FI86079C - Foerfarande foer producering av etanol och ett protein eller en peptid, som aer heterolog till jaest. - Google Patents

Foerfarande foer producering av etanol och ett protein eller en peptid, som aer heterolog till jaest. Download PDF

Info

Publication number
FI86079C
FI86079C FI861696A FI861696A FI86079C FI 86079 C FI86079 C FI 86079C FI 861696 A FI861696 A FI 861696A FI 861696 A FI861696 A FI 861696A FI 86079 C FI86079 C FI 86079C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
yeast
protein
peptide
ethanol
heterologous
Prior art date
Application number
FI861696A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI861696A0 (fi
FI861696A (fi
FI86079B (fi
Inventor
Edward Hinchliffe
Enda Kenny
Original Assignee
Delta Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Delta Biotechnology Ltd filed Critical Delta Biotechnology Ltd
Publication of FI861696A0 publication Critical patent/FI861696A0/fi
Publication of FI861696A publication Critical patent/FI861696A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86079B publication Critical patent/FI86079B/fi
Publication of FI86079C publication Critical patent/FI86079C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
    • C12C5/004—Enzymes
    • C12C5/006—Beta-glucanase or functionally equivalent enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
    • C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Alcoholic Beverages (AREA)

Description

1 86079
Menetelmä etanolin ja hiivalle heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamiseksi Tämä keksintö kohdistuu Permen toin ti tuot tMden eristämiseen.
Valmistettaessa alkoholia käymisteitse (PermentoimaI la) hiiva käyttää vesiliuoksessa olevat sokerit etanoliksi. Hiiva kasvaa käymisen aikana, ja vaikka pientä osaa hiivasta voidaankin käyttää myöhemmässä fermentaatioorosessissa, niin hiivan loppuosa muodostaa kulienkin yli jäämän, joka on no i .st et lava käytöstä. Vaikka tällä h i. i vny I i määrä I Ui onkin tiettyä käyttöä, esimerkiksi eläinrehuna ja h i i vanut: teiden lähtöaineena, niin kuitenkin tuotetun hiivan ylimäärä on huomattava, ja sen markkina-arvo on suhteellisen alhainen.
Tämäntyyppiset suuressa mittakaavassa toteutettavat fermentoin-tiprosessit voidaan jakaa kolmeen laajaan luokkaan: (1) Fermentoinnit, joissa saatu fermentoilu vesipitoinen väliaine on toivottu lopputuote. Tähän luokkaan kuuluvat tavanomaiset panimoprosessit: oluen (ohessa käytetyllä käsitteellä "olut" tarkoitetaan mallaspohjäisiä ale-, stout- ja laqer-tyyppisiä juomia sekä muita käymisteitse saatuja juomia), siiderin ja muiden käymisteitse saatujen juomien valmistamiseksi.
• • · · '“· (2) Fermentoinnit, joissa toivottu lopputuote on tislattu, juo- • * · '·* tavaksi tarkoitettu, alkoholia sisältävä väkevä tuote. Tähän luokkaan kuuluvat fermentointiprosessit viskien, brandyjen sekä ***** muiden alkoholijuomien tuottamiseksi, sekä muiden juomien väke- '·'·/· voittamiseen käytettävän alkoholin tuottamiseksi.
• · • · · • · · • · (3) Fermentoinnit teollisesti käytettävän alkoholin tuottami- : seksi. Tähän luokkaan kuuluvat eräissä maissa teollisessa mi- • « · • · tässä toteutetut käymisprosessi t: pol tloainealkoholin tuottami- • · · seksi, sekä käymisprosessit, joissa lähtöaineena käytetään tiet-*. *: tyjä teollisuudesta saatavia jätenesteitä, esimerkiksi oaperi- massan valmistuksessa syntyviä jätevesiä.
2 86079
Hiivaylimäärän muodostuminen on tunnusomaista kaikille näille teollisille prosesseille.
Viime vuosina huomattavasti mielenkiintoa on kohdistettu mikro-organismien geneettiseen muuntamiseen siten, että ne saadaan tuottamaan heterologisia proteiineja ja peptidejä, loisin sanoen sellaisia proteiineja ja peptidejä, joita inikro-organis-mien luonnolliset geneettiset komponentit eivät tuota. Tällaiseen geneettiseen manipulointiin on käytetty lukuisia mikro- - organismeja, joisin hiivat oval herättäneet tiettyä mi elenkii n-toa. Laboratoriokokeissa käytettävät hiivat eivät: kuitenkaan tavallisesti ole niitä samoja hiivoja, joita käytetään alkoholin tuotantoon liittyvissä suuren mitan teollisissa fermentoin-neissa, ja hiivan kasvuolosuhteet laboratoriossa poikkeavat huomattavasti alkoholin tuotantoon tähtäävissä teollisissa käy- j- misprosesseissa käytettyjen hiivojen kohdalla todetuista kasvuolosuhteista. ;
Hiivat kuuluvat alempien eukarioottisten mikro-organismien ryh- * maan, jossa esiintyy erilaisia biologisia ja biokemiallisia omi- naisuuksia. Yleisesti käytetyllä käsitteellä "hiiva" tarkoitetaan Saccharomyces cerevisiae-hiivan kantoja, joilla on kaupal- ' f lista arvoa leipomo-, panimo- ja polttimoteollisuudessa. Samankaltaisia hiivoja käytetään viinin valmistuksessa ja saken panossa, sekä tuotettaessa polttoainealkoholia sakkaroosista tai :.i.; hydrolysoidusta tärkkelyksestä, ja käsiteltäessä teollisuuden : : jätenesteitä.
« · · • φ · • * · ·;··: Kaikki panimo-, leipomo- ja polttimoteollisuudessa käytetyt . hiivat voidaan luokitella taksonomisesti Saccharomyces cerevi- * · · siae-hiivoiksi. Tähän luokkaan kuuluvat pinnalla fermentoituvat » · · ale-hiivat (S. cerevisiae) sekä pohjalla fermentoituvat lager- . . hiivat (S. uvarum tai S. carlsbergensis). ; • · ♦ ’ • * * • * Ji »·· c • · · * *·[ Tarkasti otettuna, käsite "panimohiiva" erottaa panimoissa käy- :*·.· tettävän hiivan kaikista muista hiivoista siinä suhteessa, että • · se on hiivakanta, jota käytetään oluen valmistamiseen, eli se on oluen valmistusprosessissa tällä hetkellä käytettävän hiivan 3 86079 eräs kanta. Tällaisten hiivojen on kyettävä saamaan aikaan maultaan hyväksyttävää olutta vaikuttaessaan käyttävästä humalaa sisältävään tai sisältämättömään mallasuutteeseen (panimo-vierre). Tämän käymisprosessin pääasialliset tuotteet ovat etanoli ja hiilidioksidi, jotka ovat oluen oleellisia komponentteja. Kaikki S. cerevisiae-lajiin kuuluvat hiivat eivät kuitenkaan kykene täyttämään näitä vaatimuksia. Tässä suhteessa kriittisen tekijän uskotaan olevan hiivakannan kyky muodostaa määrältään vähäisiä metaboliatuotteita, kuten estereitä, happoja, korkeamoia alkoholeja ja ketoneita, tarkoin tasapainotettuina osuuksina. Hiiva saattaa olla panimokäyttöön soveltumatonta, jos yhtä tai useampaa tällaista määrältään vähäistä metabolia-tuotetta syntyy liian paljon, joko absoluuttisesti tai muiden metaboliittien suhteen. (Rainbow, C. A, 1970, "The Yeasts", toimittaneet Rose, A.H. & Harrison J.S. Voi. 3, sivu 147).
Yleisesti ottaen panimohiiva eroaa muista hiivoista ominaisuuk-siensa suhteen. Teollisuushiivojen useimmat kannat, toisin kuin laboratoriohiivojen kannat, eivät kykene pariutumaan; niiden sanotaan olevan homothallisia. Teollisuushiivat ovat tavallisesti aneuploidisia tai polyploidisia, joten käytettävissä on vähemmän tilaisuuksia geenimutaatioiden toteamiseksi fenotyyppien avulla. Useimmat polyploidiset kannat eivät muodosta itiöitä, tai niiden muodostamien itiöiden elinkelpoisuus on hyvin alhainen, joten merkityksellisen geneettisen analyysin toteuttaminen « « o on turhauttavaa. Näitä tekijöitä voidaan käyttää yhdessä mit- « · * tana teollisuushiivojen fenotyypin stabiilisuudesta, joka mitta saattaa myötävaikuttaa siihen, valitaanko ne teollisiin sovellu-tuksiin. Samoin, korkeaan ploidisuuteen liittyvä geeniannos ‘ saattaa myötävaikuttaa tällaisten kantojen yleiseen sopivuuteen fermentointiprosesseissa käytettäviksi verrattuna haploidisiin ja diploidisiin kantohin, joiden käymiskyky on yleisesti ottaen . . huono.
• · · • * · • · • « * « ♦ * Tämän lisäksi panimohiivoilla on tiettyjä teknisiä ominaisuuk- ·· , » ..·.·.»·♦· ; siä, joiden avulla ne sopeutuvat hyvin normaaliin ympäristöönsä, eli humalaa sisältävään panimovierteeseen, ja joista mainittakoon * · · esimerkiksi niiden kyky käydä fermentointisäiliön pinnalla (ale- • ♦ * ;**. hiiva) tai säiliön pohjalla (lager-hiiva) .
« * * • · · • * 4 86079
Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 84308981.4, nimellä Bass PLC, joka on julkaistu numerolla 147 198, ja joka vastaa FI-patenttihakemusta 850381, kuvataan patenttivaatimuksineen menetelmä etanolin ja hiivalle heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamiseksi, jossa menetelmässä vesipitoinen, hiilihydraatteja sisältävä alusta fermentoidaan hiivakannalla, joka on muunnettu geneettisesti siten, että se kykenee ilmentämään heterologista proteiinia tai peptidiä, täten muodostunut etanoli otetaan talteen, ja mainittu heterologinen proteiini tai peptidi saadaan muista fermentaatiotuotteista.
Mainitussa hakemuksessa esitetty keksintö perustuu siihen havaintoon, että teollisessa fermentointiprosessissa, johon liittyy alkoholin muodostumista, on mahdollista käyttää geneettisesti muunnettuja hiivoja, jotka kykenevät ilmentämään heterologista proteiinia tai peptidiä. Yllättäen todettiin, että tällaisen hiivan käyttö sopii yhteen teollisuus- tai panimotermentoinneis-sa esiintyvien olosuhteiden kanssa. Tämä tarkoittaa sitä, että käymisprosessissa muodostuva ylimääräinen hiiva toimii heterologisen proteiinin tai peptidin lähteenä, joten sen teollinen arvo on noussut huomattavasti. Lisäksi, koska alkoholin tuotanto pysyy käymisprosessin pääasiallisena tavoitteena, ja koska tavanomaista laitteistoa voidaan suurimmaksi osaksi käyttää vain vähäisiä muutoksia tehden, niin parempiarvoisen • · hiivatuotteen tuottamiseen liittyvät lisäkustannukset ovat ;** alhaiset, joten tätä uutta menetelmää voidaan käyttää heterolo- gisten proteiinien tai peptidien taloudellisesti kannattavana valmistustapana, jolloin heterologiset proteiinit tai peptidit eivät arvokkuudestaan huolimatta aiheuta pääomakustannuksia.
• Kun mainitun hakemuksen mukainen menetelmä toteutetaan vettä sisältävän, juotavan nesteen, kuten oluen, tuottamiseksi, niin • · ·. käymisvaiheen päätyttyä käynyt neste erotetaan hiivasta (sekä ·/ : tavallisesti kaikesta muusta käyneessä alustassa läsnäolevasta : kiinteästä materiaalista). Näissä oloissa on selvästi toivotta- • »♦ vaa, ja tavallisesti välttämätöntäkin, ettei käynyt neste 'V sisällä heterologista proteiinia tai peptidiä, sillä tavaili- * « · f - · 5 sesti heterologisen proteiinin tai peptidin läsnäolo juotavaksi tarkoitetussa nesteessä ei ole hyväksyttävää.
Mainitussa hakemuksessa todetaan, että tällaisissa olosuhteissa heterologinen proteiini tai peptidi voidaan saada hiivasoluista.
Oheisen keksinnön mukaisessa menetelmässä käyminen toteutetaan sellaisissa olosuhteissa, että hiiva lisääntyy tavalliseen tapaan, mutta heterologista proteiinia tai peptidiä syntyy ainoastaan vähän tai ei lainkaan. Tämän jälkeen, tavallisesti sitten, kun hiiva on erotettu käyneestä nesteestä, heterologisen proteiinin tai peptidin ilmentyminen indusoidaan, ja täten saatu proteiini tai peptidi erotetaan hiivasta. Tällä tavalla meneteltäessä vältytään siltä vaaralta, että itse käynyt neste kontaminoituisi heterologisella proteiinilla tai peptidillä.
Tässä menetelmässä vältytään samoin siltä vaaralta, että heterologisen proteiinin tai peptidin läsnäolo käymisen aikana häiritsisi alkoholin tuotantoa, tai erityisesti, että proteiinin tai peptidin synteesi vaikuttaisi haitallisesti hiivan kykyyn tuottaa alkoholia käymistietä.
Näin ollen, tämän keksinnön mukainen menetelmä etanolin ja hiivalle heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamiseksi käsit-: tää hiilihydraatteja sisältävän, vesipitoisen alustan fermentoimi- sen hiivakannalla, joka on muutettu geneettisesti siten, että . .·. se kykenee ilmentämään heterologista proteiinia tai peptidiä ____: olosuhteissa, joissa hiiva lisääntyy, mutta mainitun heterologisen proteiinin tai peptidin ilmentymistä ei esiinny, täten muodostuneen etanolin talteenottamisen, jonka jälkeen mainitun '*’·* proteiinin tai peptidin ilmentyminen hiivassa indusoidaan, ja mainittua heterologista proteiinia tai peptidiä saadaan siitä.
• · • « · • · • · · : Heterologisten geenien ilmentämiseksi hiivassa ollaan kuvattu ,·* : lukuisia erilaisia järjestelmiä. Useimmissa tapauksissa nämä I..’ järjestelmät riippuvat uuden solubiomassan kasvusta sellaisissa olosuhteissa, jotka helpottavat mielenkiinnon kohteena olevan • · · » « · • · · • · • · ♦ • · · ♦ · 6 86079 geenin tehokasta kopioitumista ja luentaa, jotta asianmukaista proteiinia tai peptidiä muodostuisi. Kuitenkin eräiden ilmentämisjärjestelmien tapauksessa kasvatusalustan sisällön manipulointi vaikuttaa heterologisen geenin ilmentymiseen. Tällaisissa tapauksissa uutta solubiomassaa voidaan kasvattaa ilman, että siihen liittyisi samanaikaisesti heterologisen proteiinin tai peptidin tuotantoa, jonka jälkeen geenin ilmentyminen voidaan indusoida siirtämällä hiivasolut olosuhteisiin, jotka suosivat heterologisen geenin ilmentymistä.
Oheisessa keksinnössä on välttämätöntä valita geenin ilmentämis-järjestelmä siten, että se sopii yhteen tarkastelun kohteena olevan etanolikäymisen kanssa. Eräät tunnetut järjestelmät ovat soveltumattomia. Esimerkiksi hiivan glykolyyttisiä geenipromoot-toreita voidaan käyttää heterologisten proteiinien tuotannon indusoimiseksi hiivasoluissa. Suuria määriä hiivabiomassaa voidaan saada kasvattamalla soluja alustassa, joka sisältää käymis-kyvyttömän substraatin ainoana hiilen lähteenään; geenin ilmentäminen voidaan tämän jälkeen indusoida glukoosia lisäämällä, mikä kiihottaa glykolyyttisen geenipromoottorin, eli PGK, kopioitumista (Kingsman ja Kingsman, 1982, eurooppalainen patenttihakemus O 073 635). Samanlaista järjestelmää, jossa käytetään hyväksi hapan fosfataasi-geenipromoottoria (PH05), voidaan käyttää geenin ilmentämisen indusoimiseksi olosuhteissa, :joista epäorgaaninen fosfaatti puuttuu (Hinnen et ai., 1983 eurooppalainen patenttihakemus O 100 561). Nämä tunnetut järjestelmät, joita käytetään geenin ilmentämisen indusoimiseksi hii-vassa, edellyttävät kuitenkin määrätyn kasvualustan käyttämistä solubiomassan suurien määrien tuottamiseksi. Lisäksi glykolyy^' tisen geenipromoottorin tapauksessa kasvu käymiskyvytöntä hiilen lähdettä käyttäen edellyttää hapen läsnäoloa. Näin ollen kumpikaan järjestelmä ei yleisesti ottaen sovellu panimohiivalla -/·! toteutettaviin fermentointeihin, sillä panimoprosessi on olennai-sesti tai osittain anaerobinen (hapeton) ja kasvualustana on .1 - panimovierre, joka on sokereiden, kuten maltoosin ja glukoosin, suhteellisen monimutkainen seos.
• · • · • 1 · • # · « · 1
II
· • · · • · • 1 7 86079
Induktion heterologisen geenin ilmentämiseksi panimohiivassa on sovittava yhteen olutkäymiselle asetettujen vaatimusten kanssa, mikäli induktiota on tarkoitus käyttää tässä keksinnössä.
Tässä suhteessa geenin ilmentäminen on välttämättä indusoitava tehoaineella tai olosuhteilla, jota tai joita ei tavallisesti esiinny panimovierteessä eikä oluessa. Tunnettuja geenin ilmen-tämisjärjestelmiä heterologisten proteiinien ja polypeptidien tuotannon indusoimiseksi hiivassa, ja jotka järjestelmät soveltuvat tässä keksinnössä käytettäviksi, ovat esimerkiksi: (i) hiivan lämoöshokkipromoottori (HSP90) (Finkelstein, 1983, WO 84/04535, Heat regulated production of selected and fused proteins in yeast) sekä (ii) hiivan GALl-promoottori (Botstein et al., 1984, GB-patenttihakemus 2 137 208A). Näissä järjestelmissä käytetään hyväksi lämpöä ja qalaktoosia, vastaavasti, geenin ilmentymisen kiihottamiseksi, ja kumpaakin niistä voitaisiin käyttää tässä keksinnössä. Galaktoosin avulla säädettävän järjestelmän soveltaminen on erityisen käyttökelpoista, sillä panimovierre ei sisällä tavallisesti riittävästi galaktoosia galaktoosin säätelemän promoottorin ilmentymisen aikaansaamiseksi. Näin ollen tällaiset galaktoosin säätelemät geenin il-mentämisjärjestelmät eivät toimi panimohiivassa olutkäymisen aikana.
Tässä uudessa menetelmässä käytettävän hiivakannan on luonnol-: lisestikin sovelluttava tarkastellun tyyppiseen teolliseen fer- .·;·. mentaatioon. Tämä edellytys voidaan turvata toteuttamalla ge- , neettinen muuntaminen hiivakannassa, jolla tiedetään olevan toivotut ominaisuudet, sillä ollaan todettu, että nämä toivo-. tut ominaisuudet, jotka tekevät hiivakannan sopivaksi tietyntyyp-piseen teolliseen käymisprosessiin, saadaan säilymään geneetti-sen muuntamisen aikana. Esimerkiksi, mikäli tarkastellaan käymisprosessia oluen valmistamiseksi, niin geneettiseen muun- • · V·· tamiseen valittu hiivakanta on mieluiten tunnettu, nykyään : : · tällaisissa käymisprosesseissa käytettävä panimohiivan kanta.
#·1 · Kuten edellä huomautettiin, panimohiivan tällaiset teollisuus-• ·» kannat eroavat tunnusomaisilta piirteiltään "laboratoriohiivoista", « 1 ' * · • 1 · • · 1 · • · · • ·« • 8 86 079 ja näistä eroista mainittakoon erityisesti kyky fermentoida humalaa käsittävää panimovierrettä.
Panimovierre on pääasiallisesti humalakasvin kukintoja aromiaineena sisältävä, mallastetun ohran tai muiden liottamalla ja idättämällä esikäsiteltyjen viljalajien kuumavesiuute. Tärkeimmät parametrit hiivan kasvua ja aineenvaihduntaa ajatellen ovat hiilihydraatti- ja typpipitoisuudet (sekä aminohappokoostumus). Nämä voivat vaihdella maasta ja panimosta toiseen, katso esimerkiksi julkaisu "Malting and Brewing Science", voi. 2,
Hopped Wort and Beer; tekijät Hough, J.S., Briggs, D.E., Steven R ja Young, T.W., 1982, Chapman ja Hall, Lontoo ja New York, sivut 456-498. Yleisesti ottaen voidaan todeta, että panimovierre sisältää käymiskykyisiä sokereita yhteensä 5-10 g vierteen 100 millilitraa kohden, joista käymiskykyisistä sokereista vähintään puolet on maltoosia.
Muita hiivan kasvuun ja suorituskykyyn vaikuttavia tekijöitä ovat: (1) Kasvutekijät. Näitä ovat esimerkiksi seuraavat aineet: biotiini, tiamiini, riboflaviini, pyridoksiini, pantoteenihappo ja nikotiinihappo. Yleensä panimovierre sisältää runsaasti näitä tekijöitä, jotka kuluvat loppuun hiivan kasvun aikana.
(2) Mineraalit. Panimohiivan mineraalitarve on samankaltainen kuin useimmilla muilla elävillä organismeilla. Panimovierre ..·. täyttää nämä vaatimukset, sillä se sisältää hivenmääriä metalli- -· ioneja, kuten rautaa, kaliumia, magnesiumia, sinkkiä, mangaania ja kuparia, jotka ovat olennaisia ravintoaineita kasvulle ja käymiselle.
Merkittävin ero laboratoriossa käytettävän viljelyalustan ja ·.*.· panimovierteen välillä on alustan sokerikoostumus. Useimmissa laboratoriossa käytettävissä alustoissa käytetään glukoosia : hiilihydraatin pääasiallisena lähteenä, kun taas maltoosi on vierteen tärkein käymiskykyinen aineosa.
’· ‘ Panimotermentoinnit toteutetaan tavallisesti anaerobisina '···' (hapettomina) f ermentointeina. Kuitenkin happi on hiivan kasvun • · » • * * · ii 9 86079 tärkein edellytys käymisprosessin alkuvaiheissa. Useimmat laboratoriotermentoinnit toteutetaan siten, että hiivabiomassan saanto saadaan mahdollisimman suureksi, kun taas olutkäymisissä keskitytään etanolisaantoon sekä aromiaineiden tuottamiseen.
Näin ollen olutkäymisessä käytetään enemmän siirrostetta ("ymppiä") kuin mitä laboratoriossa tavallisesti käytettäisiin. Täten solujen kahdentuminen (solujen lisääntyminen) on pudonnut alueelle 2-4 fermentointia kohden.
Olutvierteen fermentoiminen toteutetaan tavallisesti lämpötilassa, joka on alueella 8-25°C, ja tämän alueen korkeampia lämpötiloja, kuten 15-25°C, käytetään, mikäli tuotteena on ale-tyyppinen olut, ja esimerkiksi lämpötiloja 8-15°C käytetään silloin, kun tuote on lager-tyyppinen. Laboratorio-oloissa hiivojen viljely toteutetaan merkittävästi korkeammassa lämpötilassa, esimerkiksi 25-35°C.
Samoin, mikäli teollisen käymisprosessin tavoitteena on tislaamalla erotettavan alkoholin tuottaminen, niin tällöin on käytettävä tällaiseen käymisprosessiin sopivasta kannasta saattaa, geneettisesti muunnettua hiivaa. Näissä käymisprosesseissa hiilihydraattien lähteenä voidaan käyttää esimerkiksi viljaa, perunoita, kassavaa, sokeriruokoa, sokerijuurikkaita tai ligno-selluloosan kaltaista materiaalia, ja niitä on valinnaisesti :voitu esikäsitellä esimerkiksi kemiallisilla, entsymaattisilla ;1j1: tai fysikaalisilla menetelmillä näissä lähtöaineissa olevan . .·. selluloosan ja/tai tärkkelyksen muuttamiseksi käymiskykyisiksi ____: sokereiksi.
Hiivan geneettinen muuntaminen voidaan toteuttaa tunnettuja tekniikoita soveltamalla. Sopivia menetelmiä kuvataan kirjallisuudessa, ja erityisiä menetelmiä esitetään jäljempänä esi- • · *.2: merkeissä.
• « · • · · • 1 · .·. : Suuri joukko heterologisia proteiineja tai peptidejä voidaan *./ ilmentää hiivassa. Esimerkkeinä mainittakoon entsyymit, kuten • 1 "1 β-laktamaasi, g-glukanaasi ja g-galaktosidaasi. Muita käyttö- « · · « « 1 I·1 2 • 1 · 10 86079 kelpoisia heterologisia proteiineja ja peptidejä ovat esimerkiksi eräät ihmisistä peräisin olevat ja/tai lääkintähoidossa käyttökelpoiset materiaalit, kuten ihmisseerumin albumiini ja immunoglobuliinit. Kirjallisuudessa kuvataan menetelmiä mikro-organismien geneettiseksi muuntamiseksi siten, että ne kykenevät ilmentämään tällaisia proteiineja tai peptidejä.
Seuraavat esimerkit havainnollistavat yksityiskohtaisemmin tätä keksintöä. Liitteenä olevien piirustusten kahdeksan kuvaa esittävät, vastaavasti: 1. Plasmidin pEHBll muodostamista 2. HSA-primeerin oligonukleotidiketjua 3. HSA cDNA-geenin DNA-ketjua 4. Koodaamattoman 5'-alueen muunnosta ja signaalipeptidiketjun jatketta 5. "Todellisen" HSA cDNA-kloonin (MET-HSA) muodostamista 6. Plasmidia pEKH3 7. Plasmidin pEHBll-MET-HSA muodostamista 8. Plasmidin pETl3:l MET-HSA muodostamista.
Esimerkki 1 8-galaktosidaasin tuotanto panimohiivassa 8-galaktosidaasi (EC 3.2.1.23) on entsyymi (proteiini), joka hydrolysoi 8-D-galaktosidimolekyylien, kuten laktoosimolekyylin, 1" päissä sijaitsevia, ei-pelkistäviä β-D-galaktoosijäännöksiä. E.
’ . coli-bakteerin B-galaktosidi on Lac Z-geenin tuote, joka geeni sijaitsee E. coli-kromosomissa kartta-asemassa 8 minuuttia (Bachmann, B.J., 1983, Microbiological Reviews, 47, sivu 180). Lac Z-geeni muodostaa osan lac-operonista, jolla on ollut : :keskeinen osa selvitettäessä geeniaktiivisuuden geneettistä säätelyä prokariootissa E. coli (Beckwith, J., 1972. Teoksessa "The Operon" sivu 11, toim. Miller, J.H. ja Reznikoff, W.S., .T. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
• · • · · *· ” Viime vuosina β-galaktosidaasin rakenteellista geeniä (Lac Z) • · · on käytetty DNA-manipuloinneissa. On osoitettu, ettei β-galakto- . sidaasiproteiinin aminopäätteen pää ole olennainen entsymaatti- • · ·
II
11 86079 selle aktiivisuudelle (Muller-Hill, B. ja Kania, J., 1974, Nature, 149, s. 561). Tämä on helpottanut monien geenifuusioiden muodostamista, joissa fuusioissa Lac Z-geenin koodaava 5'-osa (joka vastaa proteiinin N-päätteistä päätä) on korvattu muilla DNA-ketjuilla. Näissä geenifuusioissa lac z-ketjun kopiointiin liittyvä geenipromoottori on korvattu analogisilla DNA-ketjui1la, jotka ovat peräisin eri geeneistä (Casadaban, M.J. et ai, 1980, Journal of Bacteriology, 143, sivu 971), mutta saaduissa proteiineissa säilyy 8-galaktosidaasin aktiivisuus.
E. coli-bakteerin Lac Z-qeeni oli eräs ensimmäisistä prokarioot-tisista kromosomaalisista geeneistä, jotka saatiin ilmentymään S. cerevisiae-hiivassa (Panthier, J.J. et ai, 1980, Current Genetics, 2, sivu 109). Tässä tapauksessa E. coli-bakteerin luonnollinen Lac Z-geeni alikloonattiin hiivan ja E. colirn väliseen sukkulavektoriin (plasmidi), ja vietiin hiivan sellaiseen laboratoriokantaan, jolla ei ole luonnostaan β-galaktosidaa-sin aktiivisuutta. Geenin ilmentymisen taso ja täten entsyymin muodostuminen oli kuitenkin tehotonta tätä järjestelmää käytettäessä. Tämän jälkeen on muodostettu geenifuusioita, joissa hiivan sytokromi Cl-geenin (CYC1) kopioitumiseen liittyvä promoottori korvaa Lac Z-geenin promoottorin. Nämä CYCl-Lac Z-fuusiot on siirretty transformaatiolla hiivan laboratorio-kantoihin, joissa niiden on todettu tuottavan entsymaattisesti : aktiivista β-galaktosidaasia (Guarente, L. ja Ptashne, M.
1981, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, .sivu 2199). CYCl-Lac Z-geenifuusioiden yksityiskohtainen analyy-si on osoittanut, että hiivan tuottaman β-galaktosidaasin tasot paljastavat säätelymallin, joka tavallisesti todetaan sytokromi * · · c:n tapauksessa (eli synteesin väheneminen glukoosin avulla kas-**’-1 vaneissa soluissa). (Guarente, L. ja Ptashne, M., 1981).
Tällä tavalla Lac Z-geeniä on käytetty tutkittaessa geenin il- « 1 V1: mentymisen säätelyä sekä prokariooteissa että eukariooteissa, * ♦ » V : DNA-kopioitumisen tasolla.
« « • · · • ·· #··** Hiivan CYCl-geenissä ne DNA-ketjut, jotka säätelevät DNA- kopioitumista RNA-polymeraasin II avulla, on paikallistettu • · « « · · • » · « · • » · • · · » · i2 86079 kahteen alueeseen, sytokromi c-proteiinia koodaavista ketjuista ylävirran puolelle (5'). Yksi näistä säätelevistä ketjuista sijaitsee lähellä sitä kohtaa, josta kopioituminen alkaa; toinen niistä sijaitsee ylävirran puolella käynnistysalueesta ja sisältää aktivointikohdan, joka edistää geenin ilmentymistä (UASc) (Guarente, L. ja Ptashne, M. 1981; Faye, G. et ai, 1981, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78_, sivu 2258). Guarente ja kolleegat (1982, Proceedings of the National Academy of Sciences, 79, sivu 7410) ovat osoittaneet, että muilla geeneillä on ylävirran puoleisia aktivointikohtia (UAS), erityisesti S. cerevisiae-hiivan GALlO-geenillä. Nämä tutkijat muodostivat geenifuusion, jossa CYCl-geenin UASc-kohta korvattiin GALlO-geenin UAS-kohdalla. Lisäksi geenifuusio, jossa CYCl-geenin promoottori (kopioitumisen käynnistymisalue) säilyy, sulautetaan yhteen E. coli-bakteerin Lac Z-geenin kanssa siten, että entsymaattisesti aktiivista (3-galaktosidaasia muodostuu hiivassa, joka on transformoitu tämän hybridigeenin sisältävällä plasmidi-DNA:lla (plasmidi pLGSD5).
Hiivan galaktoosimetaboliaan liittyvien geenien säätely tunnetaan hyvin. Galaktoosin aineenvaihduntaan välttämättömiä entsyymejä koodaavien kolmen geenin (GAL1, GAL10 ja GAL7) kopioituva ilmentyminen riippuu geenin GAL4 koodaamasta kopioitumiseen liittyvästä aktivaattorista (Oshima, Y. 1982, teoksessa "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression" toim. Broach, J.R. et ai, sivu 159, Cold Spring r - : Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). GAL80- : geenin tuote (tukahduttava GAL80-proteiini) inaktivoi peruutet- ....: tavasti aktivoivan GAL4-proteiinin kyvyn edistää näiden geenien . .·. kopioitumista. Galaktoosin arvellaan sitoutuvan tukahduttavaan GAL80-proteiiniin, mikä vapauttaa aktivoivan GAL4-proteiinin, joka puolestaan edistää galaktoosille spesifisten geenien kopioitumista. Galaktoosi indusoi GALlO-CYCl-hybridipromoottoria ’· edellä kuvatulla tavalla (Guarente, L. et ai, 1982, Proceedings * of the National Academy of Sciences, USA, 9_, sivu 7410). Näin ;\· ollen galaktoosi indusoi β-galaktosidaasin tuotantoa.
• · • · · • · · t t t • » · 1
II
· * · · «· · · • · 13 86079 E. coli-bakteerin B-galaktosidaasin tuottaminen panimohiivassa GALlO-CYCl-hybridipromoottorista ilmentyvän, E. coli-bakteerin β-galaktosidaasigeenin siirtämiseksi panimohiivan kantaan NCYC240 plasmidissa pET13:l läsnäoleva CUP-l-qeeni oli alikloo-nattava. Liitteenä olevassa kuvassa 1 esitetään kaavamaisesti suurin piirtein 2,85 kiloemäsparin suuruisen, CUP-l-geenin sisältävän Xbal DNA-kappaleen alikloonaaminen plasmidin pLGSD5 ainoaan Xbal-kohtaan, jolloin saatiin yhdistelmäplasmidi pEHBll, joka sisältää GALlO-CYCl-promoottorin.
Panimohiivan kanta NCYC240 esikäsiteltiin plasmidilla pEHBll transformointia varten seuraavalla toimenpiteellä. Hiivaa kasvatettiin 100 millilitrassa YEP-alustaa (10 g/1 hiivauutetta, 20 g/1 peptonia), jota oli täydennetty glukoosilla pitoisuudeksi 2 % paino/tilavuus, ja kasvattamista jatkettiin varhaisen eksponentiaalisen kasvun vaiheeseen; solut otettiin talteen ja pestiin kylmällä steriilillä vedellä ennen niiden suspendoimista uudestaan 10 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,6, joka sisälsi 1 M sorbitolia, 10 mM ditiotreitolia ja 40 ^,ug/ml entsyymiä Zymolyase 6000 (Kirin Brewery Co. Ltd.), 30°C:n lämpötilassa, 1,5 tuntia kestäneen inkuboinnin jälkeen hiivasolut muuttuvat sferoplasteiksi, jotka otetaan talteen sentrifugoimalla, ja ne pestään kolmasti 20 millilitralla liuosta, joka käsittää 1 M sorbitolia, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. Lopuksi sferoplastit suspentoidaan uudestaan 1 millilitraan liuosta,
•:·* joka käsittää 1 M sorbitolia, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl, pH
‘ 7,6, ja tästä suspensiosta 100 ^ul lisätään 15 mikrolitraan plasmidia pEHBll. Tätä seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jonka jälkeen siihen lisätään 1 ml liuosta, : joka käsittää 40 % polyetyleeniglykolia 4000, 10 mM CaCl2, ;·.·. 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. Sferoplastit otetaan talteen 2-5
minuutin kuluttua sentrifugoimalla, ja ne suspentoidaan . . varovaisesti uudestaan 0,5 millilitraan NEP-sorbitolialustaa (MgS04 7H20 2 g/1, (NH^ S04 2 g/1, KH2P04 3 g/1, CaCl2 2H20 *. 0,25 g/1, hiivauute 2 g/1, peptoni 3 g/1, glukoosi 40 g/1, 1 M
sorbitoli), ja inkuboidaan 28°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan ;** : ennen niiden maljaamista sulaan NEP-sorbitolialustaan, jota oli • · · • · * • · · « · • · * • · ♦ • · 14 86079 täydennetty agarilla (3% paino/tilavuus) sekä CuSO^^H^O (0,2 mM). Maljoja inkuboitiin 4-6 vuorokautta 28°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen kuparille vastustuskykyiset pesäkkeet otettiin talteen ja siirrettiin NEP-alustalle, jota oli täydennetty agarilla (2¾) sekä CuSO^-T^O (0,2 mM). Plasmidin pEHBll sisältävät, transformoituneet NCYC240-pesäkkeet tunnistettiin sen perusteella, että ne kykenivät kasvamaan NEP-agarilla, joka käsitti 1 mM CuSC^^H^O· Tämän lisäksi nämä transformantit voitiin ilmaista kasvattamalla niitä M63-alus-talla, joka sisälsi qalaktoosia sekä kromogeenisen indikaattorin Xgal ( 5-brom.i-4-kloori-3-indolyyli-3-D-galaktosidi ) , käyttäen menetelmää, joka esitetään julkaisussa Fuarente (1983, teoksessa "Methods in Enzymology", Recombinant DNA, Voi. 107, toim. Wu, R ja Grossman, L., s. 181). β-galaktosidaasia tuottavat hiivapesäkkeet (jotka sisältävät plasmidin pEHBll) kehittävät sinivihreän värin, jota ei ilmaannu pesäkkeissä, joista pEHBll puuttuu. Täten yksinkertaisen maljakokeen avulla voidaan osoittaa, että plasmidilla pEHBll transformoitu panimohii-va kykenee tuottamaan entsymaattisesti aktiivista β-galaktosidaasia.
Hiivakanta NCYC240 (pEHBll) on tallennettu kantakokoelmaan National Collection of Yeast Cultures, Colney Lane, Norwich NR4 7AU, Brittein Saaret, joulukuun 12. päivänä 1984 tunnusnumerolla NCYC 1547.
: : 1 3-qalaktosidaasin tuotannon indusoiminen panimohiivassa ; Edellä mainitussa patenttihakemuksessa kuvattuja panimohiivan ..-.j kantoja NCYC240 (pEHBll) ja NCYC240 (pETl3:l) kasvatettiin . aerobisina viljelminä ravistelupulloissa (NEP-alusta, joka käsittää lisäksi 2% glukoosia ja 0,2 mM CuS0^17H20) 28°C:n lämpötilassa. Myöhäisen stationäärivaiheen solut otettiin talteen viljelyalustasta ja niistä määritettiin 3-galaktosidaasin ’·aktiivisuus menetelmällä, joka kuvataan teoksessa "Experiments * in Molecular Genetics" toim. Miller, J.H., Cold Spring Harbor .·. : Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1972.
· · • « · • · · • · is 86079
Solut pestiin 2 kertaa tislatulla vedellä ja suspendoitiin uudestaan Z-puskuriin (16,1 g/1 Na2HPC>4 7H20, 5,5 g/1 NaH2P04*H2°» 0,75 g/1 KC1, 0,246 g/1 MgSC>4*7H20, 2,7 ml/1 2-merkaptoetanoli) . Absorbanssi määritettiin aallonpituudella 600 nm, ja solut tehtiin läpäiseviksi lisäämällä 3 pisaraa kloroformia, 2 pisaraa 0,1¾ natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja sekoittamalla voimakkaasti 10 sekuntia. 1 millilitraan Z-puskurissa olevia, läpäiseviksi tehtyjä soluja lisättiin 0,2 ml 0-nitrofenoli-galakto-sidia (ONPG) (4 mg/ml fosfaattipuskurissa, pH 7) ja reaktio-seosta inkuboitiin 28°C:n lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä seokseen 0,5 ml 1 M Na2co2, solujätteet poistettiin ja absorbanssi määritettiin aallonpituudella 420 nm. β-galakto-sidaasiyksiköt laskettiin Miller'in esittämällä tavalla (1972).
Kokeet osoittivat, ettei NCYC240 (pETl3:1)-kannalla ollut lainkaan luontaista β-galaktosidaasin aktiivisuutta, kun taas NCYC240 (pEHBll) tuotti suurin piirtein 1,05 yksikköä β-galak-tosidaasia. Kun NCYC240 (pEHBll)-soluja suspendoitiin uudestaan 2 tilavuuteen 2% galaktoosiliuosta, ja niitä inkuboitiin 28°C:n lämpötilassa pitkähkön ajanjakson ajan, niin (<-gal aktosidaasin aktiivisuus indusoitui huomattavasti korkeammalle tasolle. Täten, viiden tunnin pituisen induktion jälkeen £5-galaktosidaasia saatiin 135 yksikköä, solujen lukumäärän kasvamatta lainkaan, kun taas 23 tunnin pituisen induktion jälkeen, solujen lukumäärän noustua kaksinkertaiseksi, β-galaktosidaasia saatiin 4154 . .·. yksikköä. Kun jompi kumpi kannoista NCYC240 tai NCYC240 (pETl3:l) käsiteltiin samalla tavalla, niin β-galaktosidaasia ei saatu ilmaistavissa olevia määriä.
β-galaktosidaasin tuotannon indusoiminen galaktoosin avulla panimohiivassa olutkäymisen jälkeen_
Plasmidi pEHBll transformoitiin edellä esitetysti lager-hiivan erääseen käytössä olevaan kantaan, ja kantoja BB10.1, BB10.1 (pEHBll) ja NCYC240 (pEHBll) kasvatettiin NEP-alustalla, joka sisälsi lisäksi 2¾ glukoosia ja 0,2 mM CuSC>4*7H20, 28°C:n lämpötilassa, hiivasolut otettiin talteen ja siirrostettiin ilmal-’· / la kyllästettyyn panimovierteeseen. Fermentoinnin annettiin « · · • · * % m · ie 86079 edetä anaerobisesti 12°C:n lämpötilassa niin kauan, ettei vierteen ominaispaino enää laskenut. Fermentointien etenemistä seurattiin tarkoin, ja näitä fermentointeja verrattiin suoraan saman vierteen niihin fermentointeihin, joissa käytettiin käsittelemättömiä, plasmidilla pEHBll transformoimattomia panimohii-voja NCYC240 ja BB10.1. Kaikissa tapauksissa geneettisesti muunnettu hiiva fermentoi vierteen samalla nopeudella ja samalla tavalla kantavierrettä heikentäen kuin käsittelemättömätkin hii-vakannat. BB10.1 (pEHBll)- ja NCYC240 (pEHBll)-solut otettiin talteen vastaavista oluista sentrifugoimalla, ja ne pestiin kahdesti vedellä, jonka jälkeen niistä määritettiin β-galaktosidaa-sin aktiivisuus. Kumpikaan kanta ei tuottanut yli 1,0 yksikköä β-galaktosidaasia tällä tavalla määritettynä. β-galaktosidaa-sia saatiin kuitenkin merkittäviä määriä, kun kannat suspendoi-tiin uudestaa 2% paino/tilavuus galaktoosiin. Optimaalisiksi olosuhteiksi 3-galaktosidaasin aktiivisuuden indusoimiseksi galak-toosilla todettiin: (i) 2-3% paino/tilavuus qalaktoosia, (ii) vähimmäissuola-alusta (1,7 g/1 hiivan typpiperustaa ilman aminohappoja ja ammoniumsulfaattia, 5 g/1 ammoniumsulfaattia, 2,5% paino/tilavuus kasaminohappoja), (iii) solutiheys 0,1-30%, mieluiten 10% paino/tilavuus (märkä hiivakasauma/induktioalusta) (iv) molekulaarisen hapen läsnäolo. Kun näitä olosuhteita käytettiin rutiinituotannossa, niin kannoilla NCYC240 (pEHBll) ja BB10.1 (pEHBll) saatiin 2000-1200 yksikköä β-galaktosidaasia, kun kantoja pidettiin 24 tuntia induktioalustassa.
: Kantaa NCYC240 (pEHBll) arvioitiin edelleen oluen valmistukses- : : : sa vallitsevissa oloissa. Tässä tapauksessa hiivalla fermen- ·;··; toitiin kokonaan maltaista valmistettu ale-vierre viiden bar- . rel'in (5 x 163,7 litraa) koepanimossa. Tuotettu olut jatkokä- siteltiin, viimeisteltiin ja täytettiin pulloihin, jonka jälkeen sitä verrattiin käsittelemättömällä hiivalla NCYC240 fermentoi-. . tuun vertailuolueen, joka oli muuten tuotettu identtisissä olo- * suhteisa. Kvalitatiivisella organoleptisellä analyysillä ei • » » *·1 ' todettu mitään merkittävää eroa näiden kahden tuotteen välillä.
Näin ollen on ilmeistä, että panimohiivaa voidaan muuttaa menes-tyksekkäällä tavalla geneettisesti siten, että tällaiset hiivat \ kykenevät tuottamaan merkittäviä määriä heterologista proteii- li · · » ♦ 1 • « i7 86079 nia fermentointivaiheen jälkeen toteuttavan induktion seurauksena, tämän geneettisen muuntamisen kuitenkaan vaikuttamatta haitallisesti hiivan kykyyn tuottaa pääasiallista tuotetta, eli olutta.
Esimerkki II
Ihmisseerumin albumiiniproteiinin tuottaminen panimohiivassa Ihmisseerumin albumiinin (HSA) cDNA-ketjun kloonaaminen toteutettiin spesifistä oligonukleotidiprimeeriä käyttäen (katso julkaisut Baralle, F.E., 1977, Cell, j^O, 549-558; Noyes, B.E. , etal. 1979, Proceedings of the National Academy of Science, USA, 76^ 1770-1774; Hydson, P. etal, 1981, Nature, 291, 127-131). Valikoimalla edullinen alue HSA-proteiinin tunnetusta aminohappoketjusta (Dayhoff, M.O., 1976, Atlas of Protein Sequences and Structures Nat. Biomed. Res. Foundation Washington) geneettisestä koodista voitiin ennustaa kahdeksan 14 pituista oligonukleotidiä, joista yhden tulisi täydentää täsmällisesti HSA:n lähetti-RNA-molekyyliä (mRNA) (katso liitteenä olevien piirustusten kuva 2). Oligonukleotidit syntetoitiin samanaikaisesti menetelmällä, joka esitetään julkaisussa Wallace, R.B., 1981, Nucleic Acids Research, 9_, 879-894), käyttäen kiinteän faasin fosfotriesterimenetelmää, jonka kehittivät tutkijat Gait, M.K., et ai., (1980, Nucleic Acids Research, 8, 1081-1096). Tätä synteettisten oligonukleotidien seosta käytettiin primeerinä cDNA-synteesissä, käyttäen ihmisen maksan : RNA:ta mallina (katso Baralle, F.E., 1977, Cell, 1_2^ 1085- 1095). Syntetoitu cDNA jaettiin fraktioihin denaturoivalla gee-. .·. Iillä, ja asianmukaisen kokoinen vyöhyke eluoitiin. Tämän ____: jälkeen tämä yksijuosteinen cDNA muunnettiin kaksijuosteiseksi takaisinsilmukointireaktiolla, käyttäen Klenow DNA-polymeraasia *** (katso Wickens, M.P., et ai, 1978, Journal of Biological **’·1 Chemistry, 253, 2483-2495). Tuloksena oleva kaksi juosteinen cDNA pilkottiin entsyymillä TaqT ja ligatoitiin Ml3mp9-*.2: vektoriin, jota oli käsitelty Accl-restriktioendonukleaasilla · ja alkalisella fosfataasilla, ja ligaatioseos transformoitiin ; E. coli-kantaan JM101 (Messing, J. ja Vieira, J. , 1981, I./ Analects, 9. (8), 1). DNA-ketjun analysointi (suoritettiin • · 1 • ♦ · • · · • · 1 · · 2 • · · 10 86079 menetelmällä, jok?» esitetään julkaisussa Sanqer, F. et ai, 19ΘΟ, Journal of Molecular Bioloqy, 143, 161-178) tämän yhdistelmäplasmidin näytteestä mahdollisesti kahden kloonin tunnistamisen, joista klooneista käytetään ohessa lyhenteitä M13ALB1 ja M13ALB7 (kuva 3). Nämä kloonit käsittivät HSA cDNA-molekyylin DNA-ketjun nukleotidien 144-692 (M13ALB1) ja 692-955 (M13AL.B2) välissä (kuva 3).
§ cDNA-kir jasto muodostettiin syn tet oimal la cDNA käyttäen mallina - koko maksan niRNA: t ;i ja käyttäen primeerinä oiiqotymiIni-dTl2-18-ketjua. cDNArt muutettiin kaksijuosteisiksi edellä esitetysti ja yksijuosteineri hiusneulamainen silmukkarakenne pilkottiin Sl-nukleaasi11a (Efstra tiadis, Λ. et ai, 1.976, Cell, 1_, 279-288). Tuotteet puhdistettiin Sephacryl S 300-kolonni ll.a ja mahdolliset cDNA-ketjun ylimenevät 5'-päät täytettiin DNA-polymeraasin I Klenow-fraqmentilla. Tässä vaiheessa cDNA-molekyylien päät olivat pääasiallisesti epäreaktiivisia ("blunt”), joten ne ^ ligatoitiin plasmidin dAT153PvuJI8 PvuII-kohtaan (plasmidia oli ϊ edeltä käsin käsitelty alkalisella fosfataasilla, millä estettiin sen muuttuminen renkaaksi) (Anson, D. et ai. The F.MB0 Journal _3, 1984 sivut 1053-1064) ja transformoitiin E. coli-kantaan MC1061 (Casadaban, M.T., & Cohen, SN., 1980 Journal of Molecular Biology, 138, 179-207) tai johonkin muuhun sopivaan kantaan.
10 mikrogrammasta mRNA:ta saatiin tuotetuksi suurin piirtein . 10 000 yhdistelmäpesäket tä. Näissä pesäkkeissä oleva cDNA
seulottiin HSA DNA-ketjujen suhteen radioaktiivisilla koettimilla, jotka oli saatu klooneista M13ALB1 ja M13ALB2 avoimen fosfodiesterisillan luennalla (Rigby, P.W.J. et ai, 1977, . Journal of Molecular Biology, 113, 237-251). E. coli-kannan « · · ' *·*· MC1061 pesäkkeitä, joiden käsittämällä yhdistelmä-cDNA-kloo- I * · ’·*·* neilla oli DNA-ketjuun liittyvää homologisuutta HSA-geenin kanssa, eristettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa : J/·· Baralle, F.E. et ai (1980, Nucleic Acids Research 8, 4393-4404). j : Täysipituisten cDNA-kloonien tunnusomaiset piirteet selvitet- } ; tiin analysoimalla DNA-ketjun järjestys (Maxam, A.M. ja ^
Gilbert, W. , 1980 Methods in Enzymology, 6jS, 499-560; Sanger T F. et ai, 1980 Journal of Molecular Biology, 1.43, 161-178), : ja niiden todettiin sisältävän koko HSA cDNA-geeni (kuva 3).
Il 19 86079
Ei-koodaava 5'-alue ja täysipituisen HSA cDNA:n signaalipepti-diketju irrotettiin kuvassa 4 esitetyllä tavalla plasmidin pAT135ALB tuottamiseksi.
ΜΕΤ-HSA cDNA-molekyylin muodostaminen ΜΕΤ-HSA cDNA-molekyylin muodostamiseksi käytettiin yleisesti ottaen tunnettuja tekniikoita, jotka esitetään yhteenvedon omaisesti kuvassa 5. 1843 emäsparin pituinen BamHI-kappale plasmidista pAT153ALB eristettiin ja tehtiin tasapäiseksi käsittelemällä SI-nukleaasilla (Maniatis et ai, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA), ja liitettiin plasmidin Xbal-kohtaan M13mpl9 (Messing, 1983,
Methods in Enzymology, Recombinant, loi, 20-78), joka viimeksi mainittu plasmidi oli samoin tehty tasapäiseksi käsittelemällä sitä SI nukleaasilla. E. coli-kannan JMlO.l transfektoimisen jälkeen valmistettiin lysaatteja lukuisista faagitäplistä, ja yksijuosteista (SS) DNA:ta eristettiin loppuunkehittyneistä bakteriofaagipartikkeleista. Sen jälkeen, kun DNA-ketjun järjestys oli analysoitu (Sanger, 1977 et ai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 7£, 5463), yhdistelmä Ml3mpl9.7 tunnistettiin. Kaksijuos-teinen (RF) DNA preparoitiin ja katkaistiin juuri muodostetusta ainoasta Xhol-kohdasta käsittelemällä tällä restriktioendonukleaa-silla, mitä seurasi Sl-nukleaasilla pilkkominen yksijuosteisten 5'-jatkeiden poistamiseksi.
• *. · Näillä manipuloinneilla loppuunkehittyneeseen, luonnolliseen po- **:*: lypeptidiketjuun liittyvä ensimmäinen kodoni (GAT) saatiin pal- • :*; jastetuksi. Tämän jälkeen synteettinen oiigonukleotidi, jonka ____: 5'-päät olivat fosforyloimattomat, istutettiin muunnettuun „ .·. Xhol-kohtaan. Kuten aikaisemminkin, yhdistelmät analysoitiin suoraan määrittämällä DNA-molekyylin järjestys, mitä seurasi transfektoiminen ja SS DNA:n eristäminen. Järjestys yhden tällaisen yhdistelmän Mpl9.7 met/9 asianmukaisissa osissa ** *· esitetään kuvassa 5. Tämä poikkeaa odotetusta ketjusta, joka *.· * esitetään samoin kuvassa 5; tämä poikkeama johtuu mitä toden-‘ näköisimmin sekundäärisen rakenteen muodostumisesta BamHI- .*··. kaksoiskohdan ympärille, sekä juosteiden välisen osittaisen • · * · * « • · a • · · • · Φ « « • · · 2o 86079 kahdentuman sitoutumattomien alueiden myöhemmästä irtoamisesta. Nämä poikkeamat ovat vailla seurauksia, sillä kytkijän istuttamisen ainoana tarkoituksena oli käynnistyskodonin (ATG) ja BamHI-kohdan isuttaminen välittömästi ylävirran puolelle HSA:ta koodaavasta ketjusta, mikä myös saavutettiin. Käsittelyn helpottamiseksi toinen BamHI-kohta istutettiin 3'-asemaan Met-HSA:ta koodaavasta ketjusta yhdistelmässä M13mpl9.7 met/9. Tämän jälkeen viimeksi mainitun molekyylin RF DNA katkaistiin ainoasta Sali-kohdasta, jonka alkupiste on plasmidin M13mpl9 kloonaa-vassa kytkijässä, ja näin saatu kappale tehtiin tasapäiseksi käsittelemällä sitä E. coli-bakteerin DNA-polymeraasilla I (suuri kappale tai "Klenow-kappale" (Maniatis et ai, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA)). Edellä käytetty sama kytkijä istutettiin tähän muunnettuun kohtaan.
RF DNA:n eristämisen ja BamHI-entsyymillä pilkkomisen jälkeen sopiva yhdistelmäklooni tunnistettiin ja tästä käytettiin nimitystä M13mpl9.7 met/9.1. Täysipituisen MET-HSA cDNA-geenin käsittävä ainoa BamHI-kappale kloonattiin tämän jälkeen E.
I.
coli-vektorin pBR322 ainoaan BamHI-kohtaan (Bolivar et ai, 1977,
Gene, 2_, 95-113), jolloin saatiin plasmidi pEK113 (kuva 6).
Plasmidi pEK113 transformoitiin E. coli-kantaan MC1061 (Casadaban & Cohen, 1980, Journal of Molecular Biology, 138, 179-207), joka tallennettiin kantakokoelmaan "National Collection of Industrial Bacteria (NCIB)", Torry Research Station, PO Box 31, 135, Abbey Road, Aberdeen, Scotland, AB9 8DG, huhti-kuun 3. päivänä 1986, ja sen tunnusnumerona on NCIB 12242.
: : : HSA:n kaltaisen proteiinin indusoituva ilmentyminen panimo- -: : hiivassa______ . Jotta HSA:n kaltaista proteiinia saataisiin tuotetuksi panimo- hiivassa geenin indusoituvan ilmentämisjärjestelmän avulla, MET-HSA cDNArta koodaava ketju oli sulautettava yhteen asian- . . mukaisen ilmentämissignaalin kanssa. GALlo-CYCl-hybridipro-• · * moottoria, joka säätelee E. coli-bakteerin IacZ-geenin ilmenty-mistä galaktoosin indusoimana (β-galaktosidaasin tuotanto), voidaan käyttää yleisesti järjestelmänä, joka välittää panimo-hiivassa heterologisten geenien ilmentymisen galaktoosin » · · » I · » * · • · · ♦ * · • f« • * 21 86079 indusoimana. Tämän tosiseikan hyväksikäyttämiseksi MET-HSA cDNA sulautetaan plasmidissa pEHBll läsnäolevaan GALlO-CYCl-promoottoriin. Plasmidi pEHBll pilkotaan restriktioendonukleaa-silla BamHI, ja BamHI-kappale, joka käsittää MET-HSA cDNA:n plasmidista pEK113, istutetaan. Istutuksen suuntautuminen määritetään selvittämällä restriktioendonukleaasien avulla muodostettujen yhdistelmäplasmidien tunnusomaiset piirteet, ja erottamalla täten muodostuneet kappaleet elektroforeetti-sesti agaroosigeelillä. Tämän jälkeen eristetään yhdistelmä-plasmidi, jossa 5' MET-HSA cDNA on sulautunut yhteen 3' GALIO-CYCl-hybridipromoottorin kanssa siten, että DNA-ketjun analyysin mukaan (Maxam, A.M. ja Gilbert, W., 1980, Methods in Enzymology, £5, 499-560) DNA-ketju fuusion liitoskohdassa on 5' ... TTAATA ATG ACC GGA TCC ATG GAT ... 3’ (katso kuva 7).
Tästä plasmidista käytetään nimitystä pEHBll-MET-HSA, ja se voidaan viedä panimohiivan kantoihin NCYC240 ja BB10.1 transformaatiolla, ja valikointi toteutetaan kuparin vastustuskyvyn perusteella, kuten edellä esitetään. Plasmidilla pEHBll-MET-HSA transformoitujen panimohiivan kantojen odotetaan tuottavan sopivissa olosuhteissa HSA:n kaltaista proteiinia, joka käsittää viisi ylimääräistä aminohappoa ennen lopullisen HSA-proteiinin ensimmäistä N-päätteen aminohappoa (N-metioniini, treoniini, glysiini, seriini, metioniini-HSA-C).
Plasmidin pEHBll-MET-HSA sisältäviä kantoja NCYC240 ja BB10.1 ·.·.1 voidaan kasvattaa stationäärivaiheeseen saakka NEP-glukoosialus-*t- - tässä, johon on lisätty täydennykseksi 0,2 mM CuS0^.7H20. Tämän : : : jälkeen solut otetaan talteen sentrifugoimalla ja pestään vedessä ennen niiden suspendoimista uudestaan 24 tunniksi . .1. optimaalisissa olosuhteissa geenin ilmentymisen indusoimiseksi galaktoosin avulla, kuten edellä esitetään. Indusoidusta • · · (galaktoosia sisältävästä) ja indusoimattomasta (galaktoosia . . sisältämättömästä) viljelmästä valmistetaan soluvapaat raaka-• 1 1
** ]1 uutteet rikkomalla solut Braun-homogenisaattorissa käyttäen ’·' liuosta, joka käsittää 0,1 M natriumfosfaattia pH 7,5, 1 mM
fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 5 mM 2-merkaptoetanolia.
• « .··1. Lasihelmet ja solu jätteet poistetaan sentrifugoimalla (2 mi-• · » • • · Ψ * t # • · · ψ ♦ 1 1 • «· • · 22 86079 nuuttia nopeudella 2000 x g) ja supernatantti kirkastetaan sent-rifugoimalla uudestaan (10 minuuttia nopeudella 8000 x g). Tuloksena olevista solu-uutteista määritetään ihmisseerumin albu-miiniproteiinin läsnäolo elektroforeettisesti SDS:polyakryyli-amidigeelillä, mitä seurasi Western'in täplitysmenetelmä (katso Mellor J. et ai, 1985, Gene, 3_3> s· 215). Tämän määrityksen tulokset osoittavat, että ne viljelmät, jotka oli indusoitu galaktoosin läsnäollessa, sisälsivät huomattavia määriä solun sisällä sijaitsevaa, ihmisseerumin albumiinin kaltaista proteiinia, kun taas indusoimattomat viljelmät eivät sisällä tätä proteiinia .
Samanlaiseen galaktoosilla indusoitumiseen ihmisseerumin albumiinin kaltaisen proteiinin tuotannossa voidaan päästä sekä kannalla NCYC240 (pEHBll-MET-HSA) että kannalla BB10.1 (pEHBll-MET-HSA), jotka on otettu talteen olutkäymisestä, missä hiiva-kantaa on käytetty ensin panimovierteen fermentoimiseen käymiseen sopivissa anaerobisissa olosuhteissa. Olutkäymisen lopussa talteenotettu hiiva ei sisällä ilmaistavia määriä ihmisseerumin albumiinin kaltaista proteiinia, kun taas galaktoosilla toteutetun, 24 tuntia kestäneen induktion jälkeen hiivasta voidaan todeta merkittäviä määriä proteiinia. Lisäksi huomautettakoon, että edellä kuvatulla tavalla geneettisesti muunnetut hiivat kykenevät fermentoimaan panimovierrettä samalla nopeudella ja kantavierrettä samalla tavalla heikentäen kuin muunta-. .*. mattomat emähiivatkin; täten tuotettuja oluita ei voida erottaa vertailuoluista organoleptisellä analyysillä.
MET-HSA:n indusoituva ilmentyminen panimohiivassa GAL10-CYCl-HSA-fuusioplasmidin pEHBll-MET-HSA voidaan osoittaa *···" tuottavan HSA:n kaltaista proteiinia panimohiivassa, kun se *.*.· fermentoinnin jälkeen indusoidaan galaktoosia sisältävässä induktioalustassa. Tämä proteiini kuvataan HSA:n kaltaiseksi, :sillä se sisältää viisi ylimääräistä aminohappoa N-päätteessä, ;
*..· . S
kuten edellä mainitaan. Jotta "todellisempaa" HSA-proteiinia j • t . saataisiin tuotetuksi, on välttämätöntä muodostaa GAL10-CYC1-• · · hybridipromoottorin kopioituva fuusio MET-HSA cDNA:n kanssa, • » ’·"* jossa luentaan liittyvä 5’ ATG-kodoni (metioniini) liittyy - • · · • · · • · · j • · • · · « · · • · li 23 86079 MET-HSA cDNA:n mukana. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää julkisesti saatavilla olevan plasmidin G2 sisältämää ATG GAL10-CYC1-promoottoria (Ouarenle, 1903, Methods in Enzymo-logy, Recombinant DNA, 101, 181-191). Plasmidi G2 pilkotaan restriktioendonukleaasilla BamHl ja liqatoidaan noin 1,8 kilo-emäsparin suuruiseen MET-HSA cDNA Bamli 1-kappaleeseen plasmi-dista pEK113. Tämän istutuksen suuntautuminen varmistetaan restriktioendonukleaasei.lla pilkkomalla, mistä nähdään, että 5' MET-HSA cDNA on sulautunut yhteen 3' GAL10-CYC1 ATG -promoottorin kanssa. Tätä plasmidin nimitetään G2 MET-IISA:ksi (katso kuva 8). l1 Lasin i.di G2 MET-II.SA käsittää υΝΛ-repi ikaa t ion liittyvän plasmidialkupisteen E. coli-bakteerista, β-laktamaasi-geenin, joka saa aikaan ampisilliinin vastustuskyvyn E. coli-bakteerissa, hiivan DNA-replikaation 2/iim alkupisteen, hiivan URA-3-geenin (joka helpottaa laboratoriohiivan ura-3-auksotroo-fien valikointia täydentämällä) sekä GAL10-CYCl-MET-HSA-fuusio-kasetin. MET-HSA-geenin kopioitumisen oletetaan johtavan lä-hetti-RNA:n synteesiin, joka mRNA käynnistää luennan lähetissä olevan ensimmäisen ATG:n kohdalta, ja tämä ATG on saatu MET-HSA-geenin mukana.
Jotta MET-HSA-geenin ilmentymistä panimohiivassa, ja näin ollen "todellista" ihmisseerumin albumiinia vastaavan yhdistelmäpro-teiinin tuotantoa voitaisiin säätää, GALl0-CYC1-MET-HSA-ilmen-. tymisyksikkö on sulautettava yhteen CUP-l-geenin kanssa. Tämä VS.' toteutetaan pilkkomalla plasmidi G2-MET-HSA restriktioendonukleaasilla Hindlll, joka pilkkoo ylävirran puolelta (5') URA-3- » « · **\ geenin suhteen ja alavirran puolelta (3') MET-HSA:ta koodaavan ketjun suhteen (katso kuva 8), ja tämä kappale alikloonataan ·.:.1 plasmidin pET13:l Hindlll-kohtaan, jolloin saadaan plasmidi pETl3 :1-MET-HSA (kuva 8).
Tämän jälkeen plasmidi pETl3:1-MET-HSA transformoidaan panimo- • · hiivan kantoihin NCYC240 ja BB10.1 edellä kuvatuilla menetel-millä. Plasmidin pET13 :1-MET-HSA sisältävät panimohiivakannat kasvatetaan stationäärivaiheeseen saakka NEP-glukoosialustalla, - - johon on lisätty täydennykseksi 0,2 mM CuS0417H20. Solut ote- 24 86079 taan talteen ja niitä jatkokäsitellään ennen geenin ilmentymisen indusoimista galaktoosilla, kuten edellä esitetään. Hiivoista valmistettiin solu-uutteet, ja niistä määritettiin ihmisseerumin albumiiniproteiinin läsnäolo aikaisemmin esitetyllä tavalla. Kaikissa tapauksissa muodosteen GAL10-CYC1-MET-HSA (pET13:1-MET-HSA) sisältävät panimohiivakannat tuottivat merkittäviä määriä ihmisseerumin albumiiniproteiinia.
Kun näitä samoja kantoja kasvatetaan panimovierteessä anaerobisissa olosuhteissa, jonka jälkeen geenin ilmentyminen indusoidaan ja HSA:n läsnäolo määritetään, kuten edellä on esitetty, niin hiivoissa voidaan todeta huomattavia määriä ihmisseerumin albumiinia. Olutkäymisen päätyttyä talteenotettu hiiva ei sisällä ilmaistavissa olevia määriä ihmisseerumin albumiiniproteiinia ennen galaktoosilla indusoimista.
• · • · • · · • · · • · • · · • · · * · · ·»· 1
II
· • · » • · · • »

Claims (11)

  1. 25 8 6 079
  2. 1. Menetelmä etanolin ja hiivalle heterologisen proteiinin tai peptidin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että hiilihydraatteja sisältävää vesipitoista alustaa fermentoidaan hiivakannalla, joka on muunnettu geneettisesti siten, että se kykenee ilmentämään heterologista proteiinia tai peptidiä olosuhteissa, joissa hiiva lisääntyy, mutta mainitun heterologisen proteiinin tai peptidin ilmentymistä ei esiinny, täten syntynyt etanoli otetaan talteen, minkä jälkeen mainitun proteiinin tai peptidin ilmentyminen hiivassa indusoidaan, ja mainittua heterologista proteiinia tai peptidiä saadaan tästä hiivasta, ja että mainittu hiivakanta on Saccharomyces cerevisiae- tai S. carlsbergensis -hiivan teollista kantaa geneettisesti muuntamalla aikaansaatu kanta.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hiiva sisältää plasmidin, jossa on GALlO-CyCl-hybridipromoottori, ja että mainitun proteiinin tai peptidin ilmentyminen indusoidaan saattamalla mainittu lisääntynyt hiiva kosketuksiin galaktoosin kanssa. :_· 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- : : : tu siitä, että mainittu proteiini on ihmisseerumin albumii- ·;··· nia tai ihmisseerumin albumiinin kaltaista proteiinia.
  4. 4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli otetaan talteen vettä sisältävänä juotavana nesteenä, joka on olennaisesti hiivaa sisältämätöntä, ja joka sisältää olennaisesti kaiken veden ja etanolin mainitusta käyneestä alustasta.
  5. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että etanoli otetaan talteen mainitusta käyneestä alustasta etanolitisleenä.
  6. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu 26 86079 siitä, että hiilihydraatteja sisältävä vesipitoinen alusta sisältää maltoosia pääasiallisena sokerinaan.
  7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiilihydraatteja sisältävä vesipitoinen alusta on ohramaltaisiin perustuvaa olutvierrettä.
  8. 8. Jonkin patenttivaatimuksen 4, 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi toteutetaan 8-25°C:n lämpötilassa.
  9. 9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiilihydraatteja sisältävä vesipitoinen alusta on käymisalusta juotavaksi tarkoitetun tislatun etanolin tai polttoaine-etanolin tuottamista varten.
  10. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu alusta perustuu viljaan, perunoihin, kassavaan, sokeriruokoon, sokerijuurikkaaseen tai lignosel-luloosan kaltaiseen materiaaliin, jota on valinnaisesti esikäsitelty materiaalissa olevan selluloosan ja/tai tärkkelyksen muuntamiseksi käymiskykyisiksi sokereiksi.
  11. 11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu fermentointiprosessi on olennaisesti anaerobinen fermentointiprosessi. 86079
FI861696A 1985-04-22 1986-04-22 Foerfarande foer producering av etanol och ett protein eller en peptid, som aer heterolog till jaest. FI86079C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8510219 1985-04-22
GB858510219A GB8510219D0 (en) 1985-04-22 1985-04-22 Isolation of fermentation products

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI861696A0 FI861696A0 (fi) 1986-04-22
FI861696A FI861696A (fi) 1986-10-23
FI86079B FI86079B (fi) 1992-03-31
FI86079C true FI86079C (fi) 1992-07-10

Family

ID=10578009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI861696A FI86079C (fi) 1985-04-22 1986-04-22 Foerfarande foer producering av etanol och ett protein eller en peptid, som aer heterolog till jaest.

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0201239B1 (fi)
JP (1) JPS61282097A (fi)
AT (1) ATE47426T1 (fi)
AU (1) AU585006B2 (fi)
DE (1) DE3666459D1 (fi)
DK (1) DK184486A (fi)
ES (1) ES8706828A1 (fi)
FI (1) FI86079C (fi)
GB (2) GB8510219D0 (fi)
SG (1) SG87291G (fi)
ZA (1) ZA863005B (fi)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2677350B2 (ja) * 1985-08-02 1997-11-17 メルク エンド カムパニ− インコ−ポレ−テツド 発現蛋白の発酵収率増大
JPS62215393A (ja) * 1986-01-13 1987-09-22 ジエネツクス・コ−ポレ−シヨン バチルス中でのヒト血清アルブミンの製造
GB8613388D0 (en) * 1986-06-03 1986-07-09 Delta Biotechnology Ltd Induction of galactose regulated gene expression in yeast
GB8615701D0 (en) * 1986-06-27 1986-08-06 Delta Biotechnology Ltd Stable gene integration vector
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
IE63424B1 (en) * 1987-04-09 1995-04-19 Delta Biotechnology Ltd Yeast vector
GB8725529D0 (en) * 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
JPH01215289A (ja) * 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5260202A (en) * 1988-09-07 1993-11-09 Delta Biotechnology Limited Fermentation method
GB8905674D0 (en) * 1989-03-13 1989-04-26 Imperial College Dna construct and modified yeast
US5766883A (en) * 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
GB9107628D0 (en) 1991-04-10 1991-05-29 Moonbrook Limited Preparation of diagnostic agents
US5993805A (en) * 1991-04-10 1999-11-30 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Spray-dried microparticles and their use as therapeutic vehicles
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003066824A2 (en) 2002-02-07 2003-08-14 Aventis Behring Gmbh Albumin-fused kunitz domain peptides
EP1799713B1 (en) 2004-09-23 2014-11-05 VasGene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
EP2054437A2 (en) 2006-08-07 2009-05-06 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
JP2010515441A (ja) 2007-01-15 2010-05-13 アップフロント・クロマトグラフィ・アクティーゼルスカブ 原材料からのバイオ燃料およびタンパク質の製造
EP1964923A1 (en) 2007-02-27 2008-09-03 Alain André Guy Vertès Multiplex fermentation process
DE102008008150A1 (de) * 2008-02-08 2009-08-13 Krones Ag Verfahren zur Ethanolgewinnung in einer Bierbrauanlage
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
CA2878640C (en) 2012-07-13 2023-10-24 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0079739A3 (en) * 1981-11-12 1984-08-08 The Upjohn Company Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein
GB8334261D0 (en) * 1983-12-22 1984-02-01 Bass Plc Fermentation processes

Also Published As

Publication number Publication date
GB8609776D0 (en) 1986-05-29
DK184486A (da) 1986-10-23
FI861696A0 (fi) 1986-04-22
ES8706828A1 (es) 1987-07-01
GB2175590B (en) 1988-11-09
FI861696A (fi) 1986-10-23
GB8510219D0 (en) 1985-05-30
DE3666459D1 (en) 1989-11-23
FI86079B (fi) 1992-03-31
EP0201239B1 (en) 1989-10-18
SG87291G (en) 1992-02-14
JPS61282097A (ja) 1986-12-12
AU585006B2 (en) 1989-06-08
ATE47426T1 (de) 1989-11-15
DK184486D0 (da) 1986-04-22
EP0201239A1 (en) 1986-11-12
ES554234A0 (es) 1987-07-01
AU5644886A (en) 1987-11-05
GB2175590A (en) 1986-12-03
ZA863005B (en) 1986-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86079C (fi) Foerfarande foer producering av etanol och ett protein eller en peptid, som aer heterolog till jaest.
Williams et al. Cloning the gene for the malolactic fermentation of wine from Lactobacillus delbrueckii in Escherichia coli and yeasts
AU604484B2 (en) Induction of galactose regulated gene expression in yeast
FI117388B (fi) Valintamerkkigeenittömät hiivakannat, menetelmä niiden valmistamiseksi ja näiden kantojen käyttö
Govender et al. FLO gene-dependent phenotypes in industrial wine yeast strains
KR20180037237A (ko) 프로모터 변이체
Filho et al. Stable Yeast Transformants that Secrete Functional α–Amylase Encoded by Cloned Mouse Pancreatic cDNA
Passoth et al. Analysis of the hypoxia‐induced ADH2 promoter of the respiratory yeast Pichia stipitis reveals a new mechanism for sensing of oxygen limitation in yeast
FI92601C (fi) Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista
Casey Yeast selection in brewing
Magarifuchi et al. Effect of yeast fumarase gene (FUM1) disruption on production of malic, fumaric and succinic acids in sake mash
EP0147198B1 (en) Fermentation processes and their products
JPS63133984A (ja) 組換えｄｎａ技術によって構築されるデンプン分解酵素産生微生物及びその発酵法用途
Morimura et al. Genetic Engineering of white Shochu‐Koji to achieve Higher Levels of Acid‐Stable α‐Amylase and Glucoamylase and other Properties when used for Shochu Making on a Laboratory Scale
JPH07222591A (ja) 発現系、組込みベクター及びその組込みベクターで形質転換された細胞
JPH08501695A (ja) 組換え真核細胞による分泌タンパク質の増大された産生
CN115141763A (zh) 一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用
JP2002531121A (ja) Ｎ末端伸長を有するグルコアミラーゼ
FI89724B (fi) Foerfarande foer framstaellning av -galaktosidas producerande jaeststammar, -galaktosidas producerande jaeststam och industriella utnyttjingsmetoder av saodana jaeststammar
US6190883B1 (en) Method for the production of heterologous polypeptides in transformed yeast cells
JP3541949B2 (ja) メチロトローフ酵母におけるグリコレートオキシダーゼの製造
FI84624B (fi) Foerfarande foer framstaellning av etanol och ett protein eller en peptid.
JP2001509392A (ja) 組換え酵母細胞による分泌タンパク質の産生増加
FI100473B (fi) Sokerien nopeutetun käymisen aikaansaavat uudet hiivakannat, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö
Barker et al. A yeast-based biosensor for environmental monitoring

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: DELTA BIOTECHNOLGY LIMITED