FI84519B - Foerfarande foer foerhoejning av kvantutbytet dao luminol oxideras med peroxid i naervaro av peroxidas och i foerfarandet anvaent reagens. - Google Patents
Foerfarande foer foerhoejning av kvantutbytet dao luminol oxideras med peroxid i naervaro av peroxidas och i foerfarandet anvaent reagens. Download PDFInfo
- Publication number
- FI84519B FI84519B FI865166A FI865166A FI84519B FI 84519 B FI84519 B FI 84519B FI 865166 A FI865166 A FI 865166A FI 865166 A FI865166 A FI 865166A FI 84519 B FI84519 B FI 84519B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- luminol
- pod
- fluorescein
- dicarboxylic acid
- hydrogen peroxide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Description
1 84519
Menetelmä kvanttisaannon nostamiseksi hapetettaessa lumi-nolia peroksidilla peroksidaasin läsnäollessa sekä menetelmässä käytettävä reagenssi
Keksintö koskee menetelmää kvanttisaannon nostamiseksi hapettamalla peroksiyhdisteillä peroksidaasin (POD) läsnäollessa luminolia tai 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarb-oksyylihappohydratsidia, jossa kukin alkyyliryhmä sisältää 1-3 hiiliatomia.
Kemiluminesenssireaktio on tapahtuma, jossa fluoresointiky-kyinen molekyyli saatetaan kemiallisella reaktiolla kiihdytettyyn elektronitilaan, jolloin se luovuttaa energian näkyvänä valona. Bioluminesenssireaktiot ovat entsyymien katalysoimia kemiluminesenssireaktioita, joissa happi toimii elektronin akseptorina. Kvanttisaannot (kemiluminesenssi-valokvantin suhde muutettuun molekyyliin) ovat tosin vain noin 1 % (vrt. K.D. Gundermann, Angew. Chemie 77 (1965) 572 - 580, Chemiker-Zeitung 99 (1975) no 6, 279 - 285).
Peroksidaasin (POD) katalysoimaa luminolin (3-amino-ftaali-happohydratsidi) tai peroksidien katalysoimaa luminolijoh-dannaisten reaktiota käytetään indikaatioreaktiona immuuni-kokeissa (immuno-assays), jolloin joko POD tai luminoli voi toimia merkitsijänä. Peroksidaasi (POD; Donor: H202~ok-sidoreduktaasi, EC 1.11.1.7) merkitsee sellaista entsyymien ryhmää, jotka katalysoivat suurten orgaanisten yhdistemää-rien hapettumista.
POD-määrityksellä on merkitystä ennen kaikkea eteenkytketty-jen reaktioiden yhteydessä, joissa muodostuu H202:a, esimerkiksi verensokerin määrityksessä sekä entsyymi-immunologisissa määritysmenetelmissä, jotka vaativat POD:n käyttämistä merkkausentsyyminä. Muita analyysimenetelmiä, joissa POD-määrityksellä on merkitystä, ovat esimerkiksi galaktoosi-, vetyperoksidi-, katalaasi- tai oksidaasimääritykset. On tun- 2 84519 nettua mitata POD H^O^rn tai vedynluovuttajan vähenemisestä tai hapettuneiden yhdisteiden syntymisestä. Erikoista merkitystä on sen yhteydessä saavuttanut jälkimmäinen menetelmä, jolloin olennaisina aineosina käytetään esimerkiksi di-o-ani si di i ni a , guajakolia tai ABTSra (2,2'-atsinodi^-etyyli-bentstiatsoliini-(6)-sulfonihapp<i7).
Nämä tunnetut menetelmät ovat tosin luotettavia, mutta on kuitenkin olemassa suuremman herkkyyden omaavien menetelmien tarve lyhennettäessä POD-määritystä entsyymi - immuuni testi n puitteissa. POD esittää suurta osaa esimerkiksi ELISA-pe-riaatteen mukaisessa niin sanotussa "Enzym-Immuno-Assay s" (entsyymisidosteinen immuunisorboiva aine) merkkausentsyym-n i n ä.
Lukuisten tähän menetelmään perustuvien kaupan olevien koes-tusreagenssien todellisen POD-määrityksen kesto, perusaineena esim. ABTS, joka on noin 60 minuuttia, on äärimmäisen epätyydyttävä .
Tämän ongelman ratkaisemiseksi ryhdyttiin kokeilemaan lumino-1in peroksidaasin katalysoiman reaktion herkistämistä perok-sidiyhdisteiden kanssa kohottamalla kvantti saantoa .
Julkaisusta DE-AS 29 06 732 tunnetaan menetelmä peroksidaa-sien aktiivisuusmäärityksestä erään kerni 1uminesenssireakti on avulla, joka antaa hyvän kvantti saannon ja mahdollistaa siten entsyymi-immuunikokeen rajoissa nostaa POD-määrityksen herkkyyttä ja vähentää määrityksen kestoaikaa huomattavasti.
Kemi 1uminesenssireaktion perustana on luminolin reaktio jonkin peroksidiyhdisteen kanssa, mutta se korvataan luminolin asemesta 7-di metyyliamino-naftaleeni-1,2-di karboksyy1i happo-hydratsidi 11 a, jonka avulla saavutetaan kvantti saannon (kerni-lumi nesenssi n saannon) nousu.
3 84519
Julkaisusta Nature 305 (1983), 158 - 159, Whitehead et ai., on tunnettua luminolin POD-katalysoidun hapetuksen lumine-senssin saannon moninkertainen nousu firefly-lusiferiinin (tulikärpäslusiferiinin) avulla, sellainen nousu tunnetaan myös 6-hydroksi-bentsotiatsolin vaikutuksesta (vrt. Thorpe et ai, Anal. Biochem. 145 (1985) 96-100), tai fenoliyhdis-teiden lisäyksellä (vrt. Thorpe et ai., Clin. Chem. :31 (1985) 1335-1341; EP-A-0116454).
Näillä menetelmillä voidaan tosin saavuttaa kvanttisaannon nousu, mutta niillä on se varjopuoli, etteivät tarvittavat lisäaineet (aktivaattorit) ole helposti saatavissa ja/tai ovat huonon veteen liukoisuutensa vuoksi lisättävissä vain orgaanisten liuottimien kanssa.
Tämän keksinnön tehtävänä oli siksi menetelmän kehittäminen kvanttisaannon nostamiseksi hapettamalla luminolia peroksi-diyhdisteillä P0D:n läsnäollessa tavalla, jolla vältetään edellä mainitut varjopuolet, ja joka sopii nopeaan ja herkkään P0D:n määritykseen entsyymi-immuunikokeessa. Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisella menetelmällä.
Huomattiin, että kvanttisaantoa voitiin nostaa luminolin hapetuksella peroksidiyhdisteillä P0D:n läsnäollessa, kun reaktio suoritetaan fluoreseiinin läsnäollessa, jolloin fluoreseiinin pitoisuusalue on sellainen, että saavutetaan ylikumuloituva (synergistinen) kvanttisaannon nousu, joka on suurempi kuin yksittäisten kemiluminoivien aineiden kvanttisaantojen summa.
Siksi keksinnön kohteena on menetelmä kvanttisaannon nostamiseksi hapettamalla peroksiyhdisteillä peroksidaasin (POD) läsnäollessa luminolia tai 7-dialkyyliamino-nafta-leeni-1,2-dikarboksyylihappohydratsidia, jossa kukin alkyy-liryhmä sisältää 1-3 hiiliatomia, joka on tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan fluoreseiinin läsnäollessa, jolloin fluoreseiinin pitoisuus on sellaisissa pitoisuusrajoissa, 4 84519 että se antaa suuremman kvanttisaannon kuin yksittäisten kemiluminoivien aineiden kvanttisaantojen summa.
Tämän menetelmän tarkoituksenmukaiset toteutustavat ovat patenttivaatimusten 2-6 kohteena.
On tunnettua, että myös fluoreseiinissa ilmenee vetyperoksidin vaikuttaessa kemiluminesenssia (vrt. Nilsson ja Kearns, J. Phys. Chem. 78 (1974) 1681 - 1683); sitä käytetään fluo-reseiinilla merkittyjen yhdisteiden kanssa immuunikokeissa (vrt. EP-A-0054952, EP-A-0046563, DE-A-31 32 491). B.A.
Rusin et ai:n työstä Khim. Vys. Energ. 3Λ (1) (1977) 93 -94 (referoitu CA:ssa 86 (1977) s. 595, 130 321 s) on tunnettua, että kerniluminesenssi sammuu luminaalin hapetuksessa fluoreseiinin vaikutuksesta. Siksi on pidettävä yllättävänä, että on olemassa pitoisuusalue, jossa kemiluminesenssireak-tiossa tapahtuu ylikumuloituva (synerginen) kvanttisaan-non nousu.
7-dialkyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarboksyylihappo-hydratsi-din alkyyliryhmät voivat olla erilaisia tai samanlaisia, haaroittuneita tai suoraketjuisia, ja ovat esimerkiksi metyylietyyli, propyyli ja/tai isopropyyli.
Mieluiten käytetään 7-dimetyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarb-oksyylihappo-hydratsidia.
Peroksideiksi sopivat vetyperoksidin ohella kaikki P0D:n kanssa sekoittuvat peroksidiyhdisteet, joilla on sama hape-tuspotentiaali, kuten esim. alkaliperoksidit, vetyperoksidin liitännäisyhdisteet boorihappoon (perboraatit) tai ureaan, erityisesti entsyymi-immuunikokeessa lisätään mieluiten natriumperboraattia ja ensisijassa H202:a.
5 84519
Keksinnön mukainen prosessi suoritetaan tarkoituksenmukaisim-min pH-arvoilla 7,5 - 9, parhaiten pH:n ollessa noin 8,5. Puskurina käytetään mieluiten kaiiumfosfaattipuskuri a tai glysiini-NaOH-puskuria, joskin myös muut tavalliset puskurit, kuten esim. Tris-HCl, trisulfaatti ja trisasetaatti ovat sopivia. Suositeltu puskurikonsentraatio on silloin 10 - 1000 mmoolia/1. Luminolin tai 7-diai kyy1iamino-naftaieeni-1,2-di-karboksyylihappo-hydratsidi n tai vetyperoksidin konsentraa-tiot ovat, ellei tällä reaktiolla määritetä näitä konsentraa-tioita, tälle kerni 1uminesenssireaktioi 1 e tavanomaisissa rajoissa, luminolia tai 7-diai kyy 1iamino-naftaieeni-1,2-dikar-boksyylihappo-hydratsidi a laitetaan tarkoituksen mukaisesti määriä, jotka ovat 10 ^umoolia/1 - 100 mmoolia/1. Keksinnön mukaista menetelmää käytetään tarkoituksenmukaisimmin entsy- maattisille määrityksille normaaleissa lämpötiloissa, jotka o ovat tavallisesti 20 C ja 37 C välillä, mutta jolloin itse o menetelmälle tulevat kyseeseen myös korkeammat tai alhaisemmat o o lämpötilat, erityisen suositeltava on 22 C ja 30 C välinen lämpötila-alue.
F1uoreseiinin konsentraatioalue, jolla y1ikumuloituva (sy-nergistinen) kerni 1uminesenssin kvantti saannon nousu tapahtuu, voi riippua konsentraatiosta ja muiden reaktioon osaaottavien aineiden laadusta, mutta kulloisiakin olosuhteita varten sovellettava optimaalinen alue on helposti määritettävissä muutamilla suuntaa antavilla määrityksillä. Lähinnä hapetetaan luminolia ja vetyperoksidia P0D:n läsnäollessa erityisesti entsyymi-immuunikokeen indikaattorireaktiona, tämä vaihtoreaktio suoritetaan ensi sijassa fluoresiinin läsnäollessa, jolloin työskennellään f1uoreseiinipitoisuuden ollessa 10 - 1000 mooli a/1 rajoissa, lähinnä 20 - 100 moolia/1, näissä rajoissa saavutetaan kvantti saannon nousu, joka vastaa noin kymmenkertaisesti sitä saannon nousua, joka tulee yksittäisten kerni 1uminoivien aineiden kvantti saantojen summasta.
6 84519
Korkean kvantti saannon vuoksi voi keksinnön mukainen menetelmä toimia indikaattorireaktiona (kerniluminesenssikokeena) immuuni kokei ssa POD-aktiviteetin määrityksessä, jolloin herkkyydessä saavutetaan kymmenkertainen nousu siihen verrattuna, että kokeen ainoana aineosana on luminoli.
Paitsi P0D:n määritykseen, sopii keksinnön mukainen menetelmä myös reaktioon osallistuvien peroksidien, kuten esim. vetyperoksidin määritykseen, tai määritettäessä luminolia tai 7-di aikyyliamino-naftaleeni-1,2-di karbok syy 1ihappo-hydratsi-di a.
Keksinnön mukaisella menetelmällä on siten mahdollista esim. ELISA-kokeessa laskea puhdas entsyymi aktiviteettimääritys erittäin herkkänä noin 2 - 3 minuuttiin. Mittaus toimii lähinnä siten, että mitataan määrättynä aikavälinä säteillyt valomäärä.
Siksi keksinnön kohteena on myös keksinnön mukaisen menetelmän käyttö P0D:n, luminolin tai 7-diaikyyliamino-naftaleeni- 1,2-dikarboksyylihappo-hydratsidi n määrityksessä, jotka toimivat merkkausaineina erityisesti immuunikokeissa.
Käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää voidaan POD-määritys suorittaa esim. immunologisen osa-antigeenimäärityk-sen puitteissa, jossa tunnettu määrä POD:11ä merkittyä osa-antigeeniä lisätään tutkittavaan, tuntemattoman määrän osa-antigeeniä sisältävään näytteeseen, saatetaan näyte sitten kiinteään kantajaan kytketyn osa-antigeenin spesifisen vasta-aineen yhteyteen, erotetaan kiinteä faasi nestemäisestä ja mitataan jommankumman POD-aktiivisuus (ELISA-koe). Tällä kokeella voidaan määrittää veriseerumista esim. digoksiini, tyroksiini (T ) tai insuliini, jolloin voidaan työskennellä 4 jonkin julkaisussa DE-AS 29 06 732 kuvatun menetelmän mukaan.
7 84519
Keksinnön kohteena on myös keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi soveltuva reagenssi, joka on tarkoitettu POD:n määrittämiseen kemiluminesenssimittauksella ja joka sisältää kemiluminoivaa ainetta, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat luminoli ja 7-dialkyyliaminonaftaleeni-l,2-dikarboksyyli-happo-hydratsidi, jossa kukin alkyyliryhmä sisältää 1-3 hiili-atomia, vetyperoksidin luovuttajaa, puskuriainetta (pH 7,5 - 9) ja mahdollisesti sekvestrausainetta. Reagenssille on tunnusomaista se, että reagenssi sisältää toisena kemiluminoivana aineena fluoreseiinia, joka antaa kvanttisaannon, joka on suurempi kuin yksittäisten kemiluminoivien aineiden kvanttisaantojen summa.
Eräs suosittu reagenssi sisältää yhtä testiainelitraa kohti: 10 - 1000 pmoolia/l 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarboksyylihappo-hydratsidia tai luminolia, 10 - 1000 pmoolia/l fluoreseiinia, 50 - 500 mmoolia/1 kaliumfosfaatti- tai glysiinipuskuria (pH 7,5 - 9), 10 - 200 pmoolia/l H2O2, ja mahdollisesti 0,01 - 1 mmoolia/1 sekvestrausainetta.
Joissakin tapauksissa käytettävinä sekvestrausaineina tulevat kysymykseen tätä varten tunnetut aineet, kuten etyleenidiamidi-tetraetikkahappo (EDTA) ja sen kaltaiset siihen käytetyt yhdisteet. Sen lisäksi voi reagenssi sisältää tavanmukaisia stabilointiaineita, kuten seerumialbumiinia, hiilihydraatteja ja niiden kaltaisia aineita. Η2θ2:η luovuttajana voi olla H2O2 itse, kuten myös tunnetut H202:a vapauttavat aineet, kuten esim. ureaper-hydraatti (kiinteä H2O2) ja vastaavat.
Yllämainittujen ainesosien lisäksi voi keksinnön mukainen reagenssi sisältää POD:llä merkittyjä osa-antigeenejä ja lisäksi kantajaan sidotun spesifisen vasta-aineen kulloistakin osa-anti-geenia vastaan, kun reagenssia pitää käyttää entsyymi-immuunites-tin puitteissa. Sen ohella voi reagenssi sisältää esim. ELISA-reagensseille luonteenomaisia muita aineita, kuten lisäpuskuri-aineita, stabilointiaineita ja niiden kaltaisia.
8 84519
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lähemmin sitä kuitenkaan rajoittamatta. Ellei toisin ilmoiteta, ovat ilmoitetut lämpötilat Celsiusasteita ja prosentti- ja määrätiedot painoprosentteja ja paino-osia.
Esimerkki 1 Tämä esimerkki havainnollistaa f1uoreseiinikonsentraation vaikutuksen kvantti saantoon.
Kaikki kokeet tehtiin bioluminesenssi-mittalaitteel1 a, jonka on valmistanut Fa. Berthold, Wildbad, tyyppi Biolumat LB 9500.
o
Koestusmäärä oli 500 ^u1, lämpötila 30 C.
Käytettiin seuraavia pitoisuuksia (kokeen 1oppukonsentraa-t i o t).
Vetyperoksidia 0,1 mmoolia/1
Lumi noli a 25 ^umoolia/l
Peroksidaasia 20 mg/1
Tris-HCl-puskuria (pH 8,5) 90 mmoolia/1
Kuviossa 1 esitetään graafisesti säteilyn riippuvuus fluore-seiinikonsentraatiosta. Kuten kuvio 1 osoittaa, aktivoituu valon säteily fluoreseiinipitoi suuksi 11 a 10 - 1000 umoo-lia/1 moninkertaisesti.
Esimerkki 2 Tämä esimerkki havainnollistaa luminolin ja f1uoreseiinin ylikumuloi tuvan (synergistisen ) yhteisvaikutuksen verrattuna ainoastaan yksinään käytettyyn luminoliin tai fluoreseiiniin.
Työskenneltiin seuraavilla konsentraatioi 11 a (kokeen loppu-konsentraatiot): 9 84519
Lunn'nolia 0,1 mmoolia/l FIuoreseiinia 25 umoolia/1 / POD 20 ng/1
Vetyperoksidia 0,1 mmoolia/l
Tris-HCl-puskuri a (pH 8,5) 90 mmoolia/l
Saadut tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon. I tar- max koittaa vaioemissioiden lukumäärää/2 sekunttia.
Taulukko 1
No POD Lumi noli H202 ii“?rese Jmax (sykähdystä/2s) .............. --- ........
1 + +++ 3.9 10 2 + - ++ 5.8. 3 10 . 4 3 + + -+ 8.4 10 . 4 4 + + +- 2.7 10 . 3 5 + - -+ 7.2 10 6 + + 432 7 - +++ 25
Taulukosta 1 on selvästi nähtävissä luminolin ja fluoreseii- nin synergistinen yhteisvaikutus: luminolin ja fluoreseiinin läsnäollessa on maksimaalinen vai ointensiteetti I noin max kymmenen kertaa niin suuri kuin reaktioiden intensiteettien summa vain luminolin tai f1uoreseiinin läsnäollessa (koe no.
4 ja 2).
Taulukosta on myös nähtävissä, että fluoreseiini reagoi P0D:n läsnäollessa jo myös ilman hapen kanssa.
Esimerkki 3 Tämä esimerkki näyttää POD-konsentraation vaikutuksen reaktioon. Mittaus tapahtui, kuten edellisessä esimerkissä. Työskenneltiin seuraavilla konsentraatioi 11 a (kokeen loppukon-sentraatiot): ίο 8 4 51 9
Luminolia 0,1 mmoolia/1
Vetyperoksidia 0,1 mmoolia/1
Fluoreseiinia 25 umoolia/1 /
Tris-HCl-puskuria (pH 8,5) 90 mmoolia/1
Saatiin seuraavat, taulukkoon 2 kootut tulokset.
Taulukko 2 (sykähdystä/2s) r /1 Fluoreseiinin Ilman fluore-
CpoD (m00,,a/1 ) kanssa Imax seiinia 0 40 10 0,25 79 170 1.3 1580 1220 2,5 32500 670 3,1 45200 540 6.3 433600 3580 8.3 514900 4790 6 13 suurempi kuin 10 76000 17 " 93200 25 " 339200 6 130 " suurempi kuin 10
Esimerkki 4 Tämä esimerkki osoittaa pH-arvon vaikutuksen reaktioon. Työs- kenneltiin esimerkissä 3 mainituin konsentraatioin. P0D- -10 konsentraatio oli 9 x 10 moolia/1, tris-HCl-puskuri n konsentraatio erilaisin pH-arvoin oli 90 mmoolia/1. pH-arvo 12,6 saavutettiin lisäämällä 1 mooli/1 natronlipeää.
Kuviossa 2 on esitetty graafisesti pH-arvon vaikutus valon emissioon (I ).
max 11 8451 9
Esimerkki 5
Toimittiin, kuten esimerkissä 2, mutta hapetusaineena käytettiin vetyperoksidin sijasta natriumperboraattia.
Tällöin saadut tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon 3.
Taulukko 3
No POD Perboraatti Luminoli Fluoreseiini Imav (sykähdystä/2s) ΙΠοΛ ....... ................. ~~~5 1 + + + + 1.510 2 + + - +400 3 + + + - 1.8 *104 . 3 4 + - - + 3.3 10
Myös taulukon 3 tuloksista on työskenneltäessä luminolin ja f1uoreseiinin läsnäollessa saatu y1ikumuloituva vaikutus selvästi havaittavissa.
Esimerkki 6 Tämä esimerkki näyttää keksinnön mukaisen menetelmän käytön entsyymi - immuuni kokeessa EL ISA-periaatteen mukaisesti syljen ai fa-amy1 aasi n määrityksessä.
Koe suoritettiin seuraavasti: 1. Luminesenssiputket (Lumacuvette P, polystyreeniä, re- kisteröintikoje no 4960 Lumac Systems AG, Sveitsi) inkuboi- o tiin 18 tuntia 4 C:ssa ihmissyljen amylaasia erikoisesti sitovalla ihmissyljen ai fa-amylaasi n monoklonaalisei 1 a vasta-aineella (5 ^ug/ml) 50 mM:n karbonaatti puskurissa (pH = 9,3) (500 ui). Tämä monoklonaali vasta-aine on tallennettu merkinnällä NCACC 84111305 National Collection of Animal Cell Culture: ssa Port Down, Iso-Britannia ja valmistetaan EP 0150309 mukaisesti.
12 8451 9 2. Putket pestään kerran 150 mM:n fosfaattipuskurilla (pH = 7,2, 145 mM N a C1 ) ja naudanseerumiaibumiini11 a (BSA).
3. Seuraa putken jälkikäsittely (jäikipäällystys) 150 mmoolia/1 fosfaattipuskurilla (pH 7,2), 145 mmoolia/l N a C1: 11a ja 2-prosenttisei 1 a naudanseerumiaibumiini11 a. Putket jätetään sitten yhdeksi tunniksi huoneenlämpöön.
4. Putket pestään, kuten kohdassa 2 ilmoitettiin.
5. Luminesenssiputkissa inkuboidaan humaania sylki-alfa- o amylaasi-POD-konjugaattia 4 tuntia 37 C:ssa (500 ui) eri laisissa konsentraatioissa.
6. Putket pestään viisi kertaa, kuten kohdassa 2 on kuvattu.
7. a) Joka putkeen laitetaan kehitteeksi 1 ml ABTS-reagens-sia (digoksiinin entsyymi kokeesta, Boehringer Mannheim GmbH, luettelon tilausnumero 199656). Tasan 9 minuutin kuluttua määritetään ekstinktio 405 nm:ssä inkuboimatonta ABTS-rea-genssia vastaan.
b) Jokaiseen putkeen laitetaan 1uminesenssireagenssia ilman fluoreseiinia (loppukonsentraatio ks. esimerkki 2). Lumi -nesenssi mitataan tarkalleen 30 sekunnin tai 17 minuutin kuluttua (laite: Fa. Berthold'in, Wildbad, bioiuminesenssi-mittalaite, tyyppi Biolumat LB 9500 T, integraatioaika 60 s).
c) Lisätään 500 ^ul 1uminesenssi1iuosta fluoreseiinin kanssa (loppukonsentraatio ks. esimerkki 2) ja sen jälkeen mitataan 1uminesenssi, kuten kohdassa 7 b) kuvataan.
Kuvio 3 näyttää indikaattorireaktiol1 a a), b) ja c) saadut kali broi nti käyrät. Tässä saatu mittasignaali on (tapauksessa a: valon imeytymä; tapauksissa b ja c: valon säteily) esitetty sitoutuneen sylkiamylaasi-POD-konjugaatin konsentraation funktiona.
13 84 51 9
Esimerkki 7 7-dimetyyli ami no-naftaieeni-1,2-di karboksyy1i happo-hydratsi-din (DNH) käytön synergis tinen vaikutus.
Toimittiin samoin kuin esimerkissä 1. Loppukonsentraatiot olivat: DNH 0,1 mmoolia/l
Fluoreseiini 25 umoolia/1 POD 20 ng/1
Vetyperoksidi 0,1 mmoolia/l
Tris-HCl-puskuri (pH 8,5) 90,0 mmoolia/l
Taulukko 4
No POD DNH H?02 Fluoreseiini max (sykähdystä/2s) ...................................... ~~~4 1 + + + - 1.1 10 „ 4 2 + + + + 6.10 3 + - + + 4.10*10^
Taulukosta 4 ilmenee, että käytettäessä 7-dimetyyliamino-naftaleeni-1,2-dikarboksyylihappohydratsidia ja f1uoresei inia on todettavissa synergistinen vaikutus.
Claims (10)
1. Menetelmä kvanttisaannon nostamiseksi hapettamalla peroksiyhdisteillä peroksidaasin (POD) läsnäollessa lumino-lia tai 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarboksyylihappo-hydratsidia, jossa kukin alkyyliryhmä sisältää 1-3 hiiliatomia, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan fluorese-iinin läsnäollessa, jolloin fluoreseiinin pitoisuus on sellaisissa pitoisuusrajoissa, että se antaa suuremman kvanttisaannon kuin yksittäisten kemiluminoivien aineiden kvanttisaantojen summa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peroksidiyhdisteenä käytetään vetyperoksidia.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan pH-arvossa 7,5 - 9.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo on 8,5.
5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luminoli hapetetaan vetyperoksidilla POD:n läsnäollessa.
6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan 10 - 1000 pmoolia/l fluoreseiiniä ollessa läsnä.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaisen menetelmän käyttö POD:n vetyperoksidin tai 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l, 2-dikarboksyylihappohydratsidin määrittämiseksi.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että POD, luminoli tai 7-dialkyyliamino-naftalee-ni-1,2-dikarboksyylihappohydratsidi määritetään immuuniko-keen merkkausaineena. is 8451 9
9. Reagenssi, joka on tarkoitettu POD:n määrittämiseen kemiluminesenssimittauksella ja joka sisältää kemiluminoivaa ainetta, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat lumi-noli ja 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarboksyylihap-po-hydratsidi, jossa kukin alkyyliryhmä sisältää 1-3 hiiliatomia, vetyperoksidin luovuttajaa, puskurlainetta (pH 7,5 - 9) ja mahdollisesti sekvestrausainetta, tunnettu siitä, että reagenssi sisältää toisena kemiluminoivana aineena fluoreseiinia, joka antaa kvanttisaannon, joka on suurempi kuin yksittäisten kerniluminoivien aineiden kvant-tisaantojen summa.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää 10 - 1000 pmoolia/l luminolia tai 7-dialkyyliamino-naftaleeni-l, 2-dikarboksyylihappohydratsidia, 10 - 1000 pmoolia/l fluoreseiinia, 50 - 500 mmoolia/1 kaliumfosfaatti- tai glysiinipuskuria, 10 - 200 pmoolia/l vetyperoksidia, ja mahdollisesti 0,01 - 1 mmoolia/1 sekvestrausainetta. ie 8451 9
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853545398 DE3545398A1 (de) | 1985-12-20 | 1985-12-20 | Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidase |
| DE3545398 | 1985-12-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI865166A0 FI865166A0 (fi) | 1986-12-17 |
| FI865166A FI865166A (fi) | 1987-06-21 |
| FI84519B true FI84519B (fi) | 1991-08-30 |
| FI84519C FI84519C (fi) | 1991-12-10 |
Family
ID=6289141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI865166A FI84519C (fi) | 1985-12-20 | 1986-12-17 | Foerfarande foer foerhoejning av kvantutbytet dao luminol oxideras med peroxid i naervaro av peroxidas och i foerfarandet anvaent reagens. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4834918A (fi) |
| EP (1) | EP0228046B1 (fi) |
| JP (1) | JPH066074B2 (fi) |
| AT (1) | ATE74209T1 (fi) |
| DE (2) | DE3545398A1 (fi) |
| DK (1) | DK612186A (fi) |
| ES (1) | ES2031065T3 (fi) |
| FI (1) | FI84519C (fi) |
| ZA (1) | ZA869544B (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5552298A (en) * | 1992-10-23 | 1996-09-03 | Lumigen, Inc. | Enzyme-catalyzed chemiluminescence from hydroxyaryl cyclic diacylhydrazide compounds |
| US5731148A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
| DE19623814C2 (de) * | 1995-06-15 | 1999-02-11 | Lab Molecular Biophotonics | Verfahren und Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von 5-Hydroxyindolen oder Catecholaminen |
| GB9514594D0 (en) * | 1995-07-17 | 1995-09-13 | Johnson & Johnson Clin Diag | Chemiluminescent analytical method |
| US7799573B2 (en) | 2005-08-31 | 2010-09-21 | Normadics, Inc. | Detection of explosives and other species |
| WO2008121124A1 (en) | 2007-03-19 | 2008-10-09 | Nomadics, Inc. | Hydrogen peroxide detector and methods |
| WO2010145696A1 (en) * | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Martin Jan Peter Eversdijk | Methods for detecting the presence or absence of blood |
| KR101099508B1 (ko) | 2010-06-30 | 2011-12-27 | 중앙대학교 산학협력단 | 과붕산염 선택성을 갖는 플루오레세인계 화합물을 포함하는 센서 및 이를 이용한 과붕산염 검출방법 |
| CN101936911B (zh) * | 2010-08-06 | 2012-07-04 | 陕西师范大学 | 具有长波长化学发光及荧光和显色功能的血迹检测方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE7811630L (sv) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | Metod for uppteckt eller mengdbestemning av substanser med anvendning av merkningsteknik |
| US4277437A (en) * | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4220450A (en) * | 1978-04-05 | 1980-09-02 | Syva Company | Chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4372745A (en) * | 1979-12-19 | 1983-02-08 | Electro-Nucleonics, Inc. | Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry involving microencapsulated fluorescer |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4709016A (en) * | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| US4842997A (en) * | 1982-03-03 | 1989-06-27 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| JPS58158542A (ja) * | 1982-03-17 | 1983-09-20 | Hitachi Ltd | 化学発光増感法 |
| DE3463395D1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-06-04 | Nat Res Dev | Enhanced luminescent or luminometric assay |
| AU582357B2 (en) * | 1984-04-06 | 1989-03-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Chemiluminescent methods and kit |
| GB8420053D0 (en) * | 1984-08-07 | 1984-09-12 | Secr Social Service Brit | Enhanced luminescent/luminometric assay |
-
1985
- 1985-12-20 DE DE19853545398 patent/DE3545398A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-12-10 US US06/939,867 patent/US4834918A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-17 FI FI865166A patent/FI84519C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 JP JP61300228A patent/JPH066074B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-18 DK DK612186A patent/DK612186A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-12-19 AT AT86117749T patent/ATE74209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 ES ES198686117749T patent/ES2031065T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DE DE8686117749T patent/DE3684577D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 EP EP86117749A patent/EP0228046B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 ZA ZA869544A patent/ZA869544B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA869544B (en) | 1987-08-26 |
| FI84519C (fi) | 1991-12-10 |
| JPS62156546A (ja) | 1987-07-11 |
| FI865166A0 (fi) | 1986-12-17 |
| ES2031065T3 (es) | 1992-12-01 |
| JPH066074B2 (ja) | 1994-01-26 |
| DK612186A (da) | 1987-06-21 |
| EP0228046A3 (en) | 1988-09-07 |
| US4834918A (en) | 1989-05-30 |
| DK612186D0 (da) | 1986-12-18 |
| EP0228046B1 (de) | 1992-03-25 |
| DE3545398A1 (de) | 1987-06-25 |
| FI865166A (fi) | 1987-06-21 |
| ATE74209T1 (de) | 1992-04-15 |
| EP0228046A2 (de) | 1987-07-08 |
| DE3684577D1 (de) | 1992-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kricka et al. | Chemiluminescent and bioluminescent methods in analytical chemistry. A review | |
| Dodeigne et al. | Chemiluminescence as diagnostic tool. A review | |
| US4521511A (en) | Catalyzed colorimetric and fluorometric substrates for peroxidase enzyme determinations | |
| KR920001449B1 (ko) | 효소적산화에 의한 검체의 비색적 측정방법 및 시약 | |
| JP3184894B2 (ja) | ハロペルオキシターゼ酸至適化学的発光分析系 | |
| US5043266A (en) | Ortho- and para-imidazolyl and benzimidazolyl substituted phenol as enhancers for diagnostic chemiluminescent assays | |
| US6602679B2 (en) | Stabilized formulations for chemiluminescent assays | |
| FI84519B (fi) | Foerfarande foer foerhoejning av kvantutbytet dao luminol oxideras med peroxid i naervaro av peroxidas och i foerfarandet anvaent reagens. | |
| US5552298A (en) | Enzyme-catalyzed chemiluminescence from hydroxyaryl cyclic diacylhydrazide compounds | |
| WO1986004610A1 (en) | Stabilized enzyme substrate solutions | |
| EP0606296A1 (en) | Reagents and assay methods including a phenazine-containing indicator | |
| EP0282024B1 (en) | An assay method for detecting hydrogen peroxide | |
| CA1134744A (en) | Peroxidase determination by emission of light | |
| Brown et al. | Employment of a phenoxy-substituted acridinium ester as a long-lived chemiluminescent indicator of glucose oxidase activity and its application in an alkaline phosphatase amplification cascade immunoassay | |
| Mitani et al. | Determination of horserdish peroxidase concentration using the chemiluminescence of Cypridina luciferin analogue, 2 methyl‐6‐(p‐methyoxyphenyl)‐3, 7‐dihydroimidazo [1, 2‐a] pyrazin‐3‐one | |
| Sumi et al. | A spectrofluorometric method for determining plasma allantoin based on the glyoxylate reductase reaction | |
| JPH02234698A (ja) | 細菌ルシフェラーゼ系によるｄｎａプローブの検出法 | |
| CA1252373A (en) | Chemiluminescent methods and kit | |
| EP0516948B1 (en) | Chemiluminescent method and compositions | |
| Kayamori et al. | Enzymatic method for assaying uric acid in serum with a new tetrazolium salt produces water-soluble formazan dye | |
| JP2001078797A (ja) | グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 | |
| US20040219622A1 (en) | Phosphine-containing formulations for chemiluminescent luciferase assays | |
| EP0195320B1 (en) | Diagnostic assay using microperoxidase | |
| Matherly et al. | Identification of the enol tautomer of imidazolone propionate as the urocanase reaction product | |
| Blum et al. | Chemiluminescent detection of chlorophenols with a fiber optic sensor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |