FI84624C - Foerfarande foer framstaellning av etanol och ett protein eller en peptid. - Google Patents

Description

1 84624

Menetelmä etanolin ja proteiinin tai peptidin valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu käymisprosesseihin ja niiden tuotteisiin, ja erityisemmin alkoholin, kuten etanolin, tuottamiseen käyttämällä sokereita hiivalla.

Valmistettaessa alkoholia käymisteitse vesiliuoksena olevat sokerit muunnetaan etanoliksi hiivalla käyttämällä. Hiiva kasvaa käymisen aikana, ja vaikka pieni osa hiivasta voidaankin käyttää myöhemmissä käymisprosesseissa, niin kuitenkin jäljelle jäänyt hiiva muodostaa ylimäärän, josta on päästävä eroon. Tätä ylimääräistä hiivaa voidaan käyttä joihinkin tarkoituksiin, kuten esimerkiksi eläinten rehuna sekä hiiva-uutteiden valmistuksessa, mutta kuitenkin tuotetun liiallisen hiivan määrä on suuri ja sen markkina-arvo on suhteellisen alhainen.

Tämän tyyppiset teollisen mitan käymisprosessit muodostavat kolme laajaa luokkaa: 1) Käymisprosessit, joissa saatu, loppuun käynyt, vesipitoinen alusta on toivottu lopputuote. Tähän luokkaan kuuluvat tavanomaiset panimoprosessit oluen (ohessa käytettyyn käsitteeseen "olut" kuuluvat ale-, stout- ja lager-tyyppiset sekä muun tyyppiset käymisteitse saadut juomat, jotka perustuvat maltaisiin), siiderin sekä muiden käymisteitse saatujen juomien tuottamiseksi.

2) Käymisprosessit, joissa toivottuna lopputuotteena on tislattu, juomiskelpoinen alkoholitiiviste. Tähän luokkaan kuuluvat käymisprosessit viskien, brandyjen ja muiden väkiviino-jen, sekä muiden juomien väkevöittämiseen käytettävän alkoholin tuottamiseksi.

3) Käymisprosessit teolliseen käyttöön tarkoitetun alkoholin tuottamiseksi. Tähän luokkaan kuuluvat joissakin maissa teollisessa mitassa suoritetut käymisprosessit polttoainealkoholin tuottamiseksi.

2 84624

Tunnusomaisena piirteenä näissä kaikissa teollisissa prosesseissa on liiallisen hiivan tuottaminen.

Viime vuosina huomattavasti mielenkiintoa on kohdistettu mikro-organismien geneettiseen muuntamiseen siten, että ne saadaan tuottamaan heterologisia proteiineja ja peptidejä, toisin sanoen sellaisia proteiineja ja peptidejä, joita näiden mikro-organismien luontaiset geneettiset rakennusosat eivät tuota. Tällaiseen geneettiseen manipulointiin on käytetty lukuisia eri mikro-organismeja, ja näistä mikro-organismeista hiivat ovat herättäneet tiettyä mielenkiintoa. Kuitenkaan laboratoriokokeissa käytetyt hiivat eivät tavallisesti ole niitä hiivoja, joita käytetään teollisen mitan käymisprosesseissa alkoholin tuottamiseksi, ja hiivan kasvuolosuhteet laboratoriossa ovat huomattavasti erilaiset kuin ne olosuhteet, joita hiivoilla todetaan alkoholin teollisessa käymisprosessissa.

Tämä keksintö perustuu siihen havaintoon, että teollisessa käymisprosessissa, johon liittyy alkoholin tuotantoa, voidaan käyttää sellaista geneettisesti modifioitua hiivaa, joka kykenee ilmentämään heterologisen proteiinin tai peptidin. Yllättäen ollaan todettu, että tällaisen hiivan käyttö sopii yhteen teollisen käy-misprosessin olosuhteiden kanssa. Tämä tarkoittaa sitä, että käymisprosessissa saatu liiallinen hiiva toimii heterologisen proteiinin tai peptidin lähteenä ja täten sen teollinen arvo on parantunut huomattavasti. Lisäksi koska alkoholin tuottaminen pysyy käymisprosessin pääasiallisena tavoitteena ja koska perinteistä laitteistoa voidaan suurimmaksi osaksi käyttää siihen juurikaan muutoksia tehden, niin parempiarvoisen hiivatuotteen tuottamisen lisäkustannukset ovat vähäisiä, joten tämä uusi prosessi saattaa olla taloudellisesti elinkelpoinen tapa saada heterologisia proteiineja tai peptidejä, jotka eivät vaadi suurta alkupääomaa huolimatta tuotteiden arvokkuudesta.

Näin ollen tässä keksinnössä saadaan aikaan prosessi etanolin sekä hiivan heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamiseksi.

3 84624 joka prosessi käsittää vesipitoisen, sokeria sisältävän alustan käyttämisen sellaisella hiivakannalla, joka on muunnettu geneettisesti siten, että se kykenee ilmentämään heterologisen proteiinin tai peptidin, näin syntyneen etanolin talteenot-tamisen sekä mainitun heterologisen proteiinin tai peptidin saamisen käymistuotteista. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Hiivat ovat alempien eukarioottisten mikro-organismien ryhmä, joiden mikro-organismien biologiset ja biokemialliset ominaisuudet vaihtelevat huomattavasti. Tavallisesti käsitettä "hiiva" käytetään kuvaamaan niitä Saccharomyces cerevisiae -kantoja, joilla on kaupallista merkitystä leipomo-, panimo- ja polttimoteollisuudessa. Samansukuisia hiivoja käytetään viinin valmistuksessa sekä saken panossa ja polttoainealkoholin tuotannossa sakkaroosia tai hydrolysoitua tärkkelystä käyttäen.

Kaikki panimo-, leipomo- ja polttimoteollisuudessa käytetyt hiivat voidaan taksonomisesti luokitella Saccharomyces cerevisiae -hiivoihin. Tämä luokitus sisältää pinnalla käyvät ale-hiivat (S. cerevisiae) sekä pohjalla käyvät lager-hiivat (S. uvarum tai S. carlsbergensis).

Tarkasti ottaen panimohiiva eroaa kaikista muista hiivoista siinä, että se on oluen valmistukseen käytetty hiivakanta, toisin sanoen hiivan eräs kanta, jota tällä hetkellä käytetään oluen valmistusprosessissa. Tällaisten hiivojen on käy-miskykynsä avulla kyettävä tuottamaan makunsa suhteen hyväksyttävää olutta humalapitoista mallasuutetta (polttimo-vierrettä) käytettäessä. Tämän käymisprosessin pääasialliset tuotteet ovat etanoli ja hiilidioksidi, jotka ovat oluen olennaisia aineosia. Kaikki lajiin S. cerevisiae kuuluvat hiivat eivät kuitenkaan kykene täyttämään näitä vaatimuksia. Todellakin tässä suhteessa kriittisen tekijän uskotaan olevan hiivakannan kyky muodostaa määrällisesti vähäisiä aineenvaihdunnan tuotteita, kuten estereitä, happoja, korkeampia alkoholeja ja ketoneita, tarkoin tasapainotettuina osuuksina.

Hiiva voi olla sopimatonta panimokäyttöön, koska yhtä tai useampaa näistä vähäisistä aineenvaihdunnan tuotteista 4 84624 syntyy liiallisia määriä, joko absoluuttisesti ajatellen tai muihin tuotteisiin verrattuna. (Rainbow, C.A., 1970, teoksessa "The Yeasts", toim. Rose, A.H. & Harrison J.S. Voi. 3, sivu 147.)

Yleisesti ottaen polttimohiivan ominaisuudet erottavat tämän hiivan muista hiivoista. Useimmat teolliset hiivakannat, labora-toriohiivoista poiketen, ovat kykenemättömiä suvulliseen lisääntymiseen; niiden sanotaan olevan homotallisia. Teolliset hiivat ovat tavallisesti aneuploideja tai polyploideja, joten mahdollisuudet geenimutaatioiden fenotyyppiseen havaitsemiseen ovat vähäisiä. Useimmat polyploidit kannat eivät muodosta itiöitä, tai niiden tuottamien itiöiden elinkyky on erittäin alhainen, joten järkevän geneettisen analyysin suorittaminen on turhauttavaa.

Nämä tekijät yhdessä pyrkivät aikaansaamaan teollisuushiivoissa sellaisen fenotyypin stabiilisuuden, joka saattaa myötävaikuttaa niiden valitsemiseen teollisuussovellutuksiin. Samoin korkeaan ploidisuuteen liittyvä geenimäärä saattaa myötävaikuttaa tällaisten kantojen yleiseen sopivuuteen käymisprosessissa käytettäväksi verrattuna haploideihin ja diplodeihin, joiden käymiskyky on heikko.

Lisäksi polttimohiivoilla on tiettyä sellaista teknologista käyttäytymistä, jonka avulla ne soveltuvat hyvin tavalliseen ympäristöönsä, humalapitoiseen panimovierteeseen.

Uuden prosessin toimintatapa riippuu teollisen käymisprosessin tyypistä. Mikäli käymisprosessi on suunniteltu tuottamaan vesipitoista, juotavaksi kelpaavaa nestettä, kuten olutta, käymisen päätyttyä, niin loppuunkäynyt neste erotetaan hiivasta (ja yleensä myös muusta, loppuunkäyneessä alustassa läsnäolevasta kiinteästä materiaalista). Näissä olosuhteissa on selvästi toivottavaa, ja tavallisesti todellakin oleellista, ettei heterologinen proteiini tai peptidi liukene käyneeseen nesteeseen, sillä tavallisesti ei ole hyväksyttävää, että heterologista proteiinia tai peptidiä on läsnä juotavaksi tarkoitetussa nesteessä. Näissä olosuhteissa heterologinen proteiini tai peptidi on saatavissa n 5 84624 hiivasoluista. Mikäli kuitenkin alkoholi otetaan talteen tislaamalla, kuten asianlaita on edellä mainittujen teollisten käymisprosessien toisessa ja kolmannessa tyypissä, saattaa olla hyväksyttävää, ja jopa toivottavaa, että proteiini tai peptidi on läsnä liuenneena käyneessä liuoksessa.

Uudessa prosessissa käytettävän hiivakannan tulee luonnollisestikin olla sopiva tarkasteltavaan teollisen käymisprosessin tyyppiin. Tämä tavoite voidaan turvata suorittamalla geneettinen muuntaminen sellaisessa hiivakannassa, jolla tiedetään olevan toivotunlaiset ominaisuudet, sillä on todettu, että niitä toivottuja ominaisuuksia, jotka tekevät hiivakannan sopivaksi tietyntyyppiseen teolliseen käymisprosessiin, ei tavallisesti menetetä geneettisen muuntamisen aikana. Esimerkiksi mikäli käymisproses-sina on prosessi oluen valmistamiseksi, niin geneettiseen muuntamiseen valittu hiivakanta on mieluiten tunnettu polttimohiivan kanta, jota kyseisellä hetkellä käytetään tämänkaltaisissa käy-misprosesseissa. Kuten edellä jo mainittiin, tällaisten panimo-hiivojen teollisilla kannoilla on ominaisuuksia, jotka eroavat "laboratoriohiivan" ominaisuuksista, kuten esimerkiksi kyky käyttää humalapitoista panimovierrettä.

Panimovierre on pääasiassa mallastetun ohran, tai muiden, liotuksella ja idättämällä valmistettujen viljatuotteiden kuumavesiuutos, johon aromia antavana aineena on lisätty humalaa. Hiivan kasvua ja aineenvaihduntaa ajatellen kaikkein tärkein parametri on hiilihydraatti- ja typpikoostumus (sekä aminohappokoostumus). Tämä vaihtelee maasta toiseen sekä panimosta toiseen, katso esimerkiksi "Malting and Brewing Science", Voi. 2, Hopped Wort and Beer; tekijät Hough, J.S., Briggs, D.E., Steven R. and Young,T.W., 1982, Chapman and Hall, Lontoo, New York, sivut 456-498. Yleisesti ottaen voidaan sanoa, että panimovierre sisältää yhteensä 5-10 g käymiskykyisiä sokereita 100 ml:aa vierrettä kohden, josta sokerista vähintään puolet on maltoosia.

Muut hiivan kasvuun sekä suorituskykyyn vaikuttavat tekijät ovat: (1) Kasvutekijät. Näihin kuuluu sellaisia aineita kuten biotiini, 6 84624 tiamiini, riboflaviini, pyridoksiini, pantoteenihappo ja niko-tiinihappo. Yleisesti ottaen panimovierteessä on runsaasti näitä tekijöitä, jotka kuluvat hiivan kasvun aikana.

(2) Mineraalit. Panimohiivan mineraalitarve muistuttaa useimpien elävien organismien mineraalitarvetta. Panimovierre tyydyttää nämä tarpeet, sillä se sisältää erittäin pieniä määriä metalli-ioneja, kuten rautaa, kaliumia, magnesiumia, sinkkiä, mangaania ja kuparia, jotka ovat olennaisia aineenvaihdunnan elinvoimaisille entsyymeille.

Laboratorioviljelyn alustan ja panimovierteen välinen merkittävin ero on alustan sokerikoostumus. Useimmissa laboratorioalus-toissa käytetään pääasiallisena hiilen lähteenä glukoosia, kun taas maltoosi on vierteen tärkein käymiskykyinen aineosa.

Panimokäymiset suoritetaan tavallisesti anaerobisina (hapettomina) käymisprosesseina. Kuitenkin happi on tärkein edellytys hiivan kasvulle käymisen alkuvaiheissa. Useimmat laboratoriokäymiset on suunniteltu siten, että niissä hiivamassan saanto on mahdollisimman suuri, kun taas olutkäymisissä keskitytään etanolisaan-toon sekä tuotteen aromiin. Täten olutkäymisessä siirrostemäärä ("ymppi") on suurempi kuin mitä laboratoriossa tavallisesti käytettäisiin. Näin ollen solujen kahdentumisen (solusukupolvet) lukumäärä on alentunut kahden ja neljän välille käymistapahtu-maa kohden.

Tavallisesti olutvierteen käyminen tapahtuu lämpötilassa, joka on alueella 8-25°C, jolloin tämän alueen yläpäässä olevia lämpötiloja, esimerkiksi 15-25°C, käytetään tuotteen ollessa ale-tyyppiä, ja alueella 8-15°C olevia lämpötiloja käytetään tuotteen ollessa lager-tyyppiä. Laboratorio-oloissa hiivoja viljellään merkittävästi korkeammissa lämpötiloissa, esim. 25-35°C:ssa.

Samoin niissä tapauksissa, joissa teollinen käymisprosessi on prosessi tislaamalla erotettavan alkoholin tuottamiseksi, on välttämätöntä käyttää sellaista geneettisesti muunnettua hiivaa,

II

7 84624 joka on saatu tällaiseen käymiseen soveltuvasta kannasta. Tällaisissa käymisprosesseissa sokereiden lähteenä voidaan käyttää esimerkiksi viljaa, perunoita, kassavaa, sokeriruokoa tai sokerijuurikasta, ja tämä lähde on valinnaisesti voitu esikäsitellä esimerkiksi kemiallisella tai entsymaattisella hydrolyysillä näissä raaka-aineissa olevan selluloosan ja/tai tärkkelyksen muuntamiseksi käymiskykyisiksi sokereiksi.

Hiivan geneettinen muuntaminen voidaan toteuttaa tunnetulla tavalla. Sopivia menetelmiä on esitetty kirjallisuudessa, ja tiettyjä menetelmiä on annettu jäljempänä olevissa esimerkeissä.

Lukuisia erilaisia heterologisia proteiineja tai peptidejä voidaan valita hiivassa ilmenemiseen. Esimerkkeinä voidaan mainita sellaiset entsyymit, kuten beeta-laktamaasi, beeta-glukanaasi ja beeta-galaktosidaasi. Muita käyttökelpoisia heterologisia proteiineja ja peptidejä ovat muun muassa ihmisestä peräisin olevat, mahdollisesti lääkinnällisissä tarkoituksissa käyttökelpoiset materiaalit, kuten ihmisseerumin albumiini ja immuno-globuliinit. Kirjallisuudessa esitetään menetelmiä mikro-organismien geneettiseksi muuntamiseksi siten, että ne ilmentävät tällaisia proteiineja ja peptidejä.

Geneettisesti muunnetun hiivan avulla käytettäväksi saatua hete-rologista proteiinia tai peptidiä voidaan käyttää lukuisilla eri tavoilla. Yksinkertaisimmassa tapauksessa hiiva pidättää proteiinin tai peptidin solussaan ja solut käytetään sellaisenaan. Tavallisesti on kuitenkin suositeltavaa eristää tämä heterologinen proteiini tai peptidi. Mikäli hiiva erittää tämän proteiinin tai peptidin ympäröivään alustaan, niin käymisalusta käsitellään proteiinin tai peptidin eristämiseksi. Kuten edellä huomautettiin, tämä menetelmä on yleensä sopimaton, mikäli käynyt alusta on tarkoitettu nautittavaksi, esimerkiksi virvokkeena. Tässä tapauksessa toivottu proteiini tai peptidi saadaan käymistapahtuman aikana syntyneestä hiivasta. Hiivasolut voidaan esimerkiksi rikkoa solujen sisällön vapauttamiseksi, ja sitten proteiini tai peptidi voidaan eristää solujen sisällöstä.

8 84624

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä yksityiskohtaisemmin. Liitteenä oleva piirustus esittää geenikarttoja, joissa nähdään eräässä esimerkissä käytetyn plasmidin muodostuminen.

Näissä esimerkeissä kuvataan panimohiivan muuntamista siten, että se tuottaa heterologisina proteiineina beeta-laktamaasia ja/tai beeta-glukanaasia, sekä muunnetun hiivan käyttöä panimo-prosessissa .

β-laktamaasi on sellaisten entsyymien muodostavien proteiinien ryhmälle annettu nimi, jotka entsyymit toimivat katalysoiden 6-amino-penisillaanihapon tai 7-amino-kefalosporaanihapon sekä niiden N-asyylijohdannaisten β-laktaamirenkaassa olevan amidi-sidoksen hydrolyysiä. Mainitut johdannaiset ovat penisilliinejä ja kefalosporiineja, jotka yleensä tunnetaan nimellä β-laktaami-antibiootit (Citri, N., 1971, "The Enzymes", 3. painos, toimittaja P.A. Boyer, IV, sivu 23).

β-laktamaasia esiintyy laajasti eri bakteerisuvuissa, ja sitä on todettu sekä Gram-negatiivisissa että Gram-positiivisissa bakteereissa. β-laktamaasin tuotannon määräävän geenin on usein todettu liittyvän sekä kromosomaalisiin elementteihin että kromosomien ulkopuolisiin elementteihin. Suolistobakteereissa β-laktamaasin geeni voidaan usein saada infektoimalla plasmidin muodossa olevalla, kromosomien ulkopuolisella kappaleella ja aikaansaamalla vastustustekijä (tai R-tekijä). Eräs tällainen R-tekijä, jossa on β-laktamaasigeeni, ja joka näin ollen aikaansaa isäntäbakteeris-saan β-laktaamiantibioottien vastustuskykyä, on Rl (Meynell, E.

& Datta, N., 1966 , Genetical Research, 1_, s. 134). Tämä plasmidi tunnistettiin Salmonella paratyphi B-bakteerin kliinisestä eriste-näytteestä (Meynell, E. & Datta, N., 1966, Genetical Research, 1_, s. 134) . β-laktamaasin lajispesifisyys on asetettu kyseenalaiseksi, sillä R-tekijät kykenevät välittämään omaa siirtymistään ja täten β-laktamaasigeenin siirtymistä Enterobacteriaceae-suvussa (suolistobakteerit) (Datta, N. & Richmond, M.H., 1966, Biochemical Journal, 98:, s. 204).

li 9 84624

Geneettisen muuntamistekniikan (yhdistelmä-DNA-tekniikka) kehityttyä on ilmennyt helposti manipuloitavissa olevien plasmidivek-toreiden tarvetta käytettäväksi DNA-kloonauksessa. Plasmidi-Rl-tekijässä läsnäoleva β-laktamaasigeeni on viety uusiin plasmi-deihin uusien kloonaavien vektoreiden muodostamiseksi. Eräs tällainen vektori on RSF 2124 (So, M. et ai., 1975, Molecular and General Genetics, 142, sivu 239), joka muodostettiin plasmi-dista Col El ja Rl:n johdannaisesta Rl drd 19 (Meynell, E. &

Datta, N., 1967, Nature, 214, sivu 885).

Myöhemmin RSF 2124 on manipuloitu plasmidivektoriksi pBR322 (Bolivar, F. et ai, 1977, Gene, 2_, sivu 95) , joka on edelleen manipuloitu plasmidiksi pAT153 (Twigg, A.A. & Sherratt, D., 1980, Nature, 283, sivu 216) . Rl:n β-laktamaasigeeni säilyy näissä kaikissa plasmidivektoreissa, ja ne kykenevät Escherichia coli-bakteerissa määräämään β-laktamaasientsyymin tuotannon.

Plasmidista pBR322 peräisin olevien plasmidien kloonaavien vektoreiden, jotka täten myös käsittävät Rl:n β-laktamaasigeenin, lisämanipuloiminen on ollut välttämätöntä hiivojen transformoin-tiin sopivien plasmidien (toisin sanoen plasmidien, jotka voidaan istuttaa hiivaan) muodostamiseksi. Täten esimerkiksi plasmidi pATl53 (Twigg, A.J. & Sherratt, D., 1980, Nature, 283, sivu 216) on kiinnitetty hiivan kromosomaalisen DNA:n segmentteihin (Saccharomyces cerevisiae:n LEU-2-geeni, joka määrää leusiinin biosynteesissä toimivan entsyymin, β-isopropyyli-malaatti-de-hydrogenaasin tuotannon) ja 2 ^um-plasmidin DNA:hän (2 ^um on hiivan endogeeninen plasmidi) plasmidin pJDB207 muodostamiseksi (Beggs, J.D., 1981, "Molecular Genetics in Yeast", toim. von Wettstein, D., Stenderup, A., Kielland-Brandt, M. & Friis, J.,

Alfred Benzon Symposium No 16, Munksgaard, Kööpenhamina, sivu 383).

β-laktamaasi oli ensimmäinen S. cerevisiae-hiivassa ilmennettävä heterologinen proteiini (Hollenberg, C.P., 1979, ICN-UCLA Symposium Molecular and Cellular Biology, 15^, sivu 325; Hollenberg, C.P., 1979, "Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance", 10 84624 toim. Timmis, K.N. & Puhler, A., Elsevier, sivu 481). Bakteeriperäinen ampisilliiniresistenssin geeni, joka määrää (3-laktamaa-sientsyymin tuotannon, oli peräisin plasmidista pBR325, joka on plasmidin pBR322 johdannainen, joten loppujen lopuksi se oli peräisin Salmonella paratyphi-B-bakteerista (katso aikaisemmat viitteet). S. cerevisiae-hiivan syntetoima 8-laktamaasiproteiini on puhdistettu 100-kertaiseksi raakauutteisiin verrattuna, ja sen entsyymiaktiivisuuden, molekyylipainon ja sitoutumisen spesifisiin vasta-aineisiin on osoitettu olevan täysin samat, kuin E. coli-bakteerista peräisin olevan puhdistetun proteiinin vastaavat ominaisuudet (Roggenkamp, R. et ai, 1981, PNAS USA, 7j), sivu 4466). β-laktamaasin ilmentymistaso hiivassa on alhainen johtuen bakteeriperäisen geenipromoottorin (säätelevä alue geenissä) heikosta toiminnasta; kuitenkin geenin ilmentymistä voidaan parantaa huomattavasti käyttämällä hiivan ADH1-promoottoria (alkoholi-dehydrogenaatti) (Hollenberg, C.P. et ai, 1983, "Gene Expression in Yeast", toim. Korhola, M. & Väisänen, E., Proceedings of the Alko Yeast Symposium, Helsinki, sivu 73).

Hiivan transformointi (toisin sanoen DNA:n vieminen hiivaan) saattaa olla suhteellisen tehoton toimenpide, onnistumisen riippuessa sopivasta valikointijärjestelmästä. Useimmat plasmidit, joita nykyään käytetään hiivan transformointiin, ovat valikoitavissa, koska niissä on villi geeni, joka täydentää auksotroofisen mutaation valitussa vastaanottajakannassa, joka oli S.cerevisiae-hiivan haploidi laboratoriokanta. Kuitenkin panimohiivat ovat prototroofisiä eikä niillä ole auksotroofisiä tarpeita. Trans-formanttien valikoimiseksi panimohiivasta on välttämätöntä, että solussa on dominoiva geeni, joka aikaansaa kyvyn kasvaa muutoin epätavallisissa olosuhteissa. CUP-1 on dominoiva hiivan geeni, joka määrittää kupari-ionien kelatoimiseen kykenevän proteiinin tuotannon. Tämä geeni on kloonattu hiiva/E. coli-välittäjä-vektoriin pJDB207 istuttamalla restriktio-endonukleaasi-Sau3A-entsyymillä aikaansaadut DNA-kappaleet kannasta X2180-1A plasmidin pETl3:l muodostamiseksi (Henderson, R.C.A., 1983, "The Genetics and Applications of Copper Resistance in Yeast",

Ph.D.-väitöskirja, University of Oxford). Oheisissa piirustuksissa li 11 84624 on esitetty pET13:1-plasmidin geenikartta. Plasmidissa pETl3:l on hiivan kromosomaaliset geenit LEU-2 ja CUP-1 sekä hiivan 2 ^,um-plasmidin DNA-replikaation alkamiskohta, sekä plasmidista pAT153 peräisin oleva DNA; näin ollen pET13:l sisältää bakteeriperäisen β-laktamaasigeenin, jonka tiedetään ilmentävän β-lakta-maasia hiivassa. Henderson (1983) esittää sangen yksityiskohtaisesti menetelmiä panimohiivan (ale-hiiva ja lager-hiiva) transformoimiseksi plasmidilla pET13:l. Samoin hän kuvaa panimo-hiivan transformanttien β-laktamaasiaktiivisuuden esiinseulontaa käyttäen jäljempänä esitettävää tärkkelys-jodidilevykoetta.

Selvää on, että bakteeriperäistä β-laktamaasiproteiinia syntyy plasmidilla pET13:l transformoidussa panimohiivassa, ja tämä voidaan osoittaa kasvattamalla transformantteja sopivassa indi-kaattorialustassa.

Seuraavana kuvataan panimohiivan tietyn kannan geneettinen muuntaminen viemällä siihen plasmidi pET13:l. Käytetty hiiva oli NCYC 240, joka on ale-hiivaa, ja joka on julkisesti saatavana hiivakokoelmasta National Collection of Yeast Cultures (Agricultural Research Council, Food Research Institute, Colney Lane, Norwich, Englanti).

Ennen kuin kanta NCYC 240 voitiin transformoida plasmidilla pET13:l (CUP-l/B-laktamaasi), sen herkkyys kuparille määritettiin. Tätä tarkoitusta varten NCYC 240-hiivaa istutettiin YED-glukoosiin tai YED-glukoosiagariin (1 % paino/tilavuus hiivauutetta, 2 % paino/tilavuus peptoniä, 2 % paino/tilavuus glukoosia, tehty jähmeäksi 2 % paino/tilavuus agarilla) ja kasvatettiin 2 vuorokautta 28°C:ssa. Tämän jälkeen ne toistomaljättiin NEP-agaralus-toille (MgS04.7H20 2 g/1, (NH4>2S04 2 g/1, KH2P04 3 g/1,

CaCl2.2H20 0,25 g/1, hiivauute 2 g/1, peptoni 3 g/1, glukoosi 40 g/1, tehty jähmeäksi 2 % agarilla. Naiki, N. & Yamagata, S., 1976, Plant and Cell Physiology, 1_7/ sivu 1281) joissa oli kasvavia kuparisulfaatti(CuS04)-pitoisuuksia. Testattu kanta ei kasvanut 0,1 mM CuS04:a sisältävässä NEP-alustassa. Näin ollen pääteltiin, että NEP-alustassa olevan CuS04:n 0,1 mM:n ylittävä 12 84624 pitoisuus riittää valikoitaessa panimohiivan kupariresistenttejä transformantteja.

Plasmidin pETl3:l plasmidi-DNA eristettiin Escherichia coli-bakteerin K-12 kannasta JA221 (recAl, leuB6, trg_E5, hsdR-, hsdM+, IacY. Beggs, J.D., 1978, Nature, 275, sivu 104) kirkastetun solulysaatin kesiumkloridi/etidiumbromiditasapainon gradient-tisentrifugoinnilla, käyttäen D.B. Clewell:in ja D.R. Helinski:n menetelmää (1967, Proceedings of the National Academy of Sience, USA, 6_2, sivu 1159), joka oli muunnettu Zahn:in et ai. mukaan (1977, Molecular and General Genetics, 153, sivu 45).

NCYC 240-hiivan näytteet esikäsiteltiin pET13 : 1-plasmidilla suoritettavaa transformointia varten kulloinkin kahdella menetelmällä: (A) J.D. Beggs:in menetelmällä (1978, Nature, 275, sivu 104), ja (B) R.C.A. Henderson:in esittämällä menetelmällä (1983, "The Genetics and Applications of Copper Resistance in Yeast",

Ph.D.-väitöskirja, University of Oxford), kuitenkin sillä poikkeuksella, että käytetty protoplastinen entsyymi oli Zymolyaasia (40 ^ug/ml) (Kirin Brewery Co. Ltd.). 100 ^,ul:aa menetelmillä A ja B tuotettuja hiivan sferoplasteja sekoitettiin 15 ^ul:aan pETl3:1-DNA:ta (suurin piirtein 250 ^ug DNA/ml) ja käsiteltiin polyetyleeniglykolilla (1 ml 40 %:sta PEG 4000:tta 10 mM CaC^: ssa, 10 mM Tris/HCl pH 7-6). Polyetyleeniglykolilla suoritetun käsittelyn jälkeen solut laskeutettiin sekoittamalla, ja ne suspendoitiin varovasti uudelleen 500 ^ul:aan 1,2 M sorbitolia sisältävään NEP-glukoosialustaan. Inkubointi kesti yhden tunnin 28°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen solut lisättiin 10 ml:aan sulaa NEP-glukoosialustaa, jossa oli 3 % agaria ja joka sisälsi 0,3 mM CuS0^:a; ja 1,2 M sorbitolia. Tämä kaadettiin sitten NEP-glukoosialustaan, jossa oli 2 % agaria, ja joka sisälsi 1,2 M sorbitolia ja 0,3 mM CuS0^:a. Transformointimaljoja inkuboi-tiin neljästä viiteen vuorokautta 28°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen valikoivaan kuparialustaan nousevat hiivapesäkkeet irrotettiin ja siirrettiin NEP-glukoosiagarille, joka sisälsi 0,3 mM CuS0^:a. Näitä siirrettyjä pesäkkeitä nimitettiin oletetuiksi

II

i3 84624 pETl3:1-transformanteiksi, ja ne tarkastettiin jäljempänä esitetystä sen takaamiseksi, että ne olivat aitoja panimohiivan transformantteja. Transformoitumisen esiintymistiheys kummassakin näissä kahdessa menetelmässä A ja B NCYC 240 hiivaa käytettäessä oli <4 transformanttia/^,ug DNA ja 20 transformanttia/^ug DNA, vastaavasti.

Pyrittäessä varmistamaan se, että hiiva- tai bakteerikanta on aito transformantti, on tavallista tarkistaa sisäänviedyn plasmi-di-DNA:n määrittämien, yhden tai useamman geneettisen piirteen läsnäolo. Tästä syystä edellä kuvattujen oletettujen trans-formanttien korkean tason kupariresistenssi sekä β-laktamaasi-aktiivisuus määritettiin, sillä plasmidissa pET13:l olevat geenit määrittävät kunkin fenotyypin (kupariresistenssi/β-laktamaa-sin aktiivisuus). Seuraavia menetelmiä käytettiin: (a) Korkean tason kupariresistenssi. Oletettuja pET13:1-trans-formantteja, jotka oli siirretty ja jotka kasvoivat 0,3 mM CuSO^ia sisältävällä NEP-glukoosiagarilla, viljeltiin edelleen toistomaljäämällä pesäkkeet samaan alustaan ja NEP-glukoosi-agariin + 1 mM CuSO^. Niillä siirretyillä pesäkkeillä, jotka kasvoivat sekä 0,3 mM että 1 mM CuSO^a sisältävillä alustoilla, oli selvästi korkean tason kupariresistenssiä. Tämän ominaisuuden oletetaan olevan CUP-l-geenin sisältävien plasmiditrans-formanttien piirre, sillä kopioiden lukumäärä säätelee kupari-resistenssiä hiivoissa (Fogel, S. et ai, 1983, Current Gelnetics, 1_, s. 347). Ei ole perustelematonta odottaa, että plasmiditransfor-manteissa on korkean tason kupariresistenssi johtuen plasmidin genomin lukuisista kopioista. Tämän jälkeen ne siirretyt pesäkkeet, joissa todettiin korkean tason kupariresistenssi, alistettiin β-laktamaasikokeeseen.

(b) β-laktamaasikoetta hiiva/E. coli-sekaplasmideja sisältävien hiivakantojen tuottaman β-laktamaasin toteamiseksi sovelletaan rutiininomaisesti hiivan transformantteihin. (Chevallier, M.R.

& Aigle, M., 1979), FEBS Letters, 108, s. 179). Kokeessa pitäydytään tiukasti Chevallier:in ja Aigle:n (1979) kuvaamassa menetelmässä, joka käsittää seuraavat toimenpiteet: 14 84624

Koe perustuu siihen, että penisillinaasi (β-laktamaasi) hydrolysoi penisilliiniä, jolloin tuloksena on pelkistävä yhdiste, penisilliinihappo. Penisilliinihapon pelkistävä vaikutus tehdään näkyväksi kiinteään agaralustaan sisällytetyn tummansinisen jodi-tärkkelys-kompleksin värin häviämisen avulla. Täten, mikäli β-laktamaasia tuottavia kantoja laitetaan koealustaan, niin β-laktamaasia tuottavan kannan ympärille ilmaantuu väritön rengas.

Koealusta: Hiivan typpialusta (Yeast nitrogen base, Difco) 0,65 %paino/tilavuus, glukoosi 0,1 % paino/tilavuus, liukoinen tärkkelys 0,2 % paino/tilavuus, agar 2 % paino/tilavuus, puskuroitu 0,02 M fosfaatilla pH-arvoon 6-7.

Pehmeä agaria sisältävä koealusta: kuten edellä, mutta sisältäen 1 % paino/tilavuus agaria.

Reagenssi: 3 mg/ml 15 mg/ml KI; 0,02 M fosfaattipuskuri pH 7; 3 mg/ml ampisilliinia.

Koealustaa sisältäviin maljoihin siirretään panimohiivan oletetun transformantin siirroste. Maljoja inkuboidaan 30°C:ssa 18 tuntia. Valmistetaan 4 ml sulaa, pehmeätä, agaria sisältävää koealustaa ja 1,5 ml reagenssia käsittävä seos. Seosta sekoitetaan, ja se kaadetaan varoen koealustan päälle. Tummansiniset maljat jätetään tunnin ajaksi 30°C:n lämpötilaan, jonka jälkeen ne sijoitetaan 4°C:een. Noin 24 tunnin kuluttua β-laktamaasia tuottavat kannat ovat aikaansaaneet tarkoin rajatun, valkean (värittömän) renkaan, kun taas plasmidittomissa vertailukannoissa nähdään hyvin vähäistä ja rajoittunutta värin katoamista. Näin ollen β-laktamaasia tuottavat transformantit on selvästi erotettu niistä kannoista, jotka eivät sisällä β-laktamaasigeeniä.

(c) Periytyvä epästabiilisuus. 2 ^um-perustuvilla plasmideilla, kuten pETl3:l- ja pJDB207-plasmideilla (pJDB207 on pET13:l-plasmidin emoplasmidi) transformoitujen hiivakantojen tunnusomaisena piirteenä on se, että plasmidi on periytyvästi epästabiili.

li is 84624 Tämä! epästabiilisuuden seurausta on se, että populaatiossa olevien hiivasolujen pieni osa tuottaa plasmidittomia tytärsoluja solun jakautuessa. Plasmidin pETl3:l tapauksessa plasmidittomat solut on todettavissa sillä perusteella, että nämä solut ovat herkkiä kuparille (NEP-glukoosiagar + 0,3 mM CUSO4). Täten kupa-riresistenttejä transformantteja (katso edellä oleva kohta (a)) siirretään YED-glukoosialustalle ja niiden annetaan kasvaa 3-4 vuorokautta 27°C:ssa. Tämän jälkeen YED-alustalle nousseet pesäkkeet toistomaljataan samalle alustalle ja NEP-glukoosiagarille + 0,3 mM CuSO^. Ne pesäkkeet, joista kupariresistenssin plasmidi pET13:l puuttuu, eivät kasva kuparilla täydennetyllä alustalla. Erästä muunnelmaa tästä menetelmästä panimohiivan transformant-tien puutteellisten fenotyyppien arvioimiseksi voidaan käyttää, jossa muunnelmassa oletetut transformantit siirrostetaan ensin NEP-glukoosialustalle (nestemäinen alusta ilman agaria), jossa niiden annetaan kasvaa yön yli 27°C:n lämpötilassa. Seuraavana päivänä solut voidaan maljata NEP-glukoosiagarille sopivana laimennoksena yksittäisten pesäkkeiden saamiseksi kolme vuorokautta o kestävän, 27 C:ssa suoritettavan inkuboinnin jälkeen. Sitten hiivapesäkkeet voidaan toistomaljata NEP-glukoosiagarille ja tälle samalle alustalle, joka on täydennetty 0,3 mM CuSC>4:a. Plasmidin pET13:l sisältävät panimohiivan transformantit voidaan erottaa spontaanisti kupariresistenteistä johdannaisista sillä perusteella, että kupariresistenssi voi poistua niistä.

Menetelmät (a), (b) ja (c) yhdessä ovat riittäviä sen seikan varmistamiseen, onko oletettu, kuparille resistentti transformant-ti aito. Suositeltavaa on myös tutkia kaikkien oletettujen trans-formanttien solujen morfologiaa valomikroskooppisesti. Trans-formantin huolellinen vertaaminen emäkantaan (toisin sanoen trans-formoimattomaan panimohiivaan) osoittaa, onko transformantti todellakin geneettisesti muunnettu hiiva vai kontaminantti.

Toivottaessa voidaan myös käyttää muita menetelmiä plasmidi- transformanttien varmistamiseksi.

16 84624 Näin saatu hiivan transformantti, joka tunnetaan nimellä NCYC 240 (pET13:l), tallennettiin hiivakokoelmaan National Collection of Yeast Cultures, Colney Lane, Norwich, NR4 7AU, Englanti, joulukuun 12. päivänä 1984, numerolla NCYC1545,

Hiivan NCYC 240 (pET13:l), joka edellä mainituilla menetelmillä todettiin aidoksi plasmiditransformantiksi, yksittäisen pesäkkeen annettiin kasvaa NEP-glukoosiagarilla, jossa oli 1 mM CuSO^ia, ja se siirrostettiin 200 ml:aan NEP-glukoosialustaa, joka oli täydennetty 0,2 mM CuSO^rlla (nestemäinen alusta). Viljelmää inkuboitiin ravistepullossa 28°C:ssa kaksi vuorokautta, jonka jälkeen tämä kaikki 200 ml siirrostettiin 5 litraan tätä samaa nestemäistä alustaa. Näiden viljelmien annettiin kasvaa sekoituspulloissa 20°C:ssa neljä vuorokautta. Sitten 5 litran viljelmät laimennettiin, kukin arviolta 45 litraksi varastovier-rettä. Vierteiden annettiin käydä seitsemän vuorokautta, hiiva otettiin talteen ja se siirrostettiin seuraavasti valmistettuun ale-vierteeseen.

95 % ale-maltaita ja 5 % kidemaltaita mäskättiin South Staffords-hire-vedessä 65,5°C:ssa 90 minuutin ajan. Humalaa lisättiin arvoon 36 EBU saakka ja karamelliväriä arvoon 30 EBU saakka.

Seosta keitettiin 90 minuutin ajan 1 baarin paineessa, jonka jälkeen sitä seisotettiin whirlpool-laitteessa 30 minuuttia. Käyttöhetkellä vierteen ominaispaino oli 1055° 15°C:n lämpöti lassa.

3

Hiiva puristettiin ja sitä siirrostettiin 5,7 kg/m ja maksimaalinen käymislämpötila oli 16°C. Olut pantiin varastosäiliöihin ominaispainon pudottua arvoon 1012°. Oluen annettiin kehittyä -l°C:ssa 3 vuorokautta. Olut suodatettiin ja laimennettiin ominaispainoon 1038°, arvoon 1008 PG, 24 EBU-katkeropitoisuu-teen ja 20 EBU-väriyksikköön. Etanolipitoisuus oli 4 %.

Todettiin, että olut oli juomakelpoista.

Olutnäyte dialysoitiin, jonka jälkeen se pakastekuivattiin. Pakastekuivatun oluen 8-laktamaasiaktiivisuus määritettiin, ja 17 84624 siinä ei todettu olevan havaittavaa β-laktamaasiaktiivisuutta.

Samanlaiset toimenpiteet suoritettiin käyttäen NCYC 240-hiivaa; josta puuttui plasmidi pET13:l (toisin sanoen muuntamaton NCYC 240-hiiva), kuitenkin sillä poikkeuksella, että alkuperäinen NEP-glukoosialustalla oleva hiivaviljelmä ei sisältänyt kupari-sulfaattia. Oluet, jotka tuotettiin sekä NCYC 240-hiivalla että NCYC 240 (pET13:1)-hiivalla käyttämällä, todettiin jokseenkin samanlaisiksi tavanomaisilla kolmiomakukokeella sekä aromipro-fiilin analyysillä (kirjallisuuskatsaus näistä menetelmistä on esitetty julkaisussa R.J. Anderson, 1983 Brewers Guardian, marraskuu, s. 25).

Molempia hiivamuotoja käyttäen suoritetun oluenvalmistuksen aikana kyseisten hiivojen näytteitä analysoitiin solujen lukumäärän ja elävien solujen arvioimiseksi. Tulokset osoittivat, että hiivojen välillä tässä suhteessa oli vain vähän eroavaisuutta, mikäli lainkaan. Muunnetun hiivan tapauksessa plasmidin (pET13:l) sisältävien solujen osuus määritettiin, ja todettiin, että suhteellisen harvoista soluista puuttui plasmidi. Myös muita tekijöitä seurattiin käymisen aikana, sekä muunnetun että muunta-mattoman hiivan kohdalla. Näitä olivat: vierteen ominaispainon aleneminen ajan edistyessä, solujen lukumäärän lisääntyminen ajan edistyessä ja lopullisen hiivasaaliin suuruus. Todettiin, ettei minkään näiden tekijöiden suhteen merkittävää eroa ollut todettavissa muunnetun hiivan ja muuntamattoman hiivan käytön välillä.

Osa käymisprosessissa tuotetusta muunnetusta hiivasta käytettiin edelleen samanlaisessa panimoprosessissa, kun taas liiallinen hiiva toimi 8-laktamaasin lähteenä.

8-laktamaasipitoisuus määritettiin biologisella kokeella sekä entsymaattisella kokeella. Tällaisissa kokeissa solut saadaan talteen sentrifugoimalla 10 minuuttia, jonka jälkeen ne suspen-doIdaan uudestaan 0,1 M fosfaatti/sitraattipuskuriin, pH 6,5, ja ne rikotaan käyttäen Braun-homogenisaattoria. LasiheImet ja ie 84624 solujäte poistetaan sentrifugoimalla (8000 x g, 10 minuuttia), jasupernatantti sentrifugoidaan uudestaan (1000 x g, 30 minuuttia) . Käytettäessä tuloksena olevien soluttomien uutteiden määrityksessä biologista koetta penisilliinille herkkiä E. coli-soluja maljataan pehmeälle agarille, joka sisältää 25 ^ug/ml ampisilliinia. 25 ^,ul hiivojen NCYC 240 ja NCYC 240 (pETl3:l) uutetta levitetään näille maljoille, joita tämän jälkeen inkuboi-daan 37°C:ssa. NCYC 240 (pETl3:1)-hiivan pesäkkeiden läheisyydessä todetaan voimakasta bakteerikasvustoa, kun taas NCYC 240-hiivan pesäkkeiden lähellä tällaista kasvua ei todeta. Tämä osoittaa, että olutkäymisestä saadut NCYC 240 (pET13:1)-solut tuottavat sellaista ainetta, joka kykenee hajottamaan penisilliiniä ja joka täten sallii herkkien E. coli-solujen kasvamisen, kun taas NCYC 240-soluissa (muuntamattomat) tätä aktiivisuutta ei ole. Tämän aktiivisuuden voidaan katsoa liittyvän B-laktamaasiproteiiniin. Lisäosoitus siitä, että tällainen aktiivisuus liittyy NCYC 240 (pETl3:1)-soluissa olevaan β-laktamaasiproteiiniin on saatavissa entsymaattisten kokeiden tuloksista. Ensimmäisessä näistä kokeista käytettiin kvalitatiivista, paperikiekolla toteutettavaa ilmaisujärjestelmää, jossa hiivasolu-uutteiden näytteet täplite-tään kromogeenisella kefalosporiinilla, Nitrocefin:illä, kyllästetyille Cefinase-levyille, jolloin Nitrocefin muuttuu keltaisesta punaiseksi β-laktamaasin läsnäollessa (BBL Microbiology Systems, Beckton Dickinson and Company, Oxford) (C.H. 0'Callaghan ym., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1972, 1, s. 283). Olutkäymisestä saadun NCYC 240 (pET13:1)-hiivan soluttomat uutteet muuttavat kiekkojen värin keltaisesta punaiseksi, kun taas NCYC 240-hiivalla (muuntamattomalla) ei havaita värin vaihtumista kiekolla, mikä osoittaa 8-laktamaasiproteiinin läsnäolon NCYC 240 (pETl3:l)-hiivassa, mutta ei NCYC 240-hiivassa. Hiivasolu-uutteissa olevan β-laktamaasin aktiivisuus kvantitoidaan käyttämällä samaa kromogeenistä kefalosporiinia, Nitrocefin sekä C.H. 0'Callaghan:in ym. esittämää menetelmää (1972, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1, s. 283) . Entsyymireaktiot suoritetaan 37°C:ssa 1 cm:n kyvetissä, jossa olevan Nitrocefin-liuoksen kokonaistilavuus on 1 ml (51,6 ^ug Nitrocefin 87/312:ta milli-litrassa 0,05 M fosfaattipuskuria, pH 7), johon lisätään 20 ^ul i9 84624 soluvapaata hiivauutetta. Reaktioseoksen optisen tiheyden muutos määritetään aallonpituuksilla 386 nm ja 482 nm käyttäen Beckman DU 7-spektrofotometriä. Tällä tavalla olutkäymisestä saadun NCYC 240 (pETl3:1)-hiivan soluvapaat raakauutteet kykenevät tuhoamaan 4,87 nanomoolia Nitrocefin 87/312:ta minuutissa proteiinin milligrammaa kohden 37°C:n lämpötilassa ja pH:n ollessa 7,0 (proteiiniarviot saadaan aallonpituudeltaan 230 nm ja 260 nm olevan ultraviolettisäteilyn adsorboitumisesta V.F. Kaihiin ja R.W. Bernlohrrin mukaan (1977, Analytical Biochemistry, 82, s. 362) . NCYC 240-hiivan (muuntamaton) raakasolu-uutteissa sekä NCYC 240 (pET13:1)-hiivan keitetyissä (20 minuuttia l00°C:ssa) uutteissa ei ole lainkaan (3-laktamaasiaktiivisuutta.

Edellä yksityiskohtaisesti hiivan NCYC 240 yhteydessä esitettyjen toimenpiteiden kanssa samanlaisia toimenpiteitä on myös sovellettu yksityisomistuksessa olevaan panimohiivakantaan, ja saadut tulokset olivat hyvin samanlaisia.

Seuraavassa esitetään NCYC 240-hiivan modifiointi siten, että hiiva saadaan tuottamaan toista proteiinimateriaalia, nimittäin 8-glukanaasia. Endo-1,3-1,4-8-D-glukanaasi (EC 3.2.1.73) on entsyymi, joka katalysoi 8-1,3- ja β-l,4-sitoutuneen 8-D-glukaa-nin vuorottelevien sekvenssien hydrolyysiä, ja tällaisia glukaa-neja ovat ohran β-glukaani sekä lichenaani. Tämän entsyymin ainutlaatuinen toiminta estää sitä hydrolysoimasta β-l,3-sitoutu-neen glukaanin, kuten laminariinin, toistuvia sekvenssejä sekä β-l,4-sitoutuneen glukaanin, kuten karboksimetyyliselluloosan, toistuvia sekvenssejä (Barras, D.R., 1969, julkaisussa "Cellulases and Their Applications", 156th meeting of the American Chemical Society, syyskuu 11-12, 1968, Atlantic City, .s. 105).

Gram-positiivinen bakteeri Bacillus subtilis tuottaa solun ulkopuolista endo-l,3-l,4-8-D-glukanaasia, joka käyttäytyy samalla tavalla kuin edellä esitetty entsyymi (Moscatelli, E.A. ym. 1961, Journal of Biologial Chemistry, 236, s. 2858; Rickes, E.L. ym.

1962, Archives of Biochemistry and Biophysics, £9, s. 371).

2o 84624 B. subtiliksen kromosomaalinen β-glukanaasigeeni on eristetty geenikloonauksella B. subtiliksen kannasta, jota nimitetään NCIB 8565:ksi (Hinchliffe, E., 1984, Journal of General Microbiology, 130, s. 1285). Aktiivisen geenin todettiin sijaitsevan DNA:n 3,5 kiloemäsparin suuruisessa restriktio-endonukleaasi-Eco RI-fragmentissa, joka ilmentää toiminnallista entsyymiä E. coli:ssa. Kloonatun β-glukanaasigeenin todettiin koodaavan sellaista entsyymiä, joka oli spesifinen ohran β-glukaanin hydrolyy-sille, ja sen todettiin olevan ensisijaisesti sijainniltaan sytoplasman ulkopuolinen E. coli-bakteerissa (Hinchliffe, 1984).

Myöhemmin poistoanalyysin avulla kloonatun β-glukanaasigeenin on todettu sijaitsevan 1,4 kiloemäsparin suuruisessa restriktio-endonukleaasi-PvuI-Clal-DNA-kappaleessa. Sama sijainti on todettu B. subtilis-bakteerin β-glukanaasigeenille, joka on eristetty kannasta NCIB 2117 (Cantwell, B.A. & McConnell, D.J., 1983, Gene, ^3, s. 211). Jokin aika sitten on julkaistu NCIB 2117-kannan DNA-sekvenssin analyysillä saatu täsmällisempi molekyyli-rakenne (Murphy, N. ym. 1984, Nucleic Acids Research, 12, s.

5355).

Hiivat, S. cerevisiae mukaan lukien, tuottavat lukuisia eri tyyppisiä β-glukanaaseja; kuitenkaan yksikään näistä ei kykene hydrolysoimaan β-1,3-1,4-sitoutunutta glukaania (Abd-El-Al, A.T.H. & Phaff, H.J., 1968, Biochemical Journal, 109, s. 347). Tästä voidaan päätellä, että hiiva ei tuota endo-1,3-1,4-8-glukanaasia. Tästä syystä B. subtilis-bakteerin kloonattu β-glukanaasigeeni on istutettu S. cerevisiae-hiivaan, ja on osoitettu, että tämä geeni kykenee koodaamaan biologisesti aktiivisen proteiinin S. cerevisiae-hiivassa, ja että tämän entsyymin aktiivisuus on tyypillinen B.subtilis-bakteerista ja E. coli-bakteerista löydetylle entsyymille (Hinchliffe, E. & Box, W.G., 1984,

Current Genetics, 8, s. 471). Kloonatun β-glukanaasigeenin ilmentyminen S. cerevisiae-hiivassa on tehotonta, riippuen niistä biologisesti aktiivisen entsyymin määristä, joita kloonatun β-glukanaasigeenin sisältävissä B. subtilis- ja E. coli-baktee-reissa syntyy. Kuitenkin hiivassa oleva entsyymiaktiivisuus on

II

2i 84624 todettavissa ainoastaan kloonatun geenin sisältävän hiivan raaka-solu-uutteissa (Hinchliffe, E. & Box, W.G., 1984). Tämä saattaa tarkoittaa sitä, että solu ei kykene erittämään hiivan tuottamaa entsyymiä ulos solusta, jolloin entsyymi on luonteeltaan solun sisäinen; toisin kuin bakteereiden tuottama entsyymi, joka on solun ulkopuolinen.

B. subtilis-bakteerin 3_glukanaasigeenin viemisessä panimohiivaan NCYC 240 käytettiin välittäjävektorina pET13:1-plasmidia, joka kykenee replikoituinaan sekä E. coli-bakteerissa että S. cerevisiae-hiivassa, kuten edellä mainittiin. Plasmidissa pEHB3 läsnäoleva, 3,5 kiloemäsparin suuruinen Eco Rl DNA-fragmentti alikloonattiin in vitro, järjestämällä se uudelleen plasmidin pET13:l ainoaksi Bam HI-kohdaksi mikä on yksityiskohtaisemmin nähtävissä oheisesta piirustuksesta. Piirustuksen geenikartassa säteen suuntaisesti viivoitetut kaaret edustavat B. subtilis-bakteerista peräisin olevaa DNA:ta, joka sisältää β-glukanaasigeenin (8G), leveät, täyttämättömät kaaret edustavat kromosomaalista DNA:ta, jossa ilmoitetaan LEU-2- ja CUP-l-geenien sijainti (Henderson, R.C.A., 1983, "The Genetics and Applications of Copper Resistance in Yeast", Ph.D-väitöskirja, University of Oxford), ja kapeat mustat kaariviivat tarkoittavat 2 ^um-plasmidi-DNA:ta ja paksut mustat kaariviivat tarkoittavat E. coli-bakteerin vektori-DNA-sekvenssejä. T4 DNA-ligaasilla suoritettu käsittely, mikä seurasi pEHB3-plasmidin pilkkomista Eco Rl-entsyymillä (Hinchliffe, E., 1984, Journal of General Microbiology, 130, s. 1285), suoritettiin laimeissa DNA-pitoisuuksissa, täten edesauttaen Eco Rl-pilkkomisessa syntyneiden kahden tuotteen renkaaksi liittymistä. Toinen näistä tuotteista on pEHB3-plasmidin leveästä mustasta kaaresta peräisin oleva DNA-rengas. Kun nämä tuotteet pilkottiin restriktio-endonukleaasi-Bglll-entsyymillä, tämä rengas katkesi Bglll-kohdasta ja syntyi linaarinen 3,5 kb:n fragmentti. Tällä välin pETl3:l pilkottiin ja tuloksena oleva lineaarinen fragmentti ligatoitiin pEHB3:sta peräisin olevan lineaarisen fragmentin kanssa käyttäen T4 DNA-ligaasia. Tämä pilkkominen ja ligatointi suoritettiin korkeammissa DNA-pitoisuuksissa, mikä edesauttoi 22 84624 B. subtilis-bakteerin uudestaan järjestetyn DNA:n yhdistymistä pET13:1-plasmidin Bam HI-kohtaan (Henderson, R.C.A., 1983, "The Genetics and Applications of Copper Resistance in Yeast", Ph.D-väitöskirja, University of Oxford). Ligatointi suoritetaan, koska endonukleaasit Bam HI ja Bglll aikaansaavat keskenään kilpailevat tarttuvat päät, jotka liittyvät toisiinsa muodostaen Bam Hl/BglII-hybridikohdat, joita kumpikaan endonukleaaseista Bam HI tai Bglll ei tunnista. Transformantit todettiin E. coli-kannassa HB101 resistenteiksi ampisilliinille, herkiksi tetra-sykliinille ja β-glukanaasipositiivisiksi E. coli-bakteerissa, joten ne voitiin erottaa E. colirssa olevasta pEHB3-plasmidista. Uudelleen järjestetyn Eco RI-fragmentin istuttamissuunta pEHBlO:ssä määritettiin restriktio-endonukleaasilla suoritetulla pilkkomisella, mitä seurasi agaroosi-geelielektroforeesi. Uusi plasmidi on nimetty pEHBlOrksi.

Plasmidi-DNA eristettiin hybridiplasmidin pEHBlO sisältävästä kannasta HBlOl; tämä DNA transformoitiin panimohiivaan NCYC 240, kuten edellä on esitetty. Kupariresistanssi valikoitiin myös edellä esitetyllä tavalla. NCYC 240-hiivan plasmiditransforman-tit varmistettiin korkean tason resistenssin määritysten sekä B-laktamaasikokeiden yhdistelmällä, jonka perusteella NCYC 240 (pEHBlO) oli saatu aikaan.

Hiivojen NCYC 240 (pEHBlO), NCYC 240 (pET13:l) ja NCYC 240 yksittäiset pesäkkeet siirrostettiin 200 millilitraan NEP-glukoosialustaa (täydennettynä 0,2 mM CuSO^ra, mikäli asianmukaista). Viljelmiä inkuboitiin ravistellen 27°C:ssa 2 vuorokautta, jonka ajan kuluttua kukin niistä siirrostettiin 2 litraan samaa alustaa. Kun niiden oli annettu kasvaa 3 vuorokautta 27°C:ssa, solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja ne pestiin kahdesti 0,1 M fosfaatti/sitraattipuskurilla, pH 6,4, ennen solujen rikkomista Braun-homogenisaattorilla. Supernatantteja jatkokäsiteltiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi että kukin supernatantti dialysoitiin yön yli 2 x 21 0,1 M fosfaatti/sitraat- tipuskuria, pH 6,4, vastaan. Tämän jälkeen näiden kolmen 23 84624 NCYC 240-hiivan raakasolu-uutteet alistettiin β-glukanaasikokei-siin, jotka olivat Hinchliffern ja Box:in (1984) mukaiset.

Nämä kokeet osoittivat NCYC 240 (pEHBIO)-hiivan soluttomiin uutteisiin liittyvän β-glukanaasiaktiivisuuden (1,17 nanomoolia pelkistävää sokeria vapautui ohran β-glukaanista minuutissa proteiinin milligrammaa kohden 40°C:ssa ja pH:n ollessa 6,2), ja aktiivisuuden puuttumisen sekä NCYC 240 (pETl3:l)- että NCYC 240-hiivan soluttomista uutteista.

Näin saatu hiivan transformantti, joka tunnistettiin NCYC 240 (pEHBIO):ksi, on tallennettu hiivakokoelmaan National Collection of Yeast Cultures, Colney Lane, Norwich NR47AU, Englanti,'joulukuun 12.päivänä 1984, numerolla 1546.

NCYC 240 (pEHBIO)-hiivan näyte viljeltiin edellä esitetyllä tavalla, ja sitä käytettiin panimoprosessissa, joka on sama kuin edellä NCYC 240 (pET13:1)-hiivan yhteydessä esitetty prosessi. Prosessista saatiin olutta, joka oli juotavaksi kelpaavaa, ja joka ei olennaisesti sisältänyt endo-1,3-1,4-6-D-glukanaasia. Panimoprosessista peräisin olevan hiivan todettiin sisältävän pEHBIO-plasmidin, joka määrää β-glukanaasin tuottamisen (1 nano-mooli pelkistäviä sokereita vapautui ohran β-glukaanista minuutissa proteiinin milligrammaa kohden 40°C:ssa ja pH:n ollessa 6,4), joten osa hiivasta voitiin kierrättää takaisin (eli käyttää myöhemmissä panimoprosesseissa) ja osaa hiivasta voitiin käyttää entsyymin lähteenä. Lisäksi panimoprosessista peräisin olevan NCYC 240 (pEHBIO)-hiivan raakasolu-uutteet sisältävät sekä β-lak-tamaasientsyymin aktiivisuutta (2,33 nanomoolia Nitrocefin 87/312:ta tuhoutui minuutissa proteiinin milligrammaatohden 37°C:ssa ja pH:n ollessa 7,0) että 8-glukanaasientsyymin aktiivisuutta. Tämä osoittaa mahdollisuuden tuottaa samanaikaisesti useampaa kuin yhtä heterologista proteiinia geneettisesti muunnetussa panimohiivassa, kuten NCYC 240-hiivassa.

B. subtilis-bakteerista saatua endo-1,3-1,4-β-D-glukanaasia markkinoidaan tällä hetkellä entsyymivalmisteena, jota voidaan käyttää epätoivotun B-glukaanin läsnäoloon liittyvien vaikeuksien poistamiseen. Näin ollen tätä edellä kuvattua menetelmää voidaan käyttää tähän samaan tarkoitukseen sopivan entsyymin tuottamiseen.

Claims (9)

24 84624

1. Menetelmä etanolin ja hiivalle heterologisen proteiinin tai peptidin valmistamiseksi vesipitoista, sokeria sisältävää alustaa hiivalla käyttäen, mitä seuraa etanolin ja muiden näin muodostuneiden tuotteiden talteenottaminen, tunnettu siitä, että vesipitoinen sokeria sisältävä alusta käytetään Saccharo-myces cerevisiae- tai S. carlsbergensis -hiivan teollisella kannan geneettisesti manipuloidulla muunnoksella, joka kykenee ilmentämään heterologisen proteiinin tai peptidin, etanoli saadaan talteen vesipitoisena nesteenä, joka on olennaisesti vapaa hiivasta sekä mainitusta heterologisesta proteiinista tai peptidistä ja joka käsittää olennaisesti käyneen alustan kaiken veden ja etanolin, ja mainittu heterologinen proteiini tai peptidi saadaan käymisen aikana tuotettuun hiivaan pidättyneenä proteiinina tai peptidinä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vesipitoinen neste on juotavaa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli otetaan talteen mainitusta käyneestä alustasta etanolitisleenä.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoisen, sokeria sisältävän alustan pääasiallisena läsnäolevana sokerina on maltoosi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen, sokeria sisältävä alusta on ohra-maltaaseen perustuvaa olutvierrettä.

6. Patenttivaatimuksen 2, 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käyminen suoritetaan 8-25eC:n lämpötilassa. 25 84624

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen, sokeria sisältävä alusta on käy-misalusta juotavan, tislatun etanolin tai polttoaine-etanolin tuottamiseksi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu alusta perustuun viljaan, perunoihin, kassavaan, sokeriruokoon tai sokerijuurikkaaseen, jotka on valinnaisesti esikäsitelty näissä raaka-aineissa olevan selluloosan ja/tai tärkkelyksen muuntamiseksi käymiskykyi-siksi sokereiksi.

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tämä käyminen on olennaisesti anaerobista käymistä.