- ' to o X ·ι- T- Q. .—. -—- S_ ^ r— M C (N <° <n ^ i k r~ ' £> 'SO £ U toot • to ai rs >ιί- l · Γ" r-* ·>— ton r-+-> 2 ro· X3 ra w —- -♦-> Γ- T- «—' ra K , -t-> ra 1

q_ oo o ι^·ε 10 r~-<N

00 <U 00 H f' o so O (N

• Q. · » t · · ·

O —" «-(in rH ^ ro ro VO

ω *p oo σ» o »h ,J2 CM CM CM CO Γ0 -o sz >- 85148 4-» 4-> 4-> c c e o o o 4-> 4-> 4-> o o o i- s- 04 Q. CL CL ^ ^ 4-> 4-> 4—> * *i- ·* <L> <U Φ rH 00 <—* to to co o •r- ·* T— *> *r- · * O i 4-> — 4-> ^ 4-> — C L βΛ ^ ^ -Μ ·γ- 4-> T- 4—> ·ι— C ^ ' •r- fO Cfl3 C fO Crö ™ ··- *—

C fO ·(— fO ·γ- nd *1— E O c S

•Γ- E *r- E *r- £ v- -—' •w' *»— | •r- o E O E O E \r> E S- Ό *- 03S- ^ /js +-5 io ^ rvi^ fO (Ο ·Γ- fO ·ί- ro ·*- rj ·Γ- ^ Π3 ^ ro •I- --- 00 00 ^— to ^ C O »I- vj 00 to ο O 0*0 · to ^ o 00 oo o o c m +-> tn o * ° ^ -¾ o -* σ. -* o ° £ I— t"~ cn f"~ CD Γ"~ O) * * ·—· I— ·>> cn I m- l ·!- I -I- r-» +-> EC cn in id •r- o <— o >— o >— ·>- tu I --- +->

Γ— (Vl >1 ΓΠ (Ύ*) S- t/1 ( I · V C

>» . >, . >> . >,ai-r- - >> _ <U

>> , · -m , ‘ +j * +-> -t-> ί-> r ;N >i c -° +J ΙΟ (U 10 O) ID QJl04-> QJ +-) d- -.—

a) <s> t/i t/> <υ io '— tu I

(O (/) ·κ (O ··. (O ·* 10-1-(¾ ι/l r~ o

1/) (0 _ -— , , '— , , -—- I— ΕΞ oo D ΓΝ O

Yl WEC SC ^ u vo 00 I o I 001 to ^ ra . Γ-'— m o 00 ID O') ID 00 ID · Qj --- in 00 3 O0 .CM · CN * CM 1—t E · m Ό

3 2l rH CJ iH U <H u * ' tN , r-llDC

a , ^ , „ ID CTi · (0

To ·' ,-. — vd . +j in •i-je 30 - >-i 3 · Γ" · · ·> m --- CL (H ) r-1 -—- r—( ---) Γ0 | IC '—- ·- ΓΠ CL ^ , 4-> . 3 . +J o 3 IN · r- ^ . tn ^in X? tn ^ m 'X? I r- 1-1 > tn -*-» ·γ- ω · tu aj ·" O --- ^ ^ >>—» *(—

^ -ι-χ >)X ·— X T* ·— "ZL

i^-r— I— , -4-) . >>. 1/) :iO ·(— c: >-1 /—1 c X i- >» tu * >, ' (OECT +->o >) X o _I+J >, 1/)Γ~~ --* J? ·>+ CL+-) 1/) t/ 4-)

ro Lxt i/) <N (O tN (O tN >. I <1)0 fOCJO

<C tu (0 CJ ^"U —- o S-IDQ.S- '— I—' s-

I— CL --- w w w N o (\| '—' CL -^,1 CL

w CN m m O.^u ^fn+j o; oo oo oo *ew -** ai οσίφ s; · ID .ID . ID <N(0 lOco .VDio Z (N · CN · <N · -(-1-1 · ·<- <N · ·(— I m in ιη»Γτ·-,ιη+-’ ' - - O'"1 >} * 1 To CM CM CM <f ^ in °(0 (N .( «

CM . (. CM ^ CM —- · ,— (HE CM — E

• K'’—* 9 *r— · *i— T—< fO ^ · O * O

h ,r h h ^ ^ ^ i; H S i; 1 i/) «ο , ο ^ h- co .oio I o I o I o ä —. ‘o —( cOq 00c f^c 's-mi — m c

fHc rHc: IHC rH ID Γ» — O ^HOO

. C .(0 .(0 ..CM CM CT\ .(000 iH 2 rH E r-1 E rl Cl U X· iH E .

3 ^ ^ U C' c-

. «. ·- ». I ( I - I

moo moo m tr> miner) -«r moo oo if oo 00¾1 oo oo m mm oo m m o m o m o m omin cm id o m id a> tl Ό XI 0 ,J_ CM CM CM m ID 00 -o m m m m id <d sz >- 85148 ·* · n ^ *-> -r- -r- iSl

s-' * C O

+-> U o o

I 4-> C

c: js o o c o σι »o S · ^ 3 u ro r- +j τ ο. in | cu i- oo «00 (/)0) rr CN (N ·»—-♦_) .

<u . 4-> on ~

CO -M <U

•Λ *T— · ** VO · * Γ0 · r“ *—-v 4—> «— ro ·— ·* •r- 4-) -r- «r- E >> ^ C ro C _ CO >> *r-

•r- fö ·»- >_, T- S- 4-> C

•Γ- E ,Γ~ I T~ fö d) *r- E O E» E 4-> *r- *—

ft5 S- (O VO Π3 ^ -r- E -M

•r— fO ‘f- CN *f— o C ro *r-

on v_✓ co r \ co CO O ·<“ C

So 2 w o, CO-^ «-O

° X O O ^ ^ O O +J

G* J* J*£ Γ"* * L. OO

O* O O o I fOa.

i— Γ- i— i—I »—O =3 CL

en j cr , en +_> i—

,r_ o ,r" in ··" « on +J

i— II f— u> r— . _ ·" LT) ·γ- O) >1 00 >, >, ^ »* ' *r— r- 1/1 >1 · >1 >, 4-> 4-> >, -ΤΗ-1 VO 4-> 4-4 ·· :n3+j 3-, 4-4

CD CD *β CD E ro 4—> +J

ro C0.» di, tn —i _C ro CD ro

Dl ro ro *— rO Τ’ >, E m <T3

Dl —- D' --- 1 S- O rOE

·· K 00 CN VO OS- v_* o vo oi oo U ro cn e m oo s- — o ai cc · ^ a\ u >r— y oo co J D) . 04 i-H · *- g · ^ _£ O iH u CO rH O rH Γ0 4-> '—’•«•in oo,— on on ro "—' · O >> · · •r-jg o LO . ^ r~ w S ^ ^ ^ ^ en ^ i - i -H 3 · -O ··> n ^5 ™ oo cn »-H λ ·ι—3 in +j --—. ·»—) ·- v · m -*_j cn rH > ir-v 4-> QJ-I- 4-> r«. · 01 · I—I CD ... .V ι/l CUhrt lo -*C 10 O'— *L -r- o -*! . 03 -r- ^ -r- r- K >, C ^ r-i - >, *' => i- >>l >> E >, CN · r- >, — —I 4-> >, Γ' ΙΛ m >> U ro £C 1/1 00

ZD -V Dl (N Π3 E D) — | ro I

<φ Λ U Ό * VO ' VO

5}· — 00 '“"ro CN CN CN

ro oo ro vo mu cn U

o' o o . m o · — o —

Σ «VO (N · ' ' · m CN

^ CN· ro CN OlCNH

**r~ in ' ^ *· ' 03 rH

«— ·« ο·^ο ' m · *· · cn··. m —. 4-> •r i r~m mm

CN · CN o CN ro CN

• ' ' f—I ___- *7 · tn r-i ·· · ·· rH ro rH U .— rH .

i o ' n 4—* i r· · on i on ro o f'- U cd eri O ro i cn i rH e: ,-,.-.10 OO m r- i-H r-

• ^ · | 'Γ“ · U »CN «CN

rH ci rH 2· 4_) r ^ l'™^ rH u rH U

-5 — 03 "-I w ^ • ro ·* · >· ro oo en oo E ro o en vo r-π o coh» oo (n P cor·· mm oo vo «· · * rrt · · ·· ·· o ro ocsw o m h in o in 0) tn on o rH cn ,r* vo r*

“O

.e >· li 85148

CM

VO

·· »h. · — ^ ro in +-> <N ffi vo i

'•z · I · «N

Q dl" - vn d +j (N in I ·

«. O ·» cj rr O *T

O V- —s --- · H

σ\ ’Z. CM · • +J 2 00 ^

rvi dj in Z

in E · -" I

*·*·!— Π3 ID *r— <N

+-> *r- C JS »E

,r“ +-> *«- I M

C Π3 O ·«-··« ϋ -r- <0 o ς E ^ •r- E -V Z (O CN :a3 E O =5 1 *1- u ε <* (13 S- r— {s] (/1 '— -3 l£3 ••—ra cn ^ O >> .

in s— ·(- , , O— S- o 1—1 U ^ O c°

O o >, w 3 o C

(N >> (—··(- 3 . d 00 en in ε *" 'll VO ,¾ VO -r“ 113 ' •1— I (Γ* # >, ·.' r— e (— o — ro >>.— >>· ,r~ >> σi oo pj: >1 ^ -(- >3 . 00 0J I J( P Ό d f" · on 1— (O OI* ·« (t3_.rOCi— t/i en 1 -—' —' '— , —- o o </i re T- +-> σν U d s_ ·· *_* ·* e · ·— 00 —’ d O s- vo r~- ·—> ··> ·ι— e · rs] V- >-> —- CD 00 +3 ' ' O d CO · °- 3 00 V".. 3 T3 d Γλ λ, 3 z · n: *>3 *(— o innj^j

-V Q do +->(—1- · QJ

d ai o Q- in «· m in (O d p*c s- o ’n- erv •r-3 .--- QJ -r-S-d * (\i d .

SP E <"00 r- >, QJ —« . d

CL — -I- >, Cl tn 3 * ra 'N

I—I CL 3X3 ----- -r- Ό PS n o ro 1—1 ··—) ·(— 1/1 d d ··— E s.

,_i >» +Jd « in d ai m »o in d en cj o. s— ra o in 00 ” o ^ ^ <u u <a ·(- o . J ro .

e— —> (N N o >1 C * d

ZD ·(- >, O e. >, Π3 ro (N

_11- >1 o · * Ό in E σι ro d £ d (n vo ' /5. '— · 2 . 0000 00 . „ i" o. »· · co m •fl* -—- 1 —.

in ro 1 ro d · o · ·(- o :rö

00 rr . ro c ro E

§= ^ · 1 cm g CN d d VO e p-s 1 in p—> m * o *T* % irq · 0>> · * l4_ . n r- r— «- cn in e vo (θ'—-

fS] rsl -C .d O d >iO

™ C E · · d d • *s_·* d.,_ — ^ aio d ro ro d F— ^—- ·,— c_) s L_ ia: te 1 — en * r- q.

ro O O v 1 00 o cn d oo, dv / o ^ vn d <d ·>/ · OJ ^ ‘O ·ι- 1/1 d z d —. u dg CN T3 ro-r- ^ * * d » *(” ro ir rr 00 m u· in co-^ 00 d 00 TT o 00 VO 00 2. CN qj • · ··· ·* · ^ # Q_ o <n omin o m m «m ^

0J

</) m 10 00 σ» ^ r* 1— *— ·£= >- 85148 .. +j ^ _ φ +->

» Κ ή .'ρ. TT ιη 'E

οι in 4-> (Ν οο ο Γ- VC · «Ρ · +-> ♦ 4-> « CN Η Ό CN ,|— Ο " Η . Ε . § ττ ± k ο 4-> ^Η ·" <nj_ οο ο π: cn +j •—' ο o ro ιη ι. υ · αι τ- γ-Ι · ^—' . CL VO 1/1 c · η ,-4+-1 ,,— in (m +-1 φ +-> •ι— U1 'Ν 0J 1/1 ··> -|_> Ε .»σι ··>(/!— ·» «-^ π3 <0 ·* ·'—^—· ·γ— “Ο —» ·Γ- π3 •I- ^ ·ί- Ρ-. ·Γ- +-> »f“ -Ρ C Ε t0*rj C . C -Ρ -Ρ · · ·ι— Ο Ο , ·<— * ·γ- π3 Ο. re τ- Ο τ- 2 ·Γ- rö <L> Ο E ro -V Γ" Ε E E CL ro ^ Ζ3 CN Π3· fO Ο ' 4> τι— υ -ι— ιο T-s- αι ιλ η <ζη .— ι/ι to ro ίο 1/1 o ro _ ο ο 00 το *

>, σι _\) ·» _^(Ν · ζι VO

>ι in zs r-~- roolin +ο ,— ι +->· ι— τ- ι— . I α ^ in φι ιο ^ γ~ Ο φ ,Γ- σν Ι/Ι τ- Ο Τ- , I Ω. 1— .

«ο <— ο - >, * —' >, εζ >> ο >, γ- οο >> c >>00»* iS +j οο -— +-) ro +-) · ιο α> , ·ι- Φ Ε Φ νο . to ·« ro .to </> —- to ro—- to “· o ro „ ro , — 4-) to o —«oo —« .» I ·ι— • · cz o rr tri ··> ^-» r~ co c: VO C CT· CO —- <- O 00 o - o * ^ ro ι fo ι ‘1 c . 4-) n tn -—. ε . . to >- — .o oo s: zo O- *-· ^h Q ^ ^ £ -Si Q T-J O TO Q_ 40 +J (Tl ro» C T- ro o ^ · *> z cz ι— 4-> -r-jE . — ι - ro .»oi ^Q. •'“n => rv. '--E =5 ·» ^ to Ω. ι— rl T-J lN 3 '— C .—- Z0 T-

·—I >> 4-> <—> •f-) Τ- 4-> T-) TJ

rr ι—ι « >, airo 4) co :ro 4j-r-

rH > //o to -------- E OI4J

_4 V'J (O'-'T-rj , « ' _cz λ: a

st _ —' T- >, „ ^ 00 Γλ ·“ t- r-C3L

ZZ -r- OZ 4-> CZ >, >, “>C O >i---- ro s- σι :ro o <o >, · o c >,

—I 4-) t E 4-) ro (N 1/1 Γ0 4-1 T- toO

zz) -0/ _j _cz o —-* r— ro o E ro vo < Φ >, S- . — ·' „s_ ro ^ .

m -ο0- m (N m to0·^! mm co cz 4-) o Oc 44 41 >, 01

DC Γ0 τ- Φ ·* · τ— * CD · CN

Σ E to rM (N ro 00 —' (N τ-H

Z . <0 Τ- Ό ·Γ- r— 4-J _ 1 -Γ- 4J fO *r- X r— 4-> * «—· *4Jv_C ••'Τ

·— * >, ro rH 4-> 00 I—I ro O CO

vo >1 ro tt :ro ro 3 r^ro σι-μ> ro fg Jt E »E «C »E VO O t·*1 • 4* o _j e j 1 n o 1 ι— , ι - — *ros- ">1 " 04 s- -. c_ ”·«- H '— ro t- '— ro <N i/i

I —' - O ' *--- 4> “· O

m co ro c 00 cn »ai σιο

OTTO <N kr-liH CNr- 00 vo r4 C

• · σι * ro ._. · · «00 m 'Γ] * ro rH rH · r—1 .,— rH r0 CN· *4J rH rz f»· 1— τ— r- 1—1 ro v— »»I »>,c »» »I 1 ro » rr γη σ m >) ° vr n vorn rr e »too 00 O CN 00 ^ g oor· 00 cn n O co <f • * * * (O ^ · · · · · _j · »

O CO V£> o _____ O CN rH VD H ___ O CO

0J

-PO »H cn m in

^ 00 CO 00 00 00 CO

•r—

“O

SI

>- li 85148

S

* -r- TT Γ0 m p · · m m ti (n p * ^ ro i—i r- »e ** " i in p o oo r~ r~- · i s- σι <j\ o m r-i ro · · * m «n <n ^T P »00 1/¾ Λ 1—1 00 1 * · Λ O ·> *—- · <— '—- o -r- » -r~ ir~ c ^ ·<- p vo I c c £ £ £ o ^ ^ ^ EC -r- E · (N E E >- —o Ec p · ro roc oo p ro ro vd ,|— ·<- o

-« O -r- E _ p P P

^ S- p — * o oo

• CL O 00 O O C

ro o η- σι p: p: o.

P ^ Tr . ' 3 3

•I'd; 3. (N-1- — r- P

·-—* i/ι Γ— „ p en CT QJ

•i— ·ι- en o ·>- ·ι— i/i C +J T- * O . I— 1--1-

•i- 4-> i— ·- rH C >1 —' >> P

•1-ro >n^~ (NC >>·-- >> P

Ero >> oo .ro p p pro ro E P _ ro E Φ o O) ro ro ·γ- o oi — ι/i o pe t/ι i/i S- p ro _ ro e ro o ι/i o ro ro K ·« oo .— e —- c .. o >— ____ ς_) ,—. ro- r" ro vo ro r-> vo -ie <y\ — -r-, oo E oo '— 30 J? ro· oo 2 ro · "" ·σν 5 X ^,ro · - ^ σι p oo P Ω -1- · I-H e 'S' · ro i— vo co ro — · r~~

•r-> —- >1 I CM '“CM ro I

' E >> O · 2 „ J/ (Tl

^Cn^CN § r0 ^3* r v 3 rH

►—l P · 3 JsC Ä -1-3 ·Γ— Ό *

in > " ror-’ro 3CJ +->i— P VO

Jf\ '— P 1— N— <U >1 Φ _* o m <u en I -*>»* P* ^ --- ~ ·- -r- ' -r-P r- v/ 00 ^--- — „--- -- £5 ,- -*_> ,- · *- ZD -r- * P e— P >, "-r >1 C >1 ^ _] C t—I -I— >i :ro >> >1 CL) >3 'i—

ZZ> P C>iE P 00 ι/l _Ω P P

<C ^ opje oi 0 ro — ro o I— cu p ro >, p . '-'m — 2 p ^ e o·* —- fM ro r-i ro e 3 cl o e ._ vo o· O ro

o; ·<-) o ,r- £ ι-t · r- · E

g -P-P.Ei . CM CM ’ Z O) O) CM r3 ' 00 I p cm -f— vo CM ~

3T -r— «r— ,— (N ^ * *"5T

*— ,— xj »>iU *.p in " ro · >>-i- m >-> —- in :ro ro - - ro ro pc*. i— ^ jc ,c .

- « ω J ro _* >» rH p -_' o. p -__' O p S- -I— · r -— | « | O *· Ό ·> --- o Γ'Ριη pc oo t 00 '2

OO O CM CM ’’Z ^Ηφ rH

•VO ...* ___ ‘CL * -r- CM · p ro .— p-r-p P -1- P Ό in Ö3 r- -r- CL -p

. I ^ . | . >3 C . L

ro o ro p n- ro< >· ° n- oo OOP oo o CM OO^Iq oo CO <0.,- ·· · · U · ro s- ·· · o.

O ro1 oro— o —-cl Op θ'—· ω p vo f* oo σι o p oo oo oo oo σι • Γ“

“O

-C

>- 85148

tD σ\ TT

in o • · 33 »n m o -- ω f m ^ oo S, cm

CTi (N K tD ·γ- ID

• · I · "O I

Dl rH Γ- ID t; <n ·" ™ Q.

•« <—. u aj p— p— — w Q. —

•r- C — C

c — σ. ·" ·<- :;i Έ 1/1 ^ di Έ E to · :<o 'D to'—' (O ·(— iD E · ·ι— 4—>

— to .c id toto O >i I O C

o o t- Λ o o O'— ^ p— o ~ -V j-> — 3 ·γ- c— ·“· oo 3 C I— to S_

I— — COO E — TJ· OlCL

Ο) — — O (O C — — TD r— C — o I— +j

i— — >, S3 (—+->- >, CD

>>S_ >>ro >>0 >, to >>>^+JE >>i- +jt-

-P Q QJ '—' -Ju£ CL ·» dj +J

CU --- to I— p— 1/) +J

(O to (O (O +-> 4-> (0(0

to re _* *— ~J —' οι :re — (O

to ^ cr Ί' to e E

· 00 <N r- · CN ·γ— si 00 o 00 * 00 n 04->>> 00S- · f>> · ·Λ · 4-* £- · Π3 3(/) _J ^ rt-t fö O , ^— ^P Q » . p> — E ·ι— CTl +J O) p— C •'O E 00 (O ·—> •'-pH — O .H L. (O .

O E . " i. +J ID DJ T ·' — v-pQ. 3 p— dl O . —' ·— — , Q. --3 3 J-> L- ’ >t 3 >

t-Η -P -l-J to CL Π I—I >, -r—) DJ

tLJ I—) * (U +-> dl CTtJsi 4JC0 rH > i/\ - dl I -P ·«.· i— O).

rH ^ — p— J* PO 0J ,_* [»- (O—' LO

O '—' r— -r— — IE tO ai '—' -(-> — *£ >> tO i— O ‘ „ 'r VT — >, O >,—p +-> p— 3 Dl c >, · p 13 i- tOO >,+-> m PO O O >, p— _I -P (OC to (D (0 JE · ·+-> to —

33 -Jxt '—p C (O 03 Ο rt tn (3 O (OtO

C ai (O'—p . E ϋ P —-O

h- CL __ E . ’ O . .

10 3- ____ Ή CO s_ I ·' » 'Dc O O Π3 2 p— LD .)3 O c o; . CTt . —P '“'ta LD OJ «ro

ξ DJ "T fN | · Ό <\J E

•γ · „ m t— to ro T; —' -f- -n - ^ oo i— dj ^3 »- to iD+->. · U — (o ro oo ro cd :ro r~ (N p-»(0 tr-^r • · E I Dl E · .

t-ι h to ·*οο — P ih n - c -· -v ° ra •%C fcO· r-i» v_p ^ to— ro C to IE ID U -Ί·—.

rH— U '—iHrHDI

rHj_ h p» 2 — 2· i—to >, — W w K w D~ s

»CL » >, I I I » U

m' T}· >i to ι-t r» ld en — 00 DJ 00 ^ DJ ID Dl (— DJ 00 | * o · ro U · U · «2 O —P O --- »p' DJ »p DJ LD O —’ dl

-M

00 rH CN Γ0 ^ ID

,r“ o> o σ> σ> o Ό

-C

>- i 85148 5 ?.

• EC

rH C-> rH

m r~ ·. 10 +-* · in · S ^

O lO -r- I

• -+-> I ~o O

n -r- o "" rH

C r-l "^ · *-> * ω ^

•I-· O 'S' CL

c: s- •Γ- CL ·« ,—- e: m cm ro QJ ^ +J ^ “~· •r- l/l «“·« ·ι— ·

co -I— ro c in EC

o -m EC o I U

o +-> r) +-* <N —·

-¾ £ ~ pm I

Ξ i I k 2 cn o 52 ^ w

•r- S- w +J

r~- rO <1) £ ~ * r- _

4->0 V04_> 4_> · r * +J

Φ * «i— +-J <N '1—

00 · C (T5 +-> C

<0 O rcj :o3 O

</) ^ \ +-> E E ·»->

oo _ * O O -C O

γ- σ s_ L- >> ··> s- ΙΟ CO N CLfOS- -— Q- —s o . . --- O 4-> o co _, io -i-> c :io+j 3S:i -m cu ecu -V Q IrOto'EE -Con +-> E ·.- no >, ·- <0 ,—. · - · « +J · ·Γ— L_ -L> •r-)E >) -Μ Γ- I O -+->

--- CL 3 ·!- i. ία I >> C (O

CL ·ι-3 <λ Ö <0 m ·<- <a

+-i -MO C E ri ^ EE

Γ' I—t « aio-r-o™!— ro o rH >Λ JC C E S- * rO ·γ- S- rH VAJ *r- C rd <0 VO —- —- +— (0 O --- r— (0-r-^ -+-) ' Ζέ >i E I— ... ro ·ι- >> :=> i- in >’rnCTMor_ir _I -M ro σ ^ (Ti DC ·+-> (0°) cd -3<c —- rr -— · I mo —- · CU . cd p-- LO V- r*~

*" 5- mm on - oo I

o ino CJ .,_> σ m

□£ · ΙΟ Μ ^ Γ' (U · CN

Σ CN · · · l/l CN ·

z iH VO ι-l CN -r“ VO

i - ^ I “· a r- m +J rH · * ro £ m:+o m.» in CNre vo . E . r— m E · ^ l-H ^ +H -^ ·* · p I-· +-1 s- m CT ro . rc ^ O ** O K ___ o in c r- . I - oo tH ·ι- <ji *-) r' m i-ι π·-μ . E .cu cn «f σ ·ω iH CN .^2 U * ·

_ T7 ^ r* ^ -O

» >, * -I- II » -I- m>> n* +-> σ mo cn+->

00-3C CN°- in CN CN CNCU

. r- . <U . . . 0/ 0>S n >5 in rH VO rH^ cu M> c/i vo r- oo σ o •I— σι σ σ σ o

Ό rH

JZ >- 85148 * ro σ\ oo r- r- * * -μι *

iTl rH rH

1 c ro ld ·Λ ·» o * σ> O TT m r- oo .

• T. vo o g o r-

o1 zc · Q. · I

o in m m o ·' i +-> ro +j 0 ·» ω .

ro S rH ~ .£ C

K ·!- · C 4-> C

U Ό *T T- +J -r- | ·ι— ί— ro ·>— ·- 2 +-> E ro E ·—' ϋ CL ro E ro ·Γ- • O) ·ι— o ·ι— 10 i CL in s_ in o

O -— · ·> O ro O O

r~ —' O —- O CC

. co -p -v c CM VO :|S -5 (N -3 2 • J! <n 'g, in >, -r- · ΤΙ s- I~~ i— oo rH >> | >> rf +-> 1-1 ^ -P -P H ’ +->·γ- · >, φ m Φ<η :ro e m c io· to ro Eo ro O ro VO ro 10 .C -P -P --- ---

Yl p 2 ™ g CO ov J" #—N VO O CL · « CL CO . rv w

3 0 C .—- I · ^ · L

300 -r-4->4-> 04->iH*r-rH(D

^ SI E (U 1(0 CCU </> 4—> •M O (Q 1/1 £ *r- en O l/> ro -r- T- _C E »r- O 0)

·τ—) »—S I »— +J >, r0 +-> ·* C · " I

°0 —' E >, 4-J S- *r- +-> *—-» e - ro

t— CL >>fOO r- ro 3 Π3 3 OC

v· CL ro C >> rO #rO E ,r~.) O

►—* r— E *f“ >> E H '·—^ +J 'w» > " ro O E O O) 0) . „ V^i. rO i— i_ ^ tn ^ ? O ^ ro *r- -—s ro rö *r— ^ τ- Γ"** ^ 00 P— 4-J '—H’ | « I · ^ rH >> 'E m >> ro >> n

—!r Π , « 00 O ^ 'H

_11- _ ' O z: tn oo Z3 -P fOCTi^+j * ro ,Ο C -V · ro o o · --- --- I— Φ - f"- s— S— I ·- D- 00 I CL ·. | TT ' * VO —' 1/1 σ\ cm n u in cm o ^ °-m CC · IN r-i ^ 00<N · ;To

Σ (N · · io ·· CM E nj _c -t-J

Z VO ro th vo .e: >>··- I . +-> I ·.>>·. 1- e

^ +Ί AJ Λ V W O O

vo^ VO 5 nj ^ -rg m.^-g • +-> n- e · -h · -r- · e i-

rH·· »O rH·· rH E «H r0 CL

ΠΙ r\g L- 3C ro ·γ- - ,r- - r- -m - w „ r- 4j vo^, r- ^ g 'f φ ro ro ro φ ή>, <h « io uo σι ·</> · ·ι— +j rH tr~ ·· ro··- fH·— rHr04-> TD , -— “O ro *—* ro <r- , V ,r~ —' ro * II ' "· *· e 0\ CL tH O C0CL Ό* ro o cm φ cm cm σοω oo m oo cm s- t CL · · CL · · i · ro rH —' rH VO CO --- O rH O rH ""

CU

-P

.γΐ rH CM CO HJ* m -a o o o o o

SZ rH rH rH rH rH

>- li 1,9 851 48 ISOELEKTRINEN PISTE (pi)

Isoelektrofokusointi(IEF)-menetelmää yhdistettynä bioauto-grafiseen havainnointiin on käytetty määritettäessä keksinnön mukaisten tyypillisten yhdisteiden pl-arvot, ja 5 tässä menetelmässä on käytetty seuraavia materiaaleja:

Ampholine-kantoaineamfolyytit (40 %, paino/til.) hankittiin LKB Produkter AB:ltä, Bromma, Ruotsi. Akryyliamidi , Ν,Ν'-metyleenibisakryyliamidi (BIS), N ,N ,N ' ,N 1-tetrametyy-1ietyleenidiamiini (TEMED) ja ammoniumpersulfaatti olivat 10 Bio Rad Laboratories'1 ta, Richmond, Kalifornia, USA.

Glyseroli ja antibiootti-agar N.1 (Grove and Randall medium N.1) olivat E. Merck'lta, Darmstadt, Saksan Liittotasavalta. Geelitartunta-polyesterikaivot olivat Serva Feinbiochemica'lta, Heidelberg. Fenolindo (2,6-dikloori-15 fenoli) tuli BDH Chemicals Ltd.:ltä, Poole, Englanti.

ISOELEKTRINEN FOKUSOINTI

IEF suoritettiin geeli1evyl1ä , käyttäen LKB Multiphor 2117 kennoa ja Bio-Rad Power Supply Model 1420A:ta. Kooltaan 24,5 cm x 11,5 cm ja paksuudeltaan 1 mm olevat levyt val-20 niistettiin geel itartuntakalvoi 1 e.

Polyakryyliamidigeeleissä oli 8 % T:tä ja 4 % ristiinkyt-kettyä C:tä (30 % T vara s tointi1iuos valmistettiin liuottamalla 28,8 g akryyliamidia ja 1,2 g bis-aksyyliamidi a 100 ml:aan tislattua vettä), glyserolia 3,5 % (til./til.), 2 % 25 Ampholinea, 0,05 % ammoniumpersulfaattia katalysaattorina ja 0,05 % TEMED1iä kiihdyttimenä.

Kantoaineamfoiiiti n koostumus 35 ml:n geelin muodostumis-liuosta varten oli seuraava: pH 3,5-10: 1,6 ml Ampholine 3,5-10, 0,05 ml Ampholine 30 4-6, 0,05 ml Ampholine 7-9 ja 0,05 ml Ampholine 8-9,5 .

120 8 5148 2) pH 2,5-6: 0,4 ml Ampholine 2,4-5, 1,1 ml Ampholine 4-6, 0,2 ml Ampholine 3-10.

3) pH 7-10: 0,5 ml Ampholine 7-9, 0,8 ml Ampholine 8-9,5, 0,4 ml Ampholine 9-11.

5 Elektrodi1iuokset, joita LBK suosittelee vastaavalle pH-alueel1 e , ovat: pH-alue Anodi Katodi

3,0-10 IM H3P04 1M NaOH

2,5-6 1M H2P0^ 0,5 % Ampholine 5-7

10 7,0-10 0,1 % Ampholine 7-9 1M NaOH

KOKEELLISET OLOSUHTEET

Geeli jäähdytettiin 4°C:seen jäähdytetyn LKB 2209 vakiolämpöti-1akiertopumpun avulla. Sen jälkeen kun näytteitä oli etukäteen fokusoitu 30 minuutin ajan 5 W:ssä, näytteet (20 jjl , 15 sisältäen 0,2-2,5 jjg antibioottia) siirrettiin uraan kato diselle puolelle.

Elektrofokusointi suoritettiin käyttäen 10 W:n vakiovoimaa ja se oli suoritetty täysin 3-3,5 tunnin kuluttua lopullisen tehon ollessa 1400 V.

20 pI-MÄÄRITYS

pH-arvot määritettiin jakamalla geeliosuus 1 senttimetrin osiin ja eluoimalla yksittäiset palaset huoneen lämpötilassa 1 ml:11 a 10 mM KC1 :ää ennen pH-arvojen lukemista.

Jokaisen antibiootin isoelektrinen piste määritettiin in-25 terpoloimal1 a käyrältä, joka saatiin asettamalla pH-arvot vastaan etäisyys anodilta. Tulokset, jotka saatiin kahdella eri pH-alueel1 a , on esitetty jäljempänä Taulukossa VIII.

n 121 85148

MIKROBIOLOGINEN KEHITYS

Antibiootit paljastettiin bioautografisesti. Polyakryyli-amidigeeli asetettiin agar medium N . 1 : n 3 mm : n kerrokselle, joka oli ympätty 1 %:lla Bacillus subtil is ATCC 6633 itiöi-5 tä (0,5 OD 600 nm). Kymmenen minuutin kuluttua geeli poistettiin ja levyä inkuboitiin yön yli 37°C:ssa ja estovyö-hykkeet tutkittiin. Kontrastia, joka oli lysioituneen alueen ja bakteerikasvun välillä, korostettiin käyttämällä Pheno-lindoa (2 ,6-dik 1oorifeno!i) 1 % paino/til. (hapetus-pel -10 kistys-indikaattori).

122 8 5148

TAULUKKO VIII

(I soelektrinen piste (pl) määritettynä IEF-menetelmäl1ä) 5 Yhdiste pl 1 8.9 2 8.8 3 8.7 10 4. 8.0 5 8.8 6 7; 9 7 8.9 8 8.8 15 9 8.7 10 8.0 11 8.8 12 7.9 13 8.9 20 14 8.0 15 8.8 16 7.8 17 7.8 18 8.9 25 19 8.7 20 8.7 21 .. 7.9 22 8.8 23 8.0 30 25 7.8 26 7.8 27 7.8

Ji 123 85148

TAULUKKO VIII

(Isoelektrinen piste (pl) määritettynä IEF-menetelmäl1ä) 5 Yhdiste pl 28 7.8 29 7.9 31 7.9 10 34 8.7 35 8.6 36 5;8 37 8.5 38 5.8 15 39 4.2 40 5.6 43 8.7 44 8.7 45 5.7 20 46 8.6 47 7.8 48 4.1 51 8.5 56 5.8 25 57 4.2 62 8.6 63 _ 8.4 64 5.7 65 5.8 30 66 4.2 67 5.6 68 7.8 69 5.8 124 85 1 48

TAULUKKO VIII

(Isoelektrinen piste (pl) määritettynä IEF-menetelmäl1ä) 5 Yhdiste pl 71 9.0 74 7.8 75 7.8 77 8.1 10 78 8.1 81 9.0 8 2 8 ; 9 83 8.9 84 7.8 15 85 7.7 86 5.8 87 9.1 89 7.7 92 7.8 20 100 9.0 101 9.1 104 5.8 105 7.8 25 l; 125 8 5 I 4 8

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antibakteerinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro standardi-agar-laimennustes-teillä.

Isosensitest-lientä (Oxoid) ja Todd-Hewitt-lientä (Difco) käytetään kasvatettaessa stafylokokkia ja vastaavasti streptokokkia. Lasvatusliemet laimennetaan siten, että lopullinen ymppi on noin 104 pesäkettä muodostavaa yksikköä/ ml (CFU/ml).

Pienin estävä konsentraatio (MIC) arvioidaan alhaisimpana konsentraationa, jolla ei ole silmin havaittavaa kasvua 18-24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa. Kaavan (I) mukaisten tyypillisten yhdisteiden antibakteerisen testin tulokset on esitetty Taulukossa IX sivulla 126.

Vertailun vuoksi seuraavassa taulukossa on annettu teiko-planiinin MIC-arvoja yllä kuvatussa testissä.

Mikro-organismi Teikoplaniini (MIC pg/ml) S.aureus ATCC 6538 0,14 S. aureus Tour 0,8 S.epidermidis ATCC 12228 0,4 S.pyogenes C 203 0,05 S.pneumoniae UC 41 0,06 S.faecalis ATCC 7080 0,15 E.coli SKF 12140 >800

Proteus vulgaris X 19H >128

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 >128

Tuloksista nähdään, että keksinnön mukaisilla yhdisteillä on parantuneet antimikrobiset ominaisuudet vastaaviin lähtöaineisiin verrattuna.

85148 • la vo vo cm cm lA H <N O O r-ι r-1 *··«·· 5SOOOOOOOCO oo

(N CM (N

rH rH f—1

AA A

• CM VO (N CN

E-l ui Γ-t O f-l r-l ··»··· ZOOOOOOOOO 00

IN (N CM

r—I r-t r—I

AA A

r-H

& m vo vo vo ai φΧ-ΟΜίΑΟΟΟιΗ ^ en o* · · · · · · .£^•0000000000 00

-o w CM (N CM

E rH rH r-t

>- U

H A Λ A

S

x

►H

O

^ VN CM VO VO CM

o rD <-H LA ι-t O O i-H

CM | C M t i i t « i rH O OOOOOOOOOO 00

2 CM CM CM

i—t f—I r—1

AA A

CM IA VO VO VO CM

Ή CM O O O rH

H * I I | I t OOOOOOOOOO 00

CM CM CM

rH pH rH

Λ A

00 '

CM

cm a ns

CM (Ti UI

rH O r-t O

00 c

00 O ιΗ (Τι X -H

CO U rr I O tr> LA E-l CO 'S* w p O <OUUrH-H u CM a U CM u O) CJVMCO Eh i-H fö (¾ E U3-HUQ)< tr> 10 E-· 0 Ό (0 Cu rH to

•f < 0M ·<Η (0 ·Η CO U5 P (0 LA

5 E O G -H CO > C "T

S, COCOVmCO-I rH O -H

s£ PDQJO)en3-rMtOoot3o 0 cl) Φ Ό CT P U r-c poo O'-· 1 vmvm-hocucuocu ό

p 33D4>iC(CJ04JUDU

h nliÖOiaCUM-i O U (DU

.,- ······· )m E-· to H

ς cncncncAoicnwo,i<a1< 85148 00

• O CM

o E-· o i-4 iti rH · · · · 25ihooo«hooco oo

(N CM (N

H »H rH

Λ Λ Λ

VO CM

LO O r—I m in CV · · » « » OCNOOOOODOO 00

CM CM (M

»—4 r“i r—H

Λ A A

rH e e

Φ -'s. CM VO CM

+J tT> Ή O rH in m t/) CO O- i · · · · •'I — Or-HOOOOOOCO 00

CM CM CM

O rH rH rH

H

r— S A A A

3 +->

(O r—J

„ in CM CM

n- r» cm in rH tn m CM · · * · · rH O ΟΟΟΟΟΉΟΟΟΟ 00

^ CM CM CM

^ rH rH r—I

Es AA

c h-

CM in CM VO CM VO

rH CM rH O rH O

VO t · · · · · OOOOOOOOOO 00

CM CM CM

rH rH rH

A A A

00 * 01 CM W its CM O (Λ

rH O rH O

00 C

00 U rH CT\ X -H

m U η· r~ o tji m H en h· tn p vo < o u U ή -h u CM D CJ CM S-l φ U U) E-· ή its to e U 0 -H u <1> C en ^ E-tOTS ftS tn -h tn •r- < E-* -H us -h ui X d m m

«= g(UC-Hcn> C

« US CO S-l C O Ή rH O Ή P 330)<UE(t3-Hcnoogo 0 0)0)τ3ερ^υ^Η3οοοΉ 1 ΜΜΉοωωοω ό

O 3SQj>iC(t3U-Pa3U

^ <o <o <d & o, ή ouasu ~z · · · · · · · »_i e-ι en Eh Σ WCntnWWCflW0c<0«i< 85148 • (Ν ID in in m E-· rH O CM CM in H ······ JZOOOOOCOOO 00

CN (N CN

rH f—Ή rH

Λ Λ

• CN

Eh in rH m m • · t · |

rH ^OOOrHOCOOO CO

CN CN CN

rH »—1 »H

Λ Λ Λ rH CN (N ID CM m m

O) m £ ι-l rH o rH (N (N

H-l rH X ······ 00 Cnoooooorroo oo

'.£ =» ID CN CM

r rH rH

Ή >-

=> U Λ A

I s «3 •r->

rn (N

oo 1—1 m in rH m CM O ή · · * rH OCMOOrHCMCOCO 00

^ CM CM CM

^ rH rH rH

ro C Λ Λ Λ I— • m cm rH tH in CM rH in in rH ·····«

52 OOOOOOOCO CO

O CN CN CN

rH rH rH

Λ Λ Λ CC "

(N

«N ffi cd CN <J\ (J)

rH O rH O

00 C

00 O rH O x -H

CO CJ ·*Τ P~ CP

m H co o ω a ίο fioUU^-H Vh

cm D U Ή M <D

•jr £h CM IÖ (0 = OS-HU(U<rHCn EH O T3 HJ rH 03 c rilEH-Hw-HwcuS m m

<o E 0) C ·Η W > G

P (Λ W VH G 0 rH Cfl rHOrn h 3 3 U) <U E <0 tn oo E o 7 QJdJOtPDU-HDcno·-» O M^-HOtDOJrHO) Ό

1- G3CU>mC<0Oh->U3U

f* (ÖtÖtDCUCUiHHOOUtUU

•••••••VhE-huJEh *- encncnwwtnwcHrt;ftl< il 85148 ro m vo \o (N m

O VD CN O O f-H CN

fsj ······ OOOOOOOOCN^r ro vo

(N

CN (N rO VO CN CN

rH rH O O rH i—I

CP ···**·

rH OOOOOOCOCNCN

ro ro

rH VO

g VO CN r-t VO CN CN

0)03 S O iH O O rH rH

Mi—(CP · · · · · ·

</>3.00000000VO(N

5 ~ -· ro £ u

' H

§ s

-V

-(-> ro •“ϊ x: · VO m en r~ E-· m o cn tn CN rH i « · i · r-t O 52OOOCNOC0 00 00

^ CN CN CN

»H rH rH

3 Λ Λ Λ

«C

t— (N m

VO UO rH CN

rH · « · O «H O O »H »H 00 00 00

CN CN CN

rH rH

A A

00

CN

CN K (0 cn en en

rH O rH O

03 C

00 U rH O X -H

ro (J ro· r- C7> m Eh ro o in d VO < O CJ U N -H in

CN D U 1 QJ

·£ CJ V( tn Η<ΝΠ3(0

i U 3 -H U O) < r-* CP

.J. H O Ό (0 rH tn e ι<Ε-(·Η(η·Ηω[Η3ωιη ro E<UC-hX>Cn· p ω tn m e o ή <λ Ο'-ν x d d <u <u ε to tngo

r tuajOtnaU'-HdOrH

O KI-t-HOQJQJrHtiJO

s- ddo.^.c«JO-PdO

-* CilfltUOrDr'WOOCUU

•Ji ^ tn E-· *· wwwmwc/iwc^o.**: 851 48

VO

CN (N rH (N CN (N

LT) rH rH O i—1 r—l »—I

(N «····· οοοοοονοττ^τ

rH VO VO

ro

VO CN VO VO VO CN

O rH O O O rH

*3* ·«····

CN OOOOOOCNCOOO

ro (N <N

r-1 i—<

Λ A

i—I CM

<U £ VO CN CO CN CN CN

4_J Γ0 "X O r—l O rH rH rH

ΙΛ (N D1 · · · t · ·

-r- aoooooocorrcN

2 rH VO ro

U

—s M

§ s

•M

<0 ,r"3

W VO

_ CN rH VO CN CN

O <N £n f—I O O rH rH

ΓΟ (N ······

rH O ÄOOOOOOO^^T

^ vo vo ra _i =3 < h-

VO

VO CN rH CN (N CN

rH O rH O rH rH rH

CN ······ OOOOOOVOOON·

rH CN VO

rH

00

CN

CN X Π3 cn en tn rH O rH 0

00 G

00 U rH O X -H

ro u o* c'- CT> m Eh co o tn a

to < o CJ U τ -h M

cn D U rH >H cd •f- u (h cn Ehcncoco j= U 3·ΗΟ (UrtJrH 03

Eh o Ti <tj rH tn c «JEH-ritn-HtnCuScnm CO gQJC-HX>C·^ σι tntnjHCO-Htn 0<h J- 3» P <U α> ε Cö tn e o r α)α)Γσεη3υ·Η30·Η o M»H-HOa)(UrH(I)T3

i- GGQjShGcOO-PGU

-* cecotucuatHuoau

P · · · · · · · >H tn EH

* wwtntnwcnwd404< 85148

CN

• CN rH VO VO CN

£-4 i-4 O O O i—t CO ·#····

CO ZOOOOOOOOOOO

CM CM (N

»“4 t-H »—|

Λ Λ A

m vo cn in m • in o >h cn cn t—4 EH · · · · ·

ro • OOOOO'TCOOO

Z VO «N CM

rH rH

A A

tl ™

O rH

JSHrOrHCNCNOOOOOO

(N CN CN

rH rH rH

A A A

. m σι Eh (N in CN · · ·

ZCNOOrHCNCOOOOO

CN CN CN

rH rH rH

_ ΑΛΑ 4-> ω tr*

(0 4-· 3. (N

·<-> moo·— Eh ή m m o—'’ ’t— CM · · · ·

’OCJZrHOOOCMCOCOCO

x _c h cm rg cm

·—« >- 2J rH rH iH

12 O A A A

n ^

rH NC

ro —4 Z3 <c t— m vo cn cn

Γ- EH in CN O rH rH

CN ······ zooooocooooo

CN CN CN

rH rH rH

Λ Λ A

in vo cn cn

VO E-1 CN O rH rH

CN · · · · ·

ZrHOOOOOOQOOO

CN CN CN

rH rH rH

A Λ A

00 CN _ CN K Π3 cn a\ m

rH O rH O

00 C

00 U rH O X -H

cn O 'T n- tri m E-i <n o in p •r- \0 rti O u O 'S* -H ö

E CN D P -H H CJ

(Λ Γ) M M H CN (0 (0 •r- ö9,HUQ)rtI'-,tT> c r n Ό ro rH in (O aEH-Hm-riw&Hprtjm CT E<l)C-rH2>C^r s- ujtgCcorHtn p h

0 PPd)(l)Ert3 WHO

1 φ φΌ e· 3 υ-rt p o rH

O HÖ-HOlUOJcHaJO

s- B3cu>nCrtjp4-5pu hc ««βΦθ4θ(»·Η0ρδρ ·>- ....... h ® o se toiowwtncnWRO<ri.

85148 • l£> CN U-)

'S’ E-l O r-t CN

r-* · · · ·

Zrrxrooooooooo

CN CN CN

rH rH rH

A A Λ

• VO VO CN VO CN

M E-t O O tH O rH

Γ"* ······

ZOOOOO^tfCNCN

ro ro

• (N CN VO VO (N

rH EH rH rH O O rH

·««··· 200000030000

CN CN CN

.—. φ i—I r-t i—t 3 to d ΑΛΑ -V -r- ts « 2 cn

T? · CN 1C ID UO CN

O E-t i-t O O O r-l ^ r· CJ · · · · · ·

ZZ HZOOOOOCOCOCO

g CM CN CN

q rH rH rH

P{ ^ AAA

- 3 <

CN

• <N I—t CN CN

yo E-t <-· o <h i-ι in I * I « · t ZOOOOO000000

(N CN CM

rH rH rH

AAA

if) VO CN CN LD

Ο CN O rH rH CN

vo «····· ZOOOOOCNOOrr m cn id I—t t* 00

CN

cn a: to

CN 03 CO

r-t Ο r-t o

00 C

00 U r-t O X -rt η ο Ί· r* tr> m η ro ο σι p C ID < O U O -H £l

= CN S P rH H (U

.12 u H tn cn rt to & “ ö -g a -g .a ia ? s s ? p ρ ω <D g to as0 ' <U<U'OÖ'Py-HPÖ«-i b 33cu>iCtoo-ppu

^ cOfOO)D<Djt»-tOOQjP

*- cnwwwwwwfieu«i l! 85148

• (N VO VO CN (N

O £-t rH O O m i—l 00 ····*« 5500000000000

CN CM CM

r—H r-l f-H

ΑΛΑ

• VO VO VO VO CN

CT> EH O O O O rH

(n, »·····

Zooooo^roM^r

CO VO

•

• VO VO VO CN CN

00 H O O O 1—t r-l JS. !·*··(

Zooooooo^rcN

vo ro ω -r· 4-> >d co 6 3 Ό O'

3-5 "=* . CN CN VO VO CN

Γ £-1 rH r-V O O rH

ITI CJ ······ _ • rH H200000000000

2, CN (N CN

H T-^ f“l CO X J. A * (f) Λ Λ Λ

^ O

. CN VO VO VO CN

Sr VO H Ή O O O r-l L· (> ··*··· ^ 2OOOOO00 00 00

(N CM VN

rH rH rH

A A A

• CM LO VO VO CN

ID E-t rH (N O O rH

r* ·····» 200000000000

CN CN CN

r-t »H rH

“ A A A

00 (N EC (0

(M <JV OT

fH O rH Q

00 C

00 rj i—i o X -h m Cl rr i" en _ in H en o ot p

cz VO < o U U ^ -H S

S , , «n D ö £ m ω “ UMOT EH CN ro (0 5 §|^°SarHi«>

» « p -d S -a .2 ia ? 3 S

? aSSSim^inio ^ aio^Sa'vHop sg <ntnwwwwMOtö<< 851 48 CN CN CN (N U")

VO fcH rH r-H i-H rH (\J

00 ··»···

Zooooooocooo

CN CN CN

r*H rH I—( ΛΛΑ

m CN V0 VD CM

in Eh <N rH O O rH

00 ····«·

5ZOOOOOOOCOOO

CN CN CN

rH r*H r-H

A A Λ

• CN ^ (N CN CN

EH rH O rH rH rH

·«·«·· 00 200000^0000

l£> CN CN

»“H rH

r-. <U 'ä A Λ 3 +-> 2 £ 5

ΐίΉ'-' · (N VO VO VO (N

.2. Eh rH O O O rH

> oo y · · . .

HZOOOOOOO^CN

X * VO n n o

rH X

X

ro

—I

r?

< t CM VO VO VO IN

•“CM EH rH Ο Ο Ο r-l 00 ·····* 200000000000

CN CN CN

rH rH rH

AAA

• CN ID VD CN CN

iH EH *-H O O »H rH

00 I I I I I I

200000000000

CN CN CN

rH rH rH

' A Λ A

00

CM

cm ac m CN OV in rH O rH 0 00 c

00 y rH O X -H

m O ·*τ r~ (Τ' •Jl in eh co o in p

i vo < o y y n· -n C

,., CN D O rH U 0) Z y M in Ehcnctjco c pg-rtOUrtJrHOl S. η η τ3 co r-π in P <1Εη·η cn-H inpn p pm b ea)c-HE>d^ • p P aj gJ E «j in go

O PlUODlpU-rlPÖrH

h iHB-rtoSajrHiufS

:* PdQH^iScÖQ+ipy

s: idmcTacuiHOOoP

rt- · * · · · t · V«| uj pH

cocnMMcncoufioiri!

II

85148

• (N CN

<N £-» ID ΐΠ VO rH rH

σ> ······

Zooooooocooo

(N CN CN

rH r-t rH

Λ Λ A

• CM (M VO CN

rH En rH i-H VO O <—I

cv ······

ZOOOOOOOOOOD

CN (N CN

rH rH rH

A A A

. CM CM VO CM

£-) r—( i—C VO O ·—I

o ······

O JSOOOOOOOQQQQ

(N CN CN

»-H rH rH

Q) —*

4-> »H A A A

oo E

=3 --- 3 Ό tj» .C T.

>- · CN CN VO CN

0*\ £h rH rH VO O rH

•t—> oo o · · · · · · —r HZOOOOOC00000

g CN CN CN

^ rH rH rH

m 1—1 A A A

2 O

2uC

ZD

_J

rf . CM CM CN CM

I— CO E-< Ή r-l VO *H rH

00 ······

Zooooooooooo

CM CN CM

rH rH rH

ΑΛΑ

• CM CM VO CN

f" EH Ή rH VO O rH

00 ··»··· ZOOOOO0300C0

CM CN CM

rH rH l-H

' A A A

CO

CM

CM ΣΕ Π3 (N OV 0] S " 8

CO CJ rH O X -rH

n n r~ tn m R m o ω p r- vo rtiPUCJN'-Hp E c3 D O ή Vj φ p H w 6<ncö(0 •r- Pp-HUQJcaJrHtTi c £3 5¾ <o , i—t to nj rtjEH-HW-HcnpHpgm en E(UC-hS>Cn· s_ m « w e Q rj en «Pi 0 p D ai <D E ro w £ o

1 <D0)'UtT>3p-HP.S<H

o MmtHOOI&'PUJ'Q

h S I S-S:&Ä 8 f SB

•r- ····«· »J-jC/JH

s: tn(/icowcncnw(5u04<; 85148

• KD KD KD (N <N

Eh o o o tn »η ······

σ\ ZOOOOOOOCNCN

σ\ m ro

• (N VO VO CN CN

P*·* Eh rH O O r-1 rH

σ\ ·····#

ZOOOOOOOCNCN

n m

• (N VO VO CN CM

VO E-· r-l O O rH i-H

·····

Zooooocococo

CN CN CN

»H rH rH

<u 4J Η Λ Λ Λ 3 1Λ 6 3 ·ι- -o 5

^ w · (N VO VO VO CN

in En «h o o o .-h v o> U · · · · · · S^ooooococooo

<N CN CN

^ rH »H »H

VO Ä .

ro O AA

ID

ID

2 · VO VO VO VO (N

ΕηΟΟΟΟγΗ C* ···«·· SZOoooo^tcnvo n r-l

• VO VO VO VO CN

O E"» o O O O r-l OV t I | I I |

Zooooooo’sr'a·

VO VO

fr 00

CN

cn ta to

CN OV W

i-H O rH o „ CO c

00 CJ rH o X -H

n n rr r~ tr» m E-i <η o cn 5 p vo < o y U ·η u

S r». CN p Q rH U CD

•r- y H cn cn id (0 s S 8 3 u % rt S' „

? S SS

° clSiSi'ra^inBo

O (UiUOÖiSO-HSOiH

L QH'HOttJQJrHOJT) 3 3ft>igmQ.P:3p

ΐ <Ö ιΰ 0) CLO.MH 0 O SO

*- cnwwwwwwttcurt: 85148

• (N (N VO VO CN

ΙΠ &H rH rH O O rH

O ······

rH ZOOOOOOOOOOO

(N CN CN

iH rH rH

Λ Λ A

♦ ττ · in vo vo in o Eh cn o o cm rH · · · · ·

ZOrHOOOCOCOCO

CN (N CN

r-i r^i Λ A Λ CO * o H in in in rH · · · ·

ZCNOOOrHTTOOCO

VO CN CN

rH rH .

<U _ H Λ <—* co d 3 ·Γ- -Ϊ1 3 Ό Cn -C a.

H-» >- CN · VO VO VO VO CN

«o Eh o O o o »h '-J I—( M · · · · · · — HZOooooHT'rrr S vo vo

X

Γ- - CO o

»H

NC

ra

_J

Z3

<C . VO VO VO CN CN

I— rH Eh o O O t-H i-H

o ······ rH ZOOOOOV00000

rH CN CN

rH i—I

• VO VO VO CN CN

O P O O O rH rH

o ······ rH ZOOOOOCOOO*?

CN VO

rH

t

CO

CN

cn S iti cn en en rH O rH o

03 C

CO U rH O X -H

ro n Tf en in pm o « p E CNPÖrHUO) </> y ϋ W P CN iti iti

•r· ög.rHUCUrirHtJV

e p o fD Iti rH U3 ra <EH'dw,HWFHp<gcn en gcDG.rHEpCHi· s- wtnficQrHcn O’-· 0 pdcuSSn} en E o 1 φφ^οιρο-ηρο·-·

O J-lM-rIÖCUaJrHajO

(ΟίοαΓΛαΉορΦΡ

•r- ♦····«· W UJ

ς o3cncocncocow(-H04<; ,38 85 1 48

Keksinnön mukaisten tyypillisten yhdisteiden ED,n-arvot

bU

(mg/kg) in vivo-testeissä hiirillä, jotka on kokeellisesti infektoidut kannalla S.pyogenes L 49, menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet V. Arioli et ai., Journal of Anti-5 biotics 2Ji, 51 1 ( 1 976), on esitetty seuraavassa Taulukossa X.

li 139 851 48

TAULUKKO X

ED50 (mg/kg)

Yhdiste Annostustapa os. s.c I 70.7 0.047 10 2 89.6 0.046 3 ~ 300 0.099 4 /sj 300 - 0.08 5 173 0.062 6 115 < 0.03 15 7 > 300 0.81 8 > 300 0.3 9 > 300 0.3 10 > 300 1.6 II > 300 0.41 20 12 > 300 0.95 13 > 300 2,2 14 N.T. N.T.

15 > 300 2.2 16 > 300 5 25 17 > 300 rs 7 18 140 0.31 19 > 300 . 0.18 20 > 300 0.72 21 > 300 2.2 30 22 > 300 1.6 23 > 300 0.95 24 > 300 0.72 25 > 300 1.02 140 85 1 48 TAULUKKO X (jatkuu) ED50 (mg/kg)

Yhdiste Annostustapa 5 os. s.c 26 220 0.08 10 27 90 0.06 28 > 300 1.6 29 > 300 ' 2.2 30 > 300 > 10 31 > 300 2.9 15 33 60 66 > 300 5 70 90 0.15 71 72 0.08 20 73 > 300 0.81 74 > 300 0.3 75 139 0.08 76 140 0.1 77 > 300 0.18 25 78 > 300 1.4 79 > 300 1.25 80 300 . 0.14 81 90 0.1 82 173 0.07 30 83 > 300 0.46 84 > 300 1.65 85 300 0.10 «6 300 0.23 li 141 85148 TAULUKKO X (jatkuu) ED50 (mg/kg)

Yhdiste Annostustapa 5 OS. s.c 87 112 0.12 10 88 300 0.18 89 > 300 0.08 90 89.6 * 0.08 91 139 0.08 92 N.T. N.T.

15 93 > 300 1.25 94 > 300 1.25 95 140 0.09 96 90 0.07 97 > 300 0.54 20 99 100 101 102 103 N.T. N.T.

25 104 > 300 0.2 105 > 300 0.13 k 142 85148

Edellä esitetyn antimikrobisen aktiivisuuden kannalta tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan tehokkaasti käyttää antimikrobisten valmisteiden aktiiviaineena, joita valmisteita käytetään ihmisten ja eläinten lääkitsemiseen estettäessä ja hoidettaessa infektiosairauksia, joita mainituille aktiiviaineille herkät patogeeniset bakteerit aiheuttavat.

Tällaisissa hoidoissa, näitä yhdisteitä voidaan käyttää sellaisenaan tai seosten muodossa missä tahansa suhteessa.

Sen lisäksi, että tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat aktiivisia lääkkeinä, niitä voidaan käyttää eläinten kas-vupromoottoreina.

Tätä tarkoitusta varten yhtä tai useampaa tämän keksinnän mukaista yhdistettä annostetaan oraalisesti sopivassa ravintoaineessa. Tarkka konsentraatio, jota käytetään on sellainen, joka vaaditaan, jotta saadaan aktiivinen aine kasvupromoottoriin tehokkaassa määrin, käytettäessä normaalit määrät ravintoa. Keksinnön mukaisten aktiiviyhdis-teiden lisääminen eläinten ravintoon suoritetaan mieluimmin valmistamalla sopiva ravintosekoitus etukäteen, joka sisältää aktiivisia yhdisteitä tehokkaassa määrin ja tämä esisekoitus yhdistetään päivän ravintoannokseen.

Vaihtoehtoisesti välituotekonsentraatti tai ravintolisäai-ne, joka sisältää aktiivisen aineosan, voidaan sekoittaa ravintoon.

Tavat, jolla tällaiset ravintoesisekoitukset ja päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa, on esitetty viitekirjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 tai "Livestock Feeds and Feeding", 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977), jotka liitetään tähän selitykseen viitteenä.

I: 143 851 48 ESIMERKKI 1: (Menetelmä A^: Suojaamattoman teikoplaniini-lähtöaineen reaktio valitun amiinin kanssa ja lopullisen tuotteen asetaattisuolan muodostaminen)

YHDISTEIDEN No 1-6, 26, 34, 35, 82, 87, 88 ja 95 VALMISTUS

5 Hämmennettyyn liuokseen, jossa on 1 mmooli teikoplaniini A2 kompleksia, valmistettu US-julkaisussa 4,239,751 kuvatulla tavalla, ja 2 mmoolia valittua amiinia 20 mlrssa di-metyyliformamidia (DMF), lisätään tipoittain liuos, jossa on 1,1 mmoolia difenyylifosforyyliatsidia (DPPA) 5 ml:ssa 10 DMF:ää, 10 minuutissa, samalla jäähdyttäen 0-5°C:seen.

Reaktioseosta hämmennetään noin 6 tuntia 5°C:ssa ja yön yli huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen lisätään tipoittain 0-5°C:ssa DPPA:n 0,5 mmoolista liuosta 2,5 ml:ssa DMF:ää. Hämmentämistä jatketaan huoneen lämpötilassa vielä 15 24 tuntia, sen jälkeen lisätään 125 ml etyylieetteriä ja kiinteä aine, joka erottuu, kerätään, pestään 100 ml :11a eetteriä ja liuotetaan uudestaan 100 ml taan veden ja ase-tonitriilin seosta, 8:2 (til./til.), pH säädetään arvoon 2,5 1 N H C1 :11ä . Muodostunut liuos kromatografoidaan pyi-20 väässä, joka on valmistettu 250 g : 11 a silanoitua piihappo-geeliä (0,063-0,2 mm; Merck) ja tasapainoitettu ennakolta veden ja asetoni trii1in seoksella 8:2 (til./til.). Pylväs kehitetään eluoimaila lineaarisella gradient!11a alkaen 20 %:sta CH3CN:ää 0,001 N HCl:ssä aina 80 %: i i n CH3CN:ää 25 0,01 N H C1 : s s ä 20 tunnissa, nopeuden ollessa 250 ml/tunti.

Fraktiot ovat 25 ml ja eluointia seurataan H PL C:11ä . Fraktiot, jotka sisältävät otsikossa mainitun puhtaan yhdisteen, yhdistetään ja muodostuneen liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 1 N NaOH:11 a ja sen jälkeen lisätään yhtä suu-30 ri tilavuus (til./til.) vettä. Sitten tämä seos uutetaan butanolilla (til./til.) ja orgaaninen kerros erotetaan, pestään vedellä ja konsentroidaan tyhjössä 40°C:ssa, kunnes suurin osa vedestä on poistettu. Samea butanolipitoi-nen liuos suodatetaan, lisätään etyyliasetaattia (0,5 144 851 48 til./til., t.s. puoli tilavuutta liuotinta per liuoksen tilavuus) ja suspensio (tai samea liuos), joka muodostuu, uutetaan vedellä (0,5 til./til.). Orgaaninen kerros konsentroidaan pieneen tilavuuteen, lisätään etyy1ieetteriä 5 ja erottunut kiinteä aine kerätään, pestään eetterillä, sen jälkeen kuivataan tyhjössä 50°C:ssa yön yli, saadaan otsikossa mainittu yhdiste vastaavana vapaana emäksenä, joka sen jälkeen liuotetaan metanoliin (yleensä 1 g 50-100 ml:aan). Lisätään jääetikkaa (0,5 ml per gramma vapaata 10 emästä) ja muodostunutta liuosta hämmennetään muutaman minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Lisäämällä etyylieetteriä (300-500 ml), erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä (100 ml) ja kuivataan yön yli huoneen lämpötilassa, saadaan otsikossa mainitut yhdisteet vastaavana 15 monoasetaattisuolana.

ESIMERKKI 2 (Menetelmä A2: Suojaamattoman teikoplaniini-lähtöaineen reaktio valitun amiinin kanssa ja lopullisen yhdisteen hydrokloridisuolan valmistus)

YHDISTEIDEN No 13, 18, 76, 77, 80, 81, 89 ja 91 VALMISTUS

20 Reaktio teikoplaniini A^ kompleksin ja valitun amiinin välillä tapahtuu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Heti kun otsikossa mainittu raakatuote on saostettu etyylieetteri 1 -lä ja erotettu kiinteänä aineena, se suspendoidaan metanoliin (noin 1 g ainetta 100 ml:aan liuotinta). Lisätään 25 vettä (til./til.) ja muodostuneen liuoksen (tai suspen sion) pH tuodaan arvoon 2,5 1 N H C1 :11ä . Sen jälkeen lisätään silanoitua piihappogeeliä (0,063-0,2 mm, 5 g per gramma raakatuotetta; Merck) ja n-butanolia ( 200 ml). Muodostunutta suspensiota hämmennetään muutaman minuutin ajan 30 huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen liuottimet haihdutetaan täydellisesti ja jäännös laitetaan kromatografiapyl-vään yläosaan, joka pylväs sisältää samanlaisen silanoidun piihappogeelin (100 g) tasapainoitettuna veden ja asetonit-riilin seoksella, 95:5 (til./til.). Pylväs kehitetään li ns 85148 eluoimalla lineaarisella gradientilla alkaen 5 %:sta -aina 40 %:i i n (yhdisteen 13 ollessa kyseessä) tai 15 %:sta 60 %:i i n (yhdisteen 18 ollessa kyseessä) CHgCN:ää 0,001 N HClrssä, 20 tunnin kuluessa, nopeuden ollessa 100 ml/tunti.

5 Kerätään 10 ml:n fraktiot ja testataan H PL C : 11ä (menetelmä b). Fraktiot, joka sisältävät otsikossa mainitun yhdisteen, yhdistetään ja konsentroidaan tyhjössä 45°C:ssa ja lisäämällä sopivat määrät n-butanolia saadaan lopullinen vedetön, butanolipitoinen samea liuos (noin 200 ml). Sen 10 jälkeen kun on lisätty 1 N HC1 :ää (0,2 ml), liuos konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä huoneen lämpötilassa (alle 25°C). Saostamalla etyylieetteri11ä , pesemällä eetterillä ja kuivaamalla tyhjössä 40°C:ssa yön yli, saadaan otsikossa mainittu yhdiste (vastaavana dihydroklori-15 d i n a ) .

ESIMERKKI 3: (Menetelmä A^: suojaamattoman teikoplaniini-lähtöaineen reaktio valitun amiinin happoadditiosuolan kanssa emäksen läsnäollessa)

YHDISTEIDEN No 16, 38, 75, 85, 92 ja 105 VALMISTUS

20 Liuos, jossa on 0,6 ml (2,8 mmoolia) DPPA:ta 2 ml:ssa DMF:ää, lisätään hämmennettyyn liuokseen, jossa on 2,8 g (2 mmoolia) antibiootti L 1 7046: ta ja 0,6 g (4,2 mmoolia) glysiinietyyliesteri-hydrokloridia 100 ml:ssa DMF:ää 0-5 C:ssa. Lisätään 1,1 ml (8 mmoolia) trietyyliamiinia 25 (TEA), jonka jälkeen reaktioseosta hämmennetään 2 tuntia 5°C:ssa ja yön yli huoneen lämpötilassa. Reaktion kulkua seurataan H PL C : 11ä (menetelmä b). Muodostunut liuos kaadetaan 500 ml:aan etyylieetteriä ja sakka, joka muodostuu, kerätään ja liuotetaan uudestaan 500 ml :aan veden ja ase-30 tonitrii 1 in seosta, 7:3 (til./til.), samalla kun pH sääde tään arvoon 2,3 1 N HCl:llä. Lisätään 600 ml n-butanolia ja 200 ml vettä, jonka jälkeen seoksen pH säädetään arvoon 8,2 1 N NaOH:lla, samalla voimakkaasti hämmentäen. Orgaaninen kerros erotetaan, pestään 400 ml :11a ( 2x200 ml) 146 85 1 48 vettä, sen jälkeen konsentroidaan pieneen tilavuuteen (noin 50 ml) 50°C:ssa tyhjössä. Lisäämällä etyylieetteriä (200 ml) erottuu kiinteä aine (otsikossa mainittu yhdiste vapaana emäksenä) , joka kootaan ja liuotetaan uudestaan 5 200 ml:aan metanolipitoista 0,02 M HCl:ää. Lisäämällä etyy- lieetteriä (500 ml) erottuu sakka, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 40°C:ssa yön yli, saadaan 1,62 g yhdistettä 16 (vastaavana hydrokloridina).

ESIMERKKI 4: (Menetelmä A.: Suojaamattoman teikoplani ini- H 12 10 lähtöaineen reaktio kaavan HNR R mukaisen amiinin kanssa, jossa on toinen aminoryhmä ja/tai muita karboksyyliryhmiä, jotka kaikki ovat suojatut, ja myöhemmin tapahtuva suoja-ryhmien poistaminen katalyyttisesti hydraamalla)

YHDISTEIDEN 36, 37, 39, 71 ja 90 VALMISTUS

15 Noudatetaan pääasiallisesti esimerkin 1 ensimmäisen osan menetelmää (menetelmä A^).

Heti kun saadaan kondensaatiotuote, jossa on joko muita amino- tai karboksifunktioita, jotka on suojattu, yhdisteestä poistetaan suojaryhmät hydraamalla katalyyttisesti 20 käyttäen palladium hii1 el 1ä-katalysaattoria (kuten on kuvattu jäljempänä esimerkin 6 toisessa osassa, menetelmä B^).

ESIMERKKI 5: (Menetelmä A,.: Suojaamattoman teikoplaniini- o . 2 lähtöaineen reaktio kaavan HNR R mukaisen amiinin kanssa, joka sisältää jonkin muun aminoryhmän ja/tai muita karbok-25 syyliryhmiä, jotka on suojattu, ja suojaryhmien myöhemmin tapahtuva poistaminen happamessa väliaineessa)

YHDISTEIDEN 48 ja 57 VALMISTUS

Noudatetaan pääasiallisesti esimerkin 1 ensimmäisen osan menetelmää (menetelmä Aj).

30 Valittu amiini on tässä tapauksessa amiiniyhdiste, jossa on muita karboksyylifunktioita, jotka on suojattu ryhmillä, 147 85 1 48 jotka ovat poistettavissa vedettömissä happo-olosuhteissa, kuten glutamiinihappo-dibutyyliesteri . Heti kun saadaan kondensaatiotuote , jossa on suojattuja karboksifunktioita , siitä poistetaan suojaryhmät happamessa väliaineessa, jo-5 ka muodostuu vedettömästä trif1uorietikkahaposta (kuten jäljempänä esitetään esimerkin 7 toisessa osassa, mene-tel mä B^) .

ESIMERKKI 6: (Menetelmä B^: N-suojatun teikoplaniini1 äh to -aineen reaktio valitun amiinin kanssa, jota seuraa suoja-10 ryhmien poistaminen katalyyttisesti hydraamalla)

YHDISTEIDEN 9, 13, 22, 54, 61 ja 73 VALMISTUS

a) N-bentsyylioksikarbonyyli-suojatun lähtöaineen (NCBzO-ST) valmistus

Liuos, jossa on 0,45 ml bentsyyliklooriformiaattia 10 ml:ssa 15 kuivaa asetonia, lisätään tipoittain, samalla jäähdyttäen 0-3°C:ssa, hämmennettyyn liuokseen, jossa on 2 mmoolia valittua teikoplaniini1ähtöainetta ja 0,5 g NaHCOg:a 150 ml:ssa asetonin ja veden seosta, 2:1 (til./til.). Noin 30 minuutin kuluttua lisätään 500 ml vettä ja muodostunut 20 liuos uutetaan 500 ml :11a etyylieetteriä. Vesipitoisen kerroksen pH säädetään arvoon noin 3,5 1 N HCl:llä, jonka jälkeen uutetaan 500 ml :11a n-butanolia. Orgaaninen kerros erotetaan, pestään 400 ml :11a vettä ( 2x200 ml), jonka jälkeen konsentroidaan pieneen tilavuuteen 45°C:ssa tyhjössä.

25 Lisättäessä etyylieetteriä erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan huoneen lämpötilassa tyhjössä yön yli, saadaan teikoplaniini1ähtöaineen N-CBzO-johdannainen, joka on tarpeeksi puhdasta (HPLC-tiitteri > 90 %, menetelmä c) käytettäväksi seuraavassa vaiheessa 30 (saanto > 80 %).

b) Teikoplaniini-amidi-yhdisteen N-CBzO-johdannaisen valmistus 148 85 1 48

Edellä saadun N-bentsoyylioksikarbonyyli1ähtöaineen kon-densaatio valitun amiinin kanssa suoritetaan DMFrssä (HPLC, menetelmä c) DPPA:n läsnäollessa samoissa reaktio-oloissa, mitä on kuvattu esimerkissä 1. Saadaan N-CBzO-teikoplaniini-5 amidiyhdiste kiinteänä aineena, joka saostetaan reaktio-seoksesta lisäämällä etyylieetteriä.

c) Osikossa mainitun teikoplaniiniamidijohdannaisen valmistus

Edellä saatu raaka N-CBzO-teikoplaniiniamidi (1 g) liuote-10 taan seokseen (100 ml ), jossa on metanolia ja 0,1 N kloorivety-happoa, 7:3 (til./til.)» j<* muodostunutta liuosta hydrataan huoneen lämpötilassa ja ympäröivässä paineessa (0,5 g) 5-prosenttisen Pd/C-katalysaattorin läsnäollessa. Reaktio tapahtuu täydellisesti yleensä yhdessä tunnissa (HPLC, mene-15 tel mä c). Reaktioseos suodatetaan ja kirkkaaseen suodokseen lisätään silanoidun piihappogeelin (0,063-0,2 mm, 4 g,

Merck) ja n-butanolin (60 ml) seos. Sen jälkeen liuottimet haihdutetaan tyhjössä 45°C:ssa ja jäännös laitetaan kroma-tografiapylvääseen, joka sisältää samantyyppisen silanoidun 20 piihappogeelin (100 g) ja joka on valmistettu seokseen vesi:asetoni trii1i , 95:5 (til./til.).

Pylväs kehitetään lineaarisella gradientti-eluoinni11 a alkaen 5 %:sta (yhdiste 9), 10 %:sta (yhdiste 13) ja 20 %:sta (yhdiste 22) C H ^ C N : ä ä 0,001 N H C1 : s s ä aina 30 %:iin, 40 %: 25 iin ja vastaavasti 55 %:i i n C H 3 C N : ä ä vedessä 15 tunnissa, nopeuden ollessa 120 ml/tunti.

12 ml:n fraktiot kerätään ja testataan H PL C : 11ä . Fraktiot, jotka sisältävät otsikossa mainitut puhtaat yhdisteet, yhdistetään ja muodostuneeseen liuokseen lisätään n-butano-30 lia (til./til.) ja 1 N HC1 :ää (2 ml). Konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä 40°C:ssa, jonka jälkeen saadaan otsikossa mainitut yhdisteet (vastaavana dihydrokloridina) seostamalla etyylieetteri11ä butanolipitoisesta faasista, 149 851 48 pesemällä ja kuivaamalla yön yli tyhjössä 40°C:ssa.

ESIMERKKI 7: (Menetelmä B^: N-suojatun teikoplaniini1ähtö-aineen reaktio valitun amiinin kanssa, jota seuraa suoja-ryhmien poistaminen happohydrolyysi11 a) .

5 YHDISTEIDEN 11, 14, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 31, 52,

53, 78, 79, 83 ja 94 VALMISTUS

a) N-tert.-butoksikarbonyyli-suojatun teikoplaniini- lähtöaineen (N-t-BOC-ST) valmistus

Seosta, jossa on 4 mmoolia valittua teikoplaniini1 ähtöai-10 netta 2 ml:ssa (14,5 mmoolia) TEA:aa ja 2 g (7 mmoolia) tert.-butyyli-2,4,5-trikloorifenyylikarbonaattia 100 ml: ssa DMF:ää, hämmennetään 24 tuntia huoneen lämpötilassa. Lisättäessä eetteriä (900 ml) erottuu kiinteä aine, joka kerätään ja liuotetaan uudestaan veden jametanolin seok-15 seen (1 1), 7:3. Muodostuneen liuoksen pH säädetään arvoon 3,5 1 N HClrllä, sen jälkeen uutetaan eetterillä (500 ml). Vesipitoinen kerros uutetaan uudestaan n-butanoli11 a (1 1). Butanolipitoinen kerros pestään vedellä (2x500 ml) ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä 35°C:ssa. Lisää-20 mällä etyylieetteri saostuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 40°C:ssa yön yli, saadaan (saannot ovat aina yli 90 %) N-t-BOC-suojattu tei-koplaniinilähtöaine tarpeeksi puhtaana (HPLC-tiitteri > 90 %, menetelmä c) seuraavaa vaihetta varten.

25 b) Teikoplaniiniamidiyhdis teen N-t-BOC-johdannaisen valmistus

Edellä saadun N-t-B0C-suojatun teikoplaniini1ähtöaineen kon-densaatio valitun amiinin kanssa suoritetaan DMFrssä (HPLC, menetelmä c) DPPA:n läsnäollessa samoissa olosuhteissa, 30 kuin mitä on kuvattu esimerkissä 1. Samoin kuin N-CBz0- teikoplaniiniamidin tapauksessa (katso esimerkki 4 b) raaka N-t-BOC-teikoplaniiniamidi saadaan reaktioseoksesta ,50 851 48 etyylieetterisaostuksen jälkeen tarpeeksi puhtaana, jotta sitä voidaan käyttää suojaryhmien poistovaiheessa .

c) Otsikossa mainitun teikoplaniiniamidijohdannaisen valmistus 5 Liuosta, jossa on 1 mmooli N-t-BOC-teikopla niiniamidia 40 ml:ssa 100-prosenttista trifluorietikkahappoa (T F A) , hämmennetään 10-20 minuuttia 5°C:ssa, jonka jälkeen liuotin haihdutetaan tyhjössä 25°C:ssa. öljymäinen jäännös hierretään eetterin kanssa, sen jälkeen kerätään ja liuotetaan 10 uudestaan 150 ml:aan metanolia. Lisätään silanoitua pii-happogeeliä (0,063-0,2 mm, 5 g; Merck) ja liuotin haihdutetaan tyhjössä 40°C:ssa. Jäännös laitetaan pylvääseen, joka sisältää samanlaisen silanoidun piihappogeelin (150 g) ja joka on valmistettu veden ja asetoni trii1in seokseen, 15 95:5 (til./til.). Pyiväskromatografia suoritetaan olennai sesti esimerkissä 4 c kuvatun menetelmän mukaisesti. Erityisesti kehitetään lineaarisella gradienttieluoinnilla alkaen 5 %:sta CHgCN:ää 0,001 N H C1 : s s ä aina 30 %:iin CH^CNiää vedessä, kun kyseessä on yhdiste 9, lineaarisella gradient-20 tieluoinni11 a alkaen 10 %:sta CH3CN:ää 0,001 N HClrssä aina 40 %:i i n CH^CNrää vedessä, yhdisteen 14 ollessa kyseessä ja lineaarisella gradienttieluoinnilla alkaen 20 %:sta CH3CN:ää 0,001 N HCltssä aina 55 %:i i n CH3CN:ää vedessä, yhdisteen 22 ollessa kyseessä. Virtausnopeus on 120 ml/tunti ja aika 25 on 15 tuntia. Kerätään 12 ml:n fraktiot, eluointia seurataan H PL C:11ä ja työskennellään pääasiassa kuten edellä on esitetty esimerkissä 4 c.

Fraktiot, jotka sisältävät otsikossa mainitut, puhtaat yhdisteet, yhdistetään ja muodostuneeseen liuokseen lisätään 30 n-butanolia (til./til.) ja 1 N HC1:ää (2 ml). Konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä 40°C:ssa, jonka jälkeen saadaan otsikossa mainittu yhdiste (vastaavana dihydroklo-ridina, paitsi yhdiste No 25, joka otetaan talteen monohyd-rokloridina) seostamalla etyylieetteri11ä butanolipitoisesta li ’si S 51 48 faasista, pestään ja kuivataan yön yli tyhjössä 40°C:ssa. ESIMERKKI 8:

Teikoplanii n iamidi yhdiste iden 18-25 tri fluori asetaatti-suolojen valmistus 5 Teikoplaniiniamidiyhdiste (amidit 18-25) liuotetaan (1 g 300 ml:aan) veden ja a se tonitrii 1 in seokseen, 8:2 (t i1 ./ t i 1 . ). Muodostuneen liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 0,1 N N a 0 H : 11 a ja uutetaan (til./til.) n-butanoli11 a. Orgaaninen kerros erotetaan, pestään vedellä (til./til.) ja 10 konsentroidaan pieneen tilavuuteen. Lisättäessä eetteriä, erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan yön yli tyhjössä 35°C:ssa, saadaan vastaava vapaa emäs, joka liuotetaan uudestaan TFArhan (1 g 10 ml: aan) ja seostetaan etyylieetteri 11ä ( 1 00-200 ml). Kiinteä 15 aine kerätään suodattamalla, jonka jälkeen se pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 24 tuntia huoneen lämpötilassa, saadaan otsikossa mainitut yhdisteet (18-24 di-trifluoriasetaatit ja 25 trif1uoriasetaatti).

ESIMERKKI 9: (Menetelmä C: Teikoplaniini kompleksin tai 20 teikoplaniini : n yksittäisten komponenttien 1, 2, 3, 4 tai 5 amidi johdannaisen muuttaminen vastaavaksi antibiootti L 1 7054:n amidijohdannaiseksi)

YHDISTEIDEN 7-12, 28, 29 ja 41-49 VALMISTUS

Liuosta, jossa on 1 mmooli teikoplaniini A2 kompleksin tai 25 sen yksittäisen komponentin valittua amidia 200 ml:ssa 90-prosenttista vesipitoista TFA:ta, hämmennetään huoneen lämpötilassa 2 tuntia (HPLC menetelmä a tai b^). Lisättäessä 800 ml etyylieetteriä, erottuu kiinteä aine, joka nopeasti kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 30 40°C:ssa yön yli, saadaan otsikossa mainittu yhdiste (vastaavana di-trifluoriasetaattina).

152 8 5 1 48 ESIMERKKI 10: (Menetelmä : Teikoplaniini kompleksin, sen yksittäisen komponentin tai antibiootti L 1 7054:n amidi johdannaisen muuttaminen vastaavaksi antibiootti L 1 7046 : n amidi johdannaiseksi)

5 YHDISTEIDEN 13-15 ja 50 VAIHTOEHTOINEN VALMISTUS

Liuosta, jossa on 1 mmoolia T-A2-kompleksin tai sen yksittäisen komponentin sopivaa amidia tai antibiootti L 1 7 0 5 4 : n amidia 50 ml:ssa seosta, jossa on tetrahydrofuraania (THF) tai dimetoksietaania (DME) ja kons. ri kki happoa (H^O^), 10 80:20 (til./til.), hämmennetään 12-48 tuntia huoneen läm pötilassa (HPLC, menetelmä b). Lisättäessä 250 ml etyyli-eetteriä, erottuu kiinteä aine, joka kerätään ja liuotetaan uudestaan 300 m1:a a n veden ja asetonitriilin seosta, 80:20 (til./til.). Muodostuneen liuoksen pH säädetään ar-15 voon 8,4 0,1 N N a OH:11 a ja uutetaan 300 ml :11a n-butano-lia. Orgaaninen kerros erotetaan, pestään 300 ml :11a (2x 150 ml) vettä ja konsentroidaan tyhjössä 40°C:ssa pieneen tilavuuteen, sen jälkeen kun on lisätty 3 ml 0,1 N H C1 : ä ä. Lisäämällä eetteriä, erottuu kiinteä aine, joka kerätään, 20 pestään eetterillä ja kuivataan yön yli tyhjössä huoneen lämpötilassa, saadaan otsikossa mainittu yhdiste (dihydro-kloridina).

ESIMERKKI 11: (Menetelmä D^: Teikoplaniini A^ kompleksin, sen yksittäisen komponentin tai antibiootti L 1 7054:n ami-25 dijohdannaisen muuttaminen vastaavaksi antibiootti L 1 7 0 4 6 : n amidi johdannaiseksi)

YHDISTEIDEN 13-15 ja 21 VAIHTOEHTOINEN VALMISTUS

Suspensiota, jossa on 1 mmooli teikoplaniini kompleksin tai sen yksittäisen komponentin valittua amidia tai anti-30 biootti L 1 7054:n amidia 100 ml:ssa butanolipitoista 0,4 M (kuivaa) H C1 : ä ä , hämmennetään 60°C:ssa 4-6 tuntia (HPLC, menetelmä b) , jonka jälkeen lisätään 200 ml vettä ja li 153 851 48 100 ml n-butanolia samalla voimakkaasti hämmentäen 10° C:ssa , ja pH säädetään kiinteällä NaHCOg:11 a siten, että se on yli 8,4. Orgaaninen kerros erotetaan, pestään 200 ml :11a (2x100 ml) vettä ja siihen lisätään 3 ml HCl:ää.

5 Muodostunut butanolipitoinen liuos konsentroidaan pieneen tilavuuteen. Lisäämällä etyy1ieetteriä , erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan yön yli tyhjössä huoneen lämpötilassa, saadaan otsikossa mainittu yhdiste (vastaavana dihydroklori dina).

10 Yhdisteen 21 tarkoituksenmukaiseksi valmistamiseksi vaaditaan edellä esitettyyn menetelmään pieni muunnos, joka on: hydrolyysi suoritetaan butanolipitoisessa 0,45 M HCl:ssä noin 65°C:ssa 16 tuntia, samalla hämmentäen. Vastaava di-trifluoriasetaatti eristetään korvaamalla HC1 TFA:lla 1 o-15 puliisen butanolipitoisen liuoksen käsittelyssä, joka edel -1ä kuvatt i i n.

ESIMERKKI 12: (Menetelmä E^: Teikoplaniiniyhdis teen , joka on teikoplaniini IK^ kompleksi, sen yksittäinen komponentti, antibiootti L 17054 tai antibiootti L 17046, amidijohdan-20 naisen muuttaminen deglukoteikoplaniinin vastaavaksi amidiksi)

YHDISTEIDEN 18-20, 22, 23, 97, 99, 100, 101 ja 103 VALMISTUS

Suspensiota, jossa on 1 mmooli teikoplaniini A^ kompleksin,

25 antibiootti L 17 0 5 4 : n valittua amidia tai antibiootti L

1 7046:n (13 ja 15) 100 ml:ssa n-butanolia, jossa on 2-3 M (kuivaa) HCl:ää, hämmennetään 6-8 tuntia 75°C:ssa (HPLC, menetelmä b). Sen jälkeen liuotin haihdutetaan tyhjössä 45°C:ssa, jäännös liuotetaan 500 ml:aan veden ja metanolin seosta, 30 80:20 (til./til.) ja muodostuneen liuoksen pH säädetään arvoon 8,5 1 N Na0H:lla ja uutetaan 700 ml :11a n-butano-lin ja etyyliasetaatin seosta, 7:3 (til./til.). Orgaaninen kerros suspendoidaan, pestään 500 ml :11a vettä (2x250 ml), 154 85 1 48 siihen lisätään 2 ml TFA:ta ja sen jälkeen muodostunut seos konsentroidaan pieneen tilavuuteen. Lisättäessä etyy-lieetteriä, erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 60°C:ssa yön yli, saadaan 5 otsikossa mainittu yhdiste (di-trif1uoriasetaattina).

Tarvittaessa näitä yhdisteitä voidaan puhdistaa edelleen esim. pyiväskromatografi sesti edellä, esimerkissä 6 c esitetyn menetelmän mukaisesti.

ESIMERKKI 13: (Menetelmä Έ.^'· Teikoplaniiniyhdisteen, joka 10 on teikopl aniini kompleksi, sen yksittäinen komponentti, antibiootti L 17054 tai antibiootti L 17046, amidijohdan-naisen muuttaminen deglukoteikoplaniinin vastaavaksi amidiksi )

YHDISTEIDEN 18-20, 22, 23, 30, 84 ja 102 VALMISTUS

15 Suspensiota, jossa on 1 mmooli teikoplaniini A^ kompleksin, tai antibiootti L 17054:n tai antibiootti L 17046:n valittua amidia 50 ml:ssa absoluuttista trif1uorietanolia (TFE), hämmennetään 75°C:ssa 12-16 tuntia, samalla kun suspensioon johdetaan kuivaa H C1 : ä ä , sen jälkeen jäähdytetään 10 0 C : 20 seen ja jätetään seisomaan yön yli tähän lämpötilaan. Sen jälkeen kun 20 ml etyylieetteriä on lisätty, otsikossa mainittu raaka yhdiste otetaan talteen reaktioseoksesta tummana keltaisena jauheena. Puhdistamalla esimerkissä 6 c esitetyllä pyiväskromatografia-menetelmäl1ä saadaan puhdas 25 yhdiste.

ESIMERKKI 14: (Menetelmä F^: Kaavan (I) mukaisen yhdisteen transesteröinti ja esterifunktion hydrolyysi)

YHDISTEEN 17 VALMISTUS

Astiaan, joka on suojattu natronkalkki-kuivausputkella ja 30 jossa hämmennetään liuosta, jossa on 1,05 g (f^0,7 mmoolia) yhdistettä 16 (hydroklori di) 60 ml:ssa metanolia, lisätään il 155 851 48 tipoittain huoneen lämpötilassa liuos, jossa on 3 ml meta-nolipitoista 1 M K0H:ta (85-prosenttisia kaupallisia pellettejä). Tunnin kuluttua lisätään vielä 0,75 ml 1 M KOH: ta metanolissa ja hämmentämistä jatketaan 30 minuutin ajan 5 (HPLC, menetel mä b). Sen jälkeen reaktioseos jäähdytetään noin 5°C:seen ja siihen lisätään 3,75 ml 1 N HClrää. Muodostunut liuos laimennetaan 200 ml:lla vettä ja 100 ml:lla CH^CNiää. Sen jälkeen lisätään silanoitua piihappogeeliä (0,063-0,2 mm, 5 g; Merck) ja n-butanolia (400 ml), ja 10 liuottimet haihdutetaan tyhjössä 40°C:ssa.

Jäännös laitetaan pylvään, joka sisältää 200 g samaa silanoitua piihappogeeliä valmistettuna veteen, yläpäähän. Pylväs kehitetään lineaarisella gradientilla alkaen 1 %:sta aina 60 %: i i n CH^CN: ää vedessä 20 tunnissa, nopeuden oi -15 lessa 250 ml/tunti, jonka jälkeen lineaarisella gradientilla alkaen 60 %:sta CH^CNrää vedessä ain 70 %:iin CH^CNrää 0,01 N HCl:ssä 60 tunnissa, nopeudella 150 ml/tunti. Kerätään 25 ml:n fraktiot, jotka testataan HPLCrllä ja yhdisteen 17 sisältävät fraktiot (241-254) yhdistetään. Muodos-20 tuneeseen liuokseen lisätään 200 ml n-butanolia, jonka jälkeen liuos konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä 45° C:ssa, saadaan butanolipitoinen suspensio. Lisäämällä etyy-1ieetteriä, erottuu kiinteä aine, joka kerätään, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä 30°C:ssa yön yli, saadaan 25 0,795 g (^78 %) puhdasta yhdistettä 17.

Noudattamalla pääasiallisesti tätä menetelmää, mutta käyttämällä suurempia määriä metanolipitoista K0H:ta ja/tai pidentämällä tarvittaessa reaktioaikaa, voidaan saada vastaava yhdiste, jossa on vapaa karboksifunktio metoksikarbonyy-30 lifunktion sijasta.

1 5 ESIMERKKI 15: (Menetelmä B,: Suojaamattoman tai N -suoja- j 12 tun teikoplaniini1ähtöaineen reaktio kaavan NHR R mukaisen amiinin kanssa, joka sisältää toisen amino ryhmän ja/tai muita karboksiryhmiä , jotka kaikki ovat suojatut) 156 851 48

YHDISTEIDEN 68 ja 72 VALMISTUS

Hämmennettyyn liuokseen, jossa on 12 mmoolia teikoplanii-ni A2 kompleksia (valmistettaessa yhdistettä 68) tai N15--CBzO-deglukoteikoplaniinia (valmistettaessa yhdistettä 5 72), 1 3 mmoolia N&-CBzO-l ysiini-metyyliesteri-hydroklori - dia ja 24 mmoolia trietyyliamiinia (TEA) 225 ml:ssa DMF:ää, lisätään tipoittain 10 minuutissa, pitäen samalla lämpötila 0-5°C:ssa, liuos, jossa on 3 ml (noin 14 mmoolia) DPPA: ta 25 mlrssa DMFrää. Hämmennetään 4 tuntia 0-5°C:ssa ja 10 24 tuntia 20°C:ssa, jonka jälkeen reaktioseos kaadetaan 1,5 litraan etyylieetteriä ja muodostunut sakka kerätään suodattamalla ja liuotetaan uudestaan 500 mlraan metanolin ja veden seosta, 4:1 (til./til.). Muodostunut liuos jäähdytetään 10°C:seen ja siihen lisätään 800 ml n-butanolia, 15 samalla hämmentäen. Sen jälkeen kun pH on säädetty arvoon noin 8,3 (1 N NaOH:11 a ) orgaaninen kerros erotetaan, pestään 800 ml :11a (2x400 ml) vettä, jonka jälkeen konsentroidaan pieneen tilavuuteen (noin 100 ml) alennetussa paineessa 40°C:ssa. Lisättäessä etyylieetteriä (400 ml) erottuu 20 kiinteä aine, joka kerätään ja kuivataan tyhjössä 40°C:ssa yön yli, saadaan otsikossa mainittu yhdiste.

Toistamalla pääasiallisesti sama menetelmä, mutta lähtemällä teikoplaniini A,, komponentista 1, 2, 3, 4 tai 5 saadaan yksittäisten puhtaiden komponenttien vastaava johdannainen.

25 ESIMERKKI 16: (Menetelmä : Kaavan (I) mukaisen yhdisteen esterifunktion hydrolyysi)

YHDISTEIDEN 64, 69, 86 ja 104 VALMISTUS

Liuos, jossa on 5 g K^CO^a 500 ml:ssa vettä, lisätään samalla hämmentäen huoneen lämpötilassa liuokseen, jossa on 30 4 mmoolia yhdistettä 63 (valmistettaessa yhdiste 64), 68 (valmistettaessa yhdiste 69), 85 (valmistettaessa yhdiste 86) ja 105 (valmistettaessa yhdiste 104) 500 ml:ssa metanolin ja veden seosta, 1:1 (til./til.). Lisätään 750 ml

II

157 85 1 48 n-butanolia, jonka jälkeen muodostunutta seosta hämmennetään voimakkaasti 36 tuntia. Orgaaninen kerros erotetaan, vesipitoisen faasin pH säädetään arvoon 3,5 1 N HClrllä, jonka jälkeen uutetaan 500 ml :11a n-butanolia. Butanoli-5 pitoiset liuokset yhdistetään, pestään 600 ml :11a vettä (2x300 ml) ja konsentroidaan pieneen tilavuuteen (50 ml) tyhjössä 40°C:ssa. Lisättäessä etyylieetteriä (350 ml) erottuu kiinteä aine, joka kerätään ja kuivataan tyhjössä huoneen lämpötilassa yön yli, saadaan otsikossa mainittu 10 yhdiste.

ESIMERKKI 17: (Menetelmä F,: Kaavan (I) mukaisen yhdisteen,

1 2 J

jossa ryhmä -NR R sisältää karbosyklisiä funktioita, este röi nti )

YHDISTEEN 51 VALMISTUS

10 Hämmennettyä suspensiota, jossa on 4,1 g (^2 mmoolia) yhdistettä 27 200 ml:ssa 2,5 M HC1:ää absoluuttisessa etanolissa, keitetään palautusjäähdyttäen 5 tuntia. Sen jälkeen reaktioseos konsentroidaan pieneen tilavuuteen (o; 40 ml) 50°C:ssa tyhjössä. Lisättäessä etyylieetteriä (oj 260 ml) 15 erottuu kiinteä aine, joka kerätään suodattamalla ja liuotetaan uudestaan 50 ml:aan asetoni trii1in ja veden seosta, 1:1 (til./til.). Lisätään 150 ml vettä, jonka jälkeen muodostunut liuos laitetaan pylvääseen, jossa on 400 g sila-noitua piihappogeeliä (Merck) vedessä. Pylväs kehitetään 20 lineaarisella gradientilla alkaen 20 %:sta aina 70 %:iin CH^CNrää 0,001 N HClissä 20 tunnissa, nopeuden ollessa 200 ml/tunti, kerätään 20 ml:n fraktiot, jotka testataan H PL C:11ä. Ne fraktiot, jotka sisältävät puhtaan, otsikossa mainitun yhdisteen, yhdistetään ja muodostuneen liuoksen 25 pH säädetään arvoon 8,0 2-prosenttisei 1 a NaHCO^rlla. Uutetaan n-butanoli11 a (til./til.), jonka jälkeen lisätään 1 N HC1:ää (2,5 ml 1 N HC1 per 100 ml butanolipitoista liuosta) ja muodostunut orgaaninen liuos konsentroidaan pieneen tilavuuteen, jolloin saadaan kuiva butanolipitoinen suspensio, 30 josta lisäämällä etyylieetteriä (til./til.) saadaan kiinteä 158 85 1 48 aine, joka kerätään suodattamalla ja kuivataan tyhjössä 40°C:ssa yön yli, saadaan 0,97 g puhdasta yhdistettä 51 dihydrokloridina.

ESIMERKKI 18: (Menetelmä G: Teikoplaniini kompleksin 5 amidien erottaminen niiden komponenteiksi käänteis-faasi-pylväskromatografisesti)

YHDISTEIDEN 2b, 32b, 32c ja 71 VALMISTUS

Liuoksen, jossa on 5 mmoolia teikoplaniini A£ kompleksin 1ähtöaineamidijohdannaista 250 ml:ssa asetoni trii1in ja 10 veden seosta 1:1 (til./til.), pH säädetään arvoon 3,5 1 N HCl:llä, jonka jälkeen suurin osa orgaanisesta liuottimes-ta haihdutetaan tyhjössä 20°C:ssa, jolloin saadaan vähän samea liuos, joka laitetaan pylvääseen, jossa on 1 kg sila-noitua piihappogeeliä (Merck) vedessä. Pylväs kehitetään 15 lineaarisella gradientilla alkaen 20 %:sta CHgCN:ää vedessä aina 60 %: i i n C H ^ C N : ä ä 0,001 N HCl:ssä 20 tunnissa, nopeuden ollessa 200 ml/tunti, kerätään 20 ml:n fraktiot, jotka testataan H P L C : 11ä . Ne fraktiot, jotka sisältävät teikoplaniini A^ komponentti 2:n amidin, yhdistetään. Tar-20 koituksenmukaisesti myös ne fraktiot, jotka sisältävät komponenttien 1-3 ja 4 ja 5 fraktiot, yhdistetään vastaavalla tavalla. Sen jälkeen kun on lisätty sopivat määrät n-butanolia jokainen liuos konsentroidaan pieneen tilavuuteen kuivan butanolipitoisen suspension saamiseksi, josta 25 otsikossa mainitut yhdisteet saostetaan vapaina emäksinä tavalliseen tapaan etyy1ieetteri 11ä . Lisäämällä pieni ylimäärä 1 N HC1 :ää tai trif 1uorietikkahappoa ennen konsen-traatiota, saadaan vastaavat hydrokloridit tai vastaavasti trif1uoriasetaatit.

30 ESIMERKKI 19: (Menetelmä Ag: Suojaamattoman teikoplaniini-lähtöaineen reaktio N u)-n i tro-argini ini-metyyl iesteri-hydro-kloridin oL-aminoryhmän kanssa, jota seuraa muodostuneen yhdisteen suojatun typpi ryhmän poislohkaisu) li 159 85148

YHDISTEEN 33 VALMISTUS

Reaktion ensimmäinen osa, jossa lähdetään 16 g:sta (^8 mmoolia) tei kopl ani i ni A^rta ja 12 mmoolista N^'-nitro--arginiini-metyy1iesteri-hydrokloridia, suoritetaan mene-5 telmän A^ mukaisesti, joka on esitetty esimerkissä 3, saadaan 14 g yhdistettä 105.

Liuosta, jossa on 14 g (^6,5 mmoolia) tätä yhdistettä 200 mlrssa 90-prosenttista vesipitoista etikkahappoa , käsitellään 3,6 g : 11 a 55 gramma-atomia) sinkkijauhetta, sa-10 maila voimakkaasti hämmentäen huoneen lämpötilassa. Muodostunutta suspensiota hämmennetään 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen se suodatetaan. Lisättäessä etyyliasetaattia (°o 8 0 0 ml) suodokseen, erottuu jauhe ( o; 1 3 g), joka kerätään suodattamalla ja puhdistetaan käänteis-faasi-15 pyiväskromatografisesti 700 g : 11 a silanoitua piihappogeeliä, esimerkissä 1 esitetyn menetelmän mukaisesti, saadaan 10,2 g otsikossa mainittua yhdistettä vapaana emäksenä (tämän reaktion saanto yhdisteestä 105 on noin 75 %).

1 5 ESIMERKKI 20: (Menetelmä AN -suojatun tai suojaamattoman 20 tei kopl an i i n i 1 ähtöai neen reaktio N b-'-n i tro-argi ni i ni-metyyl i- esterin tai vastaavasti -bentsyyliesterin X-aminoryhmän kanssa, jota seuraa myöhemmin tapahtuva N -t-BOC- tai 1 5 N -CBzO- ja bentsyylisuojaryhmien poislohkaisu happamessa väliaineessa menetelmän A^ mukaisesti, tai vastaavasti hyd-25 raamalla katalyyttisesti menetelmän A^ mukaisesti, ja nitro-ryhmän lopullinen korvaaminen menetelmän A g mukaisesti)

YHDISTEIDEN 32a, 59, 60 ja 98 VALMISTUS

Ensimmäisessä vaiheessa, jossa lähdetään teikoplaniini A0 15 *- (kompleksi tai sen yksittäinen komponentti), N -t-BOC-de- 1 5 30 glukoteikoplani inistä tai N -CBzO-deglukoteikoplaniinista ja sopivasta N U)-nitro-arginiini-johdannaisesta , saadaan vastaavat, suojatut, otsikossa mainitut yhdisteet.

16 0 δ 51 4 8 Käsittelemällä 1OO-prosenttisei 1 a trif1uorietikkahapol1 a 1 5 N -t-BOC-suojaryhmä poistetaan ja hydraamalla katalyytti- 1 5 sesti 5-10-prosentti sella Pd/C:11ä , myös N -CBzO- ja bent -syyliryhmät korvataan.

5 Yhdisteiden 32a, 59 , 60 ja 98 N u)-ni trojohdannai set saadaan tällä tavalla. N U)-ni troryhmä poistetaan pääasiallisesti noudattamalla menetelmää Ag, kuten esimerkissä 19 on mainittu, saadaan otsikossa mainittu yhdiste.

I:

Claims (16)

161 85148

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten teikoplaniini-yhdisteen amidin, jolla on kaava (I) _ 29 9Δ 0W ,34 054 H pa 0 S'8 Ofe o 1'V 4 ^ f A H J47 0 H !« n H Im 39l V^!3 1" T r 6T il13 43S^45 H0^^09^fiV,Z OH 0H jossa R tarkoittaa vetyä tai amiinifunktion suojaryhmää pl / Y tarkoittaa ryhmää -N , jossa \r2 R1 tarkoittaa vetyä, (-Cg)alkyyliä, hydroksi(C2-C4)al-kyyliä, halogeeni(C2-C4)alkyyliä, (C1-C4)alkoksi(C2-C4)-alkyyliä, amino (C2-C4 )alkyyliä, )alkyyliamino(C2-C4 )- alkyyliä, di(C1-C4)alkyyliamino(C2-C4)alkyyliä; R2 tarkoittaa vetyä, (C^-Cg)alkyyliä, hydroksi(C2-C4)alkyyliä, halogeeni(C2-C4)alkyyliä, (C1-C4)alkoksi(C2-C4)-alkyyliä, typpeä sisältävää 5-6-jäsenistä heterosyklistä rengasta, joka on kokonaan tyydyttynyt ja joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai 0, ja jossa yksi rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (Cj-C^)-alkyylisubstituentin ja yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substituentin R5, joka on (^-04 )alkyyli, fenyyli(C1-C4)alkyyli tai pyridyyli, ja kaksi rengasjäsen- 162 85 148 tä voi mahdollisesti olla sitoutuneena toisiinsa siltasi-doksella, jonka muodostaa (<^-03)alkyleeniketju; ryhmää alk-W, jossa "alk" tarkoittaa lineaarista, 1-8 hiiliatomia sisältävää alkyleeniketjua, joka mahdollisesti on substituoitu substituentilla, joka on (Ci-C4)alkyyli, hydroksi (C^-C^alkyyli, hydroksi, karboksi, aminokarbonyyli, (C1-C4)alkyyliaminokarbonyyli, di(C^-C^ )alkyyliaminokarbo-nyyli, (C^-C^)alkoksikarbonyyli tai fenyyli(C1-C4)alkoksi-karbonyyli, ja W tarkoittaa karboksia, (Ci“C4)alkoksikar-bonyyliä, fenyyli(C^-C^ )alkoksikarbonyyliä, aminokarbonyy-liä, (C1-C4)alkyyliaminokarbonyyliä, di(C1-C4)alkyyliami-nokarbonyyliä, pentoosiaminokarbonyyliä, heksoosiaminokar-bonyyliä, ureidoa, guanidinoa, typpeä sisältävää 5-6-jäse-nistä, edellä määriteltyä heterosyklistä rengasta, joka voi olla myös tyydyttymätön, ryhmää, jonka kaava on -N ^R4 jossa R3 ja R4 tarkoittavat kumpikin, toisistaan riippumatta vetyä, (Cj^-Cg )alkyyliä, hydroksi(C2-C4)alkyyliä tai halogeeni(C2-C4)alkyyliä, tai R4 tarkoittaa fenyylimetyy-lioksikarbonyyliä ja R3 tarkoittaa vetyä tai ryhmää, jonka kaava on V -N / XR' R8 jossa R6, R7 ja R® tarkoittavat jokainen, toisistaan riippumatta (C^-C^) alkyyliä, tai R1 ja R2 yhdessä viereisen typpiatomin kanssa tarkoittavat tyydyttynyttä, 5-7-jäsenistä heterosyklistä rengas- li 163 85 1 48 ta, jossa voi mahdollisesti olla yksi (C^-C^ ) alkyylisubs-tituentti rengashiiliatomissa ja joka voi sisältää toisen heteroryhmän, joka on -0-, -S- tai -NR5-, jossa R5 tarkoittaa samaa kuin edellä; A tarkoittaa vetyä tai N[ (C^-C·^) alifaattinen]asyyli-p-D-2-deoksi-2-aminoglukopyranosyyliä, B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-p-D-2-deoksi-2-aminoglu-kopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai a-D-mannopyranosyyliä; sillä edellytyksellä, että B tarkoittaa vetyä vain kun A ja M samanaikaisesti ovat vety ja M tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, ja edelleen sillä edellytyksellä, että kun W tarkoittaa /R3 .... ®/R6 7 ryhmää -N. . ryhmää -N - R » ^r4 N8 ureidoa, guanidinoa tai typpeä sisältävää, 5-6-jäsenistä, edellä määriteltyä heterosyklistä rengasta sitoutuen suoraan "alk"osaan sidoksella, joka lähtee rengastyppiatomis-ta, lineaarisen alkyleenin "alk"osan täytyy sisältää ainakin kaksi hiiliatomia, ja sen additiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) teikoplaniinilähtöaine, joka on US-patentin No 4,239,751 mukaan saatava teikoplaniini, sen edelleen puhdistettu muoto, teikoplaniini A2 kompleksi, yhdiste, jonka kaava on 164 851 48 \H3i/^'2Si26 6W2"^ O v-6W ^^λτ' rV" « r,eY 39i V^-Jj I46 L f , A ie ΗΑη·ΛΗ 43V45 μ^Λ^·ο^ (f OH jossa R on vety tai amiinifunktion suojaryhmä, Y on hyd-roksi, A tarkoittaa vetyä tai N[(C10-Cn)alifaattinen asyyli]-0-D-2-deoksi-2-aminoglukopyranosyyliä, B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-p-D-2-deoksi-2-aminoglukopyrano-syyliä, M tarkoittaa vetyä tai α-D-mannopyranosyyliä, silla edellytyksellä, että B voi tarkoittaa vetyä vain kun A ja M ovat samanaikaisesti vety ja M voi tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, sen suola tai näiden seos missä tahansa suhteessa, saatetaan reagoimaan molaarisen ylimäärän kanssa amiinia, jonka kaava on HNR1R2, jossa R1 ja R2 tarkoittavat samaa kuin edellä ja jossa reaktiokykyiset funktiot, lukuunottamatta aminofunktiota, joka reagoi teikopla-niinilähtöaineen karboksyyliosan kanssa, on suojattu sinänsä tunnetuilla suojaryhmillä, inertissä orgaanisessa liuot-timessa ja pienen molaarisen ylimäärän kondensaatioainetta läsnäollessa, b) kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyä sokeriosaa, muutetaan mahdollisesti kontrolloidulla happohydrolyysillä vahvassa, konsentroidussa, vesipitoisessa orgaanisessa hapossa vastaavaksi yhdisteeksi, jossa B ja M tarkoittavat samaa kuin 1 edellä ja A on vety; li 165 8 5 1 48 c) kaavan (I) mukainen yhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyä sokeriosaa tai A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat edellä määriteltyjä sokeriosia, muutetaan mahdollisesti selektiivisellä hydrolyysillä käyttäen vahvaa happoa polaarisen, aproottisen liuottimen, joka on eetteri, ketoni tai näiden seos ja joka on huoneen lämpötilassa neste, läsnäollessa vastaaviksi kaavan (I) mukaisiksi amidiyhdisteiksi, joissa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa edellä määriteltyä sokeriosaa; tai d) kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat edellä määriteltyjä sokeriosia, kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat edellä määriteltyjä sokeriosia tai kaavan (I) mukainen amidiyhdiste, jossa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa edellä määriteltyä sokeriosaa, muutetaan mahdollisesti selektiivisellä hydrolyysillä orgaanisessa, proottisessa liuottimessa, joka on alifaattinen happo tai alfa-halogenoitu, alifaattinen happo ja joka reaktiolämpö-tilassa on neste, alifaattinen tai sykloalifaattinen alka-noli, joka reaktiolämpötilassa on neste sekoittuen huonosti veteen, fenyylisubstituoitu alempialkanoli, jossa fe-nyyliosassa voi mahdollisesti olla (C^-C^)alkyyli-, (¢^-C4)alkoksi- tai halogeenitähteitä ja joka reaktiolämpötilassa on neste sekoittuen huonosti veteen, tai beta-poly-halogenoitu alempialkanoli, joka reaktiolämpötilassa on neste; vahvan, liuottimen kanssa yhteensopivan hapon, joka on vahva mineraalihappo, vahva orgaaninen happo tai vahva hapan kationinvaihtohartsi vetymuodossa, läsnäollessa ja lämpötilassa, joka on 20eC-100°C, vastaavaksi kaavan (I) mukaiseksi amidiyhdisteeksi, jossa A, B ja M tarkoittavat vetyatomeja.

2. Menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa R tarkoittaa vetyä, 166 85 1 48 Y tarkoittaa ryhmää -NR1!*2, jossa R1 on vety tai (C^-Cg)-alkyyli, R2 on vety, (C^-Cg)-alkyyli, hydroksi-(C2-C4)-alkyyli, halogeeni- (C2-C4)-alkyyli, typpeä sisältävä, 5-6-jäseninen heterosyklinen rengas, joka on kokonaan tyydyttynyt ja joka voi sisältää yhden muun heteroatomin, joka on N, S tai O, ja jossa yksi rengashiiliatomi voi mahdollisesti sisältää (C1-C4)-alkyylisubstituentin, ja yksi rengastyppiatomi voi mahdollisesti sisältää substituentin R5, joka on (C1-C4)-alkyyli, fenyyli-(C1-C4)-alkyyli tai pyridyyli, ja kaksi rengasjäsentä voi mahdollisesti olla sitoutuneena toisiinsa siltasidoksella, jonka muodostaa (<^-03)-alkylee-niketju, ryhmä -alk-W, jossa "alk" tarkoittaa lineaarista, 1-8 hiiliatomia sisältävää alkyleeniketjua, joka on mahdollisesti substituoitu substituentilla, joka on karboksi, aminokarbonyyli, (C1-C4)-alkyyliaminokarbonyyli, (C1-C4)-alkoksikarbonyyli tai fenyyli-(C^-C^)-alkoksikarbonyyli, ja W tarkoittaa karboksia, (C1-C4)-alkoksikarbonyyliä, fenyyli-(C^-C^)-alkoksikarbonyyliä, aminokarbonyyliä, (CX-C4)-alkyyliaminokarbonyyliä, pentoosiaminokarbonyyliä, heksoosiaminokarbonyyliä, ureidoa, guanidinoa, typpeä sisältävää, 5-6-jäsenistä, edellä määriteltyä heterosyklistä rengasta, joka voi olla myös tyydyttymätön, tai ryhmää -NR3R4, jossa R3 ja R4 toisistaan riippumatta tarkoittavat vetyä, (C-^-Cg )-alkyyliä, hydroksi-(C2-C4)-alkyyliä tai halogeeni-(C2-C4)-alkyyliä, tai R4 tarkoittaa fenyylime-tyylioksikarbonyyliä ja R3 tarkoittaa vetyä; tai R1 ja R2 yhdessä viereisen typpiatomin kanssa tarkoittavat tyydyttynyttä, 5-7-jäsenistä heterosyklistä rengasta, jossa voi mahdollisesti olla yksi (Cx-C4)-alkyylisubs-tituentti rengashiiliatomissa, ja joka voi sisältää toisen heteroryhmän, joka on -O-, -S- tai -NR5-, jossa R5 tarkoittaa samaa kuin edellä; A tarkoittaa vetyä tai N-[(C10-Cn)alifaattinen asyyli]-8-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, I: 167 85148 B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai α-D-mannopyranosyyliä, sillä edellytyksellä, että B tarkoittaa vetyä vain kun A ja M samanaikaisesti ovat vety ja M tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, ja edelleen sillä edellytyksellä, että kun w tarkoittaa ryhmää -NR3R4, ureidoa, guanidinoa tai typpeä sisältävää, 5-6-jäsenistä, edellä määriteltyä heterosyk-listä rengasta, sitoutuen suoraan "alk"-osaan sidoksella, joka lähtee rengastyppiatomista, lineaarisen alkyleenin "alk"-osan täytyy sisältää ainakin kaksi hiiliatomia; ja sen additiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että lähtöaine, joka on teikoplaniinikompleksi, joka on saatu viljelemällä Actinoplanes teichomyceticus nov. Sp. ATCC 31121-kantaa, ja joka sisältää teikoplanii-nia , A2 ja A3, mitä tahansa sen puhdistettua muotoa, teikoplaniini A2-kompleksia, kaavan I mukaista yhdistettä, jossa kaavassa R on vety tai amiinifunktion suojaryhmä, Y on hydroksi, A tarkoittaa vetyä tai N-[ (C^q-C-j^ )alifaattinen asyyli]-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, B tarkoittaa vetyä tai N-asetyyli-p-D-2-deoksi-2-amino-glukopyranosyyliä, M tarkoittaa vetyä tai α-D-mannopyranosyyliä, sillä edellytyksellä, että B voi tarkoittaa vetyä vain kun A ja M ovat samanaikaisesti vety ja M voi tarkoittaa vetyä vain kun A on vety, sen suola tai näiden seos missä tahansa suhteessa, saatetaan reagoimaan molaarisen ylimäärän kanssa amiinia, jonka kaava on HNR^R2, jossa R^· ja R2 tarkoittavat samaa kuin edellä, ja jossa reaktiokykyiset funktiot, lukuunottamatta 168 85148 teikoplaniinilähtöaineen karboksyyliosan kanssa reagoivaa aminofunktiota, on suojattu sinänsä tunnetuilla suojaryh-millä, inertissä orgaanisessa liuottimessa ja pienen mo-laarisen ylimäärän kondensaatioainetta läsnäollessa, ja haluttaessa i) kaavan I mukaisen amidiyhdisteen valmistamiseksi, jossa B ja M tarkoittavat sokeriosaa ja A on vety, vastaava kaavan I mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat yllä määriteltyä sokeriosaa, muutetaan kontrolloidulla happohydrolyysillä vahvassa konsentroidussa vesipitoisessa orgaanisessa hapossa; ii) kaavan I mukaisen amidiyhdisteen valmistamiseksi, jossa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa yllä määriteltyä sokeriosaa, vastaava kaavan I mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat yllä määriteltyä sokeriosaa tai A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat yllä määriteltyjä sokeriosia, muutetaan selektiivisellä hydrolyysillä käyttäen vahvaa happoa, polaarisen, aproottisen liuottimen läsnäollessa, joka on eetteri, ketoni tai näiden seos ja joka on huoneen lämpötilassa neste, tai iii) kaavan I mukaisen amidiyhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa A, B ja M tarkoittavat vetyä, vastaava kaavan I mukainen amidiyhdiste, jossa A, B ja M tarkoittavat yllä määriteltyjä sokeriosia, tai vastaava kaavan I mukainen amidiyhdiste, jossa A tarkoittaa vetyä ja B ja M tarkoittavat yllä määriteltyjä sokeriosia, tai vastaava kaavan I mukainen amidiyhdiste, jossa A ja M tarkoittavat vetyä ja B tarkoittaa edellä määriteltyä sokeriosaa, muutetaan selektiivisellä hydrolyysillä orgaanisessa prootti-sessa liuottimessa, vahvan hapon läsnäollessa, läm-pötilavälillä 20°C - 100°C. l! 169 8 5 1 48

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R on vety.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa R ja R1 ovat vety-atomej a.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa A, B ja M tarkoittavat joko edellä määriteltyjä sokeriosia tai jokainen tarkoittaa vetyatomia.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa A, B ja M tarkoittavat joko samanaikaisesti edellä määriteltyjä sokeriosia tai samanaikaisesti vetyatomeja, R tarkoittaa vetyä ja -NR^R^ tarkoittaa ryhmää -HN(alk)W, jossa "alk" tarkoittaa lineaarista alkyleeniketjua, jossa on 2, 3, 4, 5, 6, 7 tai 8 metyleeniyksikköä, ja W tarkoittaa ryhmää, joka on -nh2, -nhch3, -nhc2h5, -n(ch3)2, -n(c2h5)2, tai -N(CH3)(C2H5), tai ryhmää -HNCH(C00CH3)(CH2)4NH2 , -H VcH,, tai 'HNV/X- w I I

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa A tarkoittaa β-ϋ-2-deoksi-2-(8-metyylinonanoyyli)-aminoglukopyranosyyliä, B tarkoittaa p-D-2-deoksi-2-asetyyliamino-glukopyranosyyliä ja M tarkoittaa α-D-mannopyranosyyliä. 170 8 5148

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa lähtöaine on yhdiste, jossa R tarkoittaa amiinifunktion suoja-ryhmää ja ainakin toinen ryhmistä A ja M on lopullisessa yhdisteessä vety.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R on vety, Y on -NH(CH2)3N(CH3)2, A on N-[(Ciq-C·^ )-alifaattinen asyyli]-8-D-2-deoksi-2-aminoglukopyranosyyli, B on N-asetyyli-8-D-2-deoksi-2-aminoglukopyranosyyli ja M on a-D-mannopyranosyyli, tai sen additiosuola. li 171 85148